专题03 基因工程和生物技术的安全性及伦理问题（9大考点+7点易错+6大妙招）（期末复习清单）高二生物下学期人教版

专题03 基因工程和生物技术的安全性及伦理问题 本章内容导览 1.思维导图 2.考点清单（9大考点） 3.素养提升清单（7个易错清单、6个妙招清单） 【考点01】基因工程的工具★★☆☆☆ “分子手 术刀”—限制性内 切核酸酶 (限制酶) 来源 主要是原核生物 作用 识别并切割双链DNA分子的特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 特点 专一性 作用结果   “分子缝 合针”——DNA连接酶 作用 将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的磷酸二酯键 分 类 E.coli DNA连接酶 来自大肠杆菌,可高效连接具有互补黏性末端的DNA片段,连接具有平末端的DNA片段的效率远远低于T4 DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来自T4噬菌体,能连接互补的黏性末端和平末端 “分子运输 车”—— 基因进入 受体细胞 的载体 作用 将外源DNA片段(目的基因)导入受体细胞 种 类 质粒 (最 常用) 定义 裸露的(不与组蛋白结合)、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外,并具有自我复制能力的环状双链DNA分子 结构 特点 具有复制原点(在细胞中能够自我复制)、标记基因(便于重组DNA分子的筛选)、一个至多个限制酶切割位点(供目的基因插入) 其他载体 噬菌体、动植物病毒等 与DNA相关的酶的比较 酶种类 作用部位 底物 产物 作用过程 限制酶 磷酸二 酯键 DNA DNA片段 基因表达载体的构建 DNA连接酶 DNA片段 DNA RNA聚合酶 核糖核苷酸 RNA RNA合成 逆转录酶 脱氧核苷酸 DNA 逆转录 DNA酶 DNA 脱氧核苷酸 DNA水解 DNA聚合酶 脱氧核苷酸 DNA DNA复制 解旋酶 氢键 双链DNA DNA的两条单链 DNA复制 1、基因工程的操作工具包含限制酶、DNA 连接酶、运载体，其中限制酶和 DNA 连接酶负责切割和拼接 DNA，运载体负责运载目的基因。 2、限制性核酸内切酶（限制酶），能够识别特定脱氧核苷酸序列，并在特定位点切割 DNA 分子。 3、限制酶切割产生黏性末端或平末端，切割的化学键均为 DNA 分子的磷酸二酯键，不破坏碱基对之间的氢键。 4、DNA 连接酶可恢复磷酸二酯键，将两个 DNA 片段连接拼接，不能连接氢键，也不能连接单链 DNA。 5、DNA 连接酶不具备识别特定序列的能力，只催化互补末端的 DNA 片段完成连接反应。 6、常用运载体为质粒、噬菌体、动植物病毒，质粒是裸露、环状、双链的小型 DNA 分子。 7、合格运载体需具备复制原点、标记基因、多个限制酶切割位点，满足复制、筛选、插入目的基因的需求。 【考点02】DNA的粗提取★★☆☆☆ 实验原理 (1)DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,利用这一原理,可以初步分离DNA与蛋白质 (2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于2 mol/L的NaCl溶液 (3)DNA+二苯胺试剂 蓝色 实验步骤 1、DNA 粗提取的实验原理是 DNA 在不同浓度 NaCl 溶液中溶解度不同，可利用浓度变化溶解并析出 DNA。 2、DNA 在2mol/L NaCl 溶液中溶解度最大，在0.14mol/L NaCl 溶液中溶解度最小，利于杂质分离。 3、冷却的体积分数 95% 酒精可析出 DNA，DNA 不溶于酒精，而蛋白质等杂质可溶于酒精实现除杂。 4、破碎动物细胞只需加蒸馏水吸水涨破，破碎植物细胞需加洗涤剂瓦解细胞膜并研磨去壁。 5、过滤获取含 DNA 滤液时，不能用滤纸，应用纱布过滤，防止 DNA 吸附在滤纸造成损耗。 6、粗提取全程轻缓搅拌、沿壁缓慢加水，防止 DNA 断裂，保证获取完整丝状 DNA。 7、DNA 鉴定使用二苯胺试剂，沸水浴加热变蓝色，常温下不显色，专一检测 DNA。 【考点03】PCR技术★★☆☆☆ PCR定义 在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术 PCR原理 DNA半保留复制 条件 模板 目的基因的两条链 原料 4种脱氧核苷酸 酶 耐高温的DNA聚合酶 引物 一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。2种 在一定的缓冲溶液中进行；需要控制温度的变化 PCR反应过程 变性 当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链 复性 温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 延伸 72℃左右时，在耐高温的DNA聚合酶作用下，从引物3′端开始进行互补链的合成 扩增 方向 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3′端延伸DNA链，即DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸 方式 指数形式扩增（约为2n，n为扩增循环的次数） 结果 短时间内大量扩增目的基因 产物鉴定 琼脂糖凝胶电泳 1、PCR 技术即多聚酶链式反应，原理是 DNA 的半保留复制，可体外快速扩增目的基因。 