2026届高三生物二轮复习课件微专题--限制酶专题

该高中生物学高考复习课件聚焦“限制酶及重组DNA筛选”微专题，依据高考评价体系梳理了限制酶选择、重组DNA构建与筛选等核心考点，结合2021福建卷、2025山东卷等真题分析，明确“双酶切避免反向连接”“标记基因筛选”等高频考点，归纳限制酶类型判断、重组质粒筛选等常考题型。 课件亮点在于“真题情境+问题解决+科学思维”的备考策略，如以2025山东卷Ti质粒改造题为例，解析“同尾酶无缝拼接”“平末端补平”等技巧，培养学生科学思维与探究实践素养。特设“易错点警示”（如反向连接、自身环化）和“答题模板”，助力学生掌握酶切位点设计等得分关键，教师可据此开展针对性复习，提升备考效率。

二轮微专题--难点突破 限制酶及重组DNA的筛选 1种限制酶：反向连接、自身环化 1种限制酶如何筛选重组质粒：2种标记基因--影印法 两种不同的限制酶：如何选择、优点 有一个产生平末端--重组DNA筛选 质粒和目的基因只共有一种限制酶，一端使用共有的限制酶，另一端使用两种同尾酶 在引物的5’端添加限制酶的识别序列 限制酶 以科学思维构建知识体系 问题解决，以不变应万变 例：2022年生理学或医学奖颁发给瑞典生物学家、进化遗传学家斯万特·帕博，以表彰他发现了与已灭绝古人类和人类进化相关的基因组。他们从大量木乃伊中获得少量木乃伊DNA，并在细菌中进行克隆，复制了2400年前的DNA。兴趣小组同学通过阅读相关资料，模拟了其中部分研究过程，设计了如下实验（Mspl、BamHl、Mbol、Smal为4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG）。请回答以下问题： (1)若将图2中质粒和木乃伊基因通过同种限制酶处理后进行连接，构建重组质粒，应选用的限制酶是______。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，最可能的原因是_______；为有效解决此类问题，措施是______。 (2)据图3分析，培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A、B还应分别含有______。从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是______菌落中的细菌。 (1)BamHI 同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因与质粒反向连接 改造目的基因与质粒，使其两端形成不同的酶切位点，满足双酶切需要，构建表达载体 (2)青霉素、四环素 4和6 例：(2021·福建，21节选)微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题： (2)本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。 ①选用__________酶将载体P切开，再用__________(填“T4 DNA”或“E.coliDNA”)连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。 ②载体P′不具有表达MT基因的__________和__________。选用__________酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接。 (2)①EcoRⅤ　T4 DNA　②启动子　终止子　XhoⅠ和PstⅠ 例：（2025山东卷）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为_____。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和_____对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是_____。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶_____进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为_____bp，则一定为正向重组质粒。 (1)复制原点 XbaI DNA聚合酶 SmaI 和 SpeI 550bp (2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为_____（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段_____，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为_____（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，_____（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 (2) 4 环化 测序和序列比对 （3）不能 例：蜘蛛丝由于其出色的强度、韧性、弹性、生物可降解性等，使得它有广泛的用途。