专题04 基因工程（期末真题汇编，江苏专用）高二生物下学期

**基本信息** 该试卷为高中生物学基因工程专题期末试题汇编，整合江苏多地期末真题，覆盖基因工程操作、应用及DNA实验核心内容，融入CRISPR/Cas9、蛋白质工程等科技前沿情境，注重科学思维与实验探究能力考查。 **题型特征** |题型|题量/分值|知识覆盖|命题特色| |----|-----------|----------|----------| |单选题|9题|基因工程操作（如逆转录、PCR）、应用（转基因动物）、技术伦理|结合江苏徐州、扬州等地期末真题，基础判断与情境分析结合| |多选题|6题|siRNA作用、双向启动子、荧光定量PCR原理|多选项设计考查知识辨析，如CRISPR技术操作细节| |非选择题|10题|基因克隆（PCR、载体构建）、转基因技术（农杆菌转化）、实验设计（抑菌效果、氮吸收评估）|综合大题整合多技术环节，如噬菌体展示制备抗体、无缝克隆构建载体，突出探究实践与结果分析|

专题04 基因工程 2大高频考点概览 考点01 基因工程基本操作与应用 考点02 DNA 相关实验 地 城 考点01 基因工程基本操作与应用 一、单选题 1．（24-25高二下·江苏徐州·期末）下图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径。下列相关叙述错误的是（    ） A．若A基因是从人细胞内提取的mRNA经逆转录产生的，则A基因中不含启动子序列 B．扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶从引物a、b的3'端进行子链合成 C．利用显微注射法将人血清白蛋白基因导入的绵羊受体细胞是乳腺细胞 D．为了保证从乳汁中获得人血清白蛋白，需将人血清白蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子重组 2．（24-25高二下·江苏扬州·期末）下列关于基因工程应用的叙述，正确的是（    ） A．目的基因与乳腺中特异表达的基因的启动子重组后，导入乳腺细胞 B．转基因动物作为器官移植的供体时，导入某种调节因子以抑制抗原决定基因的表达 C．通过定点突变技术获得的胰岛素基因可直接导入大肠杆菌用于发酵生产 D．可利用蛋白质工程对T4溶菌酶的空间结构直接进行改造，从而提高其耐热性 3．（24-25高二下·江苏无锡·期末）CRISPR/Cas9 基因编辑技术，可以实现对 DNA 的定点切割，其工作原理如下图所示。下列叙述错误的是（    ） A．细菌体内的Cas9能切割外源DNA保护自身，类似于限制酶 B．可通过此技术敲除突变基因根治猫叫综合征等遗传病 C．Cas9对不同目标DNA进行编辑时，应使用不同的向导RNA D．Cas9蛋白剪切DNA片段的精确性随着向导RNA的延长而增加 4．（24-25高二下·江苏淮安·期末）生物技术的应用涉及到很多安全性和伦理问题，下列相关叙述错误的是（    ） A．蛋白质工程可创造自然界中没有的蛋白质，可能会产生新的过敏原 B．上市的转基因产品都经过了安全性审核，但仍必须标注是否存在转基因成分 C．我国禁止生殖性克隆，所以“设计试管婴儿”技术不合法 D．因生物武器的极大危害性，一切试图发展、生产、储存生物武器的行为必须禁止 二、多选题 5．（23-24高二下·江苏镇江·期末）终末期心脏病患者需要进行心脏移植，但移植过程中往往会发生缺血再灌注损伤（IRI），导致心脏坏死。IRI通过促进Caspase8等一系列凋亡基因的表达，导致细胞凋亡最终引起器官坏死。根据Caspase8基因合成的小干扰RNA（siRNA）可以使Caspase8基因沉默，有效抑制IRI所致的器官损伤，其过程如图所示。下列叙述错误的有（　　） A．步骤③将重组质粒导入猪的心肌细胞最常用的方法是显微注射法 B．siRNA对应DNA序列在心肌细胞中表达产生siRNA的步骤④称为逆转录 C．细胞凋亡中会发生Caspase8DNA→siRNA→Caspase8蛋白的过程 D．基因沉默复合物，抑制遗传信息的转录过程，使Caspase8基因沉默 6．（24-25高二下·江苏泰州·期末）双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员在图1所示PCR基础上构建图2所示的表达载体，以检测双向启动子的作用效果。下列分析正确的是（　　） A．用图1PCR技术获取GUS基因时，应选择引物1和4 B．图1PCR至少需经过5次循环才可获得16个双链等长的GUS基因 C．对含LUC基因的重组质粒用SalⅠ和SphⅠ酶切后可构建图2所示载体 D．导入图2表达载体的转基因农杆菌可在含有壮观霉素的培养基上生长 7．（24-25高二下·江苏扬州·期末）荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量。其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当Taq酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。下列叙述正确的是（    ） A．PCR反应体系中需要加入Mg2+以激活Taq酶 B．Taq酶催化DNA的合成方向总是从子链的3'端向5'端延伸 C．在反应体系中，检测到的荧光信号越强则消耗的引物越多 D．若扩增n次，则共需要消耗2n-1个探针 8．（24-25高二下·江苏无锡·期末）科研人员将胰岛素B28位的脯氨酸替换为天冬氨酸或与B29位的赖氨酸交换位置，研发出了速效胰岛素类似物产品并在临床上广泛应用。下列叙述正确的有（    ） A．该过程属于蛋白质工程，生产的速效胰岛素类似物自然界不存在 B．胰岛素改造思路与中心法则的信息流动方向是一致的 C．替换氨基酸时需要用特定的蛋白酶将特定部位的肽键水解 D．胰岛素类似物想要达到预期的疗效，还需检测其高级结构是否正确 三、非选择题 9．（24-25高二下·江苏泰州·期末）借助噬菌体展示技术制备的单克隆全人源抗体scFv，是由常规抗体的1/2轻链可变区（VL）、1/4重链可变区（VH）借助连接短肽（Linker）构成。请回答下列问题： (1)获取由VL-Linker-VH序列构成如图1所示的融合基因scFv。首先，从已免疫的B细胞中提取________，借助图1中的两对引物________、________进行________，分别获得大量的VL、VH的cDNA；其次，利用重叠延伸PCR，将已获得的VL、VH通过Linker连接成融合基因scFv，已知1F的：5'端不能与基因Linker模板链配对的碱基序列为5'-CTTCTACAG-3'，则1R的5'端前6个碱基序列为：5'________3'。 (2)用融合基因scFv与噬菌粒构建表达载体（如图2）。噬菌粒是由噬菌体的部分DNA与质粒经人工构建而成。将目的基因成功插入噬菌粒所需要的酶有________。图2结构中，质粒复制原点的作用是________，能启动子代噬菌体DNA复制的结构是________。 (3)噬菌粒表达载体导入大肠杆菌和获取表面展示有scFv的子代噬菌体（如图3）。常用_______处理大肠杆菌以便于其吸收表达载体，被噬菌粒表达载体转染的大肠杆菌在含有______的培养基中，于_______（场所）中寸翻译出scFv。由于图2结构表达的蛋白质中只有________属于噬菌体，欲构建图3所示的噬菌体就需噬菌体辅助感染，为确保成功，辅助感染的噬菌体必须具有的缺陷是________。 10．（24-25高二下·江苏扬州·期末）某研究团队在哺乳动物细胞中实现了某种必需氨基酸的生物合成。该研究以中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系作为模型系统，CHO细胞系在缺乏任何一种必需氨基酸的培养基上均不能生长。研究人员从大肠杆菌中获取目的基因，设计了密码子优化的生物合成途径，在酵母菌中组装，然后导入CHO细胞中筛选培育出能合成缬氨酸的仓鼠，流程如下表所示。 (1)请完成下表： 实验目的 简要操作步骤 获得大量的目的基因 将缬氨酸的合成基因和2，3-二羟基-3-异戊酸基因先在酵母菌中组装、复制 制备含有目的基因的CHO细胞 将含有目的基因的基因表达载体通过①_______技术导入CHO细胞并进行筛选和鉴定 获取重组细胞 将CHO细胞的细胞核移植到②________期的去核卵母细胞中 形成重构胚 用物理方法如③_______激活重组细胞，使其完成细胞分裂和④_______形成重构胚 培育出能合成缬氨酸的中国仓鼠 将重构胚移植到经激素等处理过的代孕仓鼠子宫内，生出仔鼠 (2)哺乳动物细胞不能合成必需氨基酸的直接原因是缺乏相应的_______。卵母细胞要去核处理的原因是_______，去核的卵母细胞除具有体积大易操作、营养物质丰富等特点外，还含有_______的物质，有利于培养获得克隆动物。对培育至_______时期的重构胚进行胚胎分割可增加供移植的胚胎数量。 (3)研究人员做进一步研究，将转基因获得的CHO细胞系（pMTIV）与对照组细胞（pCtrl）分别置于_______的培养液中进行培养，结果如图所示，由此可得出的实验结论是_______。 11．（24-25高二下·江苏盐城·期末）抗菌肽是一类广泛存在于自然界中的多肽，对细菌、真菌、寄生虫和病毒具有广泛的抑制作用。科研人员将抗菌肽A基因及D基因进行融合形成AD基因（部分过程如图1所示），然后利用酵母菌发酵生产抗菌肽AD。 (1)AD基因复制和表达所需要的原料有______。 (2)PCR的基本过程包括：①变性→②→______③延伸。PCR过程中反应体系所处温度最高的是过程______（填序号）。A基因表达以a链为模板，D基因表达以d链为模板。为了实现图1中两基因重叠延伸，PCR1过程中需要分别在引物______和引物_______的5'端添加互补序列。 (3)为了能使AD基因与图2所示pC穿梭质粒定向连接，需要在AD基因两端加上限制酶______和_______的识别序列，构建重组质粒后导入酵母细胞。用选择性培养基对受体菌进行培养、筛选，从培养基的成分分析，与普通培养基相比，该选择性培养基应______。在酵母细胞中，重组质粒以______为起点进行复制。 (4)酸腐病是由白地霉引起的柑橘贮藏期常见的病害之一。为研究抗菌肽AD（以下简称抗菌肽）对白地霉的抑菌效果，现用无菌打孔器在果实相同部位打孔，每个打孔处接种相同体积的处理液，比较15天后的病斑直径。各组处理及结果见下表： 组别 1 2 3 接种处理方式 接种一定体积的病原菌孢子悬浮液 先接种病原菌孢子悬浮液，2h后再加入抗菌肽溶液 抗菌肽溶液与病原菌孢子悬浮液混合，培养2h后接种 15天后病斑直径/mm 41.3 28.7 11.2 表中数据表明抗菌肽对白地霉_______（从“是”、“否”中选填）有抑菌效果，且抑菌效果最好的处理组别是______，处理效果最好的可能原因是______。 12．（24-25高二下·江苏徐州·期末）大麦的丙氨酸转氨酶（AlaAT）能够使大麦在低氮土壤中正常生长，减少氮肥的使用。启动子（）能驱动基因的特异性表达。研究人员利用RT—PCR技术获得AlaAT的cDNA，并将其取代质粒表达载体（）中的基因，构建成重组质粒表达载体（），开发出了高效吸收和利用氮的转基因大麦。质粒表达载体及AlaAT的cDNA片段如图1所示。请回答下列问题： (1)启动子（）的功能是______。分析图1可知，应使用______酶切割质粒表达载体，以保证其与AlaAT的cDNA正确、高效的重组。 (2)利用RT—PCR技术从大麦中扩增出AlaAT的cDNA前，需设计两种引物P1、P2，并在引物P2的5'端增加碱基序列5'—______—3'，以保证基因与质粒表达载体的正确连接与表达。PCR扩增条件如下：94℃，5min→25个循环（变性、退火、延伸）→72℃，7min，退火温度的设置需参考引物中碱基的______。 (3)将构建好的基因表达载体导入______处理后的农杆菌细胞后，涂布在含有______的培养基中培养，一段时间后，挑取______（从“白色”“蓝色”中选填）菌落并转化大麦细胞，接着利用______技术获得转基因大麦植株。 (4)随机选取（3）中获得的5株转基因大麦，利用RT—PCR和电泳分析根部和茎、叶基因的转录情况，结果如图2所示。 分析图2得出的结论是______。请利用水培法设计实验进一步从个体水平上评估转基因大麦对氮吸收的影响，请简要写出实验思路：______。 13．（24-25高二下·江苏宿迁·期末）Bad基因编码204个氨基酸，是Bcl2（B细胞淋巴瘤/白血病-2）家族中相关的促凋亡基因。下图1为科研人员获得Bad基因重组细菌的主要流程。请回答： (1)进行Bad基因克隆时，基因组DNA不能直接用作PCR扩增的模板，原因是真核生物基因组中存在________序列，在形成成熟mRNA的过程中相关碱基序列被切除。从细胞中提取总RNA或mRNA，在mRNA的引导下使用________酶来合成cDNA链。 (2)引物设计的质量是决定图中“②PCR”成败的关键因素。首先从核酸数据库中获得mBad基因的编码序列，然后在引物的________端加上不同的限制酶识别序列，第三步为了保证抗原标签与mBad基因表达产物中氨基酸顺序正确，有时需要补加核苷酸，但是注意不能产生________，否则会导致合成的融合蛋白质分子量的减小。 (3)图2为②PCR过程的程序参数。②过程PCR反应体系配制完成后，先在冰上预冷，等程序设置完毕后再放入PCR仪中。Step1和Step8的主要目的分别是________、________。由于Step3引物含有________，不能和模板完全匹配，所以Step3的温度比Step6要低一点。 (4)一般而言，②过程后进行电泳检测，双链DNA分子越大则电泳迁移速率越________，除此之外，DNA分子的构型对其电泳迁移速率影响也大：环状超螺旋DNA电泳的速率一般快于线形DNA，从结构的角度分析，原因可能是________。 (5)研究人员在④过程中应优先选择________和________两种限制酶及E. coli DNA连接酶形成重组质粒。 (6)对重组细菌再筛时用抗原-抗体杂交法筛选，得到的阳性重组子细菌还需要进一步进行DNA测序，原因是________。 14．（23-24高二下·江苏镇江·期末）磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体过程如图所示。请回答下列问题： (1)无缝克隆时，T5核酸外切酶（从核苷酸链的外侧向内侧剪切核苷酸）沿_________（选填“5′→3′”或“3′→5′”）的方向水解DNA，过程③通常需要的酶有_________。 (2)PCR1经过_________轮循环可初步获得图中A片段，PCR2扩增GFP基因时需依据_________设计引物F2，PCR1和PCR2通常不在同一反应体系中进行，主要原因是_________。 (3)PCR扩增结束后，常采用_________的方法对产物进行检测。加样孔一端应朝向电极的_________极，PCR产物加到加样孔中通电适宜时间后进行检测，若凝胶上出现_________个条带，且与_________对比，位置和大小一致，表明PCR扩增成功。 (4)利用农杆菌侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有_________的培养基上进行筛选和鉴定，将筛选得到的种子种植可得到转基因拟南芥，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中_________，了解PA的分布和含量。 15．（24-25高二下·江苏扬州·期末）柑橘树生长过程中易受某种革兰氏阴性菌感染，严重影响柑橘产量。科研人员将M基因转入柑橘中，该基因控制合成的酶可抑制该种革兰氏阴性菌的生长与繁殖。图1是培育转基因柑橘的过程示意图，相关限制酶的识别序列及切割位点如下表。回答下列问题： 限制酶名称 识别序列和切割位点 HindⅢ 5'-A↓AGCTT-3′ BamHI 5'-G↓GATCC-3′ SalI 5'-G↓TCGAC-3′ (1)利用PCR技术扩增M基因时，应选择图2中的引物_______（填字母），设计引物序列的主要依据是_______。科研人员还需在两种引物的_______端分别加上了_______和_______序列，以便于目的基因正向插入质粒。 (2)图1重组质粒中除显示的结构外，至少还含有哪些结构?_______（填序号） ①启动子②起始密码子③终止子④终止密码子⑤标记基因⑥目的基因⑦复制原点 (3)为筛选出导入了重组质粒的农杆菌，图3表示运用影印平板法（使一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法）检测基因表达载体是否成功导入了农杆菌。 培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A和培养基B分别还含有_______、_______。据结果分析，含有目的基因的是_______菌落中的细菌。 (4)由柑橘细胞培育成转基因柑橘幼苗需要经过_______两个关键步骤。对转基因柑橘幼苗进行个体水平检测，具体操作是_______。 16．（24-25高二下·江苏南通·期末）金黄色葡萄球菌类肠毒素K(SEIK)可促进人体免疫应答，诱导淋巴细胞释放细胞因子。为研究SEIK作用机制，科研人员利用重叠延伸PCR和无缝克隆技术构建了携带SEIK和GFP（绿色荧光蛋白）融合基因的工程菌，部分过程如下图。请回答下列问题。 (1)PCR的原理是____________。PCR时，复性温度过高会影响_____________，从而导致目标产物减少。 (2)研究发现，SEIK基因和GFP基因的编码链（非模板链）碱基序列分别为： 5'-AAGGTGATATAGGAA……AGAGCCACCTCCGCC-3' 5´-TGAACCGCCTCCACC……GGCATCGACGAGCTG-3ˊ 则在PCR1反应体系中加入的引物F1、R1分别为______、______（从①~④中选填）。 序号 引物碱基序列 ① 5'-AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC-3' ② 5'-ACGAGTGGATCACTCAAGGTGATATAGGAA-3' ③ 5'-GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCT-3' ④ 5'-AACATAGACATGTGCAAGGTGATATAGGAA-3' (3)无缝克隆时，T5核酸外切酶作用的化学键是_________。过程①中，T5核酸外切酶水解脱氧核苷酸链的长度应大于同源序列长度，目的是____________________。过程③所需的酶有___________________。 (4)构建的表达载体通常经____________（方法）进行鉴定与验证。将转化后的大肠杆菌接种于含____________的选择培养基中培养，一段时间后再挑取__________的菌落纯化培养。 (5)为检测SEIK-GFP融合蛋白的生物活性，科研人员分别对小鼠注射缓冲液、SEIK溶液、GFP溶液和SEIK-GFP溶液，定时测定小鼠体内干扰素-γ(IFN-γ)含量，结果如图。 ①实验中设置GFP溶液组作为对照的目的是________。 ②研究表明，可利用SEIK-CFP融合蛋白研究SEIK作用机制，依据是___________，且能对SEIK的作用进行定位追踪。 17．（24-25高二下·江苏淮安·期末）斑马鱼是遗传学研究的常用模式生物，研究人员希望在斑马鱼心脏中表达外源基因Red，为此构建载体pTOL2-CMLC2-RED-EGFP，并将其整合到斑马鱼早期胚胎的染色体上，请回答下列问题： (1)构建载体的过程如图1所示，读图回答问题： ①利用PCR技术对CMLC2-EGFP基因片段进行克隆时，为保证基因片段以正确的顺序插入载体中，需要在一对引物的_________（选填“5'端”或“3'端”）分别添加序列_________和GTCGAC，已知CCDB片段长1.6kb，则CMLC2-EGFP基因片段长_________kb。 ②构建pTOL2-CMLC2-EGFP载体后，研究人员会将其导入大肠杆菌并培养大肠杆菌，其目的是_________，培养大肠杆菌时，需要在培养基中加入_________起选择效果，原载体pTOL2中含有CCDB片段的目的是_________。 ③步骤a和步骤b所必需的酶是限制酶和_________酶，进行步骤b前，通过PCR得到Red基因片段后，研究人员还用碱性磷酸酶进行处理，去除其两条链5'端的磷酸基团后再保存待用，目的是_________。 ④为检验载体pTOL2-CMLC2-RED-EGFP是否构建成功，研究人员用两种限制酶Kpn I和Sal I对其进行完全酶切，之后进行琼脂糖凝胶电泳，其结果如图2所示，其中可能表示构建成功的载体的序号是_________。 (2)研究人员将质粒和转座酶的mRNA通过显微注射法共同导入斑马鱼早期胚胎中，转座酶可介导DNA片段在不同DNA分子间的转移，在此起到的作用是_________。在将基因导入斑马鱼早期胚胎并培养一段时间后，研究人员验证基因是否成功导入并表达，用荧光显微镜观察胚胎，预期的结果是_________。 18．（24-25高二下·江苏无锡·期末）转录因子是一类蛋白质，能与基因启动子中的特定序列结合，进而调控基因的表达。为了研究转录因子CEBPB蛋白能否作用于小鼠Vamp8基因的启动子（含3363个碱基对），科研人员构建了相关载体并进行细胞转染实验，过程如图1。请据图回答： (1)启动子能驱动基因的______，最终表达出蛋白质，它是______识别和结合的部位。 (2)为获得含小鼠Vamp8基因启动子的序列，可提取小鼠______作为模板，根据______序列设计引物。 (3)利用同源重组的方法构建质粒时，质粒A需要用______酶处理将质粒线性化，与PCR产物充分混合，在重组酶的作用下构建质粒B。该方法对于传统载体构建的优势是______。质粒B用Bgl II 酶切后电泳，结果如图2，构建成功的是______（“1”或“2”）。 (4)LUC和REN是催化不同荧光素发光的荧光素酶，可通过添加不同荧光素测定荧光强度，计算荧光强度之比（LUC/REN），实现对目标基因表达水平的定量分析。本研究的测量结果如图3所示，其中作为对照组的是________，实验组的相对荧光素酶活性________，原因是______。 19．（24-25高二下·江苏扬州·期末）某研究团队在哺乳动物细胞中实现了某种必需氨基酸的生物合成。该研究以中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系作为模型系统，CHO细胞系在缺乏任何一种必需氨基酸的培养基上均不能生长。研究人员从大肠杆菌中获取目的基因，设计了密码子优化的生物合成途径，在酵母菌中组装，然后导入CHO细胞中筛选培育出能合成缬氨酸的仓鼠，流程如下表所示。 (1)请完成下表： 实验目的 简要操作步骤 获得大量的目的基因 将缬氨酸的合成基因和2，3-二羟基-3-异戊酸基因先在酵母菌中组装、复制 制备含有目的基因的CHO细胞 将含有目的基因的基因表达载体通过①_______技术导入CHO细胞并进行筛选和鉴定 获取重组细胞 将CHO细胞的细胞核移植到②________期的去核卵母细胞中 形成重构胚 用物理方法如③_______激活重组细胞，使其完成细胞分裂和④_______形成重构胚 培育出能合成缬氨酸的中国仓鼠 将重构胚移植到经激素等处理过的代孕仓鼠子宫内，生出仔鼠 (2)哺乳动物细胞不能合成必需氨基酸的直接原因是缺乏相应的_______。卵母细胞要去核处理的原因是_______，去核的卵母细胞除具有体积大易操作、营养物质丰富等特点外，还含有_______的物质，有利于培养获得克隆动物。对培育至_______时期的重构胚进行胚胎分割可增加供移植的胚胎数量。 (3)研究人员做进一步研究，将转基因获得的CHO细胞系（pMTIV）与对照组细胞（pCtrl）分别置于_______的培养液中进行培养，结果如图所示，由此可得出的实验结论是_______。 