2、PCR 反应体系包含模板 DNA、引物、四种脱氧核苷酸、热稳定 DNA 聚合酶和缓冲液。 3、引物能与模板 DNA 单链互补结合，为 DNA 聚合酶延伸子链提供起始位点，不可或缺。 4、PCR 三步循环流程：变性→复性→延伸，三步反复循环实现 DNA 数量指数级增长。 5、变性依靠高温解开 DNA 双链，该过程不会破坏 DNA 分子中的磷酸二酯键。 6、Taq 酶为热稳定 DNA 聚合酶，耐高温，可耐受多次高温变性而不失活。 【考点04】基因表达载体的构建★★☆☆☆ 构建目的 (1)让目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代 (2)使目的基因能够表达和发挥作用 基因表达载体的组成 启动子的分类 组成型启动子 在多数或全部组织中保持持续的驱动转录活性 诱导型启动子 受外界化学或物理信号调控驱动下游基因转录,如乳糖操纵子 特异型启动子 具有组织特异性(在特定的组织或器官中驱动下游基因转录)或者发育时期特异性(在特定发育时期驱动下游基因转录),如水稻胚乳细胞启动子 构建基因表达载体过程示意图 1、基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在、遗传并表达。 2、完整的基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因、复制原点五部分，缺一不可。 3、启动子位于目的基因首端，是RNA 聚合酶识别和结合位点，驱动目的基因转录出 mRNA。 4、终止子位于目的基因尾端，能够终止转录过程，控制基因表达的结束。 5、标记基因的作用是鉴别、筛选含有目的基因的受体细胞，不直接参与目的基因的转录和翻译。 6、构建表达载体时，需用同种限制酶切割载体和目的基因，保证产生互补末端，再用 DNA 连接酶连接。 7、目的基因成功插入载体后，可随载体 DNA 复制而复制，保证在受体细胞中稳定遗传和表达。 【考点05】将目的基因导入受体细胞★★★☆☆ 细胞类型 方法 原理/操作步骤 植物细胞 花粉管通道法 ①可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中； ②可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 农杆菌转化法 农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T­DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。如果将目的基因插入Ti质粒的T­DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞 动物细胞（受精卵） 显微注射技术　　 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 微生物细胞（原核细胞） Ca2＋处理法 用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中 1、将目的基因导入受体细胞是基因工程的重要步骤，导入方法依据受体细胞类型不同而不同。 2、导入植物细胞常用农杆菌转化法，利用农杆菌 Ti 质粒的 T-DNA 可转移并整合到植物染色体 DNA 的特点。 3、导入动物细胞（受精卵） 常用显微注射法，是动物转基因最常用、最有效的方法。 4、导入微生物细胞常用 Ca²⁺处理法，使大肠杆菌细胞处于能吸收周围 DNA 的感受态。 5、农杆菌转化法中 T-DNA 可携带目的基因，整合到植物细胞的染色体 DNA 上，保证稳定遗传。 6、目的基因导入受体细胞，不一定成功整合、不一定表达，后续必须进行筛选与鉴定。 7、不同导入方法仅改变基因进入细胞的方式，不改变目的基因的结构和遗传信息。 【考点06】目的基因的检测与鉴定★★☆☆☆ 分子水平的检测 检测目的基因是否导入受体细胞 PCR 操作方法:设计目的基因特异性引物,提取受体细胞内的基因组DNA进行PCR扩增,如果能够扩增出目的基因片段,说明该基因已经导入受体细胞 DNA分子杂交 操作方法:把目的基因片段用放射性同位素、生物素或荧光进行标记,与受体细胞的基因组 DNA 进行杂交,如果目的基因已经导入受体细胞,那么标记的基因片段就会与其结合,通过特殊的仪器就能够检测出来 检测目的基因是否转录 逆转录-PCR(RT-PCR) 操作方法:提取受体细胞内的总RNA进行逆转录,得到cDNA,以获得的cDNA为模板,设计目的基因特异性引物进行PCR 核酸分子杂交 操作方法:从待测转基因生物细胞中提取 mRNA分子,用已标记的目的基因片段作为探针与 mRNA 杂交 检测目的基因是否翻译 抗原—抗体杂交 操作方法:从受体细胞中提取蛋白质后,进行电泳分离,然后利用目的蛋白的抗体进行检测 个体生物学水平的鉴定 检测目标性状的有无等,如通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定抗虫基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度 1、目的基因的检测与鉴定分层次进行，依次检测是否导入、是否转录、是否翻译、个体是否表达性状。 2、检测目的基因是否导入受体细胞，利用DNA 分子杂交技术，以基因探针检测细胞 DNA。 3、检测目的基因是否转录出 mRNA，采用分子杂交技术，探针与细胞 mRNA 进行碱基互补配对。 4、检测目的基因是否翻译出蛋白质，采用抗原 — 抗体杂交技术，可特异性检测表达产物。 5、前三步为分子水平鉴定，个体生物学水平鉴定需直接观察转基因生物的性状表现。 6、分子杂交技术的核心原理是碱基互补配对原则，是基因检测的根本依据。 7、成功导入目的基因不代表成功表达，只有出现对应性状，才算最终完成转基因成功鉴定。 【考点07】基因工程的应用★★☆☆☆ 1.基因工程在农牧业方面的应用 分类 导入目的基因 转基因生物实例 植物 转基因抗虫植物 外源抗虫基因 抗虫棉花、玉米等 转基因抗病植物 某些病毒、真菌等的抗病基因 抗病毒甜椒、番木瓜等 转基因抗除草剂植物 降解或抵抗某种除草剂的基因 抗除草剂玉米、大豆等 改良植物的品质 富含某些必需氨基酸的蛋白质的基因 富含赖氨酸的玉米 与植物花青素代谢相关的基因 颜色变异的矮牵牛 动物 提高动物的生长速率 外源生长激素的基因 转生长激素基因的鲤鱼 改善畜产品的品质 肠乳糖酶的基因 转肠乳糖酶基因的奶牛 2、基因工程菌与乳腺生物反应器的比较 比较内容 基因工程菌 乳腺生物反应器 含义 用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类 让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 基因表达 细菌合成的药物蛋白可能没有活性 合成的药物蛋白与天然蛋白相同 受体细胞 微生物细胞 哺乳动物受精卵 目的基因 导入方式 Ca2＋处理法 显微注射法 药物提取 从微生物细胞或其培养液中提取 从哺乳动物乳汁中提取 1、基因工程可用于转基因植物培育，主要包括抗虫、抗病、抗逆及改良品质的优良作物培育。 2、抗虫转基因植物只针对特定害虫致死，不污染环境、不影响人畜安全，区别于农药杀虫。 3、抗病转基因植物可抵御病毒、细菌、真菌等病害，有效降低农作物减产损失。 4、基因工程用于动物遗传改良，可培育生长快、品质优、抗病能力强的转基因动物。 5、利用转基因动物可构建生物反应器，从乳汁、血液中提取医用蛋白，产量高、纯度高。 6、基因工程可生产工程药物，利用微生物或细胞批量合成人体稀缺的激素、抗体、干扰素等。 【考点08】蛋白质工程★★☆☆☆ 简介 设计基础 以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础 目的 改造现有蛋白质,或制造一种新的蛋白质 改造方法 由于基因决定蛋白质,因此要对蛋白质的结构进行设计改造,最终还必须通过改造或合成基因来完成 基本思路 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 应用 速效胰岛素类似物的研发、延长干扰素的体外保存时间、枯草杆菌蛋白酶的改进等 1、蛋白质工程的实质是改造基因，通过改造基因结构从而定向改造现有蛋白质的结构与功能。 2、蛋白质工程的操作起点是预期蛋白质功能，区别于基因工程从获取目的基因开始。 3、基因工程只能生产自然界已存在的蛋白质，蛋白质工程可创造自然界不存在的新型蛋白质。 4、蛋白质工程设计流程：预期功能→推测氨基酸序列→推导基因脱氧核苷酸序列→改造合成基因。 5、直接改造蛋白质无法遗传、效果短暂，改造基因可稳定遗传，是蛋白质工程的核心思路。 6、蛋白质工程基于基因工程延伸发展，离不开基因工程的剪切、拼接、表达等核心技术手段。 【考点09】生物技术的安全性与伦理问题★★☆☆☆ 1．对微生物的基因改造是基因工程中研究最早、最广泛和取得实际应用成果最多的领域，这是因为微生物具有生理结构和遗传物质简单、生长繁殖快、对环境因素敏感和容易进行遗传物质操作等优点。 2．在转基因研究工作中，科学家会采取很多方法防止基因污染。例如，我国科学家将来自玉米的α­淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，由于α­淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，因而可以防止转基因花粉的传播。 3．生殖性克隆是指通过克隆技术产生独立生存的新个体。治疗性克隆是指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。两者有着本质的区别。 4．有的伦理学家认为，生殖性克隆人是在人为地制造在心理上和社会地位上都不健全的人，严重地违反了人类伦理道德，是克隆技术的滥用。 5．我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。 6．试管婴儿与设计试管婴儿 试管婴儿与设计试管婴儿都是有性生殖，都要通过①体外受精，并进行②体外早期胚胎培养和③胚胎移植，不同的是设计试管婴儿胚胎移植前需进行遗传学诊断。 7.生物武器包括致病菌类、病毒类和生化毒剂类等，例如，天花病毒、波特淋菌、霍乱弧菌和炭疽杆菌都可以用来制造生物武器。 8.生物武器的致病能力强、攻击范围广。它可以直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布，经由呼吸道、消化道和皮肤等侵入人、畜体内，造成大规模伤亡，也能大量损害植物。 1．对微生物的基因改造是基因工程中研究最早、最广泛和取得实际应用成果最多的领域，这是因为微生物具有生理结构和遗传物质简单、生长繁殖快、对环境因素敏感和容易进行遗传物质操作等优点。 2．在转基因研究工作中，科学家会采取很多方法防止基因污染。