MaSp2是蜘蛛丝中综合性能最优异牵引丝的主要组成蛋白。研究人员通过比对分析金纺蜘蛛MaSp2蛋白的N-端重复区的12段相似的氨基酸序列，得出一段重复度较高的核心氨基酸序列，根据大肠杆菌密码子的偏好性，用氨基酸序列推出基因序列（MaSp2基本单元基因—Spin基因）。设计5段存在互补序列的引物（表1），采用重叠延伸PCR技术（图1）对该基因进行人工合成，并在该基因的两端各加上两个酶切位点（表2）。将获得的Spin基因与载体pET28a通过酶切、连接形成重组质粒表达载体pET28a-Spin。请回答下列问题： (1)图1中重叠延伸PCR中的引物3和引物4分别对应表1中的_____；Spin基因中的限制酶a和限制酶c分别对应表2中的______。 (2)重叠延伸PCR反应体系中除5种引物序列及含Mg2+的缓冲液外，还需添加_______。 (3)过程1需要用到的酶有________。 (1)引物e、引物d NdeI、XhoI (2)dNTP(原料或脱氧核苷酸）和TaqDNA聚合酶 (3)EcoRI、XhoI和DNA连接酶 (4)图2所示为研究人员利用同尾酶无缝拼接技术，将合成好的Spin基因片段继续拼接，得到Spin2、Spin4、Spin8、Spin16、Spin32串联体，并将相应片段克隆至表达载体pET28a，构建相应表达盒。单酶切1和单酶切2所用的限制酶分别是________；Spin2串联体和Spin4串联体分别含有____________个限制酶BfaⅠ的识别序列。 (4) NdeI、BfaI 1、1 请判断：DNA片段经限制酶处理后产生的相同黏性末端， 再经过DNA连接酶处理后，形成的新的识别序列， 能否再被所用的限制酶识别？ （1）若两个相同黏性末端都是由同种限制酶 （EcoR Ⅰ）切割后所得， （填“能”或“不能”） 再被所用的限制酶识别。 能 （2）若两个相同黏性末端是由不同限制酶切割所得，形成的新的 识别序列 （填“能” 或“不能”）再被所用的 限制酶识别。 不能 特殊情况：同尾酶的识别序列一长一短，可被识别序列短的限制酶再次识别切割 9 考点P114-T6 总结：拼接后能否被原来的限制酶识别和切割 例：研究显示Gata3基因是大量肿瘤细胞的潜在突变位点，Gata3蛋白由444个氨基酸构成。为研究Gata3蛋白在细胞中的定位，科研人员将GFP（绿色荧光蛋白）基因与Gata3基因融合，构建基因表达载体转入小鼠受精卵，并整合到受精卵的染色体上，获得能正常表达融合蛋白的杂合雌、雄小鼠各一只。相关限制酶识别序列及限制酶识别位点如图所示，A、B、C、F、R为不同引物，回答相关问题： (1)在利用PCR扩增GFP编码区序列的过程中，需要设计引物F和R，在两个引物的________端需分别添加限制酶识别序列。为了使GFP基因能正确插入载体中，需要设计的引物的F和R分别为________。 ①5’-CCCGTCGACAAAAACACTTTTTGATATTCG-3’ ②5’-CCCGTCGACTTCATGCTTGATATGCCAATC-3’ ③5’-CCCCTCGAGTTCATGCTTGATATGCCAATC-3’ ④5’-CCCGAATTCTTCTAGTCGACCACAAGAAG-3’ (1)5' ②④ (2)在构建Gata3基因与GFP基因的融合基因时，应将________基因中编码终止密码子的序列删除，目的是________。 (3)重组载体的构建过程中，用到的限制酶具体有________，将酶处理过的目的基因和载体连接时，需要在低温环境中操作，原因是________。 (4)为了确定目的基因插入到小鼠细胞中染色体上的具体位置，科研人员常用DNA分子原位杂交技术，分子杂交需使用特定序列的单链DNA（ss-DNA）作为分子探针。为制备大量单链DNA片段，研究人员常采用不对称PCR技术。若反应体系中原有50个模板DNA，最初10个循环后限制性引物耗尽，再进行15个循环，理论上可制备ss-DNA________个（用科学计数法计数）。 (5)研究人员从荧光小鼠中提取融合基因的相关DNA片段，若用引物A和B进行PCR扩增，但没能扩增出GFP基因，从PCR操作过程中温度控制角度分析，可能的原因有________（至少写出2点）。 (2)GFP 避免融合基因只表达出GFP蛋白 (3)SalI、EcoRI、MunI、XhoI 低温有利于黏性末端碱基之间形成氢键 (4)7.68x105 (5)变性温度低、复性温度太高 $