20．（24-25高二下·江苏苏州·期末）水杨酸是常见的水体污染物，科学家通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒制备出图示的水杨酸生物传感器。请回答下列问题。 (1)用______处理大肠杆菌，以便向菌体内导入含nahR、mrfp等特殊DNA序列的重组质粒。RNA聚合酶催化转录时沿基因的模板链______（填“5'→3'”或“3'→5'”）方向进行。 (2)选择激活能力更强的调控蛋白基因nahR1替代nahR，可______（填“提高”或“降低”）水杨酸生物传感器的灵敏度。水体中水杨酸浓度高时，其和调控蛋白形成的复合物量会______，mrfp基因的表达______（填“增强”或“减弱”），产生红色荧光蛋白就多。 (3)上述工程菌可对水杨酸进行动态监测，但无法清除水杨酸。现将水杨酸羟化酶基因（可催化水杨酸转化为能被细胞利用的物质）与mrfp基因连接成融合基因，欲判定融合基因已准确连接，应选择图2中的引物______和引物______进行PCR。Ps属于诱导型启动子，仅在水体中有水杨酸时才发挥其作用，其意义是______。 (4)工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但也存在着______等安全隐患。科学家将ccdA基因(表达毒蛋白可使工程菌致死)插入图3中的B位点,ccd B基因(表达抗毒蛋白)插入E位点解决上述隐患。该设计的优点是当水体中______时，工程菌会死亡。ccdA、ccd B基因还可以分别插入______、______位点。 地 城 考点02 DNA 相关实验 一、单选题 1．（24-25高二下·江苏徐州·期末）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验叙述，正确的是（    ） A．利用DNA溶于酒精但某些蛋白质不溶于酒精的原理可以分离DNA和蛋白质 B．可选择猪血、菜花等作为实验材料提取DNA C．利用PCR扩增4次后，同时含两种引物的DNA分子所占比例为7/8 D．琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子越大，迁移速率越快 2．（24-25高二下·江苏扬州·期末）科研人员利用两种限制酶（EcoRI和NotI）处理基因载体，进行电泳检测，结果如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．该基因载体最可能是环状DNA分子 B．电泳图谱中DNA片段越大，距离起点越近 C．该DNA分子上有2个EcoRI酶切位点 D．EcoRI和NotI的切点之间最长相距约9kb 3．（24-25高二下·江苏苏州·期末）PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。下列相关叙述错误的是（    ） A．DNA迁移的方向主要取决于电场，而与缓冲液的酸碱度基本无关 B．待分离的DNA片段较小时，实验所用琼脂糖凝胶的浓度宜稍高些 C．DNA电泳鉴定时需预先将染料加入凝胶中以使待测DNA充分染色 D．对PCR产物电泳，结果符合预期的DNA片段通常还需进行基因测序 4．（24-25高二下·江苏南通·期末）某研究小组经“研磨→过滤→离心→析出→鉴定”步骤，提取花菜DNA并鉴定。相关叙述正确的 （　　） A．研磨时加入纤维素酶和果胶酶可提高研磨的效果 B．过滤获得的滤液置于4℃冰箱中以抑制解旋酶活性 C．滤液经离心后，DNA主要分布于沉淀物中 D．粗提取的丝状物放入二苯胺试剂即成蓝色 5．（24-25高二下·江苏镇江·期末）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法错误的是（    ） A．根据DNA片段大小配制一定质量分数的琼脂糖溶液以便分离DNA分子 B．琼脂糖凝胶电泳中的电泳缓冲液中含指示剂，其可以在紫外灯下被检测出来 C．实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理 D．扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液混匀后需缓慢注入加样孔以防样品飘散 二、多选题 6．（24-25高二下·江苏宿迁·期末）关于“花菜DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（    ） A．研磨前先用液氮冷冻处理花菜，有利于DNA的释放 B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．可利用DNA不溶于酒精而某些蛋白质溶于酒精这一原理来粗提DNA D．鉴定DNA时将丝状物或沉淀物直接加入二苯胺试剂中，沸水浴加热出现蓝色 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题04 基因工程 2大高频考点概览 考点01 基因工程基本操作与应用 考点02 DNA 相关实验 地 城 考点01 基因工程基本操作与应用 一、单选题 1．（24-25高二下·江苏徐州·期末）下图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径。下列相关叙述错误的是（    ） A．若A基因是从人细胞内提取的mRNA经逆转录产生的，则A基因中不含启动子序列 B．扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶从引物a、b的3'端进行子链合成 C．利用显微注射法将人血清白蛋白基因导入的绵羊受体细胞是乳腺细胞 D．为了保证从乳汁中获得人血清白蛋白，需将人血清白蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子重组 【答案】C 【详解】A、成熟的mRNA是由基因转录后经剪切而成，不含启动子序列，故若某基因是从人的细胞内提取 mRNA 经逆转录形成的，则该基因中不含启动子序列，A正确； B、在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶从引物a、b的3'-端进行子链合成，B正确； C、导入人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞不是乳腺细胞，通常是受精卵，C错误； D、要使目的基因在乳腺细胞中表达，需要在目的基因的上游加上乳腺蛋白基因的启动子，D正确。 故选C。 2．（24-25高二下·江苏扬州·期末）下列关于基因工程应用的叙述，正确的是（    ） A．目的基因与乳腺中特异表达的基因的启动子重组后，导入乳腺细胞 B．转基因动物作为器官移植的供体时，导入某种调节因子以抑制抗原决定基因的表达 C．通过定点突变技术获得的胰岛素基因可直接导入大肠杆菌用于发酵生产 D．可利用蛋白质工程对T4溶菌酶的空间结构直接进行改造，从而提高其耐热性 【答案】B 【详解】A、目的基因需与乳腺蛋白基因的启动子重组后导入受精卵，而非直接导入乳腺细胞（动物细胞全能性受限，需通过个体发育实现产物分泌），A错误； B、转基因动物作为供体时，抑制抗原决定基因的表达可减少免疫排斥，通过导入调节因子（如抑制抗原合成的基因）可实现这一目的，符合基因工程应用。B正确； C、定点突变后的胰岛素基因需先与大肠杆菌表达载体（含启动子、终止子等）重组，才能导入受体菌，直接导入无法表达，C错误； D、蛋白质工程通过改造基因间接改变蛋白质结构，而非直接修饰蛋白质空间结构，D错误。 故选B。 3．（24-25高二下·江苏无锡·期末）CRISPR/Cas9 基因编辑技术，可以实现对 DNA 的定点切割，其工作原理如下图所示。下列叙述错误的是（    ） A．细菌体内的Cas9能切割外源DNA保护自身，类似于限制酶 B．可通过此技术敲除突变基因根治猫叫综合征等遗传病 C．Cas9对不同目标DNA进行编辑时，应使用不同的向导RNA D．Cas9蛋白剪切DNA片段的精确性随着向导RNA的延长而增加 【答案】B 【详解】A、由题干可知细菌体内的Cas9能切割外源DNA保护自身，类似于限制酶，也可以切割DNA，A正确； B、通过CRISPR/Cas9技术可以敲除突变的基因而达到根除致病基因的目的，但猫叫综合征是由人体的5号染色体结构部分缺失导致的，不属于基因突变造成的，B错误； C、向导RNA可识别并与靶基因部分碱基发生碱基互补配对，具有特异性，因此Cas9对不同目标DNA进行编辑时，应使用不同的向导RNA，C正确； D、向导RNA与目标DNA结合的前提条件是RNA序列与DNA序列精准结合，如果向导RNA过短，则基因组中能与之结合的DNA序列就会越多，出现Cas9结合剪切多个基因的现象，因此Cas9蛋白剪切DNA片段的精确性随着向导RNA长度的延长而增加，D正确。 故选B。 4．（24-25高二下·江苏淮安·期末）生物技术的应用涉及到很多安全性和伦理问题，下列相关叙述错误的是（    ） A．蛋白质工程可创造自然界中没有的蛋白质，可能会产生新的过敏原 B．上市的转基因产品都经过了安全性审核，但仍必须标注是否存在转基因成分 C．我国禁止生殖性克隆，所以“设计试管婴儿”技术不合法 D．因生物武器的极大危害性，一切试图发展、生产、储存生物武器的行为必须禁止 【答案】C 【详解】A、蛋白质工程通过改造基因来合成自然界不存在的蛋白质，新蛋白质可能成为过敏原，A正确； B、我国规定转基因产品需经安全审核，并强制标注转基因成分，B正确； C、我国禁止生殖性克隆，但允许治疗性克隆；“设计试管婴儿”若用于疾病筛查（如遗传病）是合法的，C错误； D、《禁止生物武器公约》明确禁止发展、生产及储存生物武器，D正确。 故选C。 二、多选题 5．（23-24高二下·江苏镇江·期末）终末期心脏病患者需要进行心脏移植，但移植过程中往往会发生缺血再灌注损伤（IRI），导致心脏坏死。IRI通过促进Caspase8等一系列凋亡基因的表达，导致细胞凋亡最终引起器官坏死。根据Caspase8基因合成的小干扰RNA（siRNA）可以使Caspase8基因沉默，有效抑制IRI所致的器官损伤，其过程如图所示。下列叙述错误的有（　　） A．步骤③将重组质粒导入猪的心肌细胞最常用的方法是显微注射法 B．siRNA对应DNA序列在心肌细胞中表达产生siRNA的步骤④称为逆转录 C．细胞凋亡中会发生Caspase8DNA→siRNA→Caspase8蛋白的过程 D．基因沉默复合物，抑制遗传信息的转录过程，使Caspase8基因沉默 【答案】BCD 【详解】A、将重组质粒导入动物细胞（猪的心肌细胞），最常用的方法就是显微注射法，A正确； B、步骤④是由DNA转录产生siRNA，而逆转录是指以RNA为模板合成DNA的过程，所以不是逆转录，B错误； C、转录小干扰RNA（siRNA）可以与Caspase8基因转录成的mRNA结合，使Caspase8基因沉默，因此不会发生Caspase8DNA→siRNA→Caspase8蛋白的过程，C错误； D、从图中可知，基因沉默复合物是与mRNA结合，抑制的是翻译过程，不是转录过程，D错误。 故选BCD。 6．（24-25高二下·江苏泰州·期末）双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员在图1所示PCR基础上构建图2所示的表达载体，以检测双向启动子的作用效果。下列分析正确的是（　　） A．用图1PCR技术获取GUS基因时，应选择引物1和4 B．图1PCR至少需经过5次循环才可获得16个双链等长的GUS基因 C．对含LUC基因的重组质粒用SalⅠ和SphⅠ酶切后可构建图2所示载体 D．