例如，我国科学家将来自玉米的α­淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，由于α­淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，因而可以防止转基因花粉的传播。 3．生殖性克隆是指通过克隆技术产生独立生存的新个体。治疗性克隆是指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。两者有着本质的区别。 4．有的伦理学家认为，生殖性克隆人是在人为地制造在心理上和社会地位上都不健全的人，严重地违反了人类伦理道德，是克隆技术的滥用。 5．我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。 6．试管婴儿与设计试管婴儿 试管婴儿与设计试管婴儿都是有性生殖，都要通过①体外受精，并进行②体外早期胚胎培养和③胚胎移植，不同的是设计试管婴儿胚胎移植前需进行遗传学诊断。 7.生物武器包括致病菌类、病毒类和生化毒剂类等，例如，天花病毒、波特淋菌、霍乱弧菌和炭疽杆菌都可以用来制造生物武器。 8.生物武器的致病能力强、攻击范围广。它可以直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布，经由呼吸道、消化道和皮肤等侵入人、畜体内，造成大规模伤亡，也能大量损害植物。 1、转基因生物的安全性争议主要集中在食物安全、生物安全、环境安全三个层面，需理性辩证看待。 2、转基因食物安全风险主要为滞后效应、过敏原、营养成分改变，目前尚无明确有害实证。 3、转基因生物可能造成生物安全问题，如打破原有种间界限，造成野生生物基因污染。 4、转基因生物可能引发环境安全问题，改变生态系统结构，影响生物多样性与生态稳定性。 5、设计试管婴儿需区分治疗性与生殖性，生殖性克隆人我国明令禁止，治疗性克隆可用于医学研究。 6、基因检测可预知遗传病风险，但会引发基因歧视等伦理问题，损害个人隐私与公平权。 7、我国对生物技术坚持依法监管、趋利避害、理性发展，禁止任何违背伦理与安全的操作。 易错01.混淆基因工程各类工具的功能与化学键 （1）限制酶：切割磷酸二酯键，不切割氢键，可产生黏性末端或平末端，具有特异性识别序列的特点。 （2）DNA连接酶：只能连接磷酸二酯键，不能连接氢键，无特异性识别碱基序列的功能。 （3）运载体不催化化学键断裂与生成，仅负责携带、复制、表达目的基因。 易错02.混淆基因表达载体各组件的功能 （1）启动子：RNA聚合酶结合位点，启动转录，不启动翻译，不属于基因编码区。 （2）终止子：终止转录，并非终止翻译，位于目的基因下游。 （3）标记基因：用于筛选受体细胞，不控制目的基因表达，不决定性状。 易错03.混淆三种导入方法的适用对象与原理 （1）农杆菌转化法：只适用于植物，依靠T-DNA整合到植物染色体DNA，是最常用的植物转基因方法。 （2）显微注射法：仅用于动物细胞，主要是受精卵，为动物转基因唯一常用方法。 （3）Ca²⁺处理法：只适用于原核微生物，使细胞处于可吸收外源DNA的感受态。 易错04.混淆基因工程三道检测鉴定的层次 （1）检测是否导入：DNA分子杂交，检测细胞内是否存在目的基因。 （2）检测是否转录：核酸分子杂交，检测是否产生mRNA。 （3）检测是否翻译：抗原—抗体杂交，检测是否合成蛋白质；导入成功≠表达成功。 易错05.混淆基因工程与蛋白质工程的本质区别 （1）基因工程：只能生产自然界已存在的蛋白质，改造生物现有性状。 （2）蛋白质工程：通过改造基因，可生产自然界不存在的新型蛋白质，是基因工程的延伸。 （3）蛋白质工程直接改造对象是基因，而非蛋白质，改造基因可稳定遗传。 易错06.误解转基因生物的三类安全问题 （1）食物安全：主要担忧滞后效应、过敏原、营养成分改变，不存在绝对的“有毒定论”。 （2）生物安全：转基因生物可能造成基因污染，破坏野生生物基因多样性。 （3）环境安全：可能改变生态系统食物链、食物网，破坏生态平衡。 易错07.混淆设计试管婴儿与试管婴儿、克隆人伦理 （1）普通试管婴儿：仅解决不孕不育问题，无基因筛选，属于正常辅助生殖技术。 （2）设计试管婴儿：胚胎植入前进行基因检测筛选，可用于治病，需严格规范。 （3）我国法律禁止生殖性克隆人，不反对、不禁止治疗性克隆用于医学研究。 妙招01.基因工程工具“一键区分法” ①限制酶：专一识别特定核苷酸序列，切割磷酸二酯键，具有特异性，产生黏性末端或平末端； ②DNA连接酶：只连接磷酸二酯键，无识别序列特异性，不修复氢键； ③运载体：无催化作用，仅携带目的基因，具备复制原点、标记基因、多酶切位点三大必备条件。 妙招02.受体细胞导入方法“对象匹配法” ①植物细胞：首选农杆菌转化法，依托T-DNA整合至植物染色体DNA，适用绝大多数植物； ②动物细胞：只用显微注射法，针对受精卵操作，是动物转基因专属方法； ③微生物细胞：采用Ca²⁺处理法，使细胞变为感受态，高效吸收外源DNA。 妙招03.目的基因鉴定“三层逐级判读法” ①导入水平：DNA分子杂交，检测受体细胞是否存在目的基因； ②表达转录水平：核酸分子杂交，检测细胞是否转录出对应mRNA； ③表达翻译水平：抗原—抗体杂交，检测是否合成目标蛋白质，三步全部成功才算有效表达。 妙招04.基因工程与蛋白质工程“本质二分法” ①基因工程：只复制表达自然界原有基因，生产天然存在的蛋白质，不改造基因结构； ②蛋白质工程：定向改造基因结构，可合成自然界不存在的新型蛋白质，属于基因工程的延伸。 妙招05.转基因安全问题“三类定点记忆法” ①食物安全：聚焦过敏、营养改变、滞后效应三大核心风险； ②生物安全：核心隐患为基因污染，干扰野生生物基因库； ③环境安全：破坏原有生态平衡、改变生物多样性，影响生态系统稳态。 妙招06.生物技术伦理“正反界定法” ①试管婴儿：无基因筛选，仅解决不孕不育，合规合法； ②设计试管婴儿：胚胎基因筛选，多用于疾病治疗，严格受限使用； ③克隆技术：严禁生殖性克隆人，允许治疗性克隆用于医学研究。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！1 1 / 1 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题03 基因工程和生物技术的安全性及伦理问题 本章内容导览 1.思维导图 2.考点清单（9大考点） 3.素养提升清单（7个易错清单、6个妙招清单） 【考点01】基因工程的工具★★☆☆☆ “分子手 术刀”—限制性内 切核酸酶 (限制酶) 来源 主要是原核生物 作用 识别并切割双链DNA分子的 ,并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 特点 专一性 作用结果   “分子缝 合针”——DNA连接酶 作用 将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的磷 分 类 E.coli DNA连接酶 来自大肠杆菌,可高效连接具有互补黏性末端的DNA片段,连接具有平末端的DNA片段的效率远远低于T4 DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来自T4噬菌体,能连接互补的黏性末端和平末端 “分子运输 车”—— 基因进入 受体细胞 的载体 作用 将外源DNA片段(目的基因)导入受体细胞 种 类 质粒 (最 常用) 定义 裸露的(不与组蛋白结合)、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外,并具有 的环状双链DNA分子 结构 特点 具有 在细胞中能够自我复制)、 (便于重组DNA分子的筛选)、 (供目的基因插入) 其他载体 噬菌体、动植物病毒等 与DNA相关的酶的比较 酶种类 作用部位 底物 产物 作用过程 限制酶 磷酸二 酯键 DNA DNA片段 基因表达载体的构建 DNA连接酶 DNA片段 DNA RNA聚合酶 核糖核苷酸 RNA RNA合成 逆转录酶 脱氧核苷酸 DNA 逆转录 DNA酶 DNA 脱氧核苷酸 DNA水解 DNA聚合酶 脱氧核苷酸 DNA DNA复制 解旋酶 氢键 双链DNA DNA的两条单链 DNA复制 1、基因工程的操作工具包含限制酶、DNA 连接酶、运载体，其中限制酶和 DNA 连接酶负责切割和拼接 DNA，运载体负责运载目的基因。 2、限制性核酸内切酶（限制酶），能够识别特定脱氧核苷酸序列，并在特定位点切割 DNA 分子。 3、限制酶切割产生黏性末端或平末端，切割的化学键均为 DNA 分子的磷酸二酯键，不破坏碱基对之间的氢键。 4、DNA 连接酶可恢复磷酸二酯键，将两个 DNA 片段连接拼接，不能连接氢键，也不能连接单链 DNA。 5、DNA 连接酶不具备识别特定序列的能力，只催化互补末端的 DNA 片段完成连接反应。 6、常用运载体为质粒、噬菌体、动植物病毒，质粒是裸露、环状、双链的小型 DNA 分子。 7、合格运载体需具备复制原点、标记基因、多个限制酶切割位点，满足复制、筛选、插入目的基因的需求。 【考点02】DNA的粗提取★★☆☆☆ 实验原理 (1)DNA不溶于 ,但某些 溶于酒精,利用这一原理,可以初步分离DNA与蛋白质 (2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于 (3)DNA+  蓝色 实验步骤 1、DNA 粗提取的实验原理是 DNA 在不同浓度 NaCl 溶液中溶解度不同，可利用浓度变化溶解并析出 DNA。 2、DNA 在2mol/L NaCl 溶液中溶解度最大，在0.14mol/L NaCl 溶液中溶解度最小，利于杂质分离。 3、冷却的体积分数 95% 酒精可析出 DNA，DNA 不溶于酒精，而蛋白质等杂质可溶于酒精实现除杂。 4、破碎动物细胞只需加蒸馏水吸水涨破，破碎植物细胞需加洗涤剂瓦解细胞膜并研磨去壁。 5、过滤获取含 DNA 滤液时，不能用滤纸，应用纱布过滤，防止 DNA 吸附在滤纸造成损耗。 6、粗提取全程轻缓搅拌、沿壁缓慢加水，防止 DNA 断裂，保证获取完整丝状 DNA。 7、DNA 鉴定使用二苯胺试剂，沸水浴加热变蓝色，常温下不显色，专一检测 DNA。 【考点03】PCR技术★★☆☆☆ PCR定义 在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术 PCR原理 DNA 条件 模板 原料 4种脱氧核苷酸 酶 耐高温的 引物 一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链 。2种 在一定的缓冲溶液中进行；需要控制温度的变化 PCR反应过程 变性 当温度 ℃时，双链DNA解聚为单链 复性 温度下降到 ℃左右时，两种引物通过 与两条单链DNA结合 延伸 72℃左右时，在 作用下，从引物3′端开始进行互补链的合成 扩增 方向 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3′端延伸DNA链，即DNA的合成方向总是从子链的 延伸 方式 指数形式扩增（约为2n，n为扩增循环的次数） 结果 产物鉴定 琼脂糖凝胶电泳 1、PCR 技术即多聚酶链式反应，原理是 DNA 的半保留复制，可体外快速扩增目的基因。 2、PCR 反应体系包含模板 DNA、引物、四种脱氧核苷酸、热稳定 DNA 聚合酶和缓冲液。 3、引物能与模板 DNA 单链互补结合，为 DNA 聚合酶延伸子链提供起始位点，不可或缺。 4、PCR 三步循环流程：变性→复性→延伸，三步反复循环实现 DNA 数量指数级增长。 5、变性依靠高温解开 DNA 双链，该过程不会破坏 DNA 分子中的磷酸二酯键。 6、Taq 酶为热稳定 DNA 聚合酶，耐高温，可耐受多次高温变性而不失活。 【考点04】基因表达载体的构建★★☆☆☆ 构建目的 (1)让目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代 (2)使目的基因能够表达和发挥作用 基因表达载体的组成 启动子的分类 组成型启动子 在多数或全部组织中保持持续的驱动转录活性 诱导型启动子 受外界化学或物理信号调控驱动下游基因转录,如乳糖操纵子 特异型启动子 具有组织特异性(在特定的组织或器官中驱动下游基因转录)或者发育时期特异性(在特定发育时期驱动下游基因转录),如水稻胚乳细胞启动子 构建基因表达载体过程示意图 1、基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在、遗传并表达。 2、完整的基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因、复制原点五部分，缺一不可。 3、启动子位于目的基因首端，是RNA 聚合酶识别和结合位点，驱动目的基因转录出 mRNA。 4、终止子位于目的基因尾端，能够终止转录过程，控制基因表达的结束。 5、标记基因的作用是鉴别、筛选含有目的基因的受体细胞，不直接参与目的基因的转录和翻译。 6、构建表达载体时，需用同种限制酶切割载体和目的基因，保证产生互补末端，再用 DNA 连接酶连接。 7、目的基因成功插入载体后，可随载体 DNA 复制而复制，保证在受体细胞中稳定遗传和表达。 【考点05】将目的基因导入受体细胞★★★☆☆ 细胞类型 方法 原理/操作步骤 植物细胞 花粉管通道法 ①可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入 中； ②可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在 ，使目的基因借助 进入胚囊 农杆菌转化法 农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的 （可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的 上。如果将目的基因插入Ti质粒的T­DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞 动物细胞（受精卵） 技术　　 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 微生物细胞（原核细胞） Ca2＋处理法 用 处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中 1、将目的基因导入受体细胞是基因工程的重要步骤，导入方法依据受体细胞类型不同而不同。 2、导入植物细胞常用农杆菌转化法，利用农杆菌 Ti 质粒的 T-DNA 可转移并整合到植物染色体 DNA 的特点。 3、导入动物细胞（受精卵） 常用显微注射法，是动物转基因最常用、最有效的方法。 4、导入微生物细胞常用 Ca²⁺处理法，使大肠杆菌细胞处于能吸收周围 DNA 的感受态。 5、农杆菌转化法中 T-DNA 可携带目的基因，整合到植物细胞的染色体 DNA 上，保证稳定遗传。 6、目的基因导入受体细胞，不一定成功整合、不一定表达，后续必须进行筛选与鉴定。 7、不同导入方法仅改变基因进入细胞的方式，不改变目的基因的结构和遗传信息。 【考点06】目的基因的检测与鉴定★★☆☆☆ 分子水平的检测 检测目的基因是否导入受体细胞 PCR 操作方法:设计目的基因特异性引物,提取受体细胞内的基因组DNA进行PCR扩增,如果能够扩增出目的基因片段,说明该基因已经导入受体细胞 操作方法:把 放射性同位素、生物素或荧光进行标记,与受体细胞的基因组 DNA 进行杂交,如果目的基因已经导入受体细胞,那么标记的基因片段就会与其结合,通过特殊的仪器就能够检测出来 检测目的基因是否转录 逆转录-PCR(RT-PCR) 操作方法:提取受体细胞内的总RNA进行逆转录,得到cDNA,以获得的cDNA为模板,设计目的基因特异性引物进行PCR 操作方法:从待测转基因生物细胞中提取 mRNA分子,用 作为探针与 mRNA 杂交 检测目的基因是否翻译 操作方法:从受体细胞中提取蛋白质后,进行电泳分离,然后利用目的蛋白的抗体进行检测 个体生物学水平的鉴定 检测目标性状的有无等,如通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定抗虫基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度 1、目的基因的检测与鉴定分层次进行，依次检测是否导入、是否转录、是否翻译、个体是否表达性状。 2、检测目的基因是否导入受体细胞，利用 ，以基因探针检测细胞 DNA。 3、检测目的基因是否转录出 mRNA，采用 ，探针与细胞 mRNA 进行碱基互补配对。 4、检测目的基因是否翻译出蛋白质，采用 ，可特异性检测表达产物。 5、前三步为分子水平鉴定，个体生物学水平鉴定需直接观察转基因生物的性状表现。 6、分子杂交技术的核心原理是 ，是基因检测的根本依据。 7、成功导入目的基因不代表成功表达，只有出现对应性状，才算最终完成转基因成功鉴定。 【考点07】基因工程的应用★★☆☆☆ 1.基因工程在农牧业方面的应用 分类 导入目的基因 转基因生物实例 植物 转基因抗虫植物 外源 基因 抗虫棉花、玉米等 转基因抗病植物 某些病毒、真菌等的 基因 抗病毒甜椒、番木瓜等 转基因抗除草剂植物 降解或抵抗某种 的基因 抗除草剂玉米、大豆等 改良植物的品质 富含 的蛋白质的基因 富含赖氨酸的玉米 与植物 代谢相关的基因 颜色变异的矮牵牛 动物 提高动物的生长速率 外源 的基因 转生长激素基因的鲤鱼 改善畜产品的品质 的基因 转肠乳糖酶基因的奶牛 2、基因工程菌与乳腺生物反应器的比较 比较内容 基因工程菌 乳腺生物反应器 含义 用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类 让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 基因表达 细菌合成的药物蛋白可能没有活性 合成的药物蛋白与天然蛋白相同 受体细胞 微生物细胞 哺乳动物受精卵 目的基因 导入方式 Ca2＋处理法 显微注射法 药物提取 从微生物细胞或其培养液中提取 从哺乳动物乳汁中提取 1、基因工程可用于转基因植物培育，主要包括抗虫、抗病、抗逆及改良品质的优良作物培育。 2、抗虫转基因植物只针对特定害虫致死，不污染环境、不影响人畜安全，区别于农药杀虫。 3、抗病转基因植物可抵御病毒、细菌、真菌等病害，有效降低农作物减产损失。 4、基因工程用于动物遗传改良，可培育生长快、品质优、抗病能力强的转基因动物。 5、利用转基因动物可构建 ，从乳汁、血液中提取医用蛋白，产量高、纯度高。 6、基因工程可生产工程药物，利用微生物或细胞批量合成人体稀缺的激素、抗体、干扰素等。 【考点08】蛋白质工程★★☆☆☆ 简介 设计基础 以蛋 为基础 目的 现有蛋白质,或 的蛋白质 改造方法 由于基因决定蛋白质,因此要对蛋白质的结构进行设计改造,最终还必须通过 来完成 基本思路 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 应用 速效胰岛素类似物的研发、延长干扰素的体外保存时间、枯草杆菌蛋白酶的改进等 1、蛋白质工程的实质是改造基因，通过改造基因结构从而定向改造现有蛋白质的结构与功能。 2、蛋白质工程的操作起点是预期蛋白质功能，区别于基因工程从获取目的基因开始。 3、基因工程只能生产自然界已存在的蛋白质，蛋白质工程可创造自然界不存在的新型蛋白质。 4、蛋白质工程设计流程：预期功能→推测氨基酸序列→推导基因脱氧核苷酸序列→改造合成基因。 5、直接改造蛋白质无法遗传、效果短暂，改造基因可稳定遗传，是蛋白质工程的核心思路。 6、蛋白质工程基于基因工程延伸发展，离不开基因工程的剪切、拼接、表达等核心技术手段。 【考点09】生物技术的安全性与伦理问题★★☆☆☆ 1．对微生物的基因改造是基因工程中研究最早、最广泛和取得实际应用成果最多的领域，这是因为微生物具有 、 、对环境因素 和容易进行 操作等优点。 2．在转基因研究工作中，科学家会采取很多方法防止 。例如，我国科学家将来自玉米的α­淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，由于α­淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，因而可以防止转基因花粉的传播。 3．生殖性克隆是指 。治疗性克隆是指利 。两者有着本质的区别。 4．有的伦理学家认为，生殖性克隆人是在人为地制造在心理上和社会地位上都不健全的人，严重地违反了人类 ，是克隆技术的滥用。 5．我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、 任何生殖性克隆人实验。 6．试管婴儿与设计试管婴儿 试管婴儿与设计试管婴儿都是有性生殖，都要通过① ，并进行②体 和③ ，不同的是设计试管婴儿胚胎移植前需进行 。 7.生物武器包括致病菌类、病毒类和 等，例如，天花病毒、波特淋菌、霍乱弧菌和炭疽杆菌都可以用来制造生物武器。 8.生物武器的致病能力强、 。它可以直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布，经由呼吸道、消化道和皮肤等侵入人、畜体内，造成大规模伤亡，也能大量损害植物。 1．对微生物的基因改造是基因工程中研究最早、最广泛和取得实际应用成果最多的领域，这是因为微生物具有 、 、对环境因素 和容易进行 操作等优点。 2．在转基因研究工作中，科学家会采取很多方法防止 。例如，我国科学家将来自玉米的α­淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，由于α­淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，因而可以防止转基因花粉的传播。 3．生殖性克隆是指 。治疗性克隆是指利 。两者有着本质的区别。 4．有的伦理学家认为，生殖性克隆人是在人为地制造在心理上和社会地位上都不健全的人，严重地违反了人类 ，是克隆技术的滥用。 5．我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、 任何生殖性克隆人实验。 6．试管婴儿与设计试管婴儿 试管婴儿与设计试管婴儿都是有性生殖，都要通过① ，并进行②体 和③ ，不同的是设计试管婴儿胚胎移植前需进行 。 7.生物武器包括致病菌类、病毒类和 等，例如，天花病毒、波特淋菌、霍乱弧菌和炭疽杆菌都可以用来制造生物武器。 8.生物武器的致病能力强、 。它可以直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布，经由呼吸道、消化道和皮肤等侵入人、畜体内，造成大规模伤亡，也能大量损害植物。 1、转基因生物的安全性争议主要集中在食物安全、生物安全、环境安全三个层面，需理性辩证看待。 2、转基因食物安全风险主要为滞后效应、过敏原、营养成分改变，目前尚无明确有害实证。 3、转基因生物可能造成生物安全问题，如打破原有种间界限，造成野生生物基因污染。 4、转基因生物可能引发环境安全问题，改变生态系统结构，影响生物多样性与生态稳定性。 5、设计试管婴儿需区分治疗性与生殖性，生殖性克隆人我国明令禁止，治疗性克隆可用于医学研究。 6、基因检测可预知遗传病风险，但会引发基因歧视等伦理问题，损害个人隐私与公平权。 7、我国对生物技术坚持依法监管、趋利避害、理性发展，禁止任何违背伦理与安全的操作。 易错01.混淆基因工程各类工具的功能与化学键 （1）限制酶：切割磷酸二酯键，不切割氢键，可产生黏性末端或平末端，具有特异性识别序列的特点。 （2）DNA连接酶：只能连接磷酸二酯键，不能连接氢键，无特异性识别碱基序列的功能。 （3）运载体不催化化学键断裂与生成，仅负责携带、复制、表达目的基因。 易错02.混淆基因表达载体各组件的功能 （1）启动子：RNA聚合酶结合位点，启动转录，不启动翻译，不属于基因编码区。 （2）终止子：终止转录，并非终止翻译，位于目的基因下游。 （3）标记基因：用于筛选受体细胞，不控制目的基因表达，不决定性状。 易错03.混淆三种导入方法的适用对象与原理 （1）农杆菌转化法：只适用于植物，依靠T-DNA整合到植物染色体DNA，是最常用的植物转基因方法。 （2）显微注射法：仅用于动物细胞，主要是受精卵，为动物转基因唯一常用方法。 （3）Ca²⁺处理法：只适用于原核微生物，使细胞处于可吸收外源DNA的感受态。 易错04.混淆基因工程三道检测鉴定的层次 （1）检测是否导入：DNA分子杂交，检测细胞内是否存在目的基因。 （2）检测是否转录：核酸分子杂交，检测是否产生mRNA。 （3）检测是否翻译：抗原—抗体杂交，检测是否合成蛋白质；导入成功≠表达成功。 易错05.混淆基因工程与蛋白质工程的本质区别 （1）基因工程：只能生产自然界已存在的蛋白质，改造生物现有性状。 （2）蛋白质工程：通过改造基因，可生产自然界不存在的新型蛋白质，是基因工程的延伸。 （3）蛋白质工程直接改造对象是基因，而非蛋白质，改造基因可稳定遗传。 易错06.误解转基因生物的三类安全问题 （1）食物安全：主要担忧滞后效应、过敏原、营养成分改变，不存在绝对的“有毒定论”。 （2）生物安全：转基因生物可能造成基因污染，破坏野生生物基因多样性。 （3）环境安全：可能改变生态系统食物链、食物网，破坏生态平衡。 易错07.混淆设计试管婴儿与试管婴儿、克隆人伦理 （1）普通试管婴儿：仅解决不孕不育问题，无基因筛选，属于正常辅助生殖技术。 （2）设计试管婴儿：胚胎植入前进行基因检测筛选，可用于治病，需严格规范。 （3）我国法律禁止生殖性克隆人，不反对、不禁止治疗性克隆用于医学研究。 妙招01.基因工程工具“一键区分法” ①限制酶：专一识别特定核苷酸序列，切割磷酸二酯键，具有特异性，产生黏性末端或平末端； ②DNA连接酶：只连接磷酸二酯键，无识别序列特异性，不修复氢键； ③运载体：无催化作用，仅携带目的基因，具备复制原点、标记基因、多酶切位点三大必备条件。 妙招02.受体细胞导入方法“对象匹配法” ①植物细胞：首选农杆菌转化法，依托T-DNA整合至植物染色体DNA，适用绝大多数植物； ②动物细胞：只用显微注射法，针对受精卵操作，是动物转基因专属方法； ③微生物细胞：采用Ca²⁺处理法，使细胞变为感受态，高效吸收外源DNA。 妙招03.目的基因鉴定“三层逐级判读法” ①导入水平：DNA分子杂交，检测受体细胞是否存在目的基因； ②表达转录水平：核酸分子杂交，检测细胞是否转录出对应mRNA； ③表达翻译水平：抗原—抗体杂交，检测是否合成目标蛋白质，三步全部成功才算有效表达。 妙招04.基因工程与蛋白质工程“本质二分法” ①基因工程：只复制表达自然界原有基因，生产天然存在的蛋白质，不改造基因结构； ②蛋白质工程：定向改造基因结构，可合成自然界不存在的新型蛋白质，属于基因工程的延伸。 妙招05.转基因安全问题“三类定点记忆法” ①食物安全：聚焦过敏、营养改变、滞后效应三大核心风险； ②生物安全：核心隐患为基因污染，干扰野生生物基因库； ③环境安全：破坏原有生态平衡、改变生物多样性，影响生态系统稳态。 妙招06.生物技术伦理“正反界定法” ①试管婴儿：无基因筛选，仅解决不孕不育，合规合法； ②设计试管婴儿：胚胎基因筛选，多用于疾病治疗，严格受限使用； ③克隆技术：严禁生殖性克隆人，允许治疗性克隆用于医学研究。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！1 1 / 1 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $