2027年高考一轮生物学总复习讲义-10.6 基因工程的基本工具和基本操作程序

第6讲　基因工程的基本工具和基本操作程序 考情研读·备考定位 课标要求 核心素养 1．概述基因工程的诞生。 2．阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 3．活动：DNA的粗提取与鉴定。 4．活动：利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。 5．阐明基因工程的基本操作程序 1．从结构与功能观角度理解基因工程的原理。(生命观念) 2．对比分析基因工程的三种操作工具，明确各自的应用及特点。(科学思维) 3．通过“DNA的粗提取与鉴定”实验，培养实验与探究能力。(科学探究) 4．通过“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，培养实验与探究能力。(科学探究) 考点一　重组DNA技术的基本工具 知|识|巩|固 1．基因工程的概念 (1)手段：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性。 (2)目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 (3)水平：DNA分子水平。由于在DNA分子水平上进行设计和施工，因此又叫作重组DNA技术。 2．重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)——“分子手术刀” (2)DNA连接酶——“分子缝合针” ①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA单链上。 ②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。 (3)载体——“分子运输车” 思|维|辨|析 易错整合，判断正误。 (1)DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA。(　　) (2)载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等，其中动植物病毒一般是DNA病毒。(　　) (3)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因。(　　) 延|伸|探|究 1．限制酶主要来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？原核生物中存在限制酶的意义是什么？ 提示：原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 2．天然的DNA分子是否可以直接用作基因工程载体？为什么？ 提示：不可以。具有能自我复制、有一个至多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等特点的DNA分子才可以直接用作基因工程的载体。实际上天然的DNA分子一般不完全具备上述条件，往往需经过人工改造后才能用于基因工程操作。 重|难|精|讲 1．基因工程的理论基础 2．图解限制酶的选择原则 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 (3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 特别提醒：(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。 (2)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端或平末端。 (3)限制酶在识别序列中心轴线两侧切开形成的是黏性末端，而在识别序列中心轴线处切开形成的是平末端。 3．与DNA有关的几种酶的比较 作用对象 作用部位 作用结果 限制酶 DNA 分子 磷酸 二酯键 将DNA切成两个或多个片段 DNA连 接酶 DNA分 子片段 磷酸 二酯键 将两个或多个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚 合酶 脱氧核 苷酸 磷酸 二酯键 以DNA单链为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA链上 解旋酶 DNA 分子 碱基对中 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链 DNA酶 DNA 分子 磷酸 二酯键 将DNA片段水解为脱氧核苷酸 精|准|命|题 考向一　围绕基因工程的基本工具，考查科学思维 》例1　(2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 》例2　(2023·山西卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　) A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 考向二　结合载体的作用及特点，考查科学思维 》例3　(2025·广东广州模拟)下列有关基因工程中载体的说法，正确的是(　　) A．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒 B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体 C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子 D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因 》例4　(2026·连云港调研)质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是(　　) 项目 细菌在含氨苄青霉素 的培养基上生长情况 细菌在含四环素的 培养基上生长情况 ① 能生长 不能生长 ② 能生长 能生长 ③ 不能生长 能生长 A．质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点 B．①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b C．质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个 D．将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶 考点二　基因工程的基本操作程序 知|识|巩|固 1．目的基因的筛选与获取 (1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 (2)筛选合适的目的基因 ①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。 (3)目的基因的获取 ①人工合成目的基因。 ②常用PCR特异性地快速扩增目的基因。 [易错提醒]变性过程双链DNA解聚为单链不需要解旋酶。 教材隐含知识 1．(选择性必修3 P79旁栏思考)PCR不可以扩增mRNA的原因是PCR是以DNA双链作模板的，不能直接用单链RNA进行PCR，必须把mRNA逆转录成cDNA之后再进行PCR。 [易错提醒]在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活，故PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。 2．基因表达载体的构建——基因工程的核心 (1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 教材隐含知识 2．(选择性必修3 P80旁栏思考)为什么不直接把目的基因导入受体细胞，而要用载体？游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。 (2)基因表达载体的组成及作用 (3)构建过程 3．将目的基因导入受体细胞 生物 种类 植物 动物 微生物 常用 方法 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法 受体 细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 转化 过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入 辨析 (1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。 (2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。 (3)农杆菌特点 ①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 ②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 4．目的基因的检测与鉴定 思|维|辨|析 易错整合，判断正误。 (1)所有的目的基因都可以从基因文库中获取。(　　) (2)用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的酶是DNA连接酶。(　　) (3)基因表达载体中含有启动子和密码子。(　　) (4)Ti质粒上的T－DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起。(　　) (5)目的基因的检测和鉴定过程中，分子水平的检测方法都是PCR技术。(　　) (6)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。(　　) (7)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。(　　) 延|伸|探|究 1．利用PCR扩增目的基因时，为什么要用2种不同的引物？ 提示：DNA是两条反向平行的双链结构，而复制时只能从固定的方向(模板链的3′端)开始，所以引物的碱基序列是不同的。 2．不能将目的基因插入载体的标记基因中，为什么？ 提示：标记基因用于鉴定目的基因是否成功导入受体细胞，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若标记基因中有目的基因插入，则标记基因被破坏，无法进行筛选。 3．在构建质粒载体时，目的基因的序列中能否含有用到的限制酶的识别序列，为什么？ 提示：不能，因为目的基因的序列中若含有用到的限制酶的识别序列，目的基因可能会被切断。 重|难|精|讲 1．PCR技术和DNA复制的比较 2．PCR扩增过程中的循环图示与规律 循环次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物A(或B)的 DNA分子数 1 3 7 2n－1 同时含引物A、B 的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗的引物数量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－2 2n＋1－2 目的DNA 0 0 2 2n－2n 3．如何筛选出含有目的基因的受体细胞 (1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。 (2)被转化的大肠杆菌有三种：含环状目的基因的大肠杆菌、含重组质粒的大肠杆菌、含质粒的大肠杆菌。 (3)筛选方法：将大肠杆菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的大肠杆菌和含质粒的大肠杆菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 4．启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 DNA DNA mRNA mRNA 位置 目的基 因上游 目的基 因下游 mRNA 首端 mRNA 尾端 功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(不编码氨基酸) 精|准|命|题 考向　考查基因工程的基本操作程序 》例1　科学家将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin－Ⅱ导入杨树细胞，培育成了抗虫杨树。如图表示含目的基因的DNA分子和农杆菌质粒，图中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，NeoR表示新霉素抗性基因，箭头表示识别序列完全不同的4种限制酶的酶切位点。下列叙述不正确的是(　　) A．目的基因插入质粒的T－DNA上，才能整合到受体细胞染色体中 B．为使目的基因与质粒高效重组，最好选用EcoRⅠ和PstⅠ C．成功导入重组质粒的细胞会表现为不抗氨苄青霉素、抗新霉素 D．可用PCR等技术或抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否表达 》例2　(2023·全国甲卷)接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题： (1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是____________ ____________________________________________________________________。 (2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是____________________。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是________。 (3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取______________________进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是______________________________________________________ __________________________________________________________。 (4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。 __________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 考点三　DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 知|识|巩|固 1．DNA的粗提取与鉴定 (1)实验原理 (2)实验步骤 [提醒]①加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。 ②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。 2．DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)实验基础 (2)PCR实验操作步骤 (3)DNA的电泳鉴定 思|维|辨|析 易错整合，判断正误。 (1)在溶有DNA的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色。(　　) (2)DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。(　　) (3)进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 ℃条件下储存。(　　) (4)在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关。(　　) (5)为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程中不必更换。(　　) 精|准|命|题 考向一　考查DNA粗提取与鉴定 》例1　(2024·安徽卷)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　) A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 例2　(2024·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是(　　) A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 向二　考查DNA片段的扩增及电泳鉴定 》例3　(2025·广东肇庆调研)在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，错误的是(　　) A．该载体最可能为环形DNA分子 B．两种限制酶在载体上各有一个酶切位点 C．限制酶R1与R2的切割位点最短相距200 bp D．限制酶作用位点会导致氢键和肽键断裂 》例4　(2026·山东潍坊安丘一中模拟)大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述错误的是(　　) A．提取DNA时可加入酒精，使溶于酒精的蛋白质等物质溶解 B．将提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液后可用二苯胺试剂进行鉴定 C．电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着与它所带电荷相反的电极移动的原理 D．根据电泳结果，质粒上一定没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点 真|题|再|现 1．(2025·安徽卷)质粒K中含有β－半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X－gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是(　　) A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 2．(2024·湖南卷)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　) A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 3．(2025·河北卷)为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： (1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是________和________。模板与引物在PCR反应的________阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为________。 (2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加________(填两种限制酶)的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成________键。 (3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为________，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量________，则表明融合蛋白能结合镉离子。 (4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是__________。240 μmol·L－1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是_________________________ _____________________________________________________________________。 注：镉粒子对渗透压的影响忽略不计 (5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是________和________。(填标号) ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖 ②衣藻生长速率受镉离子浓度影响 ③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质 ④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 4．(2025·河南卷)某二倍体植物松散株型与紧凑株型是一对相对性状，紧凑株型适合高密度种植，利于增产。研究人员获得了一个紧凑株型的植株，为研究控制该性状的基因，将其与纯合松散株型植株杂交，F1均为松散株型，F2中松散株型∶紧凑株型＝3∶1，控制该相对性状的基因为A/a。回答下列问题： (1)该紧凑株型性状由________(填“A”或“a”)基因控制。 (2)在A基因编码蛋白质的区域中插入一段序列得到a基因(图1)，a基因表达的肽链比A基因表达的肽链短。造成此现象的原因是____________。 (3)研究人员设计了3条引物(P1～P3)，位置如图1(→表示引物5′→3′方向)。以3个F2单株(甲、乙、丙)的DNA为模板，使用不同引物组合进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果分别为图2－A和2－B(不考虑PCR结果异常)。 ①图2－A中使用的引物组合是________；丙单株无扩增条带的原因是____________________________________________________________。 ②结合图2－A的扩增结果，在图2－B中，参照甲的条带补充乙与丙的电泳条带(将正确条带涂黑)。 ③使用图2－A中的引物组合扩增F2全部样本，有扩增条带松散株型∶无扩增条带松散株型＝________。 5．(2025·河南卷)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题： (1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是____________。将培养后的菌液混匀并充分________，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 (2)为构建携带cg(CG的编码基因)的大肠杆菌表达载体(图1)，对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coli DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5′端最好含有________酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是__________________________________。 限制酶的识别序列和切割位点如下： (3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，目的是______________________________，随后在含________和________的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 (4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度(保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键)，如图2所示。根据分析结果，选择第________位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是________________________ __________________________________________________________。 6．(2025·山东卷)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T－DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为________。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaⅠ和________对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是________。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶________进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为________bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由于T－DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T－DNA的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为________(填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶，且T－DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段________，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为________(填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，________(填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。 7．(2025·黑吉辽内卷)香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (1)可从________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5′端分别引入________和________限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5 kb(kb为千碱基对)，假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1－4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________的污染。初步判断实验组________(从“1～4”中选填)的质粒中成功插入了基因N，理由是________。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列)，b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有________。 a：5′－…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…－3′ b：5′－…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…－3′ c：5′－…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…－3′ d：5′－…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…－3′ (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的________含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 8．(2024·重庆卷)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是__________________________________ ____________________________________________________________________。 (2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是________；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ，原因是______________________________________ ____________________________________________________________________。 (3)为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有____________________________。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是________。 (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ－1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T＋基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ－2的种子也变大，但小于YZ－1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是 _________________________________________________________。 提能训练　练案[44] A组 一、选择题 1．(2025·宁夏二模)下列关于DNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶有关的叙述，错误的是(　　) A．都是由脱氧核苷酸连接而成的多聚体 B．都能降低相应化学反应所需的活化能 C．催化活性都要受温度、pH等的影响 D．其合成过程都需经过转录和翻译阶段 2．(2025·河北衡水高二下阶段练习)将外源基因导入受体细胞的过程中需要使用载体，下列有关载体的叙述错误的是(　　) A．载体应对宿主细胞无伤害，以免影响宿主细胞的正常生命活动 B．载体应具有一个至多个限制酶切割位点，以便于目的基因的插入 C．基因工程中被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上改造的 D．将外源基因送入受体细胞的载体可以是切割DNA分子的酶 3．(2025·河北衡水高二下阶段练习)下列与“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验有关的叙述，错误的是(　　) A．因DNA溶于酒精但蛋白质不溶于酒精可分离DNA与蛋白质 B．DNA的粗提取与鉴定实验中提取物与二苯胺溶液混匀后需加热再观察显色变化 C．DNA分子在电场作用下在凝胶中向着与它所带电荷相反的电极移动 D．待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时需停止电泳并取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 4．(2026·江苏南通高三上开学考试)图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有(　　) A．基因A与基因a互为等位基因，其突变不具有可逆性 B．两种限制酶酶切形成的末端类型不同，用E.coli DNA连接酶连接效率更高 C．HindⅢ切割基因A时，催化磷酸二酯键和氢键的断裂 D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定 5．(2026·湖南怀化高三上开学考试)链状DNA分子经限制酶切割产生的黏性末端如图所示。下列叙述正确的是(　　) A．限制酶切断的是同一条链上两个特定相邻碱基间的氢键 B．图中同一条链上两个相邻碱基N间有脱氧核糖、磷酸基团各2个 C．每条链5′端、3′端的C原子分别与羟基、磷酸基团相连接 D．理论上，图示黏性末端最多可能有256种 6．(2026·重庆高二上开学考试)将某外源基因与质粒结合形成重组质粒的过程如图。下列说法错误的是(　　) A．氨苄青霉素抗性基因可作为筛选重组DNA的标记基因 B．用不同限制酶分别切割含目的基因的DNA和质粒也能产生相同黏性末端 C．构建重组质粒时，除了需BamHⅠ酶外，还需DNA连接酶 D．图中方法可保证目的基因定向与质粒相连形成重组质粒 7．(2026·广东深圳高三上开学考试)下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。下列相关叙述正确的是(　　) A．①中Ti质粒应包含启动子、复制原点等元件 B．②的构建需要限制酶和DNA聚合酶等物质的参与 C．③侵染后，重组Ti质粒的全部序列都整合到④的染色体上 D．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就一定表现出抗虫性状 二、非选择题 8．(2026·河南安阳高三上阶段练习)血栓病是心脑血管疾病中死亡率和严重致残率较高的重大疾病之一。组织纤溶酶原激活剂(t－PA)可选择性高效激活血栓中的纤溶酶原生成纤溶酶，后者可水解血栓中纤维蛋白，使血管畅通，故t－PA能应用于预防和治疗急性心肌梗死等血栓性疾病。研究人员获取t－PA基因的cDNA，利用pUC19质粒、pPIC9K质粒构建基因表达载体，过程如图所示，图中①②③④表示过程。回答下列问题： 注：pPIC9K质粒中的AmpR、KanR表示标记基因，Ori表示复制原点，带箭头的序列表示启动子，指示线指示酶切位点。 (1)图示过程中，需要用到DNA连接酶、逆转录酶的过程分别是________、________(填图中的数字)。经过程②③获取的目的基因含有山羊β－酪蛋白/CMV杂合启动子，故构建重组质粒时，宜选用限制酶__________对pPIC9K质粒进行酶切。 (2)挑选未发情的成年母兔肌肉注射促性腺激素，连续注射4天后与公兔配种，第5天后手术取卵，这些步骤的目的是____________________________。将重组质粒导入受体细胞内，再通过__________技术获得转基因兔。待转基因母兔产仔后收集其乳汁，将乳汁离心获得乳清，采用____________方法检测乳清中是否存在t－PA。 (3)用纤维蛋白平板溶圈法测定纯化乳清中t－PA的活性。在含有纤维蛋白(呈乳白色)和纤溶酶原的平板上打出大小相同的孔隙，将t－PA标准品和待测样品加入各孔隙中，在37 ℃条件下培养至出现透明圈，测定各透明圈的直径，参照标准曲线即可测得t－PA的活性。该检测方法的原理：若t－PA的活性高，则__________________________________，透明圈直径大。 B组 一、选择题 1．(2025·江苏南京高二下阶段练习)下列有关限制酶和DNA连接酶的叙述，正确的是(　　) A．用限制酶酶切获得一个外源基因时得到两个切口，有2个磷酸二酯键被断开 B．限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越小 C．序列—C↓ATG—和—G↓GATCC—被限制酶切出的黏性末端碱基数不同 D．T4 DNA连接酶和E.coli DNA连接酶催化平末端和黏性末端的连接效率相同 2．(2025·新疆乌鲁木齐高二下期末)下列关于基因工程基本工具的叙述，正确的是(　　) A．限制酶只能特异性地识别由6个核苷酸组成的序列 B．限制酶切割DNA分子一次可断开2个磷酸二酯键，产生2个游离的磷酸基团 C．用作分子运输车的质粒常有特殊的抗生素合成基因，便于重组DNA分子的筛选 D．DNA连接酶能连接双链DNA片段互补的黏性末端或平末端，从而恢复被限制酶切开的氢键 3．(2026·重庆高三上阶段练习)用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。下列叙述错误的是(　　) A．两种限制性内切核酸酶识别的核苷酸序列不同，限制酶的识别序列越短，则该DNA被该酶切割的概率越高 B．泳道②中是用XhoⅠ处理得到的酶切产物 C．若用XhoⅠ和SalⅠ两种酶同时处理该DNA片段后电泳，会同时得到泳道①②对应条带 D．电泳技术中最终能够肉眼看到多条电泳条带，离不开核酸染料对DNA的染色和紫外灯的照射 4．(2025·吉林高三上阶段练习)某线性DNA分子含有5 000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a、b的识别序列和切割位点如图表所示。下列有关说法正确的是(　　) 酶a切割产物长度(bp) 酶b再次切割产物长度(bp) 2 100；1 400；1 000；500 1 900；200；800；600；1 000；500 A．酶a与酶b识别的序列不同，产生的黏性末端相同，因此无序列的特异性 B．酶a与酶b切出的黏性末端不能用DNA连接酶连接 C．该DNA分子中酶a与酶b的识别序列分别有2个和2个 D．若酶b完全切割与该DNA序列相同的质粒，得到的切割产物有2种 5．(2026·江西九江高三上开学考试)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是(　　) A．以洋葱为材料研磨时需要切碎后加入蒸馏水进行充分研磨 B．预冷的酒精溶液容易使DNA析出 C．利用二苯胺试剂对提取的DNA进行鉴定时，不需要进行沸水浴 D．粗提取的DNA中不含有蛋白质 6．(2026·湖北高三上开学考试)如图是利用基因工程技术培育抗除草剂作物的部分过程，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶，且切割DNA分子后形成的末端均不同。下列说法正确的是(　　) A．图示质粒分子在SmaⅠ切割前后分别含有0或1个游离的磷酸基团 B．培育抗除草剂作物的核心是将含bar基因的表达载体导入受体细胞 C．可选用PstⅠ和EcoRⅠ切割质粒和bar基因，确保目的基因正确插入 D．利用PCR技术可从分子水平检测bar基因是否翻译出抗除草剂蛋白 7．(2025·河北衡水阶段练习)研究人员将北极比目鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。下列叙述错误的是(　　) A．构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶 B．需将afp基因整合到Ti质粒T－DNA上，以便将其整合到番茄细胞的染色体DNA上 C．检测出番茄细胞中含有afp基因，不一定代表抗冻番茄培育成功 D．可将转化后的番茄放入低温环境中进行培养，观察其生长状况 二、非选择题 8．(2026·山西长治高三上阶段练习)乙烯受体是感受乙烯和转导信号的初始元件，广泛存在于各种植物中，并决定植物各种组织对乙烯反应的敏感性。对多种植物的研究表明，钝化植物对外源乙烯的敏感性比抑制内源乙烯的生物合成可以更为有效地延长植物的采后寿命。科学家从草莓中提取乙烯受体ErsⅠ基因，通过基因工程将ErsⅠ基因反向连接在启动子后，筛选转入反义ErsⅠ基因的草莓，达到延长储藏期的效果。回答下列问题： (1)草莓DNA的提取：取草莓植株叶片，置于预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉碎后，加入400 μL研磨液。待充分研磨后收集至离心管中，离心5 min后取①于另一干净离心管中，加入80 μL体积分数为95%的预冷酒精，离心5 min之后取②保存。过程中的①②分别是________、________(填“上清液”或“沉淀”)。 (2)通过上述方法获得DNA后，需要通过PCR技术扩增ErsⅠ基因(如图)。为使目的基因与质粒连接，在设计PCR引物扩增ErsⅠ基因时需添加限制酶XhoⅠ的识别序列(3′－GAGCTC－5′)。已知ErsⅠ基因左端①处的碱基序列为－TTCCAATTTTAA－，则其中一种引物设计的序列是5′－________－3′，进行PCR时缓冲液中加入Mg2＋的作用是________。 (3)经XhoⅠ酶切后的载体和ErsⅠ基因进行连接(如图)，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、ErsⅠ基因与载体正向连接、ErsⅠ基因与载体反向连接。为鉴定这3种连接方式，选择________对筛选的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，若电泳结果中有________bp的DNA片段出现，则进行了反向连接。 (4)用________处理农杆菌，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，将筛选得到的反向连接质粒与处理后的农杆菌混合，使重组质粒进入农杆菌。用阳性农杆菌感染植物细胞，将其接种于添加有________的固体培养基上进行筛选，最后通过________技术培育出完整的转基因植株。 (5)得到的转基因植株乙烯受体的合成受阻，其原因是________。 第6讲　基因工程的基本工具和基本操作程序 考情研读·备考定位 课标要求 核心素养 1．概述基因工程的诞生。 2．阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 3．活动：DNA的粗提取与鉴定。 4．活动：利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。 5．阐明基因工程的基本操作程序 1．从结构与功能观角度理解基因工程的原理。(生命观念) 2．对比分析基因工程的三种操作工具，明确各自的应用及特点。(科学思维) 3．通过“DNA的粗提取与鉴定”实验，培养实验与探究能力。(科学探究) 4．通过“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，培养实验与探究能力。(科学探究) 考点一　重组DNA技术的基本工具 知|识|巩|固 1．基因工程的概念 (1)手段：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性。 (2)目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 (3)水平：DNA分子水平。由于在DNA分子水平上进行设计和施工，因此又叫作重组DNA技术。 2．重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)——“分子手术刀” (2)DNA连接酶——“分子缝合针” ①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA单链上。 ②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。 (3)载体——“分子运输车” 思|维|辨|析 易错整合，判断正误。 (1)DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA。(　　) (2)载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等，其中动植物病毒一般是DNA病毒。(　　) (3)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因。(　　) 答案：(1)×　(2)√　(3)× 延|伸|探|究 1．限制酶主要来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？