导入图2表达载体的转基因农杆菌可在含有壮观霉素的培养基上生长 【答案】BD 【详解】A、图1有磷酸的是5'，有-OH的是3'所以PCR技术获取GUS基因时，应选择引物2和3，A错误； B、第1次循环得到2个DNA分子（不等长），第2次循环得到4个DNA分子（不等长）；第3次循环得到8个DNA分子（其中有2个等长的目的基因片段 ），第4次循环得到16个DNA分子（其中有8个等长的目的基因片段），第5次循环得到32个DNA分子（其中有16个等长的目的基因片段），故获得16个双链等长的GUS基因至少需经过5次循环，B正确； C、对含LUC基因的重组质粒用SphⅠ酶切会破坏LUC基因，C错误； D、导入图2表达载体的转基因农杆菌有壮观霉素抗性基因可在含有壮观霉素的培养基上生长，D正确。 故选BD。 7．（24-25高二下·江苏扬州·期末）荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量。其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当Taq酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。下列叙述正确的是（    ） A．PCR反应体系中需要加入Mg2+以激活Taq酶 B．Taq酶催化DNA的合成方向总是从子链的3'端向5'端延伸 C．在反应体系中，检测到的荧光信号越强则消耗的引物越多 D．若扩增n次，则共需要消耗2n-1个探针 【答案】AC 【详解】A、PCR反应体系中需要加入Mg2+以激活Taq酶，有利于PCR过程的进行，A正确； B、Taq酶催化DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸，即该酶的作用是在引物的3’端依次连接脱氧核苷酸，B错误； C、题意显示，每扩增一次，就有一个荧光分子生成，据此推测荧光信号越强，说明PCR循环次数越多，则消耗的引物越多，C正确； D、题意显示，在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，即每个DNA分子需要1个探针，扩增n次，可得到2n个DNA分子，则共需要消耗2n-1个探针，D错误。 故选AC。 8．（24-25高二下·江苏无锡·期末）科研人员将胰岛素B28位的脯氨酸替换为天冬氨酸或与B29位的赖氨酸交换位置，研发出了速效胰岛素类似物产品并在临床上广泛应用。下列叙述正确的有（    ） A．该过程属于蛋白质工程，生产的速效胰岛素类似物自然界不存在 B．胰岛素改造思路与中心法则的信息流动方向是一致的 C．替换氨基酸时需要用特定的蛋白酶将特定部位的肽键水解 D．胰岛素类似物想要达到预期的疗效，还需检测其高级结构是否正确 【答案】AD 【详解】A、该工程通过对天然胰岛素的氨基酸序列进行改造，属于蛋白质工程，改造后生产的蛋白质（速效胰岛素类似物）是自然界不存在的，A正确； B、天然蛋白质的合成过程是按照中心法则进行的，蛋白质工程的基本思路与中心法则相反，B错误； C、蛋白质工程的实质是对基因进行改造，需要用限制酶和DNA连接酶等工具，不需要蛋白酶，C错误； D、物质的结构决定功能，蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，胰岛素类似物想要达到预期的疗效，还需检测其高级结构是否正确，D正确。 故选AD。 三、非选择题 9．（24-25高二下·江苏泰州·期末）借助噬菌体展示技术制备的单克隆全人源抗体scFv，是由常规抗体的1/2轻链可变区（VL）、1/4重链可变区（VH）借助连接短肽（Linker）构成。请回答下列问题： (1)获取由VL-Linker-VH序列构成如图1所示的融合基因scFv。首先，从已免疫的B细胞中提取________，借助图1中的两对引物________、________进行________，分别获得大量的VL、VH的cDNA；其次，利用重叠延伸PCR，将已获得的VL、VH通过Linker连接成融合基因scFv，已知1F的：5'端不能与基因Linker模板链配对的碱基序列为5'-CTTCTACAG-3'，则1R的5'端前6个碱基序列为：5'________3'。 (2)用融合基因scFv与噬菌粒构建表达载体（如图2）。噬菌粒是由噬菌体的部分DNA与质粒经人工构建而成。将目的基因成功插入噬菌粒所需要的酶有________。图2结构中，质粒复制原点的作用是________，能启动子代噬菌体DNA复制的结构是________。 (3)噬菌粒表达载体导入大肠杆菌和获取表面展示有scFv的子代噬菌体（如图3）。常用_______处理大肠杆菌以便于其吸收表达载体，被噬菌粒表达载体转染的大肠杆菌在含有______的培养基中，于_______（场所）中寸翻译出scFv。由于图2结构表达的蛋白质中只有________属于噬菌体，欲构建图3所示的噬菌体就需噬菌体辅助感染，为确保成功，辅助感染的噬菌体必须具有的缺陷是________。 【答案】(1) 总RNA I与1R 2F与R 逆转录PCR或RT-PCR -CTGTAG- (2) 限制酶和DNA连接酶 使噬菌粒表达载体在受体细胞内复制 噬菌体复制原点 (3) Ca2+ 乳糖 大肠杆菌的核糖体 pⅢ蛋白 其DNA不能复制 【详解】（1）从已免疫的B细胞中提取总RNA，进行逆转录PCR或RT-PCR获得cDNA，扩增VL选择引物Ⅰ与1R，扩增VH选择引物2F与R。重叠延伸PCR，VL与Linker连接，1F的5'端与1R互补，所以1R5'端的前6个碱基序列为5'-CTGTAG-3'。 （2）将目的基因成功插入噬菌粒所需要的酶有限制酶和DNA连接酶；图2结构中，质粒复制原点的作用是使噬菌粒表达载体在受体细胞内复制（并稳定保存），能启动子代噬菌体DNA复制的结构是噬菌体复制原点。 （3）噬菌粒表达载体导入大肠杆菌：常用 处理大肠杆菌以便于其吸收表达载体。获取表面展示有scFv的子代噬菌体：图2中乳糖启动子，所以被噬菌粒表达载体转染的大肠杆菌在含有乳糖的培养基中才能翻译出scFv。噬菌粒无细胞结构，翻译的场所大肠杆菌的核糖体。由于噬菌粒表达载体表达出的蛋白质中只有pⅢ蛋白属于噬菌体的，因此需噬菌体辅助感染，才能获得可展示scFv的子代噬菌体，辅助感染的噬菌体必须具有的缺陷是其DNA不能复制。 10．（24-25高二下·江苏扬州·期末）某研究团队在哺乳动物细胞中实现了某种必需氨基酸的生物合成。该研究以中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系作为模型系统，CHO细胞系在缺乏任何一种必需氨基酸的培养基上均不能生长。研究人员从大肠杆菌中获取目的基因，设计了密码子优化的生物合成途径，在酵母菌中组装，然后导入CHO细胞中筛选培育出能合成缬氨酸的仓鼠，流程如下表所示。 (1)请完成下表： 实验目的 简要操作步骤 获得大量的目的基因 将缬氨酸的合成基因和2，3-二羟基-3-异戊酸基因先在酵母菌中组装、复制 制备含有目的基因的CHO细胞 将含有目的基因的基因表达载体通过①_______技术导入CHO细胞并进行筛选和鉴定 获取重组细胞 将CHO细胞的细胞核移植到②________期的去核卵母细胞中 形成重构胚 用物理方法如③_______激活重组细胞，使其完成细胞分裂和④_______形成重构胚 培育出能合成缬氨酸的中国仓鼠 将重构胚移植到经激素等处理过的代孕仓鼠子宫内，生出仔鼠 (2)哺乳动物细胞不能合成必需氨基酸的直接原因是缺乏相应的_______。卵母细胞要去核处理的原因是_______，去核的卵母细胞除具有体积大易操作、营养物质丰富等特点外，还含有_______的物质，有利于培养获得克隆动物。对培育至_______时期的重构胚进行胚胎分割可增加供移植的胚胎数量。 (3)研究人员做进一步研究，将转基因获得的CHO细胞系（pMTIV）与对照组细胞（pCtrl）分别置于_______的培养液中进行培养，结果如图所示，由此可得出的实验结论是_______。 【答案】(1) 显微注射 MⅡ（中） 电刺激（电脉冲） 分化（发育） (2) 酶 使重组细胞中的核基因全部来自含有目的基因的CHO细胞 激发CHO细胞核全能性体现 桑葚（椹）胚或囊胚 (3) 不含缬氨酸但含其他所有必需氨基酸 转基因获得的CHO细胞系（或pMTIV组）能合成缬氨酸 【详解】（1）制备含有目的基因的CHO细胞：将含有目的基因的基因表达载体通过显微注射技术导入CHO细胞并进行筛选和鉴定，该方法是将目的基因导入动物细胞的常用方法； 获取重组细胞：将CHO细胞的细胞核移植到处于MⅡ（中）期的去核卵母细胞中，因为该细胞的细胞质中含有激发细胞核发挥全能性的物质； 形成重构胚：用物理方法如电刺激（电脉冲）激活重组细胞，此外还可用化学方法激活重构胚，进而使其完成细胞分裂和分化形成重构胚，为胚胎移植作准备。 （2）哺乳动物细胞不能合成必需氨基酸的直接原因是缺乏相应的酶，根本原因是缺乏相应的基因。卵母细胞要去核处理的目的是保证重组细胞中的核基因全部来自含有目的基因的CHO细胞，去核的卵母细胞除具有体积大易操作、营养物质丰富等特点外，还含有激发CHO细胞核全能性体现的物质，有利于培养获得克隆动物。对培育至桑葚（椹）胚或囊胚时期的重构胚进行胚胎分割可增加供移植的胚胎数量，胚胎分割类似无性繁殖技术。 （3）研究人员做进一步研究，将转基因获得的CHO细胞系（pMTIV）与对照组细胞（pCtrl）分别置于不含缬氨酸但含其他所有必需氨基酸的培养液中进行培养，结果转基因获得的CHO细胞系能生长，而对照组细胞不能正常生长，由此可得出的实验结论是转基因获得的CHO细胞系（或pMTIV组）能合成缬氨酸，而对照组细胞不能合成缬氨酸，因而不能生长。 11．（24-25高二下·江苏盐城·期末）抗菌肽是一类广泛存在于自然界中的多肽，对细菌、真菌、寄生虫和病毒具有广泛的抑制作用。科研人员将抗菌肽A基因及D基因进行融合形成AD基因（部分过程如图1所示），然后利用酵母菌发酵生产抗菌肽AD。 (1)AD基因复制和表达所需要的原料有______。 (2)PCR的基本过程包括：①变性→②→______③延伸。PCR过程中反应体系所处温度最高的是过程______（填序号）。A基因表达以a链为模板，D基因表达以d链为模板。为了实现图1中两基因重叠延伸，PCR1过程中需要分别在引物______和引物_______的5'端添加互补序列。 (3)为了能使AD基因与图2所示pC穿梭质粒定向连接，需要在AD基因两端加上限制酶______和_______的识别序列，构建重组质粒后导入酵母细胞。用选择性培养基对受体菌进行培养、筛选，从培养基的成分分析，与普通培养基相比，该选择性培养基应______。在酵母细胞中，重组质粒以______为起点进行复制。 (4)酸腐病是由白地霉引起的柑橘贮藏期常见的病害之一。为研究抗菌肽AD（以下简称抗菌肽）对白地霉的抑菌效果，现用无菌打孔器在果实相同部位打孔，每个打孔处接种相同体积的处理液，比较15天后的病斑直径。各组处理及结果见下表： 组别 1 2 3 接种处理方式 接种一定体积的病原菌孢子悬浮液 先接种病原菌孢子悬浮液，2h后再加入抗菌肽溶液 抗菌肽溶液与病原菌孢子悬浮液混合，培养2h后接种 15天后病斑直径/mm 41.3 28.7 11.2 表中数据表明抗菌肽对白地霉_______（从“是”、“否”中选填）有抑菌效果，且抑菌效果最好的处理组别是______，处理效果最好的可能原因是______。 【答案】(1)脱氧核苷酸、核糖核苷酸、氨基酸 (2) 退火/复性 ① X Z (3) BamHI SalI 含氨苄青霉素、不含亮氨酸 O2 (4) 是 3 抗菌肽与病原菌孢子充分接触，能更有效发挥作用 【详解】（1）AD基因复制、转录、翻译所需要的原料分别是脱氧核苷酸、核糖核苷酸、氨基酸。 （2）PCR的基本过程包括：①变性→②退火→③延伸。PCR过程中反应体系所处温度最高的是过程①变性。为了实现图1中两基因重叠延伸，PCR1过程中需要在引物X和引物Z的5′端添加互补序列。这是因为X引物用于扩增A基因，而Z引物用于扩增D基因，并且这两个基因需要在PCR1过程中实现重叠延伸。通过在X和Z的5′端添加互补序列，可以确保在PCR1过程中，两个基因能够按照预期的方式进行重叠和延伸。 （3）HindⅢ在质粒上具有两个酶切位点，不宜选用，故需要在AD基因两端加上限制酶BamHⅠ和SalⅠ的识别序列，重组质粒上含有控制亮氨酸合成基因与氨苄青霉素抗性基因，与普通培养基相比，该选择性培养基应不含亮氨酸、含有氨苄青霉素，酵母细胞是真核细胞，故重组质粒以O2为起点进行复制。 （4）表中数据表明抗菌肽对白地霉有一定的抑菌效果，且抑菌效果最好的处理组别是3，3组抗菌肽与病原菌孢子充分接触，能更有效发挥作用。 12．（24-25高二下·江苏徐州·期末）大麦的丙氨酸转氨酶（AlaAT）能够使大麦在低氮土壤中正常生长，减少氮肥的使用。启动子（）能驱动基因的特异性表达。研究人员利用RT—PCR技术获得AlaAT的cDNA，并将其取代质粒表达载体（）中的基因，构建成重组质粒表达载体（），开发出了高效吸收和利用氮的转基因大麦。质粒表达载体及AlaAT的cDNA片段如图1所示。请回答下列问题： (1)启动子（）的功能是______。分析图1可知，应使用______酶切割质粒表达载体，以保证其与AlaAT的cDNA正确、高效的重组。 (2)利用RT—PCR技术从大麦中扩增出AlaAT的cDNA前，需设计两种引物P1、P2，并在引物P2的5'端增加碱基序列5'—______—3'，以保证基因与质粒表达载体的正确连接与表达。PCR扩增条件如下：94℃，5min→25个循环（变性、退火、延伸）→72℃，7min，退火温度的设置需参考引物中碱基的______。 (3)将构建好的基因表达载体导入______处理后的农杆菌细胞后，涂布在含有______的培养基中培养，一段时间后，挑取______（从“白色”“蓝色”中选填）菌落并转化大麦细胞，接着利用______技术获得转基因大麦植株。 (4)随机选取（3）中获得的5株转基因大麦，利用RT—PCR和电泳分析根部和茎、叶基因的转录情况，结果如图2所示。 分析图2得出的结论是______。请利用水培法设计实验进一步从个体水平上评估转基因大麦对氮吸收的影响，请简要写出实验思路：______。 【答案】(1) RNA 聚合酶识别和结合的部位（或驱动转录） SpeI、XhoI (2) GTCGAC 种类和数量（或 G/C 含量或 G、C 含量或 GC 含量） (3) Ca2+（或 CaCl2） 卡那霉素和 X-Gluc 白色 植物组织培养 (4) OsAnt1 启动子驱动的 AlaAT 基因只能在转基因大麦的根部转录（或特异性转录） （相同条件下，）利用水培法培养转基因大麦幼苗与野生型（或非转基因）大麦幼苗，一段时间后测定并比较两种幼苗根部氮的吸收情况 【详解】（1）启动子（）的功能是RNA 聚合酶识别和结合的部位（或驱动转录）。为了保证其与AlaAT的cDNA正确、高效的重组，应使用SpeI、XhoI切割质粒表达载体，因为SalI会破坏Gus基因，BamHI会破坏标记基因，XbaI与SpeI切割后会产生相同的黏性末端。 （2）使用SpeI、XhoI切割质粒表达载体，但基因含有XhoI序列，为保证基因与质粒表达载体的正确连接与表达，应保证载体和目的基因有相同黏性末端，故应在引物P2的5'端增加碱基序列5'GTCGAC3'。PCR扩增条件如下：94℃，5min→25个循环（变性、退火、延伸）→72℃，7min，退火温度的设置需参考引物中碱基的种类和数量（或 G/C 含量或 G、C 含量或 GC 含量）。 （3）将构建好的基因表达载体导入Ca2+处理后的感受态细胞后，涂布在含有卡那霉素和 X-Gluc的培养基中培养，一段时间后，挑取白色菌落并转化大麦细胞，接着利用植物组织培养技术获得转基因大麦植株。 （4）由图可知，OsAnt1 启动子驱动的 AlaAT 基因只能在转基因大麦的根部转录（或特异性转录）。为从个体水平上评估转基因大麦对氮吸收的影响，应在相同条件下，利用水培法培养转基因大麦幼苗与野生型（或非转基因）大麦幼苗，一段时间后测定并比较两种幼苗根部氮的吸收情况。 13．（24-25高二下·江苏宿迁·期末）Bad基因编码204个氨基酸，是Bcl2（B细胞淋巴瘤/白血病-2）家族中相关的促凋亡基因。下图1为科研人员获得Bad基因重组细菌的主要流程。请回答： (1)进行Bad基因克隆时，基因组DNA不能直接用作PCR扩增的模板，原因是真核生物基因组中存在________序列，在形成成熟mRNA的过程中相关碱基序列被切除。从细胞中提取总RNA或mRNA，在mRNA的引导下使用________酶来合成cDNA链。 (2)引物设计的质量是决定图中“②PCR”成败的关键因素。首先从核酸数据库中获得mBad基因的编码序列，然后在引物的________端加上不同的限制酶识别序列，第三步为了保证抗原标签与mBad基因表达产物中氨基酸顺序正确，有时需要补加核苷酸，但是注意不能产生________，否则会导致合成的融合蛋白质分子量的减小。 (3)图2为②PCR过程的程序参数。②过程PCR反应体系配制完成后，先在冰上预冷，等程序设置完毕后再放入PCR仪中。Step1和Step8的主要目的分别是________、________。由于Step3引物含有________，不能和模板完全匹配，所以Step3的温度比Step6要低一点。 (4)一般而言，②过程后进行电泳检测，双链DNA分子越大则电泳迁移速率越________，除此之外，DNA分子的构型对其电泳迁移速率影响也大：环状超螺旋DNA电泳的速率一般快于线形DNA，从结构的角度分析，原因可能是________。 (5)研究人员在④过程中应优先选择________和________两种限制酶及E. coli DNA连接酶形成重组质粒。 (6)对重组细菌再筛时用抗原-抗体杂交法筛选，得到的阳性重组子细菌还需要进一步进行DNA测序，原因是________。 【答案】(1) 内含子 逆转录 (2) 5' 终止密码子 (3) 增加DNA双链完全打开的概率 使产物充分延伸 限制酶序列 (4) 慢 环状超螺旋状的DNA体积小（结构比较紧密） (5) BamHI HindⅢ (6)可能目的基因没有与载体连接 【详解】（1）真核生物基因组中存在内含子序列，在形成mRNA的剪接加工过程中被切除，所以进行Bad基因克隆时，基因组DNA不能直接用作PCR扩增的模板。从细胞中提取总RNA或mRNA，在mRNA的引导下使用逆转录酶来合成cDNA链。 （2）DNA的合成方向是从5'端到3'端延伸，限制酶会破坏DNA序列，所以在引物的5'端加上不同的限制酶切位点序列，第三步为了保证抗原标签与mBad基因表达产物中氨基酸顺序正确，有时需要补加核苷酸，由于终止密码子会导致翻译的终止，所以补加的核苷酸不能产生终止密码子，否则会导致蛋白质分子量的减小。 （3）Step1，94℃ 5min，目的是增加DNA双链完全打开的概率；Step8，72℃ 10min的目的是使未完全延伸的产物实现充分延伸。由于Step3引物含有添加的限制酶序列，不能和模板完全匹配，所以Step3的温度比Step6要低一点。 （4）电泳是根据DNA分子的大小进行分离的技术，双链DNA分子越大则电泳迁移速率越慢。因为环状超螺旋状的DNA体积最小，在凝胶（凝胶其实是多孔的物质）中的孔中运动的阻力小，因此泳动的快，线状的DNA在孔内运动阻力很大，因此泳动慢。 （5）双酶切若选择了EcoRI，则会丢失抗原标签序列，无法形成抗原标签-目的基因融合基因，不利于目的蛋白的分离纯化。E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端，不可选择SmaI。当然，由于BamHI和SmaI距离过短，也不宜选为双酶切的组合。另外，选SmaI会导致mBad基因表达产物中氨基酸顺序不正确，需要补加核苷酸，较为麻烦，故研究人员在④过程中应优先选择BamHI和HindⅢ两种限制酶及E. coli DNA连接酶形成重组质粒。 （6）目的基因没有与载体连接，空质粒导入细菌细胞也会出现阳性重组子细菌，所以筛选得到的阳性重组子细菌还需要进一步通过DNA测序鉴定。 14．（23-24高二下·江苏镇江·期末）磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体过程如图所示。请回答下列问题： (1)无缝克隆时，T5核酸外切酶（从核苷酸链的外侧向内侧剪切核苷酸）沿_________（选填“5′→3′”或“3′→5′”）的方向水解DNA，过程③通常需要的酶有_________。 (2)PCR1经过_________轮循环可初步获得图中A片段，PCR2扩增GFP基因时需依据_________设计引物F2，PCR1和PCR2通常不在同一反应体系中进行，主要原因是_________。 (3)PCR扩增结束后，常采用_________的方法对产物进行检测。加样孔一端应朝向电极的_________极，PCR产物加到加样孔中通电适宜时间后进行检测，若凝胶上出现_________个条带，且与_________对比，位置和大小一致，表明PCR扩增成功。 (4)利用农杆菌侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有_________的培养基上进行筛选和鉴定，将筛选得到的种子种植可得到转基因拟南芥，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中_________，了解PA的分布和含量。 【答案】(1) 5′→3′ DNA 聚合酶、DNA连接酶 (2) 2 GFP基因两端的核苷酸序列 引物F1和R2有部分配对序列，引物之间能结合，会干扰引物和模板链的结合，影响PCR过程 (3) 琼脂糖凝胶电泳 负 1 DNA相对分子质量标准物（Marker） (4) 草胺膦 绿色荧光点 【详解】（1）由图可知，无缝克隆时，过程①中T5核酸外切酶沿5'→3'的方向水解DNA，以形成黏性末端。过程③缺口处DNA链的补齐，可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA 聚合酶（DNA聚合酶将游离的单个脱氧核苷酸加到子链3′末端）和DNA连接酶（将两个DNA片段进行连接）。 （2）DNA聚合酶可以将单个的脱氧核苷酸添加在一段核苷酸链的3，末端，使用引物R1，由于不匹配的片段可以作为模板使原模板链延伸一段，因此PCR1经过2轮循环即可得到图A片段；用于PCR扩增的引物是根据一段已知目的基因的核苷酸序列来设计的，由重组DNA图可知，PABD基因左侧连接bar基因，右侧连接PABD基因，最终将三者连接，设计引物F2时需依据bar和GFP的部分序列，以便GFP基因与bar基因连接；GFP基因右侧连接PABD基因，因此R2引物与PABD部分序列配对，即引物R2与引物F1部分互补配对，因此PCR1和PCR2通常不在同一反应体系中进行。 （3）PCR反应结束后，常采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖为支持介质的电泳技术，主要用于分离大分子核酸及病毒。其原理结合分子筛效应与电荷效应，通过凝胶孔径差异实现DNA片段分离；由于DNA带负电，加样孔一端应朝向电极的负极；检测PABD基因、GFP基因是否成功连接到载体上，可采用引物F2和R1进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳，并与Marker进行比对，若出现一条带，且分子量与两个基因的分子量之和相近，说明扩增成功。 （4）由图可知，bar（草胺膦抗性基因）为标记基因，位于T-DNA上，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有草胺膦的培养基上进行筛选和鉴定。由题意“将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量”可知，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色荧光点的分布，了解PA的动态变化。 15．（24-25高二下·江苏扬州·期末）柑橘树生长过程中易受某种革兰氏阴性菌感染，严重影响柑橘产量。科研人员将M基因转入柑橘中，该基因控制合成的酶可抑制该种革兰氏阴性菌的生长与繁殖。图1是培育转基因柑橘的过程示意图，相关限制酶的识别序列及切割位点如下表。回答下列问题： 限制酶名称 识别序列和切割位点 HindⅢ 5'-A↓AGCTT-3′ BamHI 5'-G↓GATCC-3′ SalI 5'-G↓TCGAC-3′ (1)利用PCR技术扩增M基因时，应选择图2中的引物_______（填字母），设计引物序列的主要依据是_______。科研人员还需在两种引物的_______端分别加上了_______和_______序列，以便于目的基因正向插入质粒。 (2)图1重组质粒中除显示的结构外，至少还含有哪些结构?_______（填序号） ①启动子②起始密码子③终止子④终止密码子⑤标记基因⑥目的基因⑦复制原点 (3)为筛选出导入了重组质粒的农杆菌，图3表示运用影印平板法（使一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法）检测基因表达载体是否成功导入了农杆菌。 培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A和培养基B分别还含有_______、_______。据结果分析，含有目的基因的是_______菌落中的细菌。 (4)由柑橘细胞培育成转基因柑橘幼苗需要经过_______两个关键步骤。对转基因柑橘幼苗进行个体水平检测，具体操作是_______。 【答案】(1) B和C M基因两端的部分核苷酸序列 5′ 5′AAGCTT3′ 5′GTCGAC3′ (2)①③⑦ (3) 氨苄青霉素 四环素（氨苄青霉素和四环素） 5和6 (4) 脱分化和再分化 对柑橘幼苗接种该种革兰氏阴性菌，观察幼苗生长情况 【详解】（1）根据子链延伸方向为5'→3'，引物需要与模板的3'端结合，根据M基因两端的部分核苷酸序列设计引物，由此可判断出扩增M基因应选择引物B和引物C；引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。据图分析，用限制酶BamHⅠ会破坏M基因，因此应使用SalⅠ和HindⅢ对M基因和质粒进行切割；目的基因两端没有相应的酶切位点，则需要在引物的5’端分别加入5′AAGCTT3′和5′GTCGAC3′，以便于目的基因正向插入质粒。 （2）基因表达载体必须包括目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等；故选①③⑦。 （3）培养基A应该含有氨苄青霉素，可筛选导入质粒的细胞，培养基B除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，还含有四环素（或氨苄青霉素和四环素），因为质粒有相应的抗性基因，能在此培养基上生长的农杆菌含有非重组质粒（有氨苄青霉素抗性基因），不能在此培养基上生长的农杆菌只含有重组质粒（重组质粒构建破坏了四环素抗性基因，农杆菌失去相应抗性），与培养基A作对比可知，含有目的基因（重组质粒）的是5和6 菌落中的细菌。 （4）由柑橘细胞培育成转基因柑橘幼苗采用了植物组织培养技术，需要经过脱分化和再分化两个关键步骤。为了获得抗革兰氏阴性菌的柑橘，则获得的转基因柑橘幼苗需要接种该种革兰氏阴性菌，观察幼苗生长情况进行鉴定。 16．（24-25高二下·江苏南通·期末）金黄色葡萄球菌类肠毒素K(SEIK)可促进人体免疫应答，诱导淋巴细胞释放细胞因子。为研究SEIK作用机制，科研人员利用重叠延伸PCR和无缝克隆技术构建了携带SEIK和GFP（绿色荧光蛋白）融合基因的工程菌，部分过程如下图。请回答下列问题。 (1)PCR的原理是____________。PCR时，复性温度过高会影响_____________，从而导致目标产物减少。 (2)研究发现，SEIK基因和GFP基因的编码链（非模板链）碱基序列分别为： 5'-AAGGTGATATAGGAA……AGAGCCACCTCCGCC-3' 5´-TGAACCGCCTCCACC……GGCATCGACGAGCTG-3ˊ 则在PCR1反应体系中加入的引物F1、R1分别为______、______（从①~④中选填）。 序号 引物碱基序列 ① 5'-AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC-3' ② 5'-ACGAGTGGATCACTCAAGGTGATATAGGAA-3' ③ 5'-GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCT-3' ④ 5'-AACATAGACATGTGCAAGGTGATATAGGAA-3' (3)无缝克隆时，T5核酸外切酶作用的化学键是_________。过程①中，T5核酸外切酶水解脱氧核苷酸链的长度应大于同源序列长度，目的是____________________。过程③所需的酶有___________________。 (4)构建的表达载体通常经____________（方法）进行鉴定与验证。将转化后的大肠杆菌接种于含____________的选择培养基中培养，一段时间后再挑取__________的菌落纯化培养。 (5)为检测SEIK-GFP融合蛋白的生物活性，科研人员分别对小鼠注射缓冲液、SEIK溶液、GFP溶液和SEIK-GFP溶液，定时测定小鼠体内干扰素-γ(IFN-γ)含量，结果如图。 ①实验中设置GFP溶液组作为对照的目的是________。 ②研究表明，可利用SEIK-CFP融合蛋白研究SEIK作用机制，依据是___________，且能对SEIK的作用进行定位追踪。 【答案】(1) DNA半保留复制 引物与模板链结合 (2) ② ③ (3) 磷酸二酯键 使同源序列间能完全互补配对 DNA聚合酶和DNA连接酶 (4) （酶切或 PCR、）电泳 卡那霉素 绿色荧光强度高 (5) 证明GFP对小鼠体内干扰素-γ的释放量无影响 SEIK-GFP 融合蛋白生物活性并未明显改变 【详解】（1）PCR的原理是DNA半保留复制。PCR时，复性温度过高会影响引物与模板链的结合，复性是指在一定温度下，引物与模板DNA单链通过碱基互补配对结合的过程，若温度过高，引物与模板链无法有效结合，就会导致后续的延伸过程无法正常进行，从而使目标产物减少。 （2）在PCR1反应体系中，是对SEIK基因进行扩增，引物的作用是与编码链的3'端互补配对，引导DNA聚合酶进行子链的合成，已知SEIK基因的编码链碱基序列为5'-AAGGTGATATAGGAA……AGAGCCACCTCCGCC-3'，对应的互补链为3'-TTCCACTATATCCTT……TCTCGGTGGAGGCGG-5'，引物F1是用于扩增SEIK基因的编码链的引物，应与SEIK基因编码链的互补链的3'端结合，所以与编码链的5'端部分序列相同且添加了同源序列1（5'-ACGAGTGGATCACTC-3'），所以F1为5'-ACGAGTGGATCACTCAAGGTGATATAGGAA -3'，即②，引物R1是用于扩增SEIK基因的非模板链的引物，应与SEIK基因非模板链3'端部分序列互补，而非模板链的序列为5´-TGAACCGCCTCCACC……GGCATCGACGAGCTG-3ˊ，所以R1为5'-GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCT -3'，即③。 （3）无缝克隆时，T5核酸外切酶作用的化学键是磷酸二酯键。过程①中，T5核酸外切酶水解脱氧核苷酸链的长度应大于同源序列长度，目的是使融合基因两端露出足够长度的同源序列，以便在后续过程中能够使同源序列间能完全互补配对。过程③是将线性化载体和目的基因连接形成重组质粒的过程，所需的酶有DNA连接酶和DNA聚合酶，DNA连接酶可以连接DNA片段之间的磷酸二酯键，DNA聚合酶可以填补可能存在的缺口。 （4）构建的表达载体通常经（酶切或 PCR）电泳进行鉴定与验证，PCR可以检测目的基因是否存在，酶切可以验证载体和目的基因的连接情况，电泳可以检测目的基因的条带大小是否正确。由图可知，表达载体中含有卡那霉素抗性基因，所以将转化后的大肠杆菌接种于含卡那霉素的选择培养基中培养，只有成功导入表达载体的大肠杆菌才能在该培养基上生长，一段时间后再挑取绿色荧光强度高的菌落纯化培养，因为构建的是携带SEIK和GFP融合基因的工程菌，绿色荧光强度高说明成功表达了融合蛋白，即成功导入了目的基因。 （5）①实验中设置GFP溶液组作为对照，因为SEIK-GFP融合蛋白中有GFP部分，设置GFP溶液组可以排除GFP本身对小鼠体内干扰素-γ（IFN-γ）含量的影响 ，即证明GFP对小鼠体内干扰素-γ的释放量无影响。 ②观察可知，注射SEIK-GFP溶液组与注射SEIK溶液组小鼠体内干扰素-γ（IFN-γ）含量变化基本一致 ，这表明SEIK-GFP融合蛋白能发挥与SEIK相同的作用，即SEIK-GFP 融合蛋白生物活性并未明显改变，可利用SEIK-CFP融合蛋白研究SEIK作用机制，且由于GFP具有荧光特性，能对SEIK的作用进行定位追踪。 17．（24-25高二下·江苏淮安·期末）斑马鱼是遗传学研究的常用模式生物，研究人员希望在斑马鱼心脏中表达外源基因Red，为此构建载体pTOL2-CMLC2-RED-EGFP，并将其整合到斑马鱼早期胚胎的染色体上，请回答下列问题： (1)构建载体的过程如图1所示，读图回答问题： ①利用PCR技术对CMLC2-EGFP基因片段进行克隆时，为保证基因片段以正确的顺序插入载体中，需要在一对引物的_________（选填“5'端”或“3'端”）分别添加序列_________和GTCGAC，已知CCDB片段长1.6kb，则CMLC2-EGFP基因片段长_________kb。 ②构建pTOL2-CMLC2-EGFP载体后，研究人员会将其导入大肠杆菌并培养大肠杆菌，其目的是_________，培养大肠杆菌时，需要在培养基中加入_________起选择效果，原载体pTOL2中含有CCDB片段的目的是_________。 ③步骤a和步骤b所必需的酶是限制酶和_________酶，进行步骤b前，通过PCR得到Red基因片段后，研究人员还用碱性磷酸酶进行处理，去除其两条链5'端的磷酸基团后再保存待用，目的是_________。 ④为检验载体pTOL2-CMLC2-RED-EGFP是否构建成功，研究人员用两种限制酶Kpn I和Sal I对其进行完全酶切，之后进行琼脂糖凝胶电泳，其结果如图2所示，其中可能表示构建成功的载体的序号是_________。 (2)研究人员将质粒和转座酶的mRNA通过显微注射法共同导入斑马鱼早期胚胎中，转座酶可介导DNA片段在不同DNA分子间的转移，在此起到的作用是_________。在将基因导入斑马鱼早期胚胎并培养一段时间后，研究人员验证基因是否成功导入并表达，用荧光显微镜观察胚胎，预期的结果是_________。 【答案】(1) 5' GGTACC 1.8 大量扩增重组载体 氨苄青霉素（或抗生素） 筛选含重组载体的大肠杆菌（或防止自身环化） DNA连接 防止Red基因片段自身环化 ③ (2) 将重组载体整合到斑马鱼染色体DNA上 斑马鱼心脏部位发出红色和绿色荧光 【详解】（1）①利用PCR技术对CMLC2−EGFP基因片段进行克隆时，为保证基因片段以正确的顺序插入载体中，需要在一对引物的5′端分别添加特定的限制酶识别序列。从图中可知，与CMLC2−EGFP基因片段相连的载体部分有SalⅠ（识别序列为GTCGAC）和KpnⅠ（识别序列为GGTACC）的酶切位点，所以需要在一对引物的5′端分别添加序列GGTACC和GTCGAC。已知CCDB片段长1.6kb，则CMLC2-EGFP基因片段长度=7.4-6+1.6=1.8kb。 ②构建pTOL2−CMLC2−EGFP载体后，将其导入大肠杆菌并培养大肠杆菌，其目的是大量扩增重组载体（利用大肠杆菌的繁殖能力，使重组载体在大肠杆菌中大量复制）。原载体pTOL2中含有氨苄青霉素抗性基因，所以培养大肠杆菌时，需要在培养基中加入氨苄青霉素（或抗生素），只有导入了重组载体的大肠杆菌才能在该培养基上生存，起到选择效果。CCDB基因是一种细胞毒性基因，原载体pTOL2中含有CCDB片段的目的是筛选含重组载体的大肠杆菌（或防止自身环化），如果没有成功插入目的基因，载体自身环化后CCDB基因表达会使宿主细胞死亡，从而筛选出成功插入目的基因的重组载体。 ③步骤a是用限制酶切割载体和目的基因，步骤b是将目的基因和载体连接起来，所必需的酶是限制酶和DNA连接酶。进行步骤b前，通过PCR得到Red基因片段后，用碱性磷酸酶进行处理，去除其两条链5′端的磷酸基团后再保存待用，目的是防止Red基因片段自身环化（因为DNA连接酶连接DNA片段时需要磷酸基团和羟基，去除5′端的磷酸基团后，Red基因片段自身无法连接成环）。 ④已知CMLC2-EGFP基因片段长1.8kb，由图可知，Red基因片段长度为7.4-6.1=1.3kb，故CMLC2-RED-EGFP长度为1.8+1.3=3.1kb，则用两种限制酶Kpn I和Sal I对其进行完全酶切后，会得到两条片段，一条长度为3.1kb，另一条长度为7.4-3.1=4.3kb，③符合。 （2）研究人员将质粒和转座酶的mRNA通过显微注射法共同导入斑马鱼早期胚胎中，转座酶可介导DNA片段在不同DNA分子间的转移，在此起到的作用是将重组载体整合到斑马鱼染色体DNA上。载体pTOL2−CMLC2−RED−EGFP中含有EGFP（绿色荧光蛋白基因）和Red基因，在将基因导入斑马鱼早期胚胎并培养一段时间后，若基因成功导入并表达，用荧光显微镜观察胚胎，预期的结果是斑马鱼心脏部位发出红色和绿色荧光（因为CMLC2是心脏特异性启动子，会使Red基因和EGFP基因在心脏中特异性表达）。 18．（24-25高二下·江苏无锡·期末）转录因子是一类蛋白质，能与基因启动子中的特定序列结合，进而调控基因的表达。为了研究转录因子CEBPB蛋白能否作用于小鼠Vamp8基因的启动子（含3363个碱基对），科研人员构建了相关载体并进行细胞转染实验，过程如图1。请据图回答： (1)启动子能驱动基因的______，最终表达出蛋白质，它是______识别和结合的部位。 (2)为获得含小鼠Vamp8基因启动子的序列，可提取小鼠______作为模板，根据______序列设计引物。 (3)利用同源重组的方法构建质粒时，质粒A需要用______酶处理将质粒线性化，与PCR产物充分混合，在重组酶的作用下构建质粒B。该方法对于传统载体构建的优势是______。质粒B用Bgl II 酶切后电泳，结果如图2，构建成功的是______（“1”或“2”）。 (4)LUC和REN是催化不同荧光素发光的荧光素酶，可通过添加不同荧光素测定荧光强度，计算荧光强度之比（LUC/REN），实现对目标基因表达水平的定量分析。本研究的测量结果如图3所示，其中作为对照组的是________，实验组的相对荧光素酶活性________，原因是______。 【答案】(1) 转录 RNA聚合酶识别和结合 (2) 基因组DNA Vamp8基因启动子两侧及两个同源臂（或加上Bgl II 酶切识别序列） (3) Bgl II 酶 不受酶切序列的限制（ 能够定向连接目的基因 ，快速高效） 2 (4) A+C 升高 CEBPB与Vamp8基因启动子结合，增强了LUC基因的表达，而REN基因表达量相同。 【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因的转录过程，通过转录形成mRNA，再经过翻译最终表达出蛋白质。 （2）要获得含小鼠Vamp8基因启动子的序列，因为基因存在于DNA上，所以可提取小鼠基因组DNA作为模板。PCR技术中，需要根据已知的Vamp8基因启动子两侧及两个同源臂（或加上Bgl II 酶切识别序列）序列设计引物，以保证能特异性扩增出Vamp8基因启动子序列。 （3）利用同源重组的方法构建质粒时，质粒A需要用限制酶处理将质粒线性化，以便与PCR产物进行重组。题目中提到Bg1Ⅱ是一种限制酶。传统载体构建需要多种限制酶和DNA连接酶等复杂操作，同源重组方法对于传统载体构建的优势是不受酶切序列的限制（ 能够定向连接目的基因 ，快速高效）。观察，质粒B用BglⅡ酶切后，若构建成功，会产生两条不同大小的片段。从图中可知，2出现了两条带，1只有一条带，所以构建成功的是2。 （4）在实验中，通常不进行处理或按照常规条件处理的组作为对照组，由图3可知载体A + C组为对照组。因为它没有导入我们研究的关键质粒B，可作为参照来对比实验组的结果。 由图3可知，实验组（载体B + C）的相对荧光素酶活性显著高于对照组（载体A + C）。 原因是CEBPB与Vamp8基因启动子结合，增强了LUC基因的表达，而REN基因表达量相同。 19．（24-25高二下·江苏扬州·期末）某研究团队在哺乳动物细胞中实现了某种必需氨基酸的生物合成。该研究以中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系作为模型系统，CHO细胞系在缺乏任何一种必需氨基酸的培养基上均不能生长。研究人员从大肠杆菌中获取目的基因，设计了密码子优化的生物合成途径，在酵母菌中组装，然后导入CHO细胞中筛选培育出能合成缬氨酸的仓鼠，流程如下表所示。 (1)请完成下表： 实验目的 简要操作步骤 获得大量的目的基因 将缬氨酸的合成基因和2，3-二羟基-3-异戊酸基因先在酵母菌中组装、复制 制备含有目的基因的CHO细胞 将含有目的基因的基因表达载体通过①_______技术导入CHO细胞并进行筛选和鉴定 获取重组细胞 将CHO细胞的细胞核移植到②________期的去核卵母细胞中 形成重构胚 用物理方法如③_______激活重组细胞，使其完成细胞分裂和④_______形成重构胚 培育出能合成缬氨酸的中国仓鼠 将重构胚移植到经激素等处理过的代孕仓鼠子宫内，生出仔鼠 (2)哺乳动物细胞不能合成必需氨基酸的直接原因是缺乏相应的_______。卵母细胞要去核处理的原因是_______，去核的卵母细胞除具有体积大易操作、营养物质丰富等特点外，还含有_______的物质，有利于培养获得克隆动物。对培育至_______时期的重构胚进行胚胎分割可增加供移植的胚胎数量。 (3)研究人员做进一步研究，将转基因获得的CHO细胞系（pMTIV）与对照组细胞（pCtrl）分别置于_______的培养液中进行培养，结果如图所示，由此可得出的实验结论是_______。 【答案】(1) 显微注射 MⅡ（中） 电刺激（电脉冲） 分化（发育） (2) 酶 使重组细胞中的核基因全部来自含有目的基因的CHO细胞 激发CHO细胞核全能性体现 桑葚（椹）胚或囊胚 (3) 不含缬氨酸但含其他所有必需氨基酸 转基因获得的CHO细胞系（或pMTIV组）能合成缬氨酸 【详解】（1）制备含有目的基因的CHO细胞：将含有目的基因的基因表达载体通过显微注射技术导入CHO细胞并进行筛选和鉴定，该方法是将目的基因导入动物细胞的常用方法； 获取重组细胞：将CHO细胞的细胞核移植到处于MⅡ（中）期的去核卵母细胞中，因为该细胞的细胞质中含有激发细胞核发挥全能性的物质； 形成重构胚：用物理方法如电刺激（电脉冲）激活重组细胞，此外还可用化学方法激活重构胚，进而使其完成细胞分裂和分化形成重构胚，为胚胎移植作准备。 （2）哺乳动物细胞不能合成必需氨基酸的直接原因是缺乏相应的酶，根本原因是缺乏相应的基因。卵母细胞要去核处理的目的是保证重组细胞中的核基因全部来自含有目的基因的CHO细胞，去核的卵母细胞除具有体积大易操作、营养物质丰富等特点外，还含有激发CHO细胞核全能性体现的物质，有利于培养获得克隆动物。对培育至桑葚（椹）胚或囊胚时期的重构胚进行胚胎分割可增加供移植的胚胎数量，胚胎分割类似无性繁殖技术。 （3）研究人员做进一步研究，将转基因获得的CHO细胞系（pMTIV）与对照组细胞（pCtrl）分别置于不含缬氨酸但含其他所有必需氨基酸的培养液中进行培养，结果转基因获得的CHO细胞系能生长，而对照组细胞不能正常生长，由此可得出的实验结论是转基因获得的CHO细胞系（或pMTIV组）能合成缬氨酸，而对照组细胞不能合成缬氨酸，因而不能生长。 20．（24-25高二下·江苏苏州·期末）水杨酸是常见的水体污染物，科学家通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒制备出图示的水杨酸生物传感器。请回答下列问题。 (1)用______处理大肠杆菌，以便向菌体内导入含nahR、mrfp等特殊DNA序列的重组质粒。RNA聚合酶催化转录时沿基因的模板链______（填“5'→3'”或“3'→5'”）方向进行。 (2)选择激活能力更强的调控蛋白基因nahR1替代nahR，可______（填“提高”或“降低”）水杨酸生物传感器的灵敏度。水体中水杨酸浓度高时，其和调控蛋白形成的复合物量会______，mrfp基因的表达______（填“增强”或“减弱”），产生红色荧光蛋白就多。 (3)上述工程菌可对水杨酸进行动态监测，但无法清除水杨酸。现将水杨酸羟化酶基因（可催化水杨酸转化为能被细胞利用的物质）与mrfp基因连接成融合基因，欲判定融合基因已准确连接，应选择图2中的引物______和引物______进行PCR。Ps属于诱导型启动子，仅在水体中有水杨酸时才发挥其作用，其意义是______。 (4)工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但也存在着______等安全隐患。科学家将ccdA基因(表达毒蛋白可使工程菌致死)插入图3中的B位点,ccd B基因(表达抗毒蛋白)插入E位点解决上述隐患。该设计的优点是当水体中______时，工程菌会死亡。ccdA、ccd B基因还可以分别插入______、______位点。 【答案】(1) Ca2+（或CaCl2） 3'→5' (2) 提高 增多 增强 (3) 2 4（无先后顺序） 减少物质和能量的浪费 (4) 基因污染（存在生态风险） （无水杨酸或）水杨酸被分解完 C F 【详解】（1）用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于感受态（容易吸收周围环境中DNA分子的状态），以便向菌体内导入含nahR、mrfp等特殊DNA序列的重组质粒。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，子链的合成方向是5'→3'，子链与模板链反向平行，因此RNA聚合酶催化转录时沿基因的模板链3'→5'方向进行。 （2）选择激活能力更强的调控蛋白基因nahR1替代nahR，可增强水杨酸生物传感器的灵敏度。分析题图1可知，水体中水杨酸浓度高时，水杨酸与调控蛋白形成的复合物量会增多，激活Ps，促进mrfp基因的表达，产生红色荧光蛋白就多。 （3）分析题图2可知，水杨酸羟化酶基因转录的模板链是b链，mrfp基因转录的模板链是a链，PCR 技术要求引物与模板链的 3' 端互补配对，且 DNA 聚合酶从引物的 3' 端开始延伸子链。要判定水杨酸羟化酶基因与基因连接成的融合基因已准确连接，需要选择能扩增出融合基因的引物组合。引物2 和引物4可以分别与融合基因中水杨酸羟化酶基因模板链的 3' 端和mrfp基因模板链的 3' 端互补配对，从而扩增出融合基因，所以应选择的引物组合是引物2和引物4。Ps属于诱导型启动子，仅在水体中有水杨酸时才发挥其作用，其意义是减少物质和能量的浪费。 （4）工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但也存在着基因污染（存在生态风险）等安全隐患。科学家将ccdA基因(表达毒蛋白可使工程菌致死)插入图3中的B位点,ccd B基因(表达抗毒蛋白)插入E位点解决上述隐患。该设计的优点是当水体中水杨酸被分解完时，工程菌会死亡。ccdA基因表达毒蛋白可使工程菌致死，当水杨酸被耗尽时，Ps启动子不再启动，此时要让工程菌启动“自亡”，ccdA应插入在Pc启动子控制的区域，所以应插入Pc启动子之后，即图中的C位点。 ccdB基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，为了保证在水杨酸存在时工程菌正常生存，ccdB应插入在Ps启动子之后，即图中的F位点，这样在水杨酸存在时，Ps启动子启动，ccdB基因表达抗毒素蛋白。 地 城 考点02 DNA 相关实验 一、单选题 1．（24-25高二下·江苏徐州·期末）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验叙述，正确的是（    ） A．利用DNA溶于酒精但某些蛋白质不溶于酒精的原理可以分离DNA和蛋白质 B．可选择猪血、菜花等作为实验材料提取DNA C．利用PCR扩增4次后，同时含两种引物的DNA分子所占比例为7/8 D．琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子越大，迁移速率越快 【答案】C 【详解】A、DNA不溶于酒精，而某些蛋白质可溶于酒精，因此利用酒精可分离DNA和蛋白质，A错误； B、猪的成熟红细胞无细胞核，DNA含量极少，不适合作为提取DNA的材料；而菜花（植物细胞）含细胞核，适合提取DNA，B错误； C、PCR扩增4次后，1个DNA分子扩增形成的DNA分子数为24=16个。其中仅初始模板链（2条）不含引物即有2个DNA分子只含1种引物，其余14个DNA分子同时含两种引物，比例为14/16=7/8，C正确； D、琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子迁移速率与分子量成反比，分子越大迁移越慢，D错误。 故选C。 2．（24-25高二下·江苏扬州·期末）科研人员利用两种限制酶（EcoRI和NotI）处理基因载体，进行电泳检测，结果如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．该基因载体最可能是环状DNA分子 B．电泳图谱中DNA片段越大，距离起点越近 C．该DNA分子上有2个EcoRI酶切位点 D．EcoRI和NotI的切点之间最长相距约9kb 【答案】C 【详解】A、由题图可知，当仅用Not I切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段（10kb），因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正确； B、在电泳中，DNA片段越大，迁移速度越慢，距离点样孔（起点）越近；DNA片段越小，迁移速度越快，距离点样孔越远，B正确； C、该基因载体是环状DNA分子，由题图可知，当仅用EcoR I切割载体时，产生2种长度的DNA片段：2kb和6kb，该载体DNA片段长10kb，所以用EcoR I切割载体应产生3个DNA片段：2个2kb和1个6kb，该DNA分子上有3个EcoR I酶切位点，C错误； D、由题可知，两种限制酶同时切割时则产生6kp、2kp和1kp3种长度的DNA片段：1个6kb、1个2kb、2个1kb，所以两种限制酶的酶切位点至少相距9kp，D正确。 故选C。 3．（24-25高二下·江苏苏州·期末）PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。下列相关叙述错误的是（    ） A．DNA迁移的方向主要取决于电场，而与缓冲液的酸碱度基本无关 B．待分离的DNA片段较小时，实验所用琼脂糖凝胶的浓度宜稍高些 C．DNA电泳鉴定时需预先将染料加入凝胶中以使待测DNA充分染色 D．对PCR产物电泳，结果符合预期的DNA片段通常还需进行基因测序 【答案】A 【详解】A、DNA 迁移方向主要取决于电场， 但缓冲液酸碱度会影响 DNA 所带电荷等，进而影响迁移，A错误； B、DNA 片段小，琼脂糖凝胶浓度高些（孔径小 ），便于分离，B正确； C、DNA 电泳染色，可将染料加入凝胶，使 DNA 充分染色，C正确； D、PCR 产物电泳符合预期后，测序可确定序列准确性，D正确。 故选A。 4．（24-25高二下·江苏南通·期末）某研究小组经“研磨→过滤→离心→析出→鉴定”步骤，提取花菜DNA并鉴定。相关叙述正确的 （　　） A．研磨时加入纤维素酶和果胶酶可提高研磨的效果 B．过滤获得的滤液置于4℃冰箱中以抑制解旋酶活性 C．滤液经离心后，DNA主要分布于沉淀物中 D．粗提取的丝状物放入二苯胺试剂即成蓝色 【答案】A 【详解】A、植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，在研磨花菜时加入纤维素酶和果胶酶，这些酶可以分解细胞壁，使细胞更容易破碎，从而提高研磨的效果，有利于DNA的释放，A正确； B、过滤获得的滤液置于4∘C冰箱中，其主要目的是降低DNA酶的活性，防止DNA被降解，而不是抑制解旋酶活性，B错误； C、滤液经离心后，由于DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，会析出；而在较高浓度的NaCl溶液中，DNA会溶解在溶液中，离心后主要存在于上清液中，而不是沉淀物中，C错误； D、粗提取的丝状物（DNA）放入二苯胺试剂后，需要在沸水浴的条件下加热，DNA才会与二苯胺反应呈现蓝色，而不是直接放入二苯胺试剂就成蓝色，D错误。 故选A。 5．（24-25高二下·江苏镇江·期末）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法错误的是（    ） A．根据DNA片段大小配制一定质量分数的琼脂糖溶液以便分离DNA分子 B．琼脂糖凝胶电泳中的电泳缓冲液中含指示剂，其可以在紫外灯下被检测出来 C．实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理 D．扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液混匀后需缓慢注入加样孔以防样品飘散 【答案】B 【详解】A、高浓度凝胶孔径小，适合分离小片段；低浓度凝胶孔径大，适合大片段。因此需根根据 DNA片段大小配制一定质量分数的琼脂糖溶液以便分离 DNA分子，A正确； B、琼脂糖凝胶电泳中的缓冲液中不含指示剂，与PCR产物混合的凝胶载样缓冲液中含有指示剂，B错误； C、PCR实验对污染极为敏感，微量离心管、枪头等需高压灭菌以去除外源DNA或核酸酶。蒸馏水也需灭菌确保无污染，C正确； D、载样缓冲液含甘油或蔗糖以增加样品密度，使其沉入加样孔。操作时应缓慢注入，避免因冲击力导致样品溢出孔外或飘散至周围缓冲液中，D正确。 故选B。 二、多选题 6．（24-25高二下·江苏宿迁·期末）关于“花菜DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（    ） A．研磨前先用液氮冷冻处理花菜，有利于DNA的释放 B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．可利用DNA不溶于酒精而某些蛋白质溶于酒精这一原理来粗提DNA D．鉴定DNA时将丝状物或沉淀物直接加入二苯胺试剂中，沸水浴加热出现蓝色 【答案】BD 【详解】A、加入适量液氮冷冻处理花菜，然后研磨，可以抑制酶的活性，避免DNA降解，使DNA提取更充分，A正确； B、研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误； C、DNA的粗提取与鉴定实验中利用DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精的原理，可以初步粗提取DNA，C正确； D、DNA鉴定时，将提取到的丝状物溶解在2mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，在水浴加热下呈现蓝色，D错误。 故选BD。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题04 基因工程 答案版 地 城 考点01 基因工程基本操作与应用 一、单选题 1．C 2．B 3．B 4．C 二、多选题 5．BCD 6．BD 7．AC 8．AD 三、非选择题 9．(1) 总RNA I与1R 2F与R 逆转录PCR或RT-PCR -CTGTAG- (2) 限制酶和DNA连接酶 使噬菌粒表达载体在受体细胞内复制 噬菌体复制原点 (3) Ca2+ 乳糖 大肠杆菌的核糖体 pⅢ蛋白 其DNA不能复制 10．(1) 显微注射 MⅡ（中） 电刺激（电脉冲） 分化（发育） (2) 酶 使重组细胞中的核基因全部来自含有目的基因的CHO细胞 激发CHO细胞核全能性体现 桑葚（椹）胚或囊胚 (3) 不含缬氨酸但含其他所有必需氨基酸 转基因获得的CHO细胞系（或pMTIV组）能合成缬氨酸 11．(1)脱氧核苷酸、核糖核苷酸、氨基酸 (2) 退火/复性 ① X Z (3) BamHI SalI 含氨苄青霉素、不含亮氨酸 O2 (4) 是 3 抗菌肽与病原菌孢子充分接触，能更有效发挥作用 12．(1) RNA 聚合酶识别和结合的部位（或驱动转录） SpeI、XhoI (2) GTCGAC 种类和数量（或 G/C 含量或 G、C 含量或 GC 含量） (3) Ca2+（或 CaCl2） 卡那霉素和 X-Gluc 白色 植物组织培养 (4) OsAnt1 启动子驱动的 AlaAT 基因只能在转基因大麦的根部转录（或特异性转录） （相同条件下，）利用水培法培养转基因大麦幼苗与野生型（或非转基因）大麦幼苗，一段时间后测定并比较两种幼苗根部氮的吸收情况 13．(1) 内含子 逆转录 (2) 5' 终止密码子 (3) 增加DNA双链完全打开的概率 使产物充分延伸 限制酶序列 (4) 慢 环状超螺旋状的DNA体积小（结构比较紧密） (5) BamHI HindⅢ (6)可能目的基因没有与载体连接 14．(1) 5′→3′ DNA 聚合酶、DNA连接酶 (2) 2 GFP基因两端的核苷酸序列 引物F1和R2有部分配对序列，引物之间能结合，会干扰引物和模板链的结合，影响PCR过程 (3) 琼脂糖凝胶电泳 负 1 DNA相对分子质量标准物（Marker） (4) 草胺膦 绿色荧光点 15．(1) B和C M基因两端的部分核苷酸序列 5′ 5′AAGCTT3′ 5′GTCGAC3′ (2)①③⑦ (3) 氨苄青霉素 四环素（氨苄青霉素和四环素） 5和6 (4) 脱分化和再分化 对柑橘幼苗接种该种革兰氏阴性菌，观察幼苗生长情况 16．(1) DNA半保留复制 引物与模板链结合 (2) ② ③ (3) 磷酸二酯键 使同源序列间能完全互补配对 DNA聚合酶和DNA连接酶 (4) （酶切或 PCR、）电泳 卡那霉素 绿色荧光强度高 (5) 证明GFP对小鼠体内干扰素-γ的释放量无影响 SEIK-GFP 融合蛋白生物活性并未明显改变 17．(1) 5' GGTACC 1.8 大量扩增重组载体 氨苄青霉素（或抗生素） 筛选含重组载体的大肠杆菌（或防止自身环化） DNA连接 防止Red基因片段自身环化 ③ (2) 将重组载体整合到斑马鱼染色体DNA上 斑马鱼心脏部位发出红色和绿色荧光 18．(1) 转录 RNA聚合酶识别和结合 (2) 基因组DNA Vamp8基因启动子两侧及两个同源臂（或加上Bgl II 酶切识别序列） (3) Bgl II 酶 不受酶切序列的限制（ 能够定向连接目的基因 ，快速高效） 2 (4) A+C 升高 CEBPB与Vamp8基因启动子结合，增强了LUC基因的表达，而REN基因表达量相同。 19．(1) 显微注射 MⅡ（中） 电刺激（电脉冲） 分化（发育） (2) 酶 使重组细胞中的核基因全部来自含有目的基因的CHO细胞 激发CHO细胞核全能性体现 桑葚（椹）胚或囊胚 (3) 不含缬氨酸但含其他所有必需氨基酸 转基因获得的CHO细胞系（或pMTIV组）能合成缬氨酸 20．(1) Ca2+（或CaCl2） 3'→5' (2) 提高 增多 增强 (3) 2 4（无先后顺序） 减少物质和能量的浪费 (4) 基因污染（存在生态风险） （无水杨酸或）水杨酸被分解完 C F 地 城 考点02 DNA 相关实验 一、单选题 1．C 2．C 3．A 4．A 5．B 二、多选题 6．BD 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $