专题03 基因工程及蛋白质工程（期末真题汇编，天津专用）高二生物下学期

**基本信息** 聚焦基因工程及蛋白质工程专题，整合天津多区县期末试题，以CRISPR/Cas9技术、生物反应器等科技前沿情境为载体，通过分层问题设计考查工具酶应用、操作程序及蛋白质工程等核心内容。 **题型特征** |题型|题量/分值|知识覆盖|命题特色| |----|-----------|----------|----------| |单选题|24题|含限制酶特性、PCR技术、基因表达载体构建等|如结合同尾酶识别序列考查黏性末端连接（考点01），通过双脱氧测序分析碱基突变（考点02）| |非选择题|12题|涵盖重组质粒构建、农杆菌转化、蛋白质工程改造等|如设计抗冻番茄培育流程综合考查酶切位点选择与检测（考点02），通过无缝克隆技术构建荧光探针载体（考点03）|

专题03 基因工程及蛋白质工程 3大高频考点概览 考点01 DNA重组技术的基本工具 考点02 基因工程的基本操作程序 考点03 蛋白质工程及其应用 地 城 考点01 DNA重组技术的基本工具 一、单选题 1．【答案】D 2．【答案】A 地 城 考点02 基因工程的基本操作程序 1、 单选题 1．【答案】B 2．【答案】D 3．【答案】A 4．【答案】B 5．【答案】C 6．【答案】C 7．【答案】A 8．【答案】A 9．【答案】D 10．【答案】B 11．【答案】C 12．【答案】B 13．【答案】A 14．【答案】C 15．【答案】C 16．【答案】D 17．【答案】D 18．【答案】D 19．【答案】B 20．【答案】C 21．【答案】D 二、非选择题 1． 【答案】 (1) 耐高温的DNA聚合 5′ EcoRⅠ、BamHⅠ (2) 脱氧核苷酸 RNA聚合酶识别和结合的部位，启动基因转录出mRNA (3) Ca2+ 一种能吸收环境中DNA分子 (4) 愈伤组织分化程度低，容易实现全能性 PCR 植物组织培养 2． 【答案】 (1)能吸收周围环境中DNA分子 (2) 卡那霉素和X-gal 白色 (3)B (4)聚合酶链式反应 3． 【答案】 (1)引物 (2) 5’ Sal I EcoR I (3)Mun I、XhoI、Taq DNA聚合酶（耐高温的DNA聚合酶）、DNA连接酶 4． 【答案】 (1) 四种脱氧核苷酸、TaqDNA聚合酶 ①④ (2) SmaI Xhol DNA片段浓度、DNA片段末端类型 (3) 不含 未发生交换 (4) 在细胞中的表达水平相对恒定 琼脂糖凝胶电泳 5． 【答案】 (1) 短单链核酸 脱氧核苷酸 (2) Nde I、Kpn I 同种限制酶或能产生相同末端的限制酶 (3) 对转入重组质粒的酵母菌进行初步筛选 5 6． 【答案】 (1) 脱分化 细胞分裂素 诱导叶绿素的形成；满足叶绿体利用光能制造有机物的需要 (2) 遗传特性 转基因标识 (3)Ti 质粒中的T-DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起 (4) 荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根 观察幼苗是否表现出白化特征 PDS缺失会导致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除 7． 【答案】 (1) 基因表达载体的构建 潮霉素/除草剂 (2)A (3) 45 20 样品2 8． 【答案】 (1) 沿5'→3'的方向水解DNA形成黏性末端 DNA 聚合酶和DNA连接酶 (2) 模板和引物 PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列 A、C (3) 草胺膦 3/4 绿色荧光点的分布 9． 【答案】 (1) ATP水解酶 渗透压/Na+、K+离子浓度差 (2) PCR 限制性核酸内切酶 C (3) CaCl2处理 稀释涂布 (4) 细胞膜 空间结构/结构 10． 【答案】 (1)细胞质基质 (2) 引物2和引物3 BamH Ⅰ 磷酸二酯键 不能 缺失尿嘧啶 (3)B 11． 【答案】 (1) DNA母链的一段碱基序列互补配对 引物较短，特异性不强从而扩增出非目的基因片段或者扩增效率降低 31m (2)若用该酶切割会导致目的基因与质粒反向连接，同时也会破坏质粒结构 (3) 用于重组质粒的筛选 因为导入含有目的基因的重组质粒或空质粒的酵母菌均具有尿嘧啶合成基因，都能在该培养基上存活 12． 【答案】 (1) ①④ 5' MunI 四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐高温的DNA聚合酶、（含Mg2+的）缓冲液 (2) 基因表达载体的构建 5'CTCGAG3' (3)A (4) PCR（或RT-PCR） 启动子 地 城 考点03 蛋白质工程及其应用 一、单选题 1．【答案】A 2．【答案】D 3．【答案】B 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题03 基因工程及蛋白质工程 3大高频考点概览 考点01 DNA重组技术的基本工具 考点02 基因工程的基本操作程序 考点03 蛋白质工程及其应用 地 城 考点01 DNA重组技术的基本工具 一、单选题 1．（24-25高二下·天津河西·期末）同尾酶是指一组识别序列不同，但切出的黏性末端相同的限制酶。下图为EcoR I、BamH I、Bgl II和Mbo I四种限制酶的识别序列及酶切位点。下列说法正确的是（    ） A．BamH I、Bgl II、Mbo I属于同尾酶，它们的识别序列相同 B．当目的基因编码区内有BamH I识别序列时，使用Mbo I可避免目的基因被破坏 C．选用上述任意两种不同的限制酶切割目的基因，就可以防止目的基因自身环化 D．用DNA连接酶将BamH I和Bgl II形成的黏性末端连接后，仍可再被图中某种限制酶切开 2．（24-25高二下·天津部分区·期末）下图为EcoRI、BamHI、BglI和MboI四种限制酶的识别序列及酶切位点。下列说法正确的是（　　） A．BamHI、BglI、MboI的识别序列不同，但切割之后形成的黏性末端相同 B．当目的基因内有BamHI识别序列时，使用MboI可避免目的基因被破坏 C．选用两种不同的限制酶切割目的基因，就可以防止目的基因自身环化 D．用DNA连接酶将BamHI和BgⅡ形成的黏性末端连接后，仍可再被这两种限制酶切开 地 城 考点02 基因工程的基本操作程序 1、 单选题 1．（24-25高二下·天津河西·期末）如图，科研人员发现，酵母菌的液泡膜上含有镉转运蛋白（YCF1），于是利用转基因技术将酵母菌的YCF1基因整合到杨树的染色体上，培育出能高效富集镉（Cd）的转基因杨树，种植在镉污染的土地上对土壤进行修复。下列相关叙述正确的是（    ）    A．利用PCR技术获取并克隆YCF1基因，需要设计2种碱基序列互补的引物 B．利用图1中的质粒和YCF1基因构建目的基因表达载体，需要3种工具酶 C．将含有YCF1基因的重组载体导入杨树组织细胞最常用的方法是显微注射法 D．将YCF1基因导入杨树植株后，只需要在分子水平上检测其表达情况即可 2．（24-25高二下·天津河西·期末）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　）    A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 3．（24-25高二下·天津河西·期末）下列相关实验的叙述正确的是（　　） A．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA B．羊的成熟红细胞和洋葱鳞片叶细胞都可作为提取DNA的材料 C．粗提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂后显蓝色 D．配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料 （24-25高二下·天津·期末）阅读下面的材料，完成问题。 利用基因工程对动植物的遗传物质进行改造，可制作动植物生物反应器，在药物蛋白，疫苗等的生产上有着广泛的应用，我国在这方面也取得重大进展 材料一：动物生物反应器的研究开发重点是动物乳腺反应器和动物血液反应器。我国“动物乳腺生物反应器”研究取得重要成果，7只含有人生长激素基因的兔子在深圳培育成功，还有一批已接受转基因胚胎移植的牛和羊等待最后检测。 材料二：我国对植物生物反应器研究的成果有： 成果1将乙型肝炎病毒包膜的蛋白基因导入马铃薯和番茄中，获得了高效表达该外源基因的工程植株。 成果2已将产毒素大肠杆菌热敏毒素b亚基及定居因子CS6B抗原蛋白基因导入马铃薯中，获得了高效表达重组抗原蛋白的转基因马铃薯植株。 成果3已成功地在烟草叶片中大量表达出与TMV外壳蛋白融合的多个口蹄疫病毒表面抗原小肽，并成功从烟草叶肉细胞中提取了该物质。 成果4建立了农杆菌介导的胡萝卜转化系统，已在胡萝卜中表达出了霍乱毒素b亚单位（CTB）。 4．下列关于动植物生物反应器的描述正确的是（　　） A．7只含有人生长激素基因的兔子所含目的基因和人体内生长激素基因的启动子相同 B．动物血液反应器和动物乳腺反应器相比的优点是没有性别和年龄的限制 C．制作动物乳腺生物反应器需要利用显微注射法把目的基因导入雌牛的乳腺细胞中 D．农杆菌介导的胡萝卜转化系统中，农杆菌的Ti质粒进入受体细胞完成转化 5．利用动植物生物反应器生产疫苗、药物蛋白等产品是一个复杂的过程，下面分析正确的是（　　） A．植物生物反应器生产的乙型肝炎病毒包膜的蛋白、CTB等物质属于单克隆抗体 B．动植物生物反应器生产多肽、蛋白质都一定需核糖体、内质网和高尔基体的参与 C．由上述材料可大致推测出不同生物共用一套遗传密码 D．利用转基因马铃薯的块茎进行繁殖，后代会发生性状分离 6．（24-25高二下·天津红桥·期末）干扰素是一种广谱抗病毒制剂；是具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），下图为通过基因工程生产干扰素的部分操作，图中①②③④表示相关操作过程。下列相关分析错误的是（    ） A．过程①可以用PCR技术获取干扰素基因 B．过程②需用耐高温的DNA聚合酶和引物 C．过程③操作要注意干扰素基因应包含启动子、终止子及标记基因等结构 D．过程④为目的基因的导入，最后必须对干扰素进行功能活性鉴定 7．（24-25高二下·天津滨海新·期末）如图为农杆菌转化法培育转基因抗病毒番茄植物的过程示意图，下列叙述错误的是（    ） A．过程A需要限制酶和DNA连接酶的参与，可将重组质粒直接侵染植物细胞 B．过程B可用处理农杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 C．抗病毒基因整合到番茄细胞的染色体DNA上需要借助T-DNA的转移 D．转基因抗病毒番茄植株是否培育成功可通过抗病毒接种实验进行鉴定 （24-25高二下·天津河东·期末）阅读下列材料，完成下面小题。 疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfert基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。 研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。 8．氯喹抗性患者体内的疟原虫变异类型属于（    ） A．基因突变 B．基因重组 C．染色体数目变异 D．染色体结构变异 9．下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（    ） A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用 D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段 10．为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。 1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（    ） A．1号和6号 B．2号和4号 C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号 11．（24-25高二下·天津河北·期末）采用基因工程技术培育转基因羊作为乳腺生物反应器，使其能合成人凝血因子且只存在于乳汁中。下列说法正确的是（    ） A．该转基因羊无法将人凝血因子基因传递给后代 B．该转基因羊的所有细胞都含有人凝血因子基因并可以正常表达 C．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别等限制，受体来源更广泛 D．将含有人凝血因子基因的表达载体导入羊乳腺细胞中即可获得乳腺生物反应器 12．（24-25高二下·天津和平·期末）果蝇的正常眼与无眼受一对等位基因A/a控制。现用正常眼雌、雄果蝇为亲本进行杂交，绘制部分后代系谱图，并对其成员进行基因检测。检测过程：①提取待测个体DNA进行PCR扩增，选用的引物与A和a基因都能结合，且两者的PCR产物片段大小相同；②将PCR产物进行变性再复性的处理；③处理后，用T7El酶（能切开DNA中没有配对碱基的位点）对这些片段进行切割，电泳结果如图所示。不考虑变异，下列说法正确的是（    ） A．控制正常眼与无眼的基因位于常染色体上，正常眼为隐性性状 B．Ⅰ1电泳结果中800bp片段既有A基因也有a基因 C．Ⅰ1和Ⅰ2特有的500bp、300bp片段是a基因扩增后酶切的产物 D．若Ⅱ1与Ⅰ2交配，子代表型为正常眼的果蝇中杂合子占3/5 13．（24-25高二下·天津和平·期末）下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传给子代的是（　　） A．将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗 B．将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌 C．将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株 D．将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛 14．（24-25高二下·天津和平·期末）下列与DNA粗提取和鉴定有关的叙述，错误的是（　　） A．预冷的酒精容易使DNA析出 B．DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液中 C．可用碱性染料甲紫鉴定提取出来的DNA D．整个提取过程中可以不使用离心机 15．（24-25高二下·天津部分区·期末）温度是影响实验成功的重要条件之一、下列实验操作中，所需温度最低的是（　　） A．用斐林试剂检测梨匀浆中的还原糖 B．用二苯胺试剂鉴定洋葱的DNA粗提取物 C．观察叶绿体和细胞质的流动 D．用PCR仪自动完成延伸步骤 16．（24-25高二下·天津部分区·期末）下列关于生物学实验操作或现象的描述，正确的是（　　） A．