原核生物中存在限制酶的意义是什么？ 提示：原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 2．天然的DNA分子是否可以直接用作基因工程载体？为什么？ 提示：不可以。具有能自我复制、有一个至多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等特点的DNA分子才可以直接用作基因工程的载体。实际上天然的DNA分子一般不完全具备上述条件，往往需经过人工改造后才能用于基因工程操作。 重|难|精|讲 1．基因工程的理论基础 2．图解限制酶的选择原则 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 (3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 特别提醒：(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。 (2)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端或平末端。 (3)限制酶在识别序列中心轴线两侧切开形成的是黏性末端，而在识别序列中心轴线处切开形成的是平末端。 3．与DNA有关的几种酶的比较 作用对象 作用部位 作用结果 限制酶 DNA 分子 磷酸 二酯键 将DNA切成两个或多个片段 DNA连 接酶 DNA分 子片段 磷酸 二酯键 将两个或多个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚 合酶 脱氧核 苷酸 磷酸 二酯键 以DNA单链为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA链上 解旋酶 DNA 分子 碱基对中 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链 DNA酶 DNA 分子 磷酸 二酯键 将DNA片段水解为脱氧核苷酸 精|准|命|题 考向一　围绕基因工程的基本工具，考查科学思维 》例1　(2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 答案：D 解析：若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含四环素培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含氨苄青霉素的培养基中能形成菌落，在含四环素的培养基中不能形成菌落，D错误。 》例2　(2023·山西卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　) A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 答案：C 解析：酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。 考向二　结合载体的作用及特点，考查科学思维 》例3　(2025·广东广州模拟)下列有关基因工程中载体的说法，正确的是(　　) A．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒 B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体 C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子 D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因 答案：D 解析：在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；具有一至多个限制酶切割位点、具有标记基因的质粒才可以作为基因工程中的载体，B错误；细菌没有染色体，质粒是一种独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的环状DNA分子，C错误；作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因，而且能在受体细胞中复制并稳定保存，D正确。 》例4　(2026·连云港调研)质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是(　　) 项目 细菌在含氨苄青霉素 的培养基上生长情况 细菌在含四环素的 培养基上生长情况 ① 能生长 不能生长 ② 能生长 能生长 ③ 不能生长 能生长 A．质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点 B．①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b C．质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个 D．将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶 答案：C 解析：质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点，A错误；①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b，②是c，③是a，B错误；将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶，D错误。 考点二　基因工程的基本操作程序 知|识|巩|固 1．目的基因的筛选与获取 (1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 (2)筛选合适的目的基因 ①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。 (3)目的基因的获取 ①人工合成目的基因。 ②常用PCR特异性地快速扩增目的基因。 [易错提醒]变性过程双链DNA解聚为单链不需要解旋酶。 教材隐含知识 1．(选择性必修3 P79旁栏思考)PCR不可以扩增mRNA的原因是PCR是以DNA双链作模板的，不能直接用单链RNA进行PCR，必须把mRNA逆转录成cDNA之后再进行PCR。 [易错提醒]在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活，故PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。 2．基因表达载体的构建——基因工程的核心 (1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 教材隐含知识 2．(选择性必修3 P80旁栏思考)为什么不直接把目的基因导入受体细胞，而要用载体？游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。 (2)基因表达载体的组成及作用 (3)构建过程 3．将目的基因导入受体细胞 生物 种类 植物 动物 微生物 常用 方法 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法 受体 细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 转化 过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入 辨析 (1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。 (2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。 (3)农杆菌特点 ①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 ②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 4．目的基因的检测与鉴定 思|维|辨|析 易错整合，判断正误。 (1)所有的目的基因都可以从基因文库中获取。(　　) (2)用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的酶是DNA连接酶。(　　) (3)基因表达载体中含有启动子和密码子。(　　) (4)Ti质粒上的T－DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起。(　　) (5)目的基因的检测和鉴定过程中，分子水平的检测方法都是PCR技术。(　　) (6)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。(　　) (7)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。(　　) 答案：(1)×　(2)×　(3)×　(4)√　(5)×　(6)√　(7)× 延|伸|探|究 1．利用PCR扩增目的基因时，为什么要用2种不同的引物？ 提示：DNA是两条反向平行的双链结构，而复制时只能从固定的方向(模板链的3′端)开始，所以引物的碱基序列是不同的。 2．不能将目的基因插入载体的标记基因中，为什么？ 提示：标记基因用于鉴定目的基因是否成功导入受体细胞，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若标记基因中有目的基因插入，则标记基因被破坏，无法进行筛选。 3．在构建质粒载体时，目的基因的序列中能否含有用到的限制酶的识别序列，为什么？ 提示：不能，因为目的基因的序列中若含有用到的限制酶的识别序列，目的基因可能会被切断。 重|难|精|讲 1．PCR技术和DNA复制的比较 2．PCR扩增过程中的循环图示与规律 循环次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物A(或B)的 DNA分子数 1 3 7 2n－1 同时含引物A、B 的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗的引物数量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－2 2n＋1－2 目的DNA 0 0 2 2n－2n 3．如何筛选出含有目的基因的受体细胞 (1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。 (2)被转化的大肠杆菌有三种：含环状目的基因的大肠杆菌、含重组质粒的大肠杆菌、含质粒的大肠杆菌。 (3)筛选方法：将大肠杆菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的大肠杆菌和含质粒的大肠杆菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 4．启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 DNA DNA mRNA mRNA 位置 目的基 因上游 目的基 因下游 mRNA 首端 mRNA 尾端 功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(不编码氨基酸) 精|准|命|题 考向　考查基因工程的基本操作程序 》例1　科学家将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin－Ⅱ导入杨树细胞，培育成了抗虫杨树。如图表示含目的基因的DNA分子和农杆菌质粒，图中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，NeoR表示新霉素抗性基因，箭头表示识别序列完全不同的4种限制酶的酶切位点。下列叙述不正确的是(　　) A．目的基因插入质粒的T－DNA上，才能整合到受体细胞染色体中 B．为使目的基因与质粒高效重组，最好选用EcoRⅠ和PstⅠ C．成功导入重组质粒的细胞会表现为不抗氨苄青霉素、抗新霉素 D．可用PCR等技术或抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否表达 答案：D 解析：农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，根据这一特点，将目的基因插入质粒的T－DNA上，才能整合到受体细胞染色体中，A正确；应选用EcoRⅠ和PstⅠ切割质粒，保证目的基因正向连接到载体，氨苄青霉素抗性基因会被破坏，故成功导入重组质粒的细胞会表现为不抗氨苄青霉素、抗新霉素，B、C正确；检测目的基因是否表达应检测是否成功产生蛋白质，可用抗原—抗体杂交技术，D错误。 》例2　(2023·全国甲卷)接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题： (1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是____________ ____________________________________________________________________。 (2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是____________________。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是________。 (3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取______________________进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是______________________________________________________ __________________________________________________________。 (4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。 __________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 答案：(1)疫苗中不含乙肝病毒DNA　(2)用于筛选含有重组表达载体的细胞　RNA聚合酶　(3)染色体DNA(基因组DNA)　与目的基因特异性互补且带有标记的DNA片段(带标记的含有目的基因的DNA片段)　(4)从酵母细胞中提取总蛋白质，再用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测是否出现杂交带 解析：(1)重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面的一种病毒蛋白。蛋白质注入人体后，无法完成病毒遗传物质的复制与蛋白质的合成，无法独立增殖。 (2)抗生素抗性基因作为标记基因，用于重组表达载体的筛选。RNA聚合酶识别目的基因启动子并驱动转录。 (3)检测的目的是目的基因是否插入染色体中，故提取酵母细胞染色体DNA进行目的基因鉴定。基因探针是一段带有检测标记，且顺序是已知的、与目的基因互补的DNA片段。 (4)检测目的蛋白在宿主细胞中是否表达，通常采用抗原—抗体杂交的实验方法。因此，要检测目的蛋白在酵母细胞中是否表达，首先需要提取酵母细胞的总蛋白，然后用特异性抗体进行杂交，若出现杂交带，则说明酵母细胞表达了目的蛋白。 考点三　DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 知|识|巩|固 1．DNA的粗提取与鉴定 (1)实验原理 (2)实验步骤 [提醒]①加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。 ②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。 2．DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)实验基础 (2)PCR实验操作步骤 (3)DNA的电泳鉴定 思|维|辨|析 易错整合，判断正误。 (1)在溶有DNA的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色。(　　) (2)DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。(　　) (3)进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 ℃条件下储存。(　　) (4)在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关。(　　) (5)为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程中不必更换。(　　) 答案：(1)×　(2)√　(3)×　(4)×　(5)× 精|准|命|题 考向一　考查DNA粗提取与鉴定 》例1　(2024·安徽卷)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　) A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 答案：D 解析：研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可初步分离DNA，B正确；DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。 》例2　(2024·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是(　　) A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 答案：A 解析：在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4 ℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确；研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。 考向二　考查DNA片段的扩增及电泳鉴定 》例3　(2025·广东肇庆调研)在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，错误的是(　　) A．该载体最可能为环形DNA分子 B．两种限制酶在载体上各有一个酶切位点 C．限制酶R1与R2的切割位点最短相距200 bp D．限制酶作用位点会导致氢键和肽键断裂 答案：D 解析：单用限制酶R1或R2切割均只得到一段序列(两种限制酶切割产生的DNA片段等长)，可知载体可能是环状DNA分子，当用两种限制酶R1和R2同时切割载体时，产生两种长度的DNA片段，则这两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，两种限制酶同时切割可得到200 bp和600 bp的DNA分子片段，可知限制酶R1和R2的酶切位点最短相距200 bp，A、B、C正确；限制酶是切割DNA的工具，能够特异性识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，D错误。 》例4　(2026·山东潍坊安丘一中模拟)大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述错误的是(　　) A．提取DNA时可加入酒精，使溶于酒精的蛋白质等物质溶解 B．将提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液后可用二苯胺试剂进行鉴定 C．电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着与它所带电荷相反的电极移动的原理 D．根据电泳结果，质粒上一定没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点 答案：D 解析：由于蛋白质可溶于酒精，而DNA在冷酒精中溶解度很低，所以在提取DNA时加入酒精，使溶于酒精的蛋白质等物质溶解，而让DNA析出，A正确；由于DNA在2 mol/L NaCl溶液中溶解度较大，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，所以将提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液后，可用二苯胺试剂在沸水浴条件下进行鉴定，B正确；电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着与它所带电荷相反的电极移动的原理，C正确；因为质粒的本质是环状的DNA，限制酶Ⅰ和Ⅱ处理后电泳只有一条条带，可能是该质粒上有一个切割位点，也可能没有切割位点，D错误。 真|题|再|现 1．(2025·安徽卷)质粒K中含有β－半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X－gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是(　　) A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 答案：C 解析：使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于感受态，提高转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质粒，包括含目的基因的重组质粒(可能形成白色菌落)和未重组的质粒K(形成蓝色菌落)，故可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确；由于仅含卡那霉素，未添加X－gal，无论导入的是重组质粒还是空白质粒，因不含X－gal，无法产生蓝色物质，故生长出的菌落均为白色，B正确；筛选平板中长出的白色菌落，可能是导入了重组质粒(含目的基因)，但也可能是目的基因插入方向错误的重组质粒或表达错误的质粒，不能仅仅因为是白色菌落就判定为表达目标蛋白的菌株，C错误；若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化的质粒K中β－半乳糖苷酶基因完整，能表达活性β－半乳糖苷酶，分解X－gal形成蓝色菌落，D正确。 2．(2024·湖南卷)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　) A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 答案：B 解析：限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；酶切条件不合适通常会使切割效果下降，此时应调整反应条件如温度和pH等，调整酶的用量没有作用，B错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。 3．(2025·河北卷)为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： (1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是________和________。模板与引物在PCR反应的________阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为________。 (2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加________(填两种限制酶)的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成________键。 (3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为________，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量________，则表明融合蛋白能结合镉离子。 (4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是__________。240 μmol·L－1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是_________________________ _____________________________________________________________________。 注：镉粒子对渗透压的影响忽略不计 (5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是________和________。(填标号) ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖 ②衣藻生长速率受镉离子浓度影响 ③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质 ④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 答案：(1)脱氧核苷酸　引物　复性　PCR反应需要在高温条件下进行变性步骤(90～95 ℃使双链DNA解旋为单链)，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的DNA聚合酶能在高温环境中保持活性，保证PCR反应的正常进行　(2)SmaⅠ和EcoRⅠ　磷酸二酯键　(3)细胞表面发出黄色荧光　高　(4)转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用　镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用　(5)①　③ 解析：(1)在PCR反应中，原料是脱氧核苷酸，随着反应进行不断被消耗，分子数量逐渐减少；引物在PCR过程中会结合到模板DNA上参与子链合成，也会逐渐减少，所以分子数量逐渐减少的是引物和脱氧核苷酸。模板与引物在PCR的复性阶段开始结合。在复性过程中，温度降低，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，是因为PCR反应需要在高温条件下进行变性步骤(90～95 ℃使双链DNA解旋为单链)，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的DNA聚合酶能在高温环境中保持活性，保证PCR反应的正常进行。 (2)观察图1，将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，需分别使用两种限制酶切割可以产生不同的黏性末端，能保证目的基因准确插入载体。因为NbeⅠ和XbaⅠ限制酶切割后产生的黏性末端相同，所以这两种限制酶只能选一个，按照连接的顺序在将GP1连接到载体时应该用SmaⅠ和EcoRⅠ。DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键，从而将载体和目的基因连接起来。 (3)若在荧光显微镜下观察到细胞表面发出黄色荧光，初步表明融合蛋白表达成功，因为融合蛋白中有黄色荧光蛋白YFP，其表达后会发出黄色荧光。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量高，则表明融合蛋白能结合镉离子。因为融合蛋白中的CADR可吸附水体中的镉离子，若融合蛋白发挥作用，会使细胞壁镉离子含量升高。 (4)转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用。240 μmol·L－1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用。 (5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是①和③。①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖，能够持续发挥作用；③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质，便于后续处理，而化学药物可能存在二次污染等问题。 4．(2025·河南卷)某二倍体植物松散株型与紧凑株型是一对相对性状，紧凑株型适合高密度种植，利于增产。研究人员获得了一个紧凑株型的植株，为研究控制该性状的基因，将其与纯合松散株型植株杂交，F1均为松散株型，F2中松散株型∶紧凑株型＝3∶1，控制该相对性状的基因为A/a。回答下列问题： (1)该紧凑株型性状由________(填“A”或“a”)基因控制。 (2)在A基因编码蛋白质的区域中插入一段序列得到a基因(图1)，a基因表达的肽链比A基因表达的肽链短。造成此现象的原因是____________。 (3)研究人员设计了3条引物(P1～P3)，位置如图1(→表示引物5′→3′方向)。