紫色洋葱鳞片叶内表皮细胞没有颜色，不能用于质壁分离实验 B．“探究pH对酶活性的影响”实验，实验温度属于无关变量，实验过程中无需控制 C．“探究酵母菌细胞的呼吸方式”实验需要设置有氧和无氧两种条件，其中有氧的为实验组，无氧的为对照组 D．利用香蕉进行DNA粗提取与鉴定实验中，香蕉研磨后离心取上清液，加入95%的冷酒精，有利于DNA析出 17．（24-25高二下·天津河北·期末）利用基因工程生产羧酸酯酶（CarE）制剂的流程如下图所示。下列叙述错误的是（    ） A．图中质粒的化学本质是 DNA B．过程①需要进行碱基互补配对 C．过程③需要用 Ca²⁺处理大肠杆菌 D．过程④只需进行 DNA 检测即可确定是否成功获得了工程菌 18．（24-25高二下·天津部分区·期末）与常规栽培技术相比，利用植物细胞培养进行药用次生代谢产物的生产具有显著的优越性，根据不同的需求可以采用不同的技术流程（如图）。相关叙述正确的是（　　） A．培养体系1中的外源基因导入前需用Ca2+处理受体细胞 B．培养体系2中获得的愈伤组织细胞应具有全能性，其细胞形态和结构与外植体细胞相同 C．在将经灭菌处理后的外植体诱导形成愈伤组织期间，一般不需要光照 D．在由外植体诱导形成愈伤组织的过程中，细胞发生了分裂及基因的选择性表达 19．（24-25高二下·天津部分区·期末）免疫PCR是对微量抗原的一种检测方法。下图是利用该技术检测牛乳中微量抗生素的流程图：首先将抗体1固定在微板上，冲洗后加入待检的牛乳，再加入DNA标记的抗体2，进行PCR扩增，最后进行电泳检测。下列相关叙述错误的是（　　） A．PCR扩增获得产物的量与牛乳中抗生素的量成正相关 B．图示过程所需抗体需对高温有较强的耐受性 C．图示过程中三次冲洗的目的均不同 D．图示抗原检测过程发生两次抗原与抗体的结合 20．（24-25高二下·天津和平·期末）最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧腺苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧核苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．上述PCR反应体系中加入的物质均相同 B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C．5′—CTACCCGTGAT—3′为对照个体的一段序列 D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 21．（24-25高二下·天津部分区·期末）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术, Cas9基因表达的Cas9 蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA 双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示，下列分析错误的是（　　） A．构建重组质粒时，SgRNA 编码序列需要插入到质粒的启动子的下游 B．SgRNA 和Cas9 蛋白形成复合体后,其功能类似限制酶 C．根据目标DNA 设计相应的SgRNA，可实现对目标 DNA的定点切割 D．CRISPR/Cas9识别目标 DNA 序列主要与Cas9蛋白的特异性相关 二、非选择题 1．（24-25高二下·天津河西·期末）我国科研人员从某植物中提取了一种抗冻基因AtC，利用基因工程技术获得转基因抗冻的番茄新品种，操作流程如图。Tetr表示四环素抗性基因，EcoRⅠ、BamHⅠ表示不同的限制酶，对应箭头指向位置为相应限制酶的切割位点（不考虑其他未知的酶切位点）。请回答下列问题： (1)过程①利用PCR技术扩增AtC基因时，需要添加______酶；为确保AtC基因准确插入农杆菌质粒中，需在引物的______（填“5′”或“3′”）端添加______（填“EcoRⅠ”、“BamHⅠ”或“EcoRⅠ、BamHⅠ”）酶的识别序列。 (2)基因表达载体中启动子的基本组成单位是______，启动子的作用是______。 (3)过程③中需要先用______处理农杆菌，使其处于______的生理状态，以便基因表达载体导入农杆菌。 (4)利用愈伤组织作为受体细胞的原因是______。在分子水平上，可利用______技术检测AtC基因是否整合到愈伤组织细胞中，再经过基因表达的检测，筛选出能合成抗冻蛋白的番茄愈伤组织细胞，再通过______技术；培育转基因番茄植株，再进行个体生物学水平的鉴定。 2．（24-25高二下·天津红桥·期末）研究人员利用基因工程技术将油料作物紫苏DGAT1基因导入四尾栅藻，获得转基因的产油微藻，利用地热水培养不仅能生产生物柴油，还能治理地热水。操作过程如下图，请回答下列问题：    (1)将质粒pMD19-DGAT1导入大肠杆前通常先用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于一种__________的生理状态。 (2)为了便于筛选含pMD19 - DGAT1重组质粒的大肠杆菌，该选择培养基中应添加__________物质。在培养基中挑取__________颜色的大肠杆菌菌落可提取该质粒并获取目的基因。 (3)启动子往往具有物种特异性，在载体pBI121质粒中插入紫苏DGAT1基因，其上游启动子应选择__________（填字母）。 A．紫苏DGAT1基因启动子 B．四尾栅藻启动子 C．大肠杆菌启动子 (4)为了判断DGAT1基因是否导入四尾栅藻细胞，可利用__________（中文全称）等技术进行检测。 3．（24-25高二下·天津红桥·期末）下图是A基因部分片段和载体的部分结构。科研人员欲将A基因的启动子连接在图中载体中，进而使载体上的荧光蛋白基因得到表达。图中标记了A基因部分片段和载体部分结构中限制酶酶切位点及各种限制酶识别序列及切割位点，回答下列问题： (1)图中R、F表示扩增启动子所用的__________。 (2)已知A基因的启动子两端没有限制酶识别序列，因此在F和R的__________（填“3'”或“5'”）端分别连接限制酶的识别序列。分析两种片段中的限制酶酶切位点、相应识别序列及两段基因的转录方向，F和R依次应添加__________、__________限制酶识别序列。 (3)为完成科研人员的设想，除需使用F和R处添加的序列所对应的酶外，扩增启动子和构建基因表达载体的过程还需用到的酶有__________。 4．（24-25高二下·天津部分区·期末）我国科学家尝试构建地衣芽孢杆菌基因编辑系统，并通过将外源vgb基因定向插入19T-pfIB 质粒中对该系统进行初步验证，主要过程如图1.请回答下列问题。    (1)步骤①利用已构建的质粒19T-pflB，通过反向 PCR获得左右同源片段，除图中已有的组分外，还应添加缓冲液（Mg2+）和___________（答两点）等。下表为pflB部分基因序列和 设计的相关引物，可选用的引物是___________（填编号）。 DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列） pflB基因 5'-TCGCACACCTGACTACAATT……TCGCAATGGCAATCGGCAAACT-3' 3'-AGCGTGTGGACTGATGTTAA……AGCGTTACCGTTAGCCGTTTGA-5' PCR引物 ① 5'ACGGGATCCTTGTAGTCAGGTGTGCGA3' ② 5'ACGGGATCCTTTGCCGATTGCCATTGC3' ③ 5'AACTGCAGTCGCACACCTGACTACAA3' ④ 5'AACTGCAGGCAATGGCAATCGGCAAA3' 注：下划线标注为BamHI识别序列5'-G↓GATCC-3'和PstI识别序列 5'-CTGCA↓G-3' (2)步骤②双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是_________和________，影响DNA连接酶反应速率的因素有反应体系的温度、pH、酶浓度和___________（答出两点）等。 (3)图2是质粒PNZTK-PFTF-vgb转入地衣芽孢杆菌后，将目的基因插入基因组的过程示意图。    将受体菌接种在含四环素和___________（含/不含）卡那霉素培养基中培养一段时间后，因没有选择压力，会导致发生双交换的质粒丢失。挑取一定数量的单菌落，接种到含四环素的培养基上，并一一对应接种到含卡那霉素的培养基上，实验结果如图3所示。其中在两种培养基均能生长的菌株是只发生单交换或___________的受体菌。 (4)科学家通过分析vgb基因在重组菌株及原始菌株中的表达水平验证该基因编辑系统。分析时需要以rpsE基因（核糖体S5蛋白基因）为参照，该基因表达的特点是___________，可采用___________的方法检测基因表达的产物量。 5．（24-25高二下·天津西青·期末）葡聚糖和木聚糖等物质具有一定的粘度，添加在某些饮品中会影响口感或堵塞过滤装置。某实验室科研工作者采用构建共表达GluZ（葡聚糖酶基因）和XylB（木聚糖酶基因）两种融合基因的工程酵母，降低酿造饮品中的葡聚糖和木聚糖等物质含量以降低粘度。图1中PGK是酵母菌的特异性启动子，ADH为终止子，KanMX是遗传霉素抗性基因。GluZ和XylB两种融合基因的结构如图2所示，MFα是酵母菌特有的信号肽基因（信号肽可以引导分泌型蛋白的表达）。请回答下列问题。 (1)PCR扩增序列时，需设计相应的引物，引物的本质是__________，需要的原料是__________。 (2)结合图1和图2，应选择限制酶__________对质粒进行切割。为使MFα与GluZ（或XylB）连接形成融合基因，引物R1与引物F2（或引物）F3的5'端引入的限制酶种类的要求是__________。 (3)科研人员将两种融合基因分别重组至质粒YE得到重组质粒G和X，并对处于特殊状态的酵母菌进行转化。为检测转化是否成功，可在培养基中加入遗传霉素，其作用是__________，在获得的酵母菌单菌落中选取6个单菌落分别制成菌悬液，标号为1~6，然后分别加入含木聚糖或葡聚糖的刚果红平板的圆孔中，观察透明圈的产生情况，结果如图3所示，其中同时含有质粒G和质粒X的菌悬液是__________（用序号表示）。 注：木聚糖和葡聚糖都能与刚果红结合形成红色复合物，若木聚糖和葡聚糖被分解，培养基中就会出现以圆孔为中心的透明圈。 6．（24-25高二下·天津河北·期末）基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统（切—浸—生芽（Cut-Dip-Budding,简称 CDB法）。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。 回答下列问题。 (1)图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于________；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和__________，该过程还需要光照，其作用是__________。 (2)图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的_。图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注________。 (3)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是_________。 (4)已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS 基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B。据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是________________，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是___________，依据是_________。 7．（24-25高二下·天津和平·期末）为使甘蓝具有抗除草剂能力，科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入甘蓝植株，获得抗草甘膦转基因甘蓝。 (1)基因工程中最核心的步骤是①_____。步骤②用Ca²⁺处理农杆菌后获得感受态细胞，以便将重组质粒导入。步骤③将农杆菌与甘蓝愈伤组织共培养后，在步骤④的培养基中添加_____以便筛选出含目的基因的甘蓝植株。 (2)草甘膦抗性基因一条链的两端序列如下，采用PCR技术获取和扩增草甘膦抗性基因，应选用的引物组合为_____。 A．5'-CTTGGATGAT-3'和5'-TCTGTTGAAT-3' B．5'-CTTGGATGAT-3'和5'-TAAGTTGTCT-3' C．5'-ATTCAACAGA-3'和5'-ATCATCCAAG-3' D．5'-ATTCAACAGA-3'和5'-GAACCTACTA-3′ (3)若目的基因用BamHl和BglⅡ剪切，质粒用BamHI剪切，酶切后的目的基因存在正向与反向两种连接方式。可用BamHI和EcoRI酶对两种重组质粒进行剪切，正向连接的重组质粒会被切去_____kb长度的片段，反向连接的重组质粒会被切去_____kb长度的片段。通过凝胶电泳分析产物大小进行区分，如下图所示，图中_____（样品1/样品2）为所需基因表达载体。 限制酶 识别序列和切割位点 BamHI —G'GATCC— BglII —A'GATCT— EcoRI —G'AATTC— 8．（24-25高二下·天津和平·期末）磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程如图。 (1)无缝连接时，过程①中使用T5核酸外切酶目的是______。过程③所需的酶有______。 (2)PCR技术分别扩增PABD和GFP基因时，配制的两个反应体系中不同的有______。引物R1的设计需依据______的核苷酸序列。据图分析引物F1和R2分别为______（填序号）。 A．5′-TCCGGACTCAGATAGC-3′ B．5′-AGGCCTGAGTCTATCGTTATGTCCGGACTCAGATAGC-3′ C．5′-GCTATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCGTCTCA-3′ D．5′-TCCGGACTCAGATAGCTATCGATGCGCAGCTGACGA-3′ (3)经无缝连接得到重组DNA后，利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子（T1）进行表面消毒，均匀铺在含有______的MS培养基上进行筛选。T1代阳性植株自交，按单株收种并播种后获得的T2代中抗性幼苗占比为______，说明T1可能为单个位点插入的转基因株系。通过观测转基因拟南芥根尖细胞中______，了解PA的动态变化。 9．