以3个F2单株(甲、乙、丙)的DNA为模板，使用不同引物组合进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果分别为图2－A和2－B(不考虑PCR结果异常)。 ①图2－A中使用的引物组合是________；丙单株无扩增条带的原因是____________________________________________________________。 ②结合图2－A的扩增结果，在图2－B中，参照甲的条带补充乙与丙的电泳条带(将正确条带涂黑)。 ③使用图2－A中的引物组合扩增F2全部样本，有扩增条带松散株型∶无扩增条带松散株型＝________。 答案：(1)a　(2)插入序列后，a基因中编码终止密码子的序列提前，a基因转录产生的mRNA提前终止翻译　(3)P2和P3　丙的基因型为AA，无引物P3的结合序列，利用引物P2和P3扩增时，无法得到扩增产物　　2∶1 解析：(1)根据题意可知，研究人员获得了一个紧凑株型的植株，为研究控制该性状的基因，将其与纯合松散株型植株杂交，F1均为松散株型，F2中松散株型∶紧凑株型＝3∶1，说明紧凑株型为隐性性状，由a基因控制。 (2)在A基因编码蛋白质的区域中插入一段序列得到a基因(图1)，a基因表达的肽链比A基因表达的肽链短，说明终止密码子提前出现，因此推测可能是A基因内部插入一段序列后，使a基因中编码终止密码子的序列提前，a基因转录产生的mRNA提前终止翻译。 (3)①子二代中的基因型为AA、Aa、aa，根据图示可知，A和a基因上均含有P1和P2引物互补的序列，而P3引物识别的序列只有a基因中才存在，若选择引物P1和P2进行扩增，则A基因和a基因均能扩增出相应产物，只是a基因扩增的产物长度要大于A基因扩增的产物，即AA的个体扩增产物的电泳条带与aa的个体扩增产物的电泳条带不同，且Aa的个体扩增产物的电泳条带应为两条，与图2－A不符，若选择引物P3和P2进行扩增，则只有Aa和aa的个体中因含有a基因而能扩增出产物，且扩增出的产物电泳条带相同，而AA的个体由于不含与P3引物结合的序列，因此不能扩增出产物，没有对应的电泳条带。即图2－A中使用的引物组合是P2和P3，丙的基因型为AA，无引物P3的结合序列，利用引物P2和P3扩增时，无法得到扩增产物。 ②图2－A是利用引物P3和P2扩增后电泳的结果，则图2－B是利用引物P1和P2扩增的产物电泳的结果。由于a基因扩增出来的产物长度大于A基因扩增的产物，因此AA(松散株型)、aa(紧凑株型)基因的个体扩增的产物电泳时均只有一个条带，且aa基因的个体扩增的产物电泳时形成的电泳条带距离点样孔近，而Aa(松散株型)的个体扩增的产物电泳时会出现两个电泳条带，故乙与丙的电泳条带为。 ③使用图2－A中的引物组合(P3和P2)扩增F2全部样本，由于只有含a基因的个体才能扩增出相应产物，且A_为松散株型，而子二代中Aa∶AA＝2∶1，所以使用图2－A中的引物组合扩增F2全部样本，有扩增条带松散株型(Aa)∶无扩增条带松散株型(AA)＝2∶1。 5．(2025·河南卷)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题： (1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是____________。将培养后的菌液混匀并充分________，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 (2)为构建携带cg(CG的编码基因)的大肠杆菌表达载体(图1)，对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coli DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5′端最好含有________酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是__________________________________。 限制酶的识别序列和切割位点如下： (3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，目的是______________________________，随后在含________和________的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 (4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度(保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键)，如图2所示。根据分析结果，选择第________位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是________________________ __________________________________________________________。 答案：(1)在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大　稀释　(2)BamHⅠ　重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列　(3)使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态　卡拉胶　四环素　(4)44　该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小 解析：(1)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。由于在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大，因此可选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌。将培养后的菌液混匀并充分稀释，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 (2)E.coli DNA连接酶连接具有黏性末端的片段效率高，因此切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的限制酶，即不能选择EcoRⅤ酶和SmaⅠ酶，而SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割后的黏性末端相同，若选择SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割，会出现质粒和目的基因的自连，甚至目的基因倒接，因此切割质粒时SpeⅠ酶与XbaⅠ酶中只能选择一个，而另一个限制酶需要选择BamHⅠ酶，又由于转录的方向是由启动子→终止子，且mRNA形成的方向是5′→3′，且mRNA与DNA的模板链方向相反，因此基因模板链的3′应靠近启动子，故为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5′端最好含有BamHⅠ酶切位点。T4 DNA连接酶既可以连接平末端，也可连接黏性末端，不同的平末端均可由T4 DNA连接酶连接，由于限制酶的识别序列具有专一性，若连接后的序列不存在最初限制酶的识别序列，则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割。故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列。 (3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，便于重组DNA进入受体细胞。由于具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种可分解卡拉胶，使其菌落周围形成透明圈，且重组质粒上含有四环素抗性基因，因此导入目的基因的大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 (4)据图可知，虚线长度代表氨基酸间的空间距离，由于第44位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小，因此选择第44位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适。 6．(2025·山东卷)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T－DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为________。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaⅠ和________对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是________。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶________进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为________bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由于T－DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T－DNA的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为________(填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶，且T－DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段________，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为________(填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，________(填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。 答案：(1)复制原点　XbaⅠ　DNA聚合酶　SmaⅠ和SpeⅠ　550　(2)4　环化　测序和序列比对　(3)不能 解析：(1)DNA复制的起点是复制原点，因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据SmaⅠ限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaⅠ酶切，抗除草剂基因可以正向接入质粒也可以反向接入质粒，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamHⅠ，因为该限制酶会破坏终止子，因此可选择XbaⅠ和SmaⅠ进行酶切，XbaⅠ酶切会形成黏性末端，需要用DNA聚合酶将黏性末端补平(可使重组质粒最小，同时PstⅠ酶切后产生的黏性末端无法用DNA聚合酶抹平，因为DNA聚合酶只能从3′延伸子链)。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T－DNA片段上含有一个SmaⅠ酶切位点和一个SpeⅠ酶切位点，可以选择用SmaⅠ和SpeⅠ进行酶切，转录的方向是从模板的3′→5′，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为550 bp，若反向接，较短的条带长度近似为200 bp。 (2)由于后续PCR难以扩增大片段DNA，所以最好选择识别序列为4个碱基的限制酶，原因是识别序列越短，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的PCR扩增。由于引物是根据已知序列设计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否是同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此对同一个基因的操作为测序和序列比对。 (3)突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。 7．(2025·黑吉辽内卷)香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (1)可从________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5′端分别引入________和________限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5 kb(kb为千碱基对)，假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1－4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________的污染。初步判断实验组________(从“1～4”中选填)的质粒中成功插入了基因N，理由是________。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列)，b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有________。 a：5′－…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…－3′ b：5′－…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…－3′ c：5′－…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…－3′ d：5′－…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…－3′ (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的________含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 答案：(1)基因数据库/序列数据库　XhoⅠ　XbaⅠ　DNA连接酶　(2)外源DNA　1　目的基因N大小为2.3kb　(3)GCC　(4)香树脂醇 解析：(1)GenBank是目前国际上广泛使用的序列数据库之一，它的数据主要是各国的实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息，故可从序列数据库或基因数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶，分析图1可知，质粒pYL应该选用SpeⅠ和XhoⅠ酶切，由于目的基因N含有SpeⅠ识别序列，故N基因不能使用SpeⅠ酶切，但XbaⅠ与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用XbaⅠ替换SpeⅠ，即N基因两端应该含有XbaⅠ和XhoⅠ识别序列。题干信息：N基因a链为转录模板链，用引物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的5′端含有引物1序列，而编码链的5′端含有引物2序列，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2的5′端添加XbaⅠ、引物1的5′端添加XhoⅠ识别序列。 (2)构建重组质粒，大小约9.5 kb(kb为千碱基对)，假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，而质粒pYL本身7.2 kb，可知目的基因N大小为2.3 kb。分析电泳图可知，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应体系是否存在污染，即检验PCR反应中是否有外源DNA污染。 (3)编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA。密码子位于mRNA上，mRNA上的序列与编码链序列相似，而a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列)，可知a引物延伸后的序列为编码链。b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析题图bcd序列可知，c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，且c引物延伸后的序列为编码链，根据a引物5′－端首位GCA为240位，则c引物5′－端GCC为243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。 (4)题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。由此可知，进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 8．(2024·重庆卷)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是__________________________________ ____________________________________________________________________。 (2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是________；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ，原因是______________________________________ ____________________________________________________________________。 (3)为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有____________________________。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是________。 (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ－1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T＋基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ－2的种子也变大，但小于YZ－1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是 _________________________________________________________。 答案：(1)脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸) (2)EcoRⅠ　酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向连接(反向连接)　(3)酶切后的空载体片段、启动子D＋基因S片段　PCR　(4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大 解析：(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。 (2)①根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoRⅠ的识别序列，若使用限制酶EcoRⅠ，会使目的基因序列被破坏。 ②根据图中限制酶的识别序列可知，限制酶SpeⅠ和XbaⅠ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段正向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。 (3)①DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D＋基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D＋基因S”片段。 ②在分子水平上可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。 (4)根据(4)题目信息可知，再生植株YZ－1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ－2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。 提能训练　练案[44] A组 一、选择题 1．(2025·宁夏二模)下列关于DNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶有关的叙述，错误的是(　　) A．都是由脱氧核苷酸连接而成的多聚体 B．都能降低相应化学反应所需的活化能 C．催化活性都要受温度、pH等的影响 D．其合成过程都需经过转录和翻译阶段 答案：A 解析：DNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶的化学本质都是蛋白质，都是由氨基酸连接而成的多聚体，A错误；酶能降低化学反应所需的活化能，因此这三种酶都能降低相关化学反应所需的活化能，B正确；酶的作用条件温和，温度、pH等都会影响酶活性，故这三种酶的作用过程都要受温度、pH等的影响，C正确；三种酶的化学本质都是蛋白质，蛋白质的合成需经过转录和翻译阶段，D正确。 2．(2025·河北衡水高二下阶段练习)将外源基因导入受体细胞的过程中需要使用载体，下列有关载体的叙述错误的是(　　) A．载体应对宿主细胞无伤害，以免影响宿主细胞的正常生命活动 B．载体应具有一个至多个限制酶切割位点，以便于目的基因的插入 C．基因工程中被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上改造的 D．将外源基因送入受体细胞的载体可以是切割DNA分子的酶 答案：D 解析：载体需和目的基因一起进入宿主细胞并与其共存，因此载体应对宿主细胞无伤害，以免影响宿主细胞的正常生命活动，A正确；载体应具有一个至多个限制酶切割位点，以便与目的基因拼接形成重组载体，B正确；天然的质粒往往存在不足，基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，C正确；切割DNA分子的酶为限制酶，是基因工程的工具之一，但不是运载体，D错误。 3．(2025·河北衡水高二下阶段练习)下列与“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验有关的叙述，错误的是(　　) A．因DNA溶于酒精但蛋白质不溶于酒精可分离DNA与蛋白质 B．DNA的粗提取与鉴定实验中提取物与二苯胺溶液混匀后需加热再观察显色变化 C．DNA分子在电场作用下在凝胶中向着与它所带电荷相反的电极移动 D．待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时需停止电泳并取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 答案：A 解析：因DNA不溶于酒精但蛋白质溶于酒精，因而可分离DNA与蛋白质，A错误；将提取到的丝状物(DNA)与二苯胺溶液充分混匀后，需要水浴加热才能呈现蓝色，B正确；DNA分子具有极性，在电场作用下，会在凝胶中向着与它所带电荷相反的电极移动，这是DNA电泳的原理，C正确；电泳缓冲液加入电泳槽，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时停止电泳，以防止样品流失到缓冲液中，之后取出凝胶置于紫外灯下观察和照相，D正确。 4．(2026·江苏南通高三上开学考试)图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有(　　) A．基因A与基因a互为等位基因，其突变不具有可逆性 B．两种限制酶酶切形成的末端类型不同，用E.coli DNA连接酶连接效率更高 C．HindⅢ切割基因A时，催化磷酸二酯键和氢键的断裂 D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定 答案：D 解析：突变是不定向的，所以突变具有可逆性，A错误；E.coli DNA连接酶连接平末端的效率低于T4 DNA连接酶，而AluⅠ限制酶切割DNA形成的是平末端，应该用T4 DNA连接酶，B错误；HindⅢ切割基因A时，破坏磷酸二酯键，C错误；因为正常基因A和致病基因a的HindⅢ切割位点不同，所以产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定，D正确。 5．(2026·湖南怀化高三上开学考试)链状DNA分子经限制酶切割产生的黏性末端如图所示。下列叙述正确的是(　　) A．限制酶切断的是同一条链上两个特定相邻碱基间的氢键 B．图中同一条链上两个相邻碱基N间有脱氧核糖、磷酸基团各2个 C．每条链5′端、3′端的C原子分别与羟基、磷酸基团相连接 D．理论上，图示黏性末端最多可能有256种 答案：D 解析：限制酶的作用对象是DNA分子的两条链中脱氧核糖和磷酸之间的磷酸二酯键，DNA分子有两条链，因此，限制酶切断的是DNA分子两条链上两个特定相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，A错误；图中同一条链上两个相邻碱基N间有脱氧核糖2个、磷酸基团1个，B错误；图中每条链5′端、3′端的碳原子分别与磷酸基团、羟基相连接，C错误；图中黏性末端含有4个碱基，因此，理论上，图示黏性末端最多可能有44＝256种，D正确。 6．(2026·重庆高二上开学考试)将某外源基因与质粒结合形成重组质粒的过程如图。下列说法错误的是(　　) A．氨苄青霉素抗性基因可作为筛选重组DNA的标记基因 B．用不同限制酶分别切割含目的基因的DNA和质粒也能产生相同黏性末端 C．构建重组质粒时，除了需BamHⅠ酶外，还需DNA连接酶 D．图中方法可保证目的基因定向与质粒相连形成重组质粒 答案：D 解析：氨苄青霉素抗性基因是质粒上的标记基因，可用于筛选含有重组DNA的受体细胞，A正确；不同的限制酶识别不同的核苷酸序列，但可能由于识别序列部分相同，切割后可能会产生相同的黏性末端，B正确；构建重组质粒时，首先要用BamHⅠ酶切割质粒和含目的基因的DNA，产生相同的黏性末端，然后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接起来，C正确；仅用BamHⅠ一种限制酶切割，目的基因和质粒都可能会发生自身环化，或者目的基因与质粒反向连接，不能保证目的基因定向与质粒相连形成重组质粒，D错误。 7．(2026·广东深圳高三上开学考试)下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。下列相关叙述正确的是(　　) A．①中Ti质粒应包含启动子、复制原点等元件 B．②的构建需要限制酶和DNA聚合酶等物质的参与 C．③侵染后，重组Ti质粒的全部序列都整合到④的染色体上 D．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就一定表现出抗虫性状 答案：A 解析：基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子、复制原点组成，即①中Ti质粒应包含启动子、终止子、标记基因和复制原点等元件，A正确；②是目的基因表达载体，其构建过程需要限制酶和DNA连接酶，B错误；③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T－DNA整合到受体细胞的染色体上，C错误；④的染色体上若含抗虫基因，但目的基因也可能不能转录或者不能翻译，或者表达的蛋白质不具有生物活性，即⑤不一定表现出抗虫性状，D错误。 二、非选择题 8．(2026·河南安阳高三上阶段练习)血栓病是心脑血管疾病中死亡率和严重致残率较高的重大疾病之一。组织纤溶酶原激活剂(t－PA)可选择性高效激活血栓中的纤溶酶原生成纤溶酶，后者可水解血栓中纤维蛋白，使血管畅通，故t－PA能应用于预防和治疗急性心肌梗死等血栓性疾病。研究人员获取t－PA基因的cDNA，利用pUC19质粒、pPIC9K质粒构建基因表达载体，过程如图所示，图中①②③④表示过程。回答下列问题： 注：pPIC9K质粒中的AmpR、KanR表示标记基因，Ori表示复制原点，带箭头的序列表示启动子，指示线指示酶切位点。 (1)图示过程中，需要用到DNA连接酶、逆转录酶的过程分别是________、________(填图中的数字)。经过程②③获取的目的基因含有山羊β－酪蛋白/CMV杂合启动子，故构建重组质粒时，宜选用限制酶__________对pPIC9K质粒进行酶切。 (2)挑选未发情的成年母兔肌肉注射促性腺激素，连续注射4天后与公兔配种，第5天后手术取卵，这些步骤的目的是____________________________。将重组质粒导入受体细胞内，再通过__________技术获得转基因兔。待转基因母兔产仔后收集其乳汁，将乳汁离心获得乳清，采用____________方法检测乳清中是否存在t－PA。 (3)用纤维蛋白平板溶圈法测定纯化乳清中t－PA的活性。在含有纤维蛋白(呈乳白色)和纤溶酶原的平板上打出大小相同的孔隙，将t－PA标准品和待测样品加入各孔隙中，在37 ℃条件下培养至出现透明圈，测定各透明圈的直径，参照标准曲线即可测得t－PA的活性。该检测方法的原理：若t－PA的活性高，则__________________________________，透明圈直径大。 答案：(1)②④　①　SacⅠ、SnaBⅠ　(2)促进雌兔超数排卵，与公兔配种后获得多枚受精卵，作为转基因的受体细胞　胚胎移植　抗原—抗体杂交 (3)t－PA激活纤溶酶原生成的纤溶酶含量高，水解纤维蛋白多 解析：(1)过程②和④中将DNA片段与质粒连接，需要DNA连接酶，过程①利用mRNA获得cDNA，需要逆转录酶。已知经过过程②③获取的目的基因含有山羊β－酪蛋白/CMV杂合启动子，故构建重组质粒时，不需要保留pPIC9K质粒的启动子，但需要保留复制原点和标记基因等，且最好使用双酶切，故宜选用SacⅠ、SnaBⅠ两种限制酶对pPIC9K质粒进行酶切。 (2)挑选未发情的成年母兔肌肉注射促性腺激素，连续注射4天后与公兔配种，第5天后手术取卵，这些步骤的目的是促进雌兔超数排卵，与公兔配种后获得多枚受精卵，作为转基因的受体细胞。将重组质粒导入受体细胞内，再通过早期胚胎培养、胚胎移植技术获得转基因兔。待转基因母兔产仔后收集其乳汁，将乳汁离心获得乳清，采用抗原—抗体杂交方法检测乳清中是否存在t－PA。 (3)已知t－PA可选择性高效激活血栓中的纤溶酶原生成纤溶酶，后者可水解血栓中的纤维蛋白。在含有纤维蛋白(不透明)和纤溶酶原的平板中加入t－PA，若t－PA的活性高，则t－PA激活纤溶酶原生成的纤溶酶含量高，水解纤维蛋白多，透明圈直径大。 B组 一、选择题 1．(2025·江苏南京高二下阶段练习)下列有关限制酶和DNA连接酶的叙述，正确的是(　　) A．用限制酶酶切获得一个外源基因时得到两个切口，有2个磷酸二酯键被断开 B．限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越小 C．序列—C↓ATG—和—G↓GATCC—被限制酶切出的黏性末端碱基数不同 D．T4 DNA连接酶和E.coli DNA连接酶催化平末端和黏性末端的连接效率相同 答案：C 解析：限制酶切割DNA双链时，每个切口会断开2个磷酸二酯键(双链各1个)。若获得一个外源基因需切两次(两个切口)，则共断开4个磷酸二酯键，A错误；限制酶识别序列越短，其在DNA中出现的概率越大，B错误；序列—C↓ATG—被切割后，黏性末端为单链“AT”的2个碱基；而—G↓GATCC—被切割后，黏性末端为单链“GATC”的4个碱基(如BamHⅠ酶切)，两者碱基数不同，C正确；T4 DNA连接酶催化平末端连接的效率高于E.coli DNA连接酶，D错误。 2．(2025·新疆乌鲁木齐高二下期末)下列关于基因工程基本工具的叙述，正确的是(　　) A．限制酶只能特异性地识别由6个核苷酸组成的序列 B．限制酶切割DNA分子一次可断开2个磷酸二酯键，产生2个游离的磷酸基团 C．用作分子运输车的质粒常有特殊的抗生素合成基因，便于重组DNA分子的筛选 D．DNA连接酶能连接双链DNA片段互补的黏性末端或平末端，从而恢复被限制酶切开的氢键 答案：B 解析：大多数限制酶能特异性地识别由6个核苷酸组成的序列，A错误；限制酶切割双链DNA时，会在两条链上各断开一个磷酸二酯键，共断开2个，每个切口产生1个游离的磷酸基团，总计2个，B正确；质粒作为运载体需携带标记基因(如抗生素抗性基因)，而非“抗生素合成基因”，C错误；DNA连接酶的作用是连接磷酸二酯键，而非恢复氢键。氢键的恢复依赖碱基互补配对，D错误。 3．(2026·重庆高三上阶段练习)用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。下列叙述错误的是(　　) A．两种限制性内切核酸酶识别的核苷酸序列不同，限制酶的识别序列越短，则该DNA被该酶切割的概率越高 B．泳道②中是用XhoⅠ处理得到的酶切产物 C．若用XhoⅠ和SalⅠ两种酶同时处理该DNA片段后电泳，会同时得到泳道①②对应条带 D．电泳技术中最终能够肉眼看到多条电泳条带，离不开核酸染料对DNA的染色和紫外灯的照射 答案：C 解析：酶具有专一性，不同的限制酶识别并切割不同的核苷酸序列，限制酶的识别序列越短，则该DNA被该酶切割的概率越高，A正确；分析图1可知，限制酶XhoⅠ有两处切割位点，切割后产生3个DNA片段，泳道②中是用XhoⅠ处理得到的酶切产物，B正确；泳道①②是分别用SalⅠ和XhoⅠ切割DNA分子电泳得到的结果，若用XhoⅠ和SalⅠ两种酶同时处理该DNA片段后电泳，应该在一个泳道里出现6种条带，C错误；电泳条带染色是通过化学或荧光染料与分离后的分子(如DNA、RNA、蛋白质)特异性结合，使其在凝胶中显现，以便观察、分析和记录的关键步骤。因此电泳技术中最终能够肉眼看到多条电泳条带，离不开核酸染料对DNA的染色和紫外灯的照射，D正确。 4．(2025·吉林高三上阶段练习)某线性DNA分子含有5 000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a、b的识别序列和切割位点如图表所示。下列有关说法正确的是(　　) 酶a切割产物长度(bp) 酶b再次切割产物长度(bp) 2 100；1 400；1 000；500 1 900；200；800；600；1 000；500 A．酶a与酶b识别的序列不同，产生的黏性末端相同，因此无序列的特异性 B．酶a与酶b切出的黏性末端不能用DNA连接酶连接 C．该DNA分子中酶a与酶b的识别序列分别有2个和2个 D．若酶b完全切割与该DNA序列相同的质粒，得到的切割产物有2种 答案：D 解析：酶a与酶b都切开特定部位的磷酸二酯键，切断的化学键相同；但酶a的识别序列为AGATCT，酶b的识别序列为GGATCC，两种酶的识别序列不相同，因此这两种酶具有专一性，A错误；酶a与酶b切出的黏性末端相同，均为GATC，能用DNA连接酶连接，B错误；由酶切产物可知，酶a单独切割后会形成4个片段，说明含有3个酶a的酶切位点；酶b再次酶切后，又新形成4种片段，说明有2个酶b的酶切位点，C错误；质粒为环状DNA分子，若酶b完全切割与该DNA序列相同的质粒，质粒上有2个酶b的酶切位点，则得到的切割产物有2种，D正确。 5．(2026·江西九江高三上开学考试)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是(　　) A．以洋葱为材料研磨时需要切碎后加入蒸馏水进行充分研磨 B．预冷的酒精溶液容易使DNA析出 C．利用二苯胺试剂对提取的DNA进行鉴定时，不需要进行沸水浴 D．粗提取的DNA中不含有蛋白质 答案：B 解析：洋葱研磨时需加入研磨液，仅用蒸馏水无法有效破碎细胞并释放DNA，A错误；DNA不溶于高浓度冷酒精，预冷的酒精可降低DNA溶解度，使其析出，B正确；二苯胺试剂鉴定DNA需在沸水浴(约100 ℃)条件下显蓝色，否则无法观察到明显颜色变化，C错误；粗提取的DNA中可能残留少量蛋白质(如未完全分解的组蛋白)，需通过进一步纯化去除，D错误。 6．(2026·湖北高三上开学考试)如图是利用基因工程技术培育抗除草剂作物的部分过程，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶，且切割DNA分子后形成的末端均不同。下列说法正确的是(　　) A．图示质粒分子在SmaⅠ切割前后分别含有0或1个游离的磷酸基团 B．培育抗除草剂作物的核心是将含bar基因的表达载体导入受体细胞 C．可选用PstⅠ和EcoRⅠ切割质粒和bar基因，确保目的基因正确插入 D．利用PCR技术可从分子水平检测bar基因是否翻译出抗除草剂蛋白 答案：C 解析：质粒为环状DNA，SmaⅠ切割后形成线性DNA，含2个游离磷酸基团，A错误；基因工程核心是基因表达载体的构建，B错误；PstⅠ和EcoRⅠ切割可避免质粒自身环化和目的基因反向连接，C正确；PCR检测目的基因是否导入，抗原—抗体杂交检测是否翻译出相应蛋白质，D错误。 7．(2025·河北衡水阶段练习)研究人员将北极比目鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。下列叙述错误的是(　　) A．构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶 B．需将afp基因整合到Ti质粒T－DNA上，以便将其整合到番茄细胞的染色体DNA上 C．检测出番茄细胞中含有afp基因，不一定代表抗冻番茄培育成功 D．可将转化后的番茄放入低温环境中进行培养，观察其生长状况 答案：A 解析：构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶和DNA连接酶，不需要核酸酶，A错误；Ti质粒上的T－DNA可整合到宿主细胞的染色体DNA上，因此需将afp基因整合到Ti质粒T－DNA上，以便将其整合到番茄细胞的染色体DNA上，B正确；只有番茄具有抗冻性才能代表抗冻番茄培育成功，含有的afp基因若不表达，也不会形成抗冻番茄，不能代表抗冻番茄培育成功，C正确；检测转基因抗冻番茄是否培育成功的最简便方法是在个体水平上进行抗性鉴定，即观察其是否能在相对寒冷的环境中生长，D正确。 二、非选择题 8．(2026·山西长治高三上阶段练习)乙烯受体是感受乙烯和转导信号的初始元件，广泛存在于各种植物中，并决定植物各种组织对乙烯反应的敏感性。对多种植物的研究表明，钝化植物对外源乙烯的敏感性比抑制内源乙烯的生物合成可以更为有效地延长植物的采后寿命。科学家从草莓中提取乙烯受体ErsⅠ基因，通过基因工程将ErsⅠ基因反向连接在启动子后，筛选转入反义ErsⅠ基因的草莓，达到延长储藏期的效果。回答下列问题： (1)草莓DNA的提取：取草莓植株叶片，置于预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉碎后，加入400 μL研磨液。待充分研磨后收集至离心管中，离心5 min后取①于另一干净离心管中，加入80 μL体积分数为95%的预冷酒精，离心5 min之后取②保存。过程中的①②分别是________、________(填“上清液”或“沉淀”)。 (2)通过上述方法获得DNA后，需要通过PCR技术扩增ErsⅠ基因(如图)。为使目的基因与质粒连接，在设计PCR引物扩增ErsⅠ基因时需添加限制酶XhoⅠ的识别序列(3′－GAGCTC－5′)。已知ErsⅠ基因左端①处的碱基序列为－TTCCAATTTTAA－，则其中一种引物设计的序列是5′－________－3′，进行PCR时缓冲液中加入Mg2＋的作用是________。 (3)经XhoⅠ酶切后的载体和ErsⅠ基因进行连接(如图)，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、ErsⅠ基因与载体正向连接、ErsⅠ基因与载体反向连接。为鉴定这3种连接方式，选择________对筛选的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，若电泳结果中有________bp的DNA片段出现，则进行了反向连接。 (4)用________处理农杆菌，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，将筛选得到的反向连接质粒与处理后的农杆菌混合，使重组质粒进入农杆菌。用阳性农杆菌感染植物细胞，将其接种于添加有________的固体培养基上进行筛选，最后通过________技术培育出完整的转基因植株。 (5)得到的转基因植株乙烯受体的合成受阻，其原因是________。 答案：(1)上清液　沉淀　(2)CTCGAGTTCCAATTTTAA　Mg2＋是DNA聚合酶的激活剂，能提高其催化PCR反应的效率　(3)HpaⅠ酶和BamHⅠ酶　300 bp和6 400　(4)Ca2＋　潮霉素　植物组织培养　(5)反义ErsⅠ基因的转录产物与ErsⅠ基因的转录产物碱基互补配对，使得翻译过程受阻 解析：(1)取草莓植株叶片，置于预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉碎后，加入400 μL研磨液。待充分研磨后收集至离心管中离心，沉淀物中含细胞结构等其他杂质，上清液中含有DNA，故离心后取①上清液于另一干净离心管中，加入80 μL体积分数为95%的预冷酒精，DNA不溶于乙醇，部分蛋白质杂质可溶于乙醇，故离心5 min之后取②沉淀保存。即过程中的①②分别是上清液、沉淀。 (2)由题意得，ErsⅠ基因左端①处的碱基序列为5′－TTCCAATTTTAA－3′，故可设计引物5′－TTCCAATTTTAA－3′，在设计PCR引物扩增ErsⅠ基因时需添加限制酶XhoⅠ的识别序列，已知XhoⅠ的识别序列为3′－GAGCTC－5′，因此需要在引物的5′端添5′－CTCGAG－3′的限制酶XhoⅠ识别序列，故其中一种引物设计的序列是5′－CTCGAGTTCCAATTTTAA－3′。Mg2＋是DNA聚合酶的激活剂，能提高其催化PCR反应的效率。 (3)经XhoⅠ酶切后的载体和ErsⅠ基因进行连接(如图)，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、ErsⅠ基因与载体正向连接、ErsⅠ基因与载体反向连接。若连接产物为单个载体自连，载体上没有BamHⅠ酶识别位点，则使用HpaⅠ酶和BamHⅠ酶切割后，产生6 000 bp的产物；ErsⅠ基因与载体正向连接，重组载体上存在1个BamHⅠ酶和1个HpaⅠ酶识别位点，BamHⅠ酶和HpaⅠ酶识别位点之间的距离为200＋(700－100)＝800，故使用双酶切后的产物为800 bp和6 000＋700－800＝5 900 bp；若ErsⅠ基因与载体反向连接，则BamHⅠ酶和HpaⅠ酶识别位点之间的距离为200＋100＝300 bp，双酶切后的产物为300 bp和6 000＋700－300＝6 400 bp。 (4)用Ca2＋处理农杆菌，目的是使农杆菌处于感受态，即成为一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，便于重组质粒进入农杆菌，完成转化实验。质粒上含有潮霉素抗性基因，将农杆菌涂布接种于添加有潮霉素的固体培养基上，只有含有重组质粒(重组质粒中含有潮霉素抗性基因)的农杆菌才能在该培养基上生长，最后通过植物组织培养技术培育出完整的转基因植株。 (5)由题意可知，通过基因工程将ErsⅠ基因反向连接在启动子后，筛选转入反义ErsⅠ基因的草莓，达到延长储藏期的效果，说明得到的转基因植株乙烯受体的合成受阻，其原因是反义ErsⅠ基因的转录产物与ErsⅠ基因的转录产物碱基互补配对，使得翻译过程受阻。 学科网（北京）股份有限公司 $