（24-25高二下·天津和平·期末）帝王蝶是世界上唯一能长距离迁徙的蝴蝶，其幼虫只摄食一种叫乳草的植物，乳草会分泌一种名为强心甾的毒素，有资料研究显示，过量摄入强心甾对除帝王蝶幼虫以外其他的动物来说都是有毒的，会导致死亡。 (1)钠钾泵在许多动物细胞膜上均有存在，它能为主动转运供能并控制细胞内外的钠、钾离子浓度，因此从膜蛋白功能的角度看，钠钾泵还具有______的活性。强心甾能与细胞膜表面的钠钾泵结合，抑制其主动转运功能，从而导致细胞内外______失衡，使细胞破裂。 (2)科学家猜测：帝王蝶的钠钾泵基因可能发生了突变，使其获得了对强心甾的抗性。为研究帝王蝶钠钾泵基因的碱基排列顺序并获得相应的蛋白产物，科学家尝试从帝王蝶基因组中获取该基因，并通过______实现了对其的扩增；科学家选用合适的______、DNA连接酶和载体构建重组DNA分子，并将其导入大肠杆菌以获得大量的目的基因，再将其导入______中（A．农杆菌B．酵母细胞C．昆虫细胞D．海拉细胞）获得相应的蛋白产物。 (3)为提高重组DNA分子导入的成功率，除了需要确保重组DNA分子有足够的物质的量外，还必须采用______方法提高大肠杆菌接受外源DNA的能力。为了筛选成功导入重组DNA分子的大肠杆菌，宜用______法将转化混合物转移至选择培养基上。通过基因测序，发现帝王蝶钠钾泵基因中的突变会导致其蛋白产物中有3处氨基酸种类与其他昆虫不同，分别是第111、119和122位氨基酸。 (4)为了从受体细胞中分离目的基因的蛋白产物（目的蛋白），科学家在目的蛋白的肽链末端添加一个含有6-10个组氨酸的“标签”，然后，可以提取受体细胞______（填细胞结构）中的全部蛋白质，并通过识别“标签”获得纯度较高的目的蛋白。通过对目的蛋白的研究发现：上述3个位点的突变使得帝王蝶钠钾泵的______发生了改变，强心甾无法与其结合，由此验证了之前的猜测。 10．（24-25高二下·天津滨海新区·期末）乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需的关键条件。 (1)乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为______。 (2)获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下： ①利用PCR技术扩增乳酸脱氢酶基因，应选择的一对引物是______。若以乳酸脱氢酶基因甲链为转录的模板链，为构建基因的表达载体，应在与甲链结合的引物的5'端加入______（填“XbaⅠ”或“BamHⅠ”）的识别序列。 ②将上述PCR产物和质粒重组需要切割和连接______键。构建的重组质粒导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列______（能/不能）在大肠杆菌中高效表达。 ③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在______的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。 (3)以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一步提高其乳酸产量，下列措施中不合理的是______（单选）。 A．进一步优化发酵条件 B．使用乳酸菌LDH基因自身的启动子 C．敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因 D．对转基因酿酒酵母进行诱变育种 11．（24-25高二下·天津河北·期末）双乙酰是一种啤酒发酵过程中的产物，它的浓度过高会影响啤酒的风味和口感。研究发现给啤酒酵母导入Y基因后会减少啤酒酵母双乙酰的生成，进而缩短啤酒的发酵周期，改善啤酒的风味和口感。图1表示Y基因所在的DNA 上的限制酶识别位点，箭头表示Y基因的转录方向。图2表示构建表达载体时所用到的质粒。请回答下列问题： (1)利用PCR扩增Y基因时，需要设计引物，引物是一小段能与能与_______的短单链核酸。设计的引物序列不能过短，原因是____。利用PCR技术扩增Y基因时，假如加入模板为m个，循环5次共需要消耗________对引物。 (2)结合图1和图2，构建表达载体时应选择的限制酶组合是HindⅢ和KpnI，其组合酶中不选择EcoRI酶原因是______。 (3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，所以质粒上的尿嘧啶合成基因作用是_______。在缺乏尿嘧啶的培养基上生长的酵母菌不一定是含有Y基因的酵母菌原因是_____ 。 12．（24-25高二下·天津部分区·期末）低温是限制农作物产量的重要胁迫因子。科学家将寒带植物中的抗寒基因CBFs转移到拟南芥中构建拟南芥耐寒模型，用于植物低温胁迫机制的相关研究。回答下列问题： 限制酶 识别序列 EcoRI BamHI SphⅠ Sau3A XmaI AscI MunⅠ (1)PCR扩增目的基因：如图所示应选择引物________对CBFs基因进行扩增，为了后续能将目的基因定向连接到载体上，应在CBFs基因上游引物的________端添加______（“SphⅠ”或”Sau3A”或“MunⅠ”）识别序列，PCR时除模板DNA和引物外还需向PCR仪中加入________。 (2)基因工程的核心步骤是_______，图中终止子中有一段核苷酸序列为“5'-ATCTCGAGCGGG—3'”，则对该序列进行剪切的XhoI（酶切后产生黏性末端）识别的核苷酸序列（6个核苷酸）最可能为5'________3'。 (3)将拟南芥叶片浸泡在转基因农杆菌菌液中一段时间对其进行转化，然后提取叶片中的DNA，通过PCR对CBFs基因是否整合到拟南芥基因组中进行检测，结果如下图所示，该转基因叶片的基因组中可能已整合CBFs基因。PCR结果中显示出小分子非目标条带，产生的原因可能是_________ A．引物过短 B．复性温度太高 C．变性温度不够 (4)现已获取成功转入CBFs基因的拟南芥植株，利用________技术对其进行检测，结果表明转入CBFs基因的拟南芥植株没有表达出相应的mRNA。后续还应通过改变________，以利于RNA聚合酶与之识别和结合，进而实现CBFs基因在拟南芥中的转录。 地 城 考点03 蛋白质工程及其应用 一、单选题 1．（24-25高二下·天津河西·期末）将人胰岛素A链上1个天冬氨酸替换为甘氨酸，B链末端增加2个精氨酸，可制备出一种人工长效胰岛素。下列关于该胰岛素的叙述，错误的是（　　） A．进入人体后需经高尔基体加工 B．比人胰岛素多了2个肽键 C．与人胰岛素有相同的靶细胞 D．可通过蛋白质工程生产 2．（24-25高二下·天津部分区·期末）人干扰素（IFN）是机体免疫细胞产生的一类细胞因子。用白细胞生产干扰素时，每个细胞最多只能产生100~1000个干扰素分子，而用基因工程技术改造的大肠杆菌发酵生产（原理如图），在1~2天内每个菌体能产生20万个干扰素分子。天然的干扰素在体外保存相当困难，如果将干扰素分子上的一个半胱氨酸变为丝氨酸，在一定条件下可以延长保存时间。下列说法错误的是（　　） A．本研究中基因工程核心步骤用到的酶有限制酶、DNA连接酶，其作用部位都是磷酸二酯键 B．将重组质粒导入受体细胞时常用Ca2+处理大肠杆菌 C．除大肠杆菌外，还可以利用酵母菌做受体菌制备干扰素 D．为延长保存时间，需对干扰素的氨基酸序列进行直接改造 3．（24-25高二下·天津滨海新·期末）枯草杆菌蛋白酶能催化蛋白质水解为氨基酸，在有机溶剂中也能催化多肽的合成。这些碱性蛋白酶具有重要的应用价值，被广泛应用于洗涤剂、制革及丝绸工业。将枯草杆菌蛋白酶分子的天冬氨酸（99）和谷氨酸（156）改成赖氨酸，可使其在一定条件下的活力提高。下列说法错误的是（    ） A．完成氨基酸的替换需要通过改造基因实现 B．蛋白质工程需要直接改造蛋白质 C．经蛋白质工程改造后的枯草杆菌蛋白酶活性提高这一性状可遗传 D．蛋白质工程最终要达到的目的是获取编码蛋白质的基因序列信息，并表达出蛋白质 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题03 基因工程及蛋白质工程 3大高频考点概览 考点01 DNA重组技术的基本工具 考点02 基因工程的基本操作程序 考点03 蛋白质工程及其应用 地 城 考点01 DNA重组技术的基本工具 一、单选题 1．（24-25高二下·天津河西·期末）同尾酶是指一组识别序列不同，但切出的黏性末端相同的限制酶。下图为EcoR I、BamH I、Bgl II和Mbo I四种限制酶的识别序列及酶切位点。下列说法正确的是（    ） A．BamH I、Bgl II、Mbo I属于同尾酶，它们的识别序列相同 B．当目的基因编码区内有BamH I识别序列时，使用Mbo I可避免目的基因被破坏 C．选用上述任意两种不同的限制酶切割目的基因，就可以防止目的基因自身环化 D．用DNA连接酶将BamH I和Bgl II形成的黏性末端连接后，仍可再被图中某种限制酶切开 【答案】D 【难度】0.85 【知识点】DNA重组技术的基本工具 【详解】A、BamH I、Bgl II、Mbo I识别序列不同，但切出的黏性末端相同，属于同尾酶，A错误； B、根据相关限制酶的识别序列和切割位点可知，由于BamH Ⅰ的识别序列包括Mbo Ⅰ的识别序列，所以当目的基因编码区内有BamH I识别序列时，使用Mbo I也会破坏目的基因，B错误； C、BamH I、Bgl II的识别序列不同，但会产生相同的黏性末端，若用二者切割目的基因，不能防止目的基因自身的环化，C错误； D、用DNA连接酶将BamH I和Bgl II形成的黏性末端连接后，不能被二者切开，但可再被限制酶Mbo I切开，D正确。 故选D。 2．（24-25高二下·天津部分区·期末）下图为EcoRI、BamHI、BglI和MboI四种限制酶的识别序列及酶切位点。下列说法正确的是（　　） A．BamHI、BglI、MboI的识别序列不同，但切割之后形成的黏性末端相同 B．当目的基因内有BamHI识别序列时，使用MboI可避免目的基因被破坏 C．选用两种不同的限制酶切割目的基因，就可以防止目的基因自身环化 D．用DNA连接酶将BamHI和BgⅡ形成的黏性末端连接后，仍可再被这两种限制酶切开 【答案】A 【难度】0.65 【知识点】DNA重组技术的基本工具 【分析】由于同种限制酶切割得到的目的基因或质粒的两端黏性末端相同，会出现自体相连的现象，所以为了保证目的基因与载体的正确连接，通常用两种识别序列和切割位点不同的限制酶同时处理含目的基因的DNA片段与载体。 【详解】A、据图可知，BamHI、BglI、MboI的识别序列不同，但切割之后形成的黏性末端相同，属于同尾酶，A正确； B、根据相关限制酶的识别序列和切割位点可知，当目的基因编码区内有BamHI识别序列时，使用MboI也会破坏目的基因，B错误； C、BamHI、BgⅡ的识别序列不同，但会产生相同的黏性末端，若用二者切割目的基因，不能防止目的基因自身的环化，C错误； D、用DNA连接酶将BamHI和BgⅡ形成的黏性末端连接后，碱基序列与BamHI和BgⅡ识别的序列均不同，由于限制酶具有专一性，故不可被二者重新切开，D错误。 故选A。 二、非选择题 地 城 考点02 基因工程的基本操作程序 1、 单选题 1．（24-25高二下·天津河西·期末）如图，科研人员发现，酵母菌的液泡膜上含有镉转运蛋白（YCF1），于是利用转基因技术将酵母菌的YCF1基因整合到杨树的染色体上，培育出能高效富集镉（Cd）的转基因杨树，种植在镉污染的土地上对土壤进行修复。下列相关叙述正确的是（    ）    A．利用PCR技术获取并克隆YCF1基因，需要设计2种碱基序列互补的引物 B．利用图1中的质粒和YCF1基因构建目的基因表达载体，需要3种工具酶 C．将含有YCF1基因的重组载体导入杨树组织细胞最常用的方法是显微注射法 D．将YCF1基因导入杨树植株后，只需要在分子水平上检测其表达情况即可 【答案】B 【难度】0.65 【知识点】目的基因的检测与鉴定、将目的基因导入受体细胞、基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术。②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术。③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、利用PCR技术获取并克隆YCF1基因，需要两种引物，但两种引物不互补，A错误； B、构建基因表达载体需要2种限制酶（形成了黏性末端和平末端）、一种DNA连接酶等，B正确； C、将重组载体导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法，而不是显微注射法，显微注射法通常用于动物细胞，C错误； D、在转基因植物的研究中，除了在分子水平上检测基因的表达情况外，还需要在个体和生态水平上进行检测，以确保转基因植物在实际环境中的功能和安全性，D错误。 故选B。 2．（24-25高二下·天津河西·期末）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　）    A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 【答案】D 【难度】0.65 【知识点】目的基因的检测与鉴定、基因表达载体的构建、DNA重组技术的基本工具 【分析】图中质粒内，氨苄青霉素抗性基因（AmpR）内含有AcaI和PvuI的酶切位点，四环素抗性基因（TetR）内含有HindIII、SphI和SalI的酶切位点。 【详解】A、若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确。 B、若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确； C、DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确； D、SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 故选D。 3．（24-25高二下·天津河西·期末）下列相关实验的叙述正确的是（　　） A．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA B．羊的成熟红细胞和洋葱鳞片叶细胞都可作为提取DNA的材料 C．粗提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂后显蓝色 D．配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料 【答案】A 【难度】0.65 【知识点】PCR扩增的原理与过程、DNA的粗提取及鉴定 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理： （1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂具有耐受性。 （2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺试剂会被染成蓝色。 【详解】A、DNA不溶于酒精，而部分蛋白质可溶于酒精，因此可利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA，A正确； B、羊是哺乳动物，其成熟红细胞中没有DNA，不能作为提取DNA的材料，B错误； C、粗提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂后，在沸水浴加热的条件下显蓝色，C错误； D、PCR反应体系中需要加入的是4种脱氧核糖核苷酸溶液作为扩增原料，而不是核糖核苷酸，因为PCR扩增的是DNA，D错误。 故选A。 （24-25高二下·天津·期末）阅读下面的材料，完成问题。 利用基因工程对动植物的遗传物质进行改造，可制作动植物生物反应器，在药物蛋白，疫苗等的生产上有着广泛的应用，我国在这方面也取得重大进展 材料一：动物生物反应器的研究开发重点是动物乳腺反应器和动物血液反应器。我国“动物乳腺生物反应器”研究取得重要成果，7只含有人生长激素基因的兔子在深圳培育成功，还有一批已接受转基因胚胎移植的牛和羊等待最后检测。 材料二：我国对植物生物反应器研究的成果有： 成果1将乙型肝炎病毒包膜的蛋白基因导入马铃薯和番茄中，获得了高效表达该外源基因的工程植株。 成果2已将产毒素大肠杆菌热敏毒素b亚基及定居因子CS6B抗原蛋白基因导入马铃薯中，获得了高效表达重组抗原蛋白的转基因马铃薯植株。 成果3已成功地在烟草叶片中大量表达出与TMV外壳蛋白融合的多个口蹄疫病毒表面抗原小肽，并成功从烟草叶肉细胞中提取了该物质。 成果4建立了农杆菌介导的胡萝卜转化系统，已在胡萝卜中表达出了霍乱毒素b亚单位（CTB）。 4．下列关于动植物生物反应器的描述正确的是（　　） A．7只含有人生长激素基因的兔子所含目的基因和人体内生长激素基因的启动子相同 B．动物血液反应器和动物乳腺反应器相比的优点是没有性别和年龄的限制 C．制作动物乳腺生物反应器需要利用显微注射法把目的基因导入雌牛的乳腺细胞中 D．农杆菌介导的胡萝卜转化系统中，农杆菌的Ti质粒进入受体细胞完成转化 5．利用动植物生物反应器生产疫苗、药物蛋白等产品是一个复杂的过程，下面分析正确的是（　　） A．植物生物反应器生产的乙型肝炎病毒包膜的蛋白、CTB等物质属于单克隆抗体 B．动植物生物反应器生产多肽、蛋白质都一定需核糖体、内质网和高尔基体的参与 C．由上述材料可大致推测出不同生物共用一套遗传密码 D．利用转基因马铃薯的块茎进行繁殖，后代会发生性状分离 【答案】4．B 5．C 【难度】0.65 【知识点】将目的基因导入受体细胞、基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用、动物细胞融合与单克隆抗体的制备 【分析】转基因动物生产药物： （1）基因来源：药用蛋白基因+乳腺组织特异性表达的启动子（原理：基因的选择性表达）。 （2）成果：乳腺生物反应器。 （3）过程：将药物蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，导入哺乳动物的受精卵中，最终培育的转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌的乳汁产生所需要的药物。 4．A、7只含有人生长激素基因的兔子能够生产人的生长激素，其细胞中所含目的基因和人体内生长激素基因的启动子不同，其含有的启动子应该是兔子乳腺细胞中特异性表达的启动子，A错误； B、动物血液反应器和动物乳腺反应器相比的优点是没有性别和年龄的限制，因而生产能力更强，B正确； C、制作动物乳腺生物反应器需要利用显微注射法把目的基因牛的受精卵中，培育出转基因牛，C错误； D、农杆菌介导的胡萝卜转化系统中，农杆菌的T-DNA进入受体细胞完成转化，D错误。 故选B。 5．A、植物生物反应器生产的乙型肝炎病毒包膜的蛋白、CTB等物质不属于单克隆抗体，是基因工程在医学上的应用，A错误； B、动植物生物反应器生产多肽、蛋白质未必都一定需核糖体、内质网和高尔基体的参与，但一定需要核糖体的参与，B错误； C、由上述材料可大致推测出不同生物共用一套遗传密码，否则基因工程无法实现，这是生物具有共同起源的证据，C正确； D、利用转基因马铃薯的块茎进行繁殖，这种生殖方式为无性繁殖，产生的后代不会发生性状分离，D错误。 故选C。 6．（24-25高二下·天津红桥·期末）干扰素是一种广谱抗病毒制剂；是具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），下图为通过基因工程生产干扰素的部分操作，图中①②③④表示相关操作过程。下列相关分析错误的是（    ） A．过程①可以用PCR技术获取干扰素基因 B．过程②需用耐高温的DNA聚合酶和引物 C．过程③操作要注意干扰素基因应包含启动子、终止子及标记基因等结构 D．过程④为目的基因的导入，最后必须对干扰素进行功能活性鉴定 【答案】C 【难度】0.65 【知识点】目的基因的检测与鉴定、将目的基因导入受体细胞、基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【详解】A、过程①表示获取目的基因——干扰素基因，该过程可采用PCR技术获取干扰素基因，然后应用限制酶酶切，A正确； B、②表示通过PCR技术扩增目的基因，其利用原理是DNA双链复制，该过程需用到耐高温的热稳定性DNA聚合酶（Taq酶）和引物，B正确； C、过程③操作要注意最终构建的基因表达载体上有干扰素基因、启动子、终止子及标记基因，C错误； D、过程④为目的基因导入，最后需对酵母菌分泌的干扰素与人体内干扰素的功能活性进行比较，以确定转基因产品的功能活性与人体的相同，D正确。 故选C。 7．（24-25高二下·天津滨海新·期末）如图为农杆菌转化法培育转基因抗病毒番茄植物的过程示意图，下列叙述错误的是（    ） A．过程A需要限制酶和DNA连接酶的参与，可将重组质粒直接侵染植物细胞 B．过程B可用处理农杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 C．抗病毒基因整合到番茄细胞的染色体DNA上需要借助T-DNA的转移 D．转基因抗病毒番茄植株是否培育成功可通过抗病毒接种实验进行鉴定 【答案】A 【难度】0.65 【知识点】基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 【详解】A、过程A构建重组质粒需限制酶和DNA连接酶，但重组质粒不能直接侵染植物细胞，需借助农杆菌等载体，A错误； B、Ca2+处理农杆菌可使其处于感受态，利于吸收周围DNA分子，B正确； C、农杆菌Ti质粒的T−DNA可将目的基因整合到受体细胞染色体DNA上，C正确； D、通过抗病毒接种实验，观察番茄是否抗病，可鉴定培育是否成功，D正确。 故选A。 （24-25高二下·天津河东·期末）阅读下列材料，完成下面小题。 疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfert基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。 研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。 8．氯喹抗性患者体内的疟原虫变异类型属于（    ） A．基因突变 B．基因重组 C．染色体数目变异 D．染色体结构变异 9．下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（    ） A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用 D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段 10．为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。 1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（    ） A．1号和6号 B．2号和4号 C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号 【答案】8．A 9．D 10．B 【难度】0.65 【知识点】DNA重组技术的基本工具、PCR扩增的原理与过程、染色体数目的变异、染色体结构的变异 【解析】8．由图甲可知，疟原虫pfert基因编码的蛋白第76位发生赖氨酸到苏氨酸的改变，是基因内部碱基对的替换，属于基因突变。 故选A。 9．A、根据图乙结果显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段,说明能够用于特异性扩增目的片段，A正确； B、根据图乙信息可知，F1-R2引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段，B正确； C、根据图乙信息可知，F1-R1能扩增目的1条带，F2-R1无法扩增目的条带，所以F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用，C正确； D、根据图乙显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段，F1-R2引物扩增条带为三条，说明R2引物无法特异性的扩增目的条带，D错误。 故选D。 10． 根据题干信息可知，疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知，在具有氯喹抗性的基因组没有ApoⅠ酶切位点，而敏感性基因组中具有该酶切位点，因此对6份血样处理后进行PCR，产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳出现两条带则为敏感型，只有一条带的为抗性，所以1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是2号和4号。 故选B。 11．（24-25高二下·天津河北·期末）采用基因工程技术培育转基因羊作为乳腺生物反应器，使其能合成人凝血因子且只存在于乳汁中。下列说法正确的是（    ） A．该转基因羊无法将人凝血因子基因传递给后代 B．该转基因羊的所有细胞都含有人凝血因子基因并可以正常表达 C．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别等限制，受体来源更广泛 D．将含有人凝血因子基因的表达载体导入羊乳腺细胞中即可获得乳腺生物反应器 【答案】C 【难度】0.85 【知识点】基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用 【详解】A、转基因羊的生殖细胞若含有人凝血因子基因，则可通过有性生殖传递给后代。通常基因工程中，目的基因会整合到受精卵的基因组中，因此转基因羊能传递该基因，A错误； B、转基因羊的所有细胞均含有人凝血因子基因（因源于受精卵分裂分化），但基因表达具有选择性，仅在乳腺细胞等特定细胞中表达，B错误； C、乳腺生物反应器需雌性个体分泌乳汁，而膀胱生物反应器可从雌雄个体的尿液中收集产物，受体选择不受性别限制，来源更广泛，C正确； D、乳腺细胞是高度分化的体细胞，无法发育为完整个体。需将表达载体导入受精卵，经胚胎发育形成转基因个体，D错误。 故选C。 12．（24-25高二下·天津和平·期末）果蝇的正常眼与无眼受一对等位基因A/a控制。现用正常眼雌、雄果蝇为亲本进行杂交，绘制部分后代系谱图，并对其成员进行基因检测。检测过程：①提取待测个体DNA进行PCR扩增，选用的引物与A和a基因都能结合，且两者的PCR产物片段大小相同；②将PCR产物进行变性再复性的处理；③处理后，用T7El酶（能切开DNA中没有配对碱基的位点）对这些片段进行切割，电泳结果如图所示。不考虑变异，下列说法正确的是（    ） A．控制正常眼与无眼的基因位于常染色体上，正常眼为隐性性状 B．Ⅰ1电泳结果中800bp片段既有A基因也有a基因 C．Ⅰ1和Ⅰ2特有的500bp、300bp片段是a基因扩增后酶切的产物 D．若Ⅱ1与Ⅰ2交配，子代表型为正常眼的果蝇中杂合子占3/5 【答案】B 【难度】0.4 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因在染色体上位置的判定方法问题、遗传系谱图中遗传方式的判定及应用 【分析】1、亲本雌雄果蝇均为正常眼，杂交产生了无眼雌果蝇，说明控制正常眼与无眼的基因位于常染色体上，正常眼为显性性状。 2、电泳图示分析，A基因单链和a基因单链互补形成的双链DNA可以被酶切，A基因和a基因不能被酶切，Ⅰ1和Ⅰ2基因型为Aa，Ⅱ1基因型为AA，Ⅱ2基因型为aa。 【详解】A、亲本雌雄果蝇均为正常眼，杂交产生了无眼雌果蝇，说明控制正常眼与无眼的基因位于常染色体或XY同源段，正常眼为显性性状，A错误； B、根据题干信息可知，A和a基因片段长度相同，且可以和相同引物结合进行PCR扩增，说明A和a的区别是部分碱基序列的不同，Ⅰ1的基因型为Aa，经过变性和复性后，产生的DNA有三种，分别是A单链和a单链结合形成的DNA，A基因，a基因，T7E1酶能切开DNA中没有配对碱基的位点，能对这些片段进行切割，三种DNA中只有A单链和a单链结合形成的DNA会被切割，结合电泳图示可知，可被切割成500bp和300bp两种，而800bp的则是A基因和a基因，B正确； C、A基因的两条单链和a基因的两条单链都是能正常互补配对的，不能被酶切。特有的500bp、300bp片段是A和a基因扩增、变性和复性之后形成的A基因单链和a基因单链结合形成的杂合双链DNA，C错误； D、结合电泳图示可知，Ⅱ1与Ⅰ2基因型分别为AA、Aa，两者交配，子代表型为正常眼的果蝇中杂合子Aa占1/2，D错误。 故选B。 13．（24-25高二下·天津和平·期末）下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传给子代的是（　　） A．将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗 B．将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌 C．将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株 D．将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛 【答案】A 【难度】0.65 【知识点】基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用 【分析】若遗传物质改变发生在生殖细胞或受精卵中，则可能遗传；若发生在体细胞中，通常不会遗传。 【详解】A、腺苷酸脱氨酶基因转入的是患者的淋巴细胞（体细胞），体细胞的基因改变不会通过生殖细胞传递给子代，A正确； B、胰岛素基因导入大肠杆菌的质粒中，质粒作为遗传物质会随细菌分裂传递给后代，B错误； C、植物体细胞导入基因后经组织培养，属于无性繁殖，遗传物质变化会保留在子代植株中，C错误； D、肠乳糖酶基因导入的是受精卵，发育成的个体生殖细胞也含此基因，可遗传给子代，D错误。 故选A。 14．（24-25高二下·天津和平·期末）下列与DNA粗提取和鉴定有关的叙述，错误的是（　　） A．预冷的酒精容易使DNA析出 B．DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液中 C．可用碱性染料甲紫鉴定提取出来的DNA D．整个提取过程中可以不使用离心机 【答案】C 【难度】0.85 【知识点】DNA的粗提取及鉴定 【详解】A、预冷的酒精（体积分数为95%）能降低DNA的溶解度，使DNA快速析出，A正确； B、DNA在2mol/L的NaCl溶液中溶解度较高，能够充分溶解，B正确； C、甲紫是用于染色体染色的碱性染料，而DNA鉴定需用二苯胺试剂在沸水浴中显蓝色，C错误； D、实验中可通过静置沉淀代替离心步骤，因此整个提取过程可不使用离心机，D正确。 故选C。 15．（24-25高二下·天津部分区·期末）温度是影响实验成功的重要条件之一、下列实验操作中，所需温度最低的是（　　） A．用斐林试剂检测梨匀浆中的还原糖 B．用二苯胺试剂鉴定洋葱的DNA粗提取物 C．观察叶绿体和细胞质的流动 D．用PCR仪自动完成延伸步骤 【答案】C 【难度】0.85 【知识点】PCR扩增的原理与过程、DNA的粗提取及鉴定、观察叶绿体、线粒体和细胞质流动实验、检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质 【详解】斐林试剂检测还原糖需水浴加热（50-65℃），在沸水浴条件下生成砖红色沉淀，二苯胺鉴定DNA需沸水浴（100℃）显蓝色，温度较高，观察叶绿体和细胞质流动需保持细胞活性，在常温（如25℃）下进行，无需加热，PCR延伸步骤需72℃（Taq酶最适温度），温度较高，综上分析，C符合题意，ABD不符合题意。 故选C。 16．（24-25高二下·天津部分区·期末）下列关于生物学实验操作或现象的描述，正确的是（　　） A．紫色洋葱鳞片叶内表皮细胞没有颜色，不能用于质壁分离实验 B．“探究pH对酶活性的影响”实验，实验温度属于无关变量，实验过程中无需控制 C．“探究酵母菌细胞的呼吸方式”实验需要设置有氧和无氧两种条件，其中有氧的为实验组，无氧的为对照组 D．利用香蕉进行DNA粗提取与鉴定实验中，香蕉研磨后离心取上清液，加入95%的冷酒精，有利于DNA析出 【答案】D 【难度】0.85 【知识点】DNA的粗提取及鉴定、探究酵母菌细胞呼吸的方式、酶促反应的因素及实验、质壁分离及其复原实验 【分析】1、质壁分离产生的内因：原生质层伸缩性大于细胞壁伸缩性；质壁分离产生的外因：外界溶液浓度＞细胞液浓度。 2、酶的特性：①高效性：酶的催化效率大约是无机催化剂的107～1013倍；②专一性：每一种酶只能催化一种或者一类化学反应；③酶的作用条件较温和：在最适宜的温度和pH条件下，酶的活性最高；温度和pH偏高或偏低，酶的活性都会明显降低。 3、DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、紫色洋葱鳞片叶内表皮细胞虽液泡颜色浅，但具有原生质层和细胞壁，仍能发生质壁分离，可通过染色等方法观察，可以用于质壁分离实验，A错误； B、探究pH对酶活性的影响时，温度作为无关变量需保持一致，否则会影响实验结果，B错误； C、探究酵母菌呼吸方式的实验中，有氧和无氧条件均为实验组，属于对比实验而非单设对照组，C错误； D、DNA不溶于高浓度冷酒精，加入95%冷酒精可使DNA析出，该操作符合DNA粗提取原理，D正确。 故选D。 17．（24-25高二下·天津河北·期末）利用基因工程生产羧酸酯酶（CarE）制剂的流程如下图所示。下列叙述错误的是（    ） A．图中质粒的化学本质是 DNA B．过程①需要进行碱基互补配对 C．过程③需要用 Ca²⁺处理大肠杆菌 D．过程④只需进行 DNA 检测即可确定是否成功获得了工程菌 【答案】D 【难度】0.85 【知识点】目的基因的检测与鉴定、将目的基因导入受体细胞、基因表达载体的构建 【详解】A、质粒是小型环状 DNA 分子，其化学本质是 DNA，A正确； B、过程①是逆转录过程，以 mRNA 为模板合成 cDNA，该过程遵循碱基互补配对原则，B正确； C、过程③将重组质粒导入大肠杆菌时，需要用Ca2+处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，便于吸收重组质粒，C正确； D、过程④要确定是否成功获得工程菌，不仅需要进行 DNA 检测，看目的基因是否导入，还需要进行 mRNA 检测（看目的基因是否转录）和蛋白质检测（看目的基因是否翻译出羧酸酯酶）等，D错误。 故选D。 18．（24-25高二下·天津部分区·期末）与常规栽培技术相比，利用植物细胞培养进行药用次生代谢产物的生产具有显著的优越性，根据不同的需求可以采用不同的技术流程（如图）。相关叙述正确的是（　　） A．培养体系1中的外源基因导入前需用Ca2+处理受体细胞 B．培养体系2中获得的愈伤组织细胞应具有全能性，其细胞形态和结构与外植体细胞相同 C．在将经灭菌处理后的外植体诱导形成愈伤组织期间，一般不需要光照 D．在由外植体诱导形成愈伤组织的过程中，细胞发生了分裂及基因的选择性表达 【答案】D 【难度】0.65 【知识点】将目的基因导入受体细胞、植物组织培养技术综合 【分析】植物组织培养就是在无菌和人工控制的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。 【详解】A、将基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，导入微生物中常用Ca2+处理法，培养体系1中的外源基因导入的是植物细胞，不需要用Ca2+处理受体细胞，A错误； B、细胞全能性是指已经分化的细胞，仍然具有发育成完整个体的潜能，培养体系2中获得的愈伤组织细胞没有形成完整个体，不具有全能性，愈伤组织是由脱分化形成的无定型细胞团，其细胞形态和结构与外植体细胞不同，B错误； C、外植体经消毒后进诱导形成愈伤组织，不是灭菌，C错误； D、在愈伤组织诱导过程中，外植体细胞经历了分裂增殖与基因选择性表达（关闭分化基因、激活脱分化相关基因），从而实现从分化状态向未分化状态的转变，D正确。 故选D。 19．（24-25高二下·天津部分区·期末）免疫PCR是对微量抗原的一种检测方法。下图是利用该技术检测牛乳中微量抗生素的流程图：首先将抗体1固定在微板上，冲洗后加入待检的牛乳，再加入DNA标记的抗体2，进行PCR扩增，最后进行电泳检测。下列相关叙述错误的是（　　） A．PCR扩增获得产物的量与牛乳中抗生素的量成正相关 B．图示过程所需抗体需对高温有较强的耐受性 C．图示过程中三次冲洗的目的均不同 D．图示抗原检测过程发生两次抗原与抗体的结合 【答案】B 【难度】0.65 【知识点】体液免疫、PCR扩增的原理与过程 【分析】免疫PCR是一种抗原检测系统，将一段已知序列的DNA片段标记到抗体2上，通过抗原抗体的特异性识别并结合，抗体2会和固定抗体1、抗生素形成复合物“固定抗体1—抗生素—抗体2”，再用PCR方法将这段DNA进行扩增，通过检测PCR产物的量，即可推知固定抗体1上吸附的抗生素的量。 【详解】A、免疫PCR中，抗生素（抗原）的量与结合的抗体2-DNA复合物量成正比，而抗体2携带的DNA分子可通过PCR指数级扩增，因此，PCR产物量间接反映抗生素的量，二者呈正相关，A正确； B、该免疫PCR检测的原理是将一段已知序列的DNA片段标记到抗体2上，通过抗原抗体的特异性识别并结合，抗体2会与固定抗体1、抗生素形成复合物“固定抗体1—抗生素—抗体2”，再用PCR方法将这段DNA进行扩增，通过检测PCR产物的量（DNA片段的量），即可推知固定抗体1上吸附的抗生素的量，与抗体是否耐高温没有多大关系，因此图示过程所需抗体无需对高温有较强的耐受性，B错误； C、图示过程，第一次冲洗是为了去除未结合的抗体1，第二次冲洗是为了去除未结合的抗生素和牛奶成分，第三次冲洗是为了去除未结合的抗体2，三次冲洗的目的均不同，C正确； D、据图可知，图示抗原检测过程分别与抗体1和抗体2结合了一次，共发生两次抗原与抗体的结合，D正确。 故选B。 20．（24-25高二下·天津和平·期末）最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧腺苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧核苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．上述PCR反应体系中加入的物质均相同 B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C．5′—CTACCCGTGAT—3′为对照个体的一段序列 D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 【答案】C 【难度】0.65 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因突变 【分析】1、PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。（2）原理：DNA复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 2、双脱氧测序法的原理：在DNA聚合酶、引物、四种单脱氧核苷酸（dNTP）存在的情况下，如果在四管反应系统中再分别加入四种双脱氧核苷三磷酸（ ddNTP），DNA链合成反应过程中 ddNTP与dNTP处于一种竞争状态，即新合成DNA链既可能掺入正常dNTP，也可能掺入ddNTP并使新合成链终止延伸。这样在每个反应系统中形成的产物是一系列长度不等的多核苷酸片段，这些片段具有相同的起点，即引物的5'端，但有不同的ddNTP终端。 在结束反应后，用四个泳道进行电泳，分别分离各组反应体系中不同长度的DNA 片段，检测DNA片段终止末端位置的碱基种类，从自显影图谱中直接读取到与模板相匹配的新的链序。 【详解】A、双脱氧测序法的PCR反应体系中，模板是单链DNA，只需加入一种引物即可启动链延伸。但题目描述中提到“分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP）”，说明反应体系需分别设置四组（每组加入一种ddNTP），而非同一体系中同时加入四种ddNTP。因此，选项A中“加入的物质均相同”的表述错误，因为四组反应的ddNTP种类不同，A错误； B、电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢，B错误； C、依据分析中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA片段）的3'终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带（DNA片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3'，患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3'，C正确； D、对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D错误。 故选C。 21．（24-25高二下·天津部分区·期末）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术, Cas9基因表达的Cas9 蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA 双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示，下列分析错误的是（　　） A．构建重组质粒时，SgRNA 编码序列需要插入到质粒的启动子的下游 B．SgRNA 和Cas9 蛋白形成复合体后,其功能类似限制酶 C．根据目标DNA 设计相应的SgRNA，可实现对目标 DNA的定点切割 D．CRISPR/Cas9识别目标 DNA 序列主要与Cas9蛋白的特异性相关 【答案】D 【难度】0.4 【知识点】基因表达载体的构建 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、启动子是一段有特殊结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质，构建重组质粒时，SgRNA编码序列需要插入到质粒的启动子下游，便于转录产生SgRNA，A正确； B、SgRNA和Cas9蛋白形成复合体后，可切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因，其功能类似于限制酶，B正确； C、SgRNA可以特异性切割DNA位点，根据目标DNA设计相应的SgRNA，可实现对目标DNA的定点切割，C正确； D、CRISPR/Cas9识别目标DNA序列主要与SgRNA编码序列有关，D错误。 故选D。 二、非选择题 1．（24-25高二下·天津河西·期末）我国科研人员从某植物中提取了一种抗冻基因AtC，利用基因工程技术获得转基因抗冻的番茄新品种，操作流程如图。Tetr表示四环素抗性基因，EcoRⅠ、BamHⅠ表示不同的限制酶，对应箭头指向位置为相应限制酶的切割位点（不考虑其他未知的酶切位点）。请回答下列问题： (1)过程①利用PCR技术扩增AtC基因时，需要添加______酶；为确保AtC基因准确插入农杆菌质粒中，需在引物的______（填“5′”或“3′”）端添加______（填“EcoRⅠ”、“BamHⅠ”或“EcoRⅠ、BamHⅠ”）酶的识别序列。 (2)基因表达载体中启动子的基本组成单位是______，启动子的作用是______。 (3)过程③中需要先用______处理农杆菌，使其处于______的生理状态，以便基因表达载体导入农杆菌。 (4)利用愈伤组织作为受体细胞的原因是______。在分子水平上，可利用______技术检测AtC基因是否整合到愈伤组织细胞中，再经过基因表达的检测，筛选出能合成抗冻蛋白的番茄愈伤组织细胞，再通过______技术；培育转基因番茄植株，再进行个体生物学水平的鉴定。 【答案】(1) 耐高温的DNA聚合 5′ EcoRⅠ、BamHⅠ (2) 脱氧核苷酸 RNA聚合酶识别和结合的部位，启动基因转录出mRNA (3) Ca2+ 一种能吸收环境中DNA分子 (4) 愈伤组织分化程度低，容易实现全能性 PCR 植物组织培养 【难度】0.65 【知识点】植物组织培养技术综合、将目的基因导入受体细胞、基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【分析】1、基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定四个步骤； 2、PCR技术的基本原理：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物；基本步骤：变性→退火→延伸； 3、植物组织培养的过程：离体的植物器官、组织或细胞（外植体）（→脱分化）→愈伤组织→（再分化）→形成根、芽→植物体；原理：植物细胞的全能性。 【详解】（1）PCR过程需要的酶是耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶），为确保AtC基因准确插入农杆菌质粒中，需进行双酶切，因此应在目的基因的两端插入与质粒相同的限制酶识别序列，即在引物的5'端添加上EcoRⅠ、BamHⅠ的识别序列 （2）启动子位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，启动基因转录出mRNA，其基本组成单位是脱氧核苷酸。 （3）过程③将AtC基因导入农杆菌，一般用Ca2+处理农杆菌，使之处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 （4）愈伤组织分化程度低，全能性易表达，故培育转基因植株时，愈伤组织可作为受体细胞。为检测目的基因是否导入农杆菌，可以用PCR技术检测。筛选出能合成抗冻蛋白的番茄愈伤组织细胞，可通过植物组织培养技术；培育转基因番茄植株，再进行个体生物学水平的鉴定。 2．（24-25高二下·天津红桥·期末）研究人员利用基因工程技术将油料作物紫苏DGAT1基因导入四尾栅藻，获得转基因的产油微藻，利用地热水培养不仅能生产生物柴油，还能治理地热水。操作过程如下图，请回答下列问题：    (1)将质粒pMD19-DGAT1导入大肠杆前通常先用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于一种__________的生理状态。 (2)为了便于筛选含pMD19 - DGAT1重组质粒的大肠杆菌，该选择培养基中应添加__________物质。在培养基中挑取__________颜色的大肠杆菌菌落可提取该质粒并获取目的基因。 (3)启动子往往具有物种特异性，在载体pBI121质粒中插入紫苏DGAT1基因，其上游启动子应选择__________（填字母）。 A．紫苏DGAT1基因启动子 B．四尾栅藻启动子 C．大肠杆菌启动子 (4)为了判断DGAT1基因是否导入四尾栅藻细胞，可利用__________（中文全称）等技术进行检测。 【答案】(1)能吸收周围环境中DNA分子 (2) 卡那霉素和X-gal 白色 (3)B (4)聚合酶链式反应 【难度】0.65 【知识点】目的基因的检测与鉴定、将目的基因导入受体细胞、基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的筛选与获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于重组DNA分子的筛选。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR技术；②检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）将质粒pMD19-DGAT1导入大肠杆前通常先用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 （2）分析题图可知，目的基因插入到LacZ基因中，使该基因被破坏，又由题中信息可知：“LacZ基因编码产生的酶可以分解物质X-gal，从而使菌落显现出蓝色。若无该基因或该基因被破坏，则菌落成白色”。且由于质粒中含有卡那霉素抗性基因，故应接种到添加卡那霉素和X-gal的培养基上培养。则导入没有连接目的基因的质粒（或空质粒；或pMD19质粒）由于含有完整的LacZ基因，可形成酶分解物质X-gal，从而使菌落显现出蓝色，因此大肠杆菌菌落成蓝色，导入重组质粒（或pMD19-DGAT1 质粒）的大肠杆菌由于LacZ基因被破坏，不能形成酶分解物质X-gal，因此菌落成白色。因此在培养基中挑取白色的大肠杆菌菌落可提取该质粒并获取目的基因。 （3）要达到让紫苏DGAT1基因在四尾栅藻细胞中表达的目的，应该添加四尾栅藻启动子。故选B。 （4）为了判断DGAT1基因是否导入四尾栅藻细胞，可利用PCR技术进行检测，PCR的中文名称是聚合酶链式反应。 3．（24-25高二下·天津红桥·期末）下图是A基因部分片段和载体的部分结构。科研人员欲将A基因的启动子连接在图中载体中，进而使载体上的荧光蛋白基因得到表达。图中标记了A基因部分片段和载体部分结构中限制酶酶切位点及各种限制酶识别序列及切割位点，回答下列问题： (1)图中R、F表示扩增启动子所用的__________。 (2)已知A基因的启动子两端没有限制酶识别序列，因此在F和R的__________（填“3'”或“5'”）端分别连接限制酶的识别序列。分析两种片段中的限制酶酶切位点、相应识别序列及两段基因的转录方向，F和R依次应添加__________、__________限制酶识别序列。 (3)为完成科研人员的设想，除需使用F和R处添加的序列所对应的酶外，扩增启动子和构建基因表达载体的过程还需用到的酶有__________。 【答案】(1)引物 (2) 5’ Sal I EcoR I (3)Mun I、XhoI、Taq DNA聚合酶（耐高温的DNA聚合酶）、DNA连接酶 【难度】0.4 【知识点】基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的筛选与获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于重组DNA分子的筛选。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR技术；②检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）图中R、F表示扩增启动子所用的引物，引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。 （2）已知A基因的启动子两端没有限制酶识别序列，因此在F和R的5'端分别连接限制酶的识别序列。为了不破坏启动子，不能使用Mun I、XhoI限制酶，为了不破坏载体上的终止子，不能使用NheI限制酶，结合两段基因的转录方向，防止目的基因反向连接，F和R依次应添加Sal I、EcoRI酶的识别序列。 （3）为完成科研人员的设想，除需使用F与R处添加的序列所对应的酶外，扩增启动子和构建基因表达载体的过程还需用到的酶有：Mun I和XhoI用于切割载体，Taq DNA聚合酶（耐高温的DNA聚合酶）进行PCR扩增，DNA连接酶用于连接目的基因和载体。 4．（24-25高二下·天津部分区·期末）我国科学家尝试构建地衣芽孢杆菌基因编辑系统，并通过将外源vgb基因定向插入19T-pfIB 质粒中对该系统进行初步验证，主要过程如图1.请回答下列问题。    (1)步骤①利用已构建的质粒19T-pflB，通过反向 PCR获得左右同源片段，除图中已有的组分外，还应添加缓冲液（Mg2+）和___________（答两点）等。下表为pflB部分基因序列和 设计的相关引物，可选用的引物是___________（填编号）。 DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列） pflB基因 5'-TCGCACACCTGACTACAATT……TCGCAATGGCAATCGGCAAACT-3' 3'-AGCGTGTGGACTGATGTTAA……AGCGTTACCGTTAGCCGTTTGA-5' PCR引物 ① 5'ACGGGATCCTTGTAGTCAGGTGTGCGA3' ② 5'ACGGGATCCTTTGCCGATTGCCATTGC3' ③ 5'AACTGCAGTCGCACACCTGACTACAA3' ④ 5'AACTGCAGGCAATGGCAATCGGCAAA3' 注：下划线标注为BamHI识别序列5'-G↓GATCC-3'和PstI识别序列 5'-CTGCA↓G-3' (2)步骤②双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是_________和________，影响DNA连接酶反应速率的因素有反应体系的温度、pH、酶浓度和___________（答出两点）等。 (3)图2是质粒PNZTK-PFTF-vgb转入地衣芽孢杆菌后，将目的基因插入基因组的过程示意图。    将受体菌接种在含四环素和___________（含/不含）卡那霉素培养基中培养一段时间后，因没有选择压力，会导致发生双交换的质粒丢失。挑取一定数量的单菌落，接种到含四环素的培养基上，并一一对应接种到含卡那霉素的培养基上，实验结果如图3所示。其中在两种培养基均能生长的菌株是只发生单交换或___________的受体菌。 (4)科学家通过分析vgb基因在重组菌株及原始菌株中的表达水平验证该基因编辑系统。分析时需要以rpsE基因（核糖体S5蛋白基因）为参照，该基因表达的特点是___________，可采用___________的方法检测基因表达的产物量。 【答案】(1) 四种脱氧核苷酸、TaqDNA聚合酶 ①④ (2) SmaI Xhol DNA片段浓度、DNA片段末端类型 (3) 不含 未发生交换 (4) 在细胞中的表达水平相对恒定 琼脂糖凝胶电泳 【难度】0.65 【知识点】目的基因的检测与鉴定、基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成（2）基因表达载体的构建：是基 因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因启动子、终止子和标记基因等（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）PCR反应除了图中已有的组分外，还需要添加TaqDNA聚合酶（用于催化DNA的合成）、四种脱氧核苷酸（dNTP）。PCR扩增时，引物需要与模板链进行碱基互补配对，且引物的延伸方向是5’到3’，分析pflB基因序列和各引物序列，①中5端含有BamHI识别序列（GGATCC），且其碱基序列能与pflB基因的一条链互补配对；④中5端含有PstI识别序列（CTGCAG），且其碱基序列能与pflB基因的另一条链互补配对，所以可选用的引物是①④。不同的引物，其碱基组成和长度可能不同，引物的Tm值（解链温度）就不同，所以需要根据不同的引物重新设置PCR程序中的退火温度。 （2）观察图可知，要将外源vgb基因定向插入19T-pfIB质粒中，构建重组质粒，需要用与切割含目的基因的DNA片段相同的限制酶切割质粒，由步骤①可知，pflB片段两端具有Smal和Xhol的酶切位点，步骤②双酶切时，是要将Kan插入到pflB片段的外侧，需使用的限制酶a和限制酶b分别是Smal和Xhol。影响DNA连接酶反应速率的因素有反应体系的温度、pH、酶浓度和底物浓度，DNA片段末端类型（DNA片段的浓度，因为DNA连接酶催化的是DNA片段之间的连接反应，底物浓度会影响反应速率）等，所以②处应填底物浓度、DNA片段末端类型。 （3）因为要让发生双交换的质粒丢失，而双交换后的重组菌含有四环素抗性但不含卡那霉素抗性（发生双交换后卡那霉素抗性基因随质粒丢失），所以受体菌应接种在含四环素和不含卡那霉素培养基中培养。只发生单交换会使受体菌含有四环素抗性和卡那霉素抗性，另外未发生交换的受体菌本身就对四环素和卡那霉素有抗性（从质粒和原始受体菌的抗性情况分析），所以在两种培养基均能生长的菌株是只发生单交换或未发生交换的受体菌。 （4）psE基因是核糖体S5蛋白基因，核糖体是细胞进行蛋白质合成的场所，在细胞中的表达相对稳定，即该基因表达的特点是在细胞中的表达水平相对恒定。检测基因表达的产物（蛋白质）量可采用琼脂糖凝胶电泳的方法，琼脂糖凝胶电泳通过分子大小分离和可视化标记，将基因表达产物的量转化为可检测的条带信号，是基因表达分析中简单、直观的方法。 5．（24-25高二下·天津西青·期末）葡聚糖和木聚糖等物质具有一定的粘度，添加在某些饮品中会影响口感或堵塞过滤装置。某实验室科研工作者采用构建共表达GluZ（葡聚糖酶基因）和XylB（木聚糖酶基因）两种融合基因的工程酵母，降低酿造饮品中的葡聚糖和木聚糖等物质含量以降低粘度。图1中PGK是酵母菌的特异性启动子，ADH为终止子，KanMX是遗传霉素抗性基因。GluZ和XylB两种融合基因的结构如图2所示，MFα是酵母菌特有的信号肽基因（信号肽可以引导分泌型蛋白的表达）。请回答下列问题。 (1)PCR扩增序列时，需设计相应的引物，引物的本质是__________，需要的原料是__________。 (2)结合图1和图2，应选择限制酶__________对质粒进行切割。为使MFα与GluZ（或XylB）连接形成融合基因，引物R1与引物F2（或引物）F3的5'端引入的限制酶种类的要求是__________。 (3)科研人员将两种融合基因分别重组至质粒YE得到重组质粒G和X，并对处于特殊状态的酵母菌进行转化。为检测转化是否成功，可在培养基中加入遗传霉素，其作用是__________，在获得的酵母菌单菌落中选取6个单菌落分别制成菌悬液，标号为1~6，然后分别加入含木聚糖或葡聚糖的刚果红平板的圆孔中，观察透明圈的产生情况，结果如图3所示，其中同时含有质粒G和质粒X的菌悬液是__________（用序号表示）。 注：木聚糖和葡聚糖都能与刚果红结合形成红色复合物，若木聚糖和葡聚糖被分解，培养基中就会出现以圆孔为中心的透明圈。 【答案】(1) 短单链核酸 脱氧核苷酸 (2) Nde I、Kpn I 同种限制酶或能产生相同末端的限制酶 (3) 对转入重组质粒的酵母菌进行初步筛选 5 【难度】0.65 【知识点】目的基因的检测与鉴定、基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的筛选与获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于重组DNA分子的筛选。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR技术；②检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，PCR选用的引物一般是单链DNA，设计引物需要的原料是4种脱氧核苷酸。 （2）为了保证插入的目的基因可以正常表达，目的基因应该插入启动子和终止子之间，应选择NdeⅠ和KpnⅠ切割质粒。为了使质粒和目的基因能够正向连接，需要使用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶对质粒和目的基因进行切割，因此引物5'端引入的限制酶种类应符合上述要求。 （3）标记基因可以用于对转入重组DNA的酵母菌进行初步筛选。同时含有质粒G和质粒X的菌悬液，应该同时具备降解木聚糖和葡聚糖的能力，由图3可知，5号为同时含有质粒G和质粒X的菌悬液，因为5号菌悬液在木聚糖刚果红平板和葡聚糖刚果红平板上均出现了透明圈，表明其既能分解木聚糖又能分解葡聚糖。 6．（24-25高二下·天津河北·期末）基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统（切—浸—生芽（Cut-Dip-Budding,简称 CDB法）。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。 回答下列问题。 (1)图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于________；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和__________，该过程还需要光照，其作用是__________。 (2)图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的_。图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注________。 (3)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是_________。 (4)已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS 基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B。据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是________________，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是___________，依据是_________。 【答案】(1) 脱分化 细胞分裂素 诱导叶绿素的形成；满足叶绿体利用光能制造有机物的需要 (2) 遗传特性 转基因标识 (3)Ti 质粒中的T-DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起 (4) 荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根 观察幼苗是否表现出白化特征 PDS缺失会导致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除 【难度】0.65 【知识点】将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定、植物组织培养技术综合 【分析】植物组织培养是指将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术，其原理为植物细胞的全能性。植物组织培养中细胞表现出全能性的条件为：离体、严格的无菌条件、适宜的培养条件及适宜浓度和比例的激素。 【详解】（1）已经分化的细胞转变为未分化的细胞，进而形成不定形的薄壁组织团块(这称为愈伤组织)的过程叫做脱分化。从愈伤组织到幼苗的培养过程叫作再分化，该过程中生长素和细胞分裂素起关键作用，此外，为了诱导叶绿素的形成；满足叶绿体利用光能制造有机物的需要，再分化过程还需要光照。 （2）图1中共培养环节实质是利用农杆菌转化法将目的基因导入愈伤组织细胞，可改变愈伤组织细胞中的遗传物质，若不经过共培养环节，则愈伤组织细胞中无外源基因，其遗传物质与植株A几乎相同，则直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的遗传特性；图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，则该种子细胞中含有目的基因，属于转基因种子，其包装需标注转基因种子，即进行转基因标识。 （3）图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞属于利用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，利用了农杆菌含有的Ti质粒的作用，Ti质粒中的T-DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起。 （4）根据题意，导入植株B的重组载体中含有绿色荧光蛋白标记基因，若将重组载体成功导入受体细胞并成功表达，则获得的阳性毛状跟段应具有绿色荧光标记，因此该过程中通过荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根即为阳性毛状根段；导入植株B的目的基因为具有敲除PDS基因功能的基因编辑载体，因此导入幼苗中的基因编辑载体若成功发挥作用，则会敲除细胞中的PDS基因，根据题意，该基因指导合成的PDS酶确实会导致植株白化，因此鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是观察幼苗是否表现出白化特征。 7．（24-25高二下·天津和平·期末）为使甘蓝具有抗除草剂能力，科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入甘蓝植株，获得抗草甘膦转基因甘蓝。 (1)基因工程中最核心的步骤是①_____。步骤②用Ca²⁺处理农杆菌后获得感受态细胞，以便将重组质粒导入。步骤③将农杆菌与甘蓝愈伤组织共培养后，在步骤④的培养基中添加_____以便筛选出含目的基因的甘蓝植株。 (2)草甘膦抗性基因一条链的两端序列如下，采用PCR技术获取和扩增草甘膦抗性基因，应选用的引物组合为_____。 A．5'-CTTGGATGAT-3'和5'-TCTGTTGAAT-3' B．5'-CTTGGATGAT-3'和5'-TAAGTTGTCT-3' C．5'-ATTCAACAGA-3'和5'-ATCATCCAAG-3' D．5'-ATTCAACAGA-3'和5'-GAACCTACTA-3′ (3)若目的基因用BamHl和BglⅡ剪切，质粒用BamHI剪切，酶切后的目的基因存在正向与反向两种连接方式。可用BamHI和EcoRI酶对两种重组质粒进行剪切，正向连接的重组质粒会被切去_____kb长度的片段，反向连接的重组质粒会被切去_____kb长度的片段。通过凝胶电泳分析产物大小进行区分，如下图所示，图中_____（样品1/样品2）为所需基因表达载体。 限制酶 识别序列和切割位点 BamHI —G'GATCC— BglII —A'GATCT— EcoRI —G'AATTC— 【答案】(1) 基因表达载体的构建 潮霉素/除草剂 (2)A (3) 45 20 样品2 【难度】0.65 【知识点】电泳鉴定、目的基因的检测与鉴定、基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定，基因表达载体的构建是核心步骤。 【详解】（1）基因工程中最核心的步骤是基因表达载体的构建，对应图1中的①过程。T-DNA（转移 DNA）是 Ti 质粒上的一段 DNA，能够整合到受体细胞的染色体DNA上。而潮霉素抗性基因在 T-DNA 片段中，所以在步骤④的培养基中添加潮霉素，含目的基因（因为目的基因随 T-DNA 整合到受体细胞染色体 DNA 上，同时潮霉素抗性基因也整合进去了）的甘蓝植株就具有潮霉素抗性，能在含潮霉素的培养基上生长，从而可以筛选出含目的基因的甘蓝植株。 （2）图l所示碱基序列磷酸端为5′端，羟基端为3′端，在进行PCR操作时，引物应分别基因两条链的3′端根据碱基互补配对原则结合，根据图中两端序列，通常选择5′-CTTGGATGAT-3′（上面链的引物）和5′-TCTGTTGAAT-3′（下面链的引物）作为引物对，A正确、BCD错误。 故选A。 （3）据图表可知，BamHI酶切割得到的黏性末端为-GATC，Bg1II酶切割得到的黏性末端为-GATC，其黏性末端相同，故剪切后的目的基因能与质粒连接在一起；重组质粒形成后，在重组质粒上，不再有Bg1II酶的识别位点，质粒上的切割位点会有EcoRI酶和BamHI酶，目的基因的编码顺序是从BamHI酶到Bg1II酶，用EcoRI酶和BamHI酶会将正向连接的目的基因片段剪切去除；正向连接的重组质粒会被切去20+25=45kb长度的片段，反向连接的重组质粒会被切去20kb长度的片段。通过琼脂糖凝胶电泳技术分析产物大小进行区分，电泳凝胶中，DNA分子量越大，在凝胶中收到的阻力越大，迁移距离越短，正向连接的重组质粒被切割后两个片段的大小为180kb和45kb，反向连接的重组质粒被切割后两个片段的大小为205kb和20kb，说明样品2是所需的基因表达载体。 8．（24-25高二下·天津和平·期末）磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程如图。 (1)无缝连接时，过程①中使用T5核酸外切酶目的是______。过程③所需的酶有______。 (2)PCR技术分别扩增PABD和GFP基因时，配制的两个反应体系中不同的有______。引物R1的设计需依据______的核苷酸序列。据图分析引物F1和R2分别为______（填序号）。 A．5′-TCCGGACTCAGATAGC-3′ B．5′-AGGCCTGAGTCTATCGTTATGTCCGGACTCAGATAGC-3′ C．5′-GCTATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCGTCTCA-3′ D．5′-TCCGGACTCAGATAGCTATCGATGCGCAGCTGACGA-3′ (3)经无缝连接得到重组DNA后，利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子（T1）进行表面消毒，均匀铺在含有______的MS培养基上进行筛选。T1代阳性植株自交，按单株收种并播种后获得的T2代中抗性幼苗占比为______，说明T1可能为单个位点插入的转基因株系。通过观测转基因拟南芥根尖细胞中______，了解PA的动态变化。 【答案】(1) 沿5'→3'的方向水解DNA形成黏性末端 DNA 聚合酶和DNA连接酶 (2) 模板和引物 PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列 A、C (3) 草胺膦 3/4 绿色荧光点的分布 【难度】0.65 【知识点】目的基因的检测与鉴定、基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程、基因分离定律的实质和应用 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）结合图示可知，过程①使用T5核酸外切酶目的是沿5'→3'的方向水解DNA形成黏性末端。过程③缺口处DNA链的补齐，可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA 聚合酶（DNA聚合酶将脱氧核苷酸加到子链3′-OH末端）和DNA连接酶（将两个DNA片段进行连接）。 （2）PCP扩增需要模板、原料、引物和TaqDNA聚合酶，扩增PABD和GFP这两种不同的基因，分别需要两种基因的单链DNA作为模板，即所需的模板不同，引物是根据目的基因复制起始端序列人工合成的，不同种类的基因所需的引物不同，综上分析，配制的两个反应体系中不同的有模板和引物。用于PCR扩增的引物是根据一段已知目的基因（PABD基因）的核苷酸序列来设计的，由图可知，PABD基因（目的基因）需要用载体进行连接，因此PCR扩增PABD基因时需依据PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列设计引物R1。由重组DNA图可知，GFP基因和PABD基因进行连接，PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，而设计引物F1仅需根据PABD基因一端的核苷酸序列，因此引物F1的碱基序列比引物R2的碱基序列短，因此扩增目的片段的引物F1对应于下表中的A。PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，即引物R2的一部分能与引物F1进行碱基互补配对，综上所述，R2对应于下表中的C。 （3）由图可知，bar（草胺膦抗性基因）为标记基因，位于T-DNA上，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子（T1）进行表面消毒，均匀铺在含有草胺膦的MS培养基上进行筛选和鉴定。若T1为单位点插入的转基因株系，假设抗性基因用A表示，非抗性为a，则T1的基因型为Aa，T1代自交获得的T2代幼苗的基因型及比例为A_:aa= 3：1，因此抗草胺膦：不抗草胺膦= 3：1，即T2代中抗性幼苗占比为3/4。由题意“将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量”可知，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色荧光点的分布，了解PA的动态变化。 9．（24-25高二下·天津和平·期末）帝王蝶是世界上唯一能长距离迁徙的蝴蝶，其幼虫只摄食一种叫乳草的植物，乳草会分泌一种名为强心甾的毒素，有资料研究显示，过量摄入强心甾对除帝王蝶幼虫以外其他的动物来说都是有毒的，会导致死亡。 (1)钠钾泵在许多动物细胞膜上均有存在，它能为主动转运供能并控制细胞内外的钠、钾离子浓度，因此从膜蛋白功能的角度看，钠钾泵还具有______的活性。强心甾能与细胞膜表面的钠钾泵结合，抑制其主动转运功能，从而导致细胞内外______失衡，使细胞破裂。 (2)科学家猜测：帝王蝶的钠钾泵基因可能发生了突变，使其获得了对强心甾的抗性。为研究帝王蝶钠钾泵基因的碱基排列顺序并获得相应的蛋白产物，科学家尝试从帝王蝶基因组中获取该基因，并通过______实现了对其的扩增；科学家选用合适的______、DNA连接酶和载体构建重组DNA分子，并将其导入大肠杆菌以获得大量的目的基因，再将其导入______中（A．农杆菌B．酵母细胞C．昆虫细胞D．海拉细胞）获得相应的蛋白产物。 (3)为提高重组DNA分子导入的成功率，除了需要确保重组DNA分子有足够的物质的量外，还必须采用______方法提高大肠杆菌接受外源DNA的能力。为了筛选成功导入重组DNA分子的大肠杆菌，宜用______法将转化混合物转移至选择培养基上。通过基因测序，发现帝王蝶钠钾泵基因中的突变会导致其蛋白产物中有3处氨基酸种类与其他昆虫不同，分别是第111、119和122位氨基酸。 (4)为了从受体细胞中分离目的基因的蛋白产物（目的蛋白），科学家在目的蛋白的肽链末端添加一个含有6-10个组氨酸的“标签”，然后，可以提取受体细胞______（填细胞结构）中的全部蛋白质，并通过识别“标签”获得纯度较高的目的蛋白。通过对目的蛋白的研究发现：上述3个位点的突变使得帝王蝶钠钾泵的______发生了改变，强心甾无法与其结合，由此验证了之前的猜测。 【答案】(1) ATP水解酶 渗透压/Na+、K+离子浓度差 (2) PCR 限制性核酸内切酶 C (3) CaCl2处理 稀释涂布 (4) 细胞膜 空间结构/结构 【难度】0.65 【知识点】目的基因的检测与鉴定、将目的基因导入受体细胞、基因表达载体的构建、蛋白质的结构及多样性 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）钠钾泵能够转运钠离子和钾离子是主动运输需要消耗能量，所以其能够将ATP水解为主动运输供能，其具有ATP水解酶的活性，转运钠离子和钾离子可以维持细胞内外离子平衡，而强心甾能与细胞膜表面的纳钾泵结合，抑制其主动转运功能，从而导致细胞内外渗透压/Na+、K+离子浓度差失衡。 （2）对目的基因的扩增常采用PCR技术，重组DNA分子的构建需要合适的限制性核酸内切酶、DNA连接酶和载体。 由于该目的基因是从帝王蝶的基因组中获得的，而帝王蝶属于昆虫类生物，所以在获得大量的目的基因后，需要将其导入昆虫细胞中使其基因表达，获得相应的蛋白产物，故选C。 （3）在确保重组DNA分子有足够的物质的量外，还必须采用各种方法提高大肠杆菌的细胞壁通透性，如采用CaCl2处理等各种方法使大肠杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，，以提高大肠杆菌接受外源DNA的能力。 为了筛选成功导入重组DNA分子的大肠杆菌，宜用稀释涂布法将转化混合物转移至选择培养基上，通过标记情况筛选出含有重组DNA的大肠杆菌。 （4）受体蛋白主要分布在细胞膜上，所以可以提取受体细胞的细胞膜中全部的蛋白质，通过识别“标签”获得纯度较高的目的蛋白。基因中3个位点的突变可能使钠钾泵的空间结构发生改变。 10．（24-25高二下·天津滨海新区·期末）乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需的关键条件。 (1)乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为______。 (2)获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下： ①利用PCR技术扩增乳酸脱氢酶基因，应选择的一对引物是______。若以乳酸脱氢酶基因甲链为转录的模板链，为构建基因的表达载体，应在与甲链结合的引物的5'端加入______（填“XbaⅠ”或“BamHⅠ”）的识别序列。 ②将上述PCR产物和质粒重组需要切割和连接______键。构建的重组质粒导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列______（能/不能）在大肠杆菌中高效表达。 ③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在______的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。 (3)以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一步提高其乳酸产量，下列措施中不合理的是______（单选）。 A．进一步优化发酵条件 B．使用乳酸菌LDH基因自身的启动子 C．敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因 D．对转基因酿酒酵母进行诱变育种 【答案】(1)细胞质基质 (2) 引物2和引物3 BamH Ⅰ 磷酸二酯键 不能 缺失尿嘧啶 (3)B 【难度】0.65 【知识点】基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用、目的基因的检测与鉴定、PCR扩增的原理与过程、无氧呼吸过程 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）酵母细胞厌氧发酵即无氧呼吸的场所为细胞质基质。 （2） ①模板连上-OH为3'端，磷酸端为5'端，PCR时子链沿着模板链的3'→5'端进行延伸，因此所选的引物是引物2和引物3。转录时RNA聚合酶沿着模板链的3'→5'端进行延伸，若以乳酸脱氢酶基因甲链为转录的模板链，则转录方向为从右向左，甲链结合的引物2距离启动子较近，其5'端需加入BamH Ⅰ限制酶识别序列。 ②将上述PCR产物和质粒重组需要切割和连接磷酸二酯键。由于启动子存在物种特异性，重组质粒上带有真核酿酒酵母基因的启动子，故重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列在大肠杆菌中不能高效表达。 ③在缺乏尿嘧啶的选择培养基上，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存，导入重组质粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因而可以正常生存，从而起到筛选作用。 （3） A、进一步优化发酵条件，使其更有利于乳酸菌的繁殖，可以提高其乳酸产量，A正确； B、由于启动子存在物种特异性，使用乳酸菌LDH基因自身的启动子，在酵母细胞中不表达，B错误； C、敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因，使酵母菌不能酿酒，从而提高乳酸产量，C正确； D、对转基因酿酒酵母进行诱变育种，可能会出现乳酸菌的高产菌株，D正确。 故选B。 11．（24-25高二下·天津河北·期末）双乙酰是一种啤酒发酵过程中的产物，它的浓度过高会影响啤酒的风味和口感。研究发现给啤酒酵母导入Y基因后会减少啤酒酵母双乙酰的生成，进而缩短啤酒的发酵周期，改善啤酒的风味和口感。图1表示Y基因所在的DNA 上的限制酶识别位点，箭头表示Y基因的转录方向。图2表示构建表达载体时所用到的质粒。请回答下列问题： (1)利用PCR扩增Y基因时，需要设计引物，引物是一小段能与能与_______的短单链核酸。设计的引物序列不能过短，原因是____。利用PCR技术扩增Y基因时，假如加入模板为m个，循环5次共需要消耗________对引物。 (2)结合图1和图2，构建表达载体时应选择的限制酶组合是HindⅢ和KpnI，其组合酶中不选择EcoRI酶原因是______。 (3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，所以质粒上的尿嘧啶合成基因作用是_______。在缺乏尿嘧啶的培养基上生长的酵母菌不一定是含有Y基因的酵母菌原因是_____ 。 【答案】(1) DNA母链的一段碱基序列互补配对 引物较短，特异性不强从而扩增出非目的基因片段或者扩增效率降低 31m (2)若用该酶切割会导致目的基因与质粒反向连接，同时也会破坏质粒结构 (3) 用于重组质粒的筛选 因为导入含有目的基因的重组质粒或空质粒的酵母菌均具有尿嘧啶合成基因，都能在该培养基上存活 【难度】0.65 【知识点】目的基因的检测与鉴定、基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【分析】基因工程的基本操作程序包括四个步骤：目的基因的获得、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。其中需要用的基本工具有限制性内切核酸酶（简称限制酶）、DNA连接酶和运载体。限制酶能够识别DNA上特定的碱基序列，将DNA从特定的位置切开，用同种的限制酶处理目的DNA和运载体，得到相同的末端，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接起来，形成重组运载体。 【详解】（1） PCR扩增时，引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。但设计的引物不能过短，因为若引物过短，会造成特异性不强，从而导致扩增出非目的基因片段或者扩增效率降低等问题。利用PCR技术扩增Y基因时，假如加入模板为m个，循环5次共需要消耗（25-1）m对引物，即31m对引物。 （2）据图，在质粒中EcoRI酶的识别序列在HindII识别序列的左侧，若用该酶切割，会导致目的基因反向连接，且EcoRI酶在质粒中有两个识别序列，若使用EcoRI酶切割，会将环状质粒切割成两个链状DNA片段，且可用的启动子和终止子分别位于两个DNA片段上，破坏了质粒结构。 （3） 酵母菌不能合成尿嘧啶，质粒上的尿嘧啶合成基因作用主要是用于重组质粒的筛选。因为导入含有目的基因的重组质粒或空质粒的酵母菌均具有尿嘧啶合成基因，都能在该培养基上存活，所以在缺乏尿嘧啶的培养基上生长的酵母菌不一定是含有Y基因的酵母菌。 12．（24-25高二下·天津部分区·期末）低温是限制农作物产量的重要胁迫因子。科学家将寒带植物中的抗寒基因CBFs转移到拟南芥中构建拟南芥耐寒模型，用于植物低温胁迫机制的相关研究。回答下列问题： 限制酶 识别序列 EcoRI BamHI SphⅠ Sau3A XmaI AscI MunⅠ (1)PCR扩增目的基因：如图所示应选择引物________对CBFs基因进行扩增，为了后续能将目的基因定向连接到载体上，应在CBFs基因上游引物的________端添加______（“SphⅠ”或”Sau3A”或“MunⅠ”）识别序列，PCR时除模板DNA和引物外还需向PCR仪中加入________。 (2)基因工程的核心步骤是_______，图中终止子中有一段核苷酸序列为“5'-ATCTCGAGCGGG—3'”，则对该序列进行剪切的XhoI（酶切后产生黏性末端）识别的核苷酸序列（6个核苷酸）最可能为5'________3'。 (3)将拟南芥叶片浸泡在转基因农杆菌菌液中一段时间对其进行转化，然后提取叶片中的DNA，通过PCR对CBFs基因是否整合到拟南芥基因组中进行检测，结果如下图所示，该转基因叶片的基因组中可能已整合CBFs基因。PCR结果中显示出小分子非目标条带，产生的原因可能是_________ A．引物过短 B．复性温度太高 C．变性温度不够 (4)现已获取成功转入CBFs基因的拟南芥植株，利用________技术对其进行检测，结果表明转入CBFs基因的拟南芥植株没有表达出相应的mRNA。后续还应通过改变________，以利于RNA聚合酶与之识别和结合，进而实现CBFs基因在拟南芥中的转录。 【答案】(1) ①④ 5' MunI 四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐高温的DNA聚合酶、（含Mg2+的）缓冲液 (2) 基因表达载体的构建 5'CTCGAG3' (3)A (4) PCR（或RT-PCR） 启动子 【难度】0.65 【知识点】目的基因的检测与鉴定、基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【分析】本题围绕基因工程培育抗寒拟南芥展开，综合考查 PCR 技术、基因表达载体构建、目的基因检测及转录调控，需结合基因克隆、载体酶切、PCR 异常分析及转录启动子等知识，体现 “获取目的基因 — 构建载体 — 转化受体 — 检测鉴定 — 表达调控” 的基因工程完整流程。 【详解】（1）①PCR 扩增需引物与模板链结合，根据 “引物延伸方向与转录方向一致”，选择引物①（上游 ）和引物④（下游 ）可扩增CBF基因完整序列。 ②为使基因定向连接到载体，需在引物 5’端 添加限制酶识别序列（保证酶切后黏性末端方向正确 ）。 ③结合载体（Ti 质粒 ）的酶切位点（需与基因两端酶切位点匹配 ），选择MunI（其识别序列不破坏基因，且能与载体酶切后连接 ）。 ④PCR体系需 Taq 酶催化子链延伸，dNTP作为合成 DNA 的原料。 （2）①基因工程核心步骤是构建载体，使目的基因在受体细胞稳定表达。 ②XhoI 识别 6 个核苷酸序列，且切割产生黏性末端。已知终止子序列含 “—ATCTCGAGCGGG—” ，匹配 XhoI 识别序列为5’-CTCGAG-3’（6 个核苷酸，符合酶切特征 ）。 （3）PCR 出现小分子非目标条带，因引物过短易与模板非特异性结合，扩增出短片段（复性温度、引物污染等不导致短条带 ），故选A 。 （4）①检测目的基因是否转录，用 PCR（或反转录 PCR ）扩增mRNA反转录的cDNA 。 ②若未表达 mRNA，可能是拟南芥原有启动子无法被RNA聚合酶识别，需改变启动子序列，促进转录起始。 地 城 考点03 蛋白质工程及其应用 一、单选题 1．（24-25高二下·天津河西·期末）将人胰岛素A链上1个天冬氨酸替换为甘氨酸，B链末端增加2个精氨酸，可制备出一种人工长效胰岛素。下列关于该胰岛素的叙述，错误的是（　　） A．进入人体后需经高尔基体加工 B．比人胰岛素多了2个肽键 C．与人胰岛素有相同的靶细胞 D．可通过蛋白质工程生产 【答案】A 【难度】0.85 【知识点】蛋白质工程的应用及实例分析 【分析】基因工程只能生产自然界已有的蛋白质，人工长效胰岛素A链上有氨基酸的替换，B链增加了两个氨基酸，需要通过蛋白质工程生产。 【详解】A、人工胰岛素作为药物直接注射进入人体，无需再经人体细胞的高尔基体加工，A错误； B、B链末端增加2个精氨酸，形成2个新肽键（肽键数=氨基酸数-肽链数），而A链替换氨基酸不影响肽键总数，故总肽键数增加2，B正确； C、人工胰岛素的作用机制未改变，靶细胞仍为肝细胞、肌细胞等，C正确； D、通过修改氨基酸序列生产该胰岛素属于蛋白质工程，D正确。 故选A。 2．（24-25高二下·天津部分区·期末）人干扰素（IFN）是机体免疫细胞产生的一类细胞因子。用白细胞生产干扰素时，每个细胞最多只能产生100~1000个干扰素分子，而用基因工程技术改造的大肠杆菌发酵生产（原理如图），在1~2天内每个菌体能产生20万个干扰素分子。天然的干扰素在体外保存相当困难，如果将干扰素分子上的一个半胱氨酸变为丝氨酸，在一定条件下可以延长保存时间。下列说法错误的是（　　） A．本研究中基因工程核心步骤用到的酶有限制酶、DNA连接酶，其作用部位都是磷酸二酯键 B．将重组质粒导入受体细胞时常用Ca2+处理大肠杆菌 C．除大肠杆菌外，还可以利用酵母菌做受体菌制备干扰素 D．为延长保存时间，需对干扰素的氨基酸序列进行直接改造 【答案】D 【难度】0.65 【知识点】蛋白质工程原理及操作流程、将目的基因导入受体细胞、基因表达载体的构建、DNA重组技术的基本工具 【详解】A、基因工程核心步骤是基因表达载体的构建，需要的工具酶是限制酶、DNA连接酶，其作用部位都是磷酸二酯键，A正确； B、将重组质粒导入大肠杆菌常用钙离子处理法，B正确； C、酵母菌是真核生物，干扰素是糖蛋白，可以利用酵母菌做受体菌制备干扰素，C正确； D、为延长保存时间，对干扰素进行改造，可以利用基因工程生产干扰素，所以需通过改造干扰素基因来实现，D错误。 故选D。 3．（24-25高二下·天津滨海新·期末）枯草杆菌蛋白酶能催化蛋白质水解为氨基酸，在有机溶剂中也能催化多肽的合成。这些碱性蛋白酶具有重要的应用价值，被广泛应用于洗涤剂、制革及丝绸工业。将枯草杆菌蛋白酶分子的天冬氨酸（99）和谷氨酸（156）改成赖氨酸，可使其在一定条件下的活力提高。下列说法错误的是（    ） A．完成氨基酸的替换需要通过改造基因实现 B．蛋白质工程需要直接改造蛋白质 C．经蛋白质工程改造后的枯草杆菌蛋白酶活性提高这一性状可遗传 D．蛋白质工程最终要达到的目的是获取编码蛋白质的基因序列信息，并表达出蛋白质 【答案】B 【难度】0.85 【知识点】蛋白质工程的应用及实例分析、蛋白质工程原理及操作流程 【详解】A、蛋白质工程通过修改基因来改变蛋白质结构，因为基因控制蛋白质的合成，故替换氨基酸需改造基因，A正确； B、蛋白质工程并非直接改造蛋白质，而是通过基因修饰或合成新基因来实现，直接改造蛋白质无法遗传，B错误； C、经基因改造后的酶活性变化由基因决定，属于可遗传变异，C正确； D、蛋白质工程最终目的是获得所需蛋白质，需先设计基因序列再表达，D正确。 故选B。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $