四川省高二生物下学期单元测试（人教版选择性必修三第三章）

**基本信息** 高二生物基因工程单元月考卷，15道原创选择（45分）和5道综合非选择（55分），以CRISPR/Cas9、转基因奶牛等科研情境为载体，考查限制酶、PCR等核心技术，融合科学思维与探究实践。 **题型特征** |题型|题量/分值|知识覆盖|命题特色| |----|-----------|----------|----------| |选择题|15/45|限制酶专一性、载体构建、PCR原理等|原创情境如白念珠菌DNA提取，梯度考查基础概念| |非选择题|5/55|基因工程流程（φC31整合酶系统）、CRISPR应用（治疗CMT1A）|综合科研案例，如抗乳腺炎奶牛培育，突出探究实践与科学思维|

Sheet2 题号 题型 分值 核心知识点 难度系数（预估） 1 单项选择题 3 限制酶的特性与基因克隆应用 0.75 2 单项选择题 3 DNA 连接酶与 DNA 聚合酶的功能区别 0.6 3 单项选择题 3 植物表达载体的结构与功能（标记基因、复制原点、酶切设计、T-DNA） 0.6 4 单项选择题 3 DNA 粗提取与鉴定的实验原理及操作 0.7 5 单项选择题 3 PCR 技术的原理（引物设计、温度设置、酶的作用、扩增效率） 0.65 6 单项选择题 3 基因表达载体核心元件的功能（启动子、终止子、标记基因、复制原点） 0.7 7 单项选择题 3 目的基因导入受体细胞的方法（农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法、感受态细胞法） 0.7 8 单项选择题 3 琼脂糖凝胶电泳的结果分析（迁移方向、条带解读、阴性对照意义、DNA 回收） 0.55 9 单项选择题 3 基因工程在农业中的应用（抗虫、抗除草剂、抗病毒技术） 0.75 10 单项选择题 3 基因工程在医药领域的应用（基因诊断、基因治疗、生物标志物） 0.6 11 单项选择题 3 蛋白质工程的流程（基因修饰、序列设计、基因获取、功能验证） 0.6 12 单项选择题 3 反义 RNA 技术与基因工程操作（PCR 能量需求、引物设计、筛选原理、生殖隔离） 0.55 13 单项选择题 3 基因组文库与 cDNA 文库的区别（序列完整性、构建原料、适用场景） 0.6 14 单项选择题 3 CRISPR/Cas9 基因编辑技术（gRNA 设计、Cas9 功能、载体构建、编辑验证） 0.4 15 单项选择题 3 目的基因的分子水平检测（分子杂交、RT-PCR、抗原 - 抗体杂交） 0.6 16 非选择题 12 PCR 技术、基因表达载体构建（工具酶、启动子、attB 位点）、细胞筛选、转基因生物安全性 0.6 17 非选择题 9 目的基因获取（RNA 提取）、重组载体构建（接头设计）、反义 RNA 抗病毒机制、转基因植株鉴定 0.55 18 非选择题 11 CRISPR/Cas9 原理、基因编辑载体构建（酶切位点选择）、实验设计（对照设置）、检测方法 0.45 19 非选择题 9 DNA 粗提取、基因表达载体构建（酶切选择）、PCR 引物设计、植物组织培养（再分化） 0.6 20 非选择题 14 Cre/loxP 重组系统、基因表达的组织特异性（启动子选择）、转基因育种、RT-PCR 体系、遗传比例计算 0.4 $ 高二生物下学期单元测试 第三章基因工程 答案及解析 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 D C C D A D A C D C 11 12 13 14 15 D B D C C 一、选择题：本题共15小题，每小题3分，共45分。在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的。 1．【答案】D 【解析】考查限制酶的特性与基因克隆应用。A 错误，限制酶切割位点可在回文序列内部或两侧；B 错误，限制酶不识别启动子，获取编码区需切割基因上下游序列；C 错误，5'-GAATTC-3' 切割后黏性末端为 5'-AATT-3'，单链突出端描述不规范；D 正确，酶的专一性要求选择基因内部无识别序列的限制酶，避免目的基因被切断。 2．【答案】C 【解析】考查 DNA 连接酶与 DNA 聚合酶的区别。A 正确，二者均催化磷酸二酯键，连接对象不同；B 正确，DNA 连接酶无需模板，DNA 聚合酶需模板链；C 错误，T4 DNA 连接酶连接平末端效率极低，仅适用于黏性末端；D 正确，DNA 连接酶消耗 ATP，DNA 聚合酶利用 dNTP 水解放能。 3．【答案】C 【解析】考查植物表达载体的结构与功能。A 正确，植物载体需抗性标记基因筛选转化细胞；B 正确，复制原点是载体在大肠杆菌扩增的必需元件；C 错误，构建载体常用两种不同限制酶，防止自身环化与反向连接；D 正确，农杆菌转化依赖 Ti 质粒的 T-DNA 转移目的基因。 4．【答案】D 【解析】考查 DNA 粗提取与鉴定实验。A 正确，石英砂辅助破壁，洗涤剂瓦解细胞膜；B 正确，DNA 不溶于冷酒精，可析出纯化；C 正确，0.14mol/L NaCl 中 DNA 溶解度最低，去除蛋白杂质；D 错误，二苯胺显色仅证明存在 DNA，无法确定为 ERG3 基因。 5．【答案】A 【解析】考查 PCR 技术原理与操作。A 正确，引物依据目的基因两端序列设计，长度 15~20nt 最佳；B 错误，PCR 变性温度为 90~95℃，55℃为复性温度；C 错误，Taq 酶从引物 3' 端延伸 DNA 链；D 错误，PCR 扩增受底物、酶活性限制，实际产量远小于 2³⁰。 6．【答案】D 【解析】考查基因表达载体元件功能。A 正确，CaMV 35S 是组成型强启动子；B 正确，终止子终止转录，防止产物过长；C 正确，潮霉素抗性基因筛选阳性细胞；D 错误，复制原点保证载体在植物受体细胞中复制，并非仅在农杆菌中。 7．【答案】A 【解析】考查目的基因导入受体细胞的方法。A 正确，农杆菌转化法是双子叶植物转基因首选；B 错误，基因枪法成本高，多用于单子叶植物；C 错误，显微注射法适用于动物受精卵；D 错误，Ca²⁺制备感受态仅适用于原核细胞。 8．【答案】C 【解析】考查琼脂糖凝胶电泳结果分析。A 正确，DNA 带负电向正极移动；B 正确，条带长度与预期一致，PCR 扩增成功；C 错误，阴性对照无条带仅排除模板污染，无法判断引物二聚体；D 正确，凝胶回收试剂盒可回收目标条带。 9．【答案】D 【解析】考查基因工程在农业中的应用。A 正确，Bt 毒蛋白基因来自苏云金芽孢杆菌；B 正确，EPSPS 基因赋予草甘膦抗性；C 正确，RNAi 可培育抗病毒植株；D 错误，Bt 蛋白在奶牛消化道内完全降解，牛奶无残留。 10．【答案】C 【解析】考查基因工程在医药中的应用。A 错误，CYP2C19 分型是基因诊断，非基因治疗；B 错误，miR-103b 是糖尿病前期标志物；C 正确，BCL6B 启动子高甲基化导致沉默，去甲基化可恢复抑癌功能；D 错误，CRISPR/Cas9 未用于人类生殖细胞编辑，安全性未证实。 11．【答案】D 【解析】考查蛋白质工程的流程。A 正确，蛋白质工程核心是基因修饰；B 正确，依据结构与功能关系优化蛋白质；C 正确，可人工合成或定点突变获得改造基因；D 错误，必须进行基因表达与功能验证。 12．【答案】B 【解析】考查反义 RNA 技术与基因工程操作。A 错误，PCR 扩增需要 dNTP 供能；B 正确，引物 5' 端添加限制酶位点，便于定向连接；C 错误，未转化细胞无潮霉素抗性，无法存活；D 错误，转基因番茄与原番茄无生殖隔离。 13．【答案】D 【解析】考查基因组文库与 cDNA 文库的区别。A 正确，基因组文库含基因全长；B 正确，cDNA 文库以胁迫处理的 mRNA 为模板；C 正确，cDNA 无内含子，长度更短；D 错误，基因组文库可用于真核生物基因克隆。 14．【答案】C 【解析】考查 CRISPR/Cas9 基因编辑技术。A 正确，gRNA 依据靶基因序列设计，防止脱靶；B 正确，Cas9 是核酸内切酶，功能同限制酶；C 错误，基因编辑需构建载体表达 gRNA 和 Cas9；D 正确，PCR + 测序可验证编辑准确性。 15．【答案】C 【解析】考查目的基因的检测与鉴定。A 错误，分子杂交探针是目的基因 DNA 单链；B 错误，RT-PCR 需先逆转录再 PCR；C 正确，抗原 - 抗体杂交检测目的蛋白；D 错误，杂交阳性仅证明导入 / 表达，无法证明整合到染色体。 第二部分（非选择题 共55分） 二、非选择题：本题共5小题，共55分。 16．【答案】（1）高温（加热）变性（1分）   dNTP（四种脱氧核苷酸）、缓冲液（Mg2+）（2分，答出2种即可，每点1分） （2）限制酶（限制性内切酶）和DNA连接酶（1分，答全给分）   驱动溶葡萄球菌素基因在乳腺细胞中特异性转录（或表达）（1分）   提供φC31整合酶识别的位点，介导外源基因定点整合（1分） （3）φC311整合酶能识别attB位点，催化外源基因定点整合；若不共转染，外源基因无法定点整合（2分，答出“整合酶识别attB位点”得1分，“实现定点整合”得1分）   含有G418抗性基因（或neo基因），能抵抗G418的杀伤（1分） （4）溶葡萄球菌素（1分）   溶葡萄球菌素能特异性杀灭金黄色葡萄球菌，抑制乳腺炎发生（1分）   避免基因沉默、插入突变等（或：定点整合，安全性高）（1分，合理即可） 【解析】考点：PCR 技术、基因表达载体构建、细胞筛选、转基因生物的安全性 （1）PCR 通过高温变性使双链 DNA 解旋，无需解旋酶；反应体系必需原料为 dNTP，还需缓冲液（提供 Mg²⁺）。评分细则：第一空答 “高温解旋” 得 1 分；第二空答出 2 种得 2 分，答 1 种得 1 分。 （2）构建载体必需限制酶切割、DNA 连接酶连接；乳腺特异性启动子保证目的基因仅在乳腺细胞表达；attB 位点是 φC31 整合酶的识别位点，核心功能是定点整合。评分细则：第一空答全 2 种酶得 1 分；后两空答出核心关键词得 1 分 / 空。 （3）受体细胞无 φC31 整合酶，共转染才能实现定点整合；G418 筛选的原理是载体含新霉素抗性基因。评分细则：第一空答出 “共转染表达整合酶” 得 2 分；第二空答 “含新霉素抗性基因” 得 1 分。 （4）目的产物是溶葡萄球菌素，可特异性杀灭金黄色葡萄球菌；φC31 系统优势是定点整合；安全评估围绕产物、基因漂移、生态影响作答。评分细则：前三空 1 分 / 空；第四空合理即得 1 分。 17．【答案】（1） 被黄瓜花叶病毒（CMV）侵染的黄瓜植株叶片 （2）与限制酶切割 Ti 质粒产生的黏性末端碱基互补配对；使病毒 cDNA 与 Ti 质粒定向连接，防止目的基因自身环化、载体自身环化 （3）转录出反义 RNA，与 CMV 的 RNA4 互补配对，抑制病毒基因的翻译过程 （4）用黄瓜花叶病毒（CMV）侵染转基因黄瓜植株，观察植株是否发病；减少农药使用量、降低环境污染、提高黄瓜产量和品质（答出 1 点即可） 【解析】考点：目的基因获取、重组载体构建、反义 RNA 抗病毒、转基因植株鉴定 （1）病毒专性寄生，仅在侵染的植株叶片中可提取到 CMV 的 RNA。评分细则：答全 “被 CMV 侵染的黄瓜叶片” 得 2 分，仅答 “叶片” 不得分。 （2）接头序列需与载体黏性末端互补，实现定向连接，防止环化。评分细则：第一空答 “互补” 得 2 分；第二空答 “定向连接、防止环化” 得 2 分。 （3）反向连接目的基因，转录出反义 RNA，与病毒 RNA 互补，抑制翻译。评分细则：答出 “反义 RNA 抑制翻译” 得 1 分。 （4）个体水平鉴定需病毒侵染实验；转基因育种优点是减农药、环保、增产。评分细则：两空各 1 分，合理即得分。 18．【答案】（1）限制性核酸内切（限制）；特异性免疫 （2）靶向序列过短，与非靶基因结合概率升高，脱靶效应增强；防止 Cas9 切割破坏必需基因，保证神经胶质细胞的正常存活 （3）①BamHⅠ ②XhoⅠ（两空顺序可互换）；③疾病模型小鼠，注射等量空载体（或生理盐水）；④抗原 - 抗体杂交；⑤腓骨肌萎缩症状（运动能力、神经髓鞘形成情况） 【解析】考点：CRISPR/Cas9 原理、基因编辑载体构建、实验设计与检测 （1）Cas9 切割 DNA，功能同限制酶；细菌针对特定噬菌体的免疫属于特异性免疫。评分细则：每空 1 分，术语正确即得分。 （2）gRNA 序列过短，脱靶效应增强；gRNA 不位于基因内部，避免切割必需基因。评分细则：每空 2 分，答出核心逻辑即得分。 （3）依据载体酶切位点选BamHⅠ、XhoⅠ；实验遵循对照原则，C 组为空载体对照；蛋白检测用抗原 - 抗体杂交；个体水平检测神经功能。评分细则：每空 1 分，酶切位点顺序可换，对照组合理即可。 19．【答案】（1）体积分数为 95% 的冷酒精；BglⅡ、XmaⅠ （2）不一定；1 （3）B、D （4）再分化；生长素和细胞分裂素的浓度比例、种类及用量不同 【解析】考点：考点：DNA 粗提取、基因表达载体构建、农杆菌转化、植物组织培养 （1）DNA不溶于冷酒精；选择不破坏目的基因和标记基因的BglⅡ、XmaⅠ酶切。评分细则：每空 1 分，术语正确即得分。 （2）农杆菌可能含空质粒，因此不一定含改良基因；样品 1 出现特异性条带，为重组质粒。评分细则：每空 1 分。 （3）PCR 引物遵循5'→3'、反向互补，仅 B、D 符合要求。评分细则：2 分，漏选得 1 分，错选不得分。 （4）愈伤组织→植株为再分化；培养基核心差异是植物激素的比例。评分细则：第一空 1 分；第二空 2 分，答 “激素比例不同” 即得分。 20．【答案】（1）限制性核酸内切酶（限制酶） （2）ATGTATGC （3）①②③ （4）①③ （5） ACD （6）3/4 （7）①②③⑤⑥ （8）①④ 【解析】考点：Cre/loxP 重组系统、基因表达的组织特异性、转基因育种、RT-PCR Cre重组酶能特异性识别loxP位点， 并切除两个同向loxP位点间的DNA序列，这与限制性核酸内切酶识别特定DNA序列并切割DNA链的功能一致 。 （2）loxP由34bp组成，包含两个13bp的反向重复序列（IR）和一个8bp的间隔区。间隔区的序列决定loxP的方向。 若两个loxP位点方向相同，Cre酶切除中间序列；若方向相反，则可能反转序列。题目要求删除中间序列，说明两个loxP方向相同。左侧loxP的间隔区模板链为5'-GCATACAT-3',所以右侧loxP位点间隔区的编码链序列为5'-ATGTATGC-3'。 （3）抗虫（cry1C）和抗草甘膦（EPSPS）基因需要在绿色组织（叶鞘、叶心、茎秆）表达，才能抵御二化螟和草甘膦，因此启动子1：驱动抗虫、抗草甘膦基因表达，这些基因需要发挥作用以抵御二化螟和草甘膦，因此选①胚乳特异性启动子。启动子2：驱动Cre重组酶基因表达，因此选②绿色组织特异性启动子。启动子3：为保证Cre/loxP重组系统的调控元件、标记基因等在所有组织中稳定表达，需选③组成型启动子（在所有组织中都能保持活性）。 质粒PC1300Z上有SacⅠ、PstⅠ的酶切位点点，而EcoRI位点可能破坏质粒关键结构/标记基因，因此多基因串联体两侧需添加①SacⅠ和③PstⅠ的识别序列，才能与酶切后的质粒高效连接（相同限制酶切产生相同黏性未端，便于连接）。  （5）A、农杆菌本身不具有卡那霉素抗性，才能通过卡那霉素筛选导入了重组质粒的农杆菌，A正确；  B、过程I是农杆菌转化法，显微注射法常用于动物细胞，B错误；  C、过程II需在含草甘膦的培养基中筛选导入了EPSPS基因的细胞，C正确；  D、过程II中生长素浓度较高时诱导生根，D正确。  故选ACD。  （6）To自交得到T1,抗除草剂与不抗除草剂比例为3:1,说明抗除草剂基因（EPSPS）为单拷贝显性基因，Tn基因型为Aa（A为抗除草剂基因，a为隐性），抗虫基因（crylC）与抗除草剂基因位于同一转基因片段上，二者连锁基因和抗享甘膜（EMN）签因成功钟入水超结程中，并利用Crle重结服系统持异性删脉种子征乳中的外源基因，获得了胚乳中无外罪基因的抗虫、抗除拿而特基因水稻，转基因水稻的部分培育过程如的A所示。  Crelna重1级静系价由Ce重组酶和le位点组成，多基因率联体友例baP位点的感图用示。当DNA分子中存在两个相同的1e产列且同向时，Ge重组麟能特算性两个位点阁的DNA序列。C、过程I需在含草甘膦的培养基中筛选导入了EPSPS基因的细胞，C正确，；  D、过程II中生长素浓度较高时诱导生根，D正确。  （6）T6自交得到T1,抗除草剂与不抗除草剂比例为3:1,说明抗除草剂基因（EPSPS）为单拷贝显性基因，To基因型为Aa（A为抗除草剂基因，a为隐性），抗虫基因（crylC）与抗除草剂基因位于同一转基因片段上，二者连锁遗传，因此To的抗虫基因也为单拷贝显性，T1 中抗虫性状的分离比与抗除草剂性状一致，即抗二化螟水稻占3/4（不考虑突变和交换）。  （7）RT-PCR分为逆转录和PCR扩增两步:逆转录阶段:以RNA模板（mRNA）为模板， 需要逆转录酶、dNTP（原料）、引物、 水、缓冲液。PCR扩增阶段:以逆转录得到的cDNA为模板，需要耐高温的DNA聚合酶（TagDNA聚合酶）、dNTP、引物，同样需要水、缓冲液；全程无需DNA模板，也无需ORNA引物。 （8）题干要求实现胚乳中删除外源基因，绿色组织（根/茎/叶）保留并表达外源基因。根细胞:cry1C不表达，EPSPS表达，对应表格中①（-、+）;胚乳细胞:Cre重组酶切除外源基因，两个基因均不表达，对应表格中④（-、-）。因此符合目标水稻的根细胞及胚乳细胞的是①④。   学科网（北京）股份有限公司 $ 应用场景：周测/单元测/月考/期中/期末/（如以上均不符合则自行添加） 高二生物下学期单元测试 第三章基因工程 （考试时间：75分钟，分值：100分） 第一部分（选择题共45分） 一、选择题：本题共15小题，每小题3分，共45分。在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的。 1.（原创）限制酶是基因克隆的核心工具酶，在BCL6B基因（抑癌基因）的克隆实验中，研究人员需用限制酶切割基因组DNA以获取目的基因。下列关于限制酶的分析正确的是（） A.若选用识别序列为6个碱基对的限制酶，切割后可产生黏性末端或平末端，且切割位点一定在回文序列内部 B.该实验中限制酶需特异性结合BCL6B基因的启动子区域，才能保证切割后获取完整的编码区 C.若限制酶识别序列为5’-GAATTC-3’，切割BCL6B基因后产生的黏性末端为5’-AATT-3’和3’-TTAA-5’ D.为避免BCL6B基因内部被切割，需选择该基因中无识别序列的限制酶，体现酶的专一性 2.（原创）在CRISPR/Cas9载体构建中，需用DNA连接酶连接gRNA片段与Cas9表达载体，以实现基因编辑工具的组装。下列关于DNA连接酶与DNA聚合酶的比较，结合该情境错误的是（） A.二者均催化磷酸二酯键形成，但DNA连接酶连接gRNA片段与载体的缺口，DNA聚合酶连接游离脱氧核苷酸 B.DNA连接酶连接时无需模板链指导，仅需识别黏性末端或平末端，而DNA聚合酶需模板链介导 C.构建CRISPR/Cas9载体时，T4DNA连接酶可连接平末端，更适用于gRNA片段与载体的高效连接 D.二者催化反应均需能量供应，DNA连接酶消耗ATP，DNA聚合酶消耗dNTP中的能量 3.（原创）科研人员构建了植物表达载体pROK2-BplMYB46，用于转化白桦。下列关于该载体的叙述，错误的是（） A.该载体需要含有植物选择标记基因（如抗卡那霉素基因），以便筛选转化成功的细胞 B.若要在大肠杆菌中大量扩增该载体，载体上必须具备复制起点（ori） C.为了将BplMYB46基因插入载体，通常需要使用同一种限制酶分别切割目的基因和载体 D.该载体构建成功后，必须包含T-DNA序列，才能通过农杆菌介导法转化植物细胞 4.（原创）某实验小组开展“白念珠菌ERG3基因的DNA粗提取与鉴定”实验，ERG3基因与白念珠菌的抗药性相关。下列关于实验原理与操作细节的分析，错误的是（） A.破碎白念珠菌细胞时需加入石英砂研磨，同时加入洗涤剂瓦解细胞膜，释放核DNA B.向溶解DNA的NaCl溶液中加入冷酒精（体积分数95%），可利用DNA不溶于酒精的特性析出纯净DNA C.粗提取时调节NaCl溶液浓度至0.14mol/L，此时DNA的溶解度最低，可去除部分蛋白质杂质 D.鉴定时加入二苯胺试剂，沸水浴后若出现蓝色，说明提取的DNA中含ERG3基因 5.（原创）PCR技术可快速扩增目的基因，在烟草钾转运蛋白基因NtKUP6的克隆中，研究人员通过PCR扩增该基因的编码区。下列关于PCR扩增的叙述正确的是（） A.设计引物时需根据NtKUP6基因编码区两端的序列合成，引物长度一般为15-20个核苷酸 B.变性阶段温度设置为55℃，目的是使NtKUP6基因的双链DNA解旋为单链 C.复性阶段引物与模板链结合后，Taq酶从引物5’端延伸DNA链，合成NtKUP6基因片段 D.循环30次后，NtKUP6基因的扩增产物量为初始模板量的230倍，可满足克隆需求 6.（原创）基因表达载体的构建是基因工程的核心，在甘蓝型油菜BnMYB46基因的功能研究中，需构建该基因的植物表达载体如图1。下列关于该表达载体组成元件与功能的对应关系，错误的是（） 图1.BnMYB46超表达载体 A.选用CaMV35S启动子，保证BnMYB46基因在烟草细胞中高效转录 B.终止子终止RNA聚合酶的转录，避免转录产物过长影响翻译 C.选用潮霉素抗性基因，用于筛选含有BnMYB46基因的烟草细胞 D.复制原点仅保证载体在农杆菌中复制，与目的基因在烟草细胞中的表达无关 7.（原创）不同受体细胞的目的基因导入方法存在差异，在月季扩展蛋白基因RmEXPB2的转基因研究中，需将该基因导入月季愈伤组织细胞。下列关于导入方法的分析，正确的是（） A.可采用农杆菌转化法，农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可将RmEXPB2基因整合到月季基因组中 B.月季为双子叶植物，可采用基因枪法导入，该方法成本低、操作简便 C.显微注射法适用于该实验，可直接将重组载体注入月季愈伤组织细胞的细胞核 D.感受态细胞法更高效，需用Ca2+处理月季愈伤组织细胞，使其处于感受态 8.（原创）琼脂糖凝胶电泳是基因工程中DNA片段鉴定的常用技术，在小麦耐低温基因TaGGCT18-6A的克隆中，研究人员对PCR扩增产物进行电泳检测。图甲为该实验的电泳图谱，M为DNA分子量标准（Marker），1为TaGGCT18-6A基因的PCR产物，2为阴性对照。下列分析错误的是（）M 1 2 图2.TaGGCT18-6A基因的PCR结果 A.电泳时DNA片段向正极移动，因为TaGGCT18-6A基因的DNA分子带负电 B.泳道一条带长度约700bp，与预期的TaGGCT18-6A基因编码区长度一致，说明PCR扩增成功 C.第三个泳道无条带，说明实验无引物二聚体污染，PCR反应特异性高 D.若要回收第二泳道中的DNA片段，可切下对应凝胶块，采用凝胶回收试剂盒提取 9.（原创）基因工程在农业上的应用包括抗虫、抗除草剂作物育种等。下列说法错误的是（） A.转Bt基因抗虫棉中的Bt毒蛋白基因来源于苏云金芽孢杆菌，其编码的蛋白对鳞翅目害虫具有特异性杀伤作用 B.抗除草剂转基因大豆通常导入的是草甘膦抗性基因（EPSPS），该基因使植物对草甘膦产生耐受性 C.RNA干扰（RNAi）技术可用于培育抗病毒植物，通过在植物中表达靶向病毒基因组的dsRNA，使病毒基因沉默 D.转Bt基因玉米全株青贮饲喂奶牛后，Bt蛋白会在牛奶中大量残留，对人体健康构成威胁 10.（原创）基因工程在医药领域的应用，为疾病诊断和治疗带来了革命性变化。下列相关叙述，正确的是（） A.CYP2C19基因分型检测，可预测患者对氯吡格雷的代谢能力和疗效，指导抗血小板药物的个体化选择，这属于基因治疗的一种 B.miR-103b在糖尿病前期患者血清中显著高表达，其作为生物标志物可用于该病的早期诊断 C.BCL6B基因在多种肿瘤中因启动子甲基化而表达沉默，恢复其表达或使用去甲基化药物，可能成为肿瘤治疗的新策略 D.CRISPR/Cas9技术已广泛应用于人类生殖细胞的基因修复，成功治愈了多种遗传病，且其安全性已得到完全证实 11.（原创）科研人员拟通过蛋白质工程改造香椿TsMYB1转录因子，提高其对次生代谢产物合成的调控能力。下列关于蛋白质工程的叙述错误的是（） A.蛋白质工程的核心是基因工程，需通过改造TsMYB1基因来实现蛋白质功能的优化，而非直接改造蛋白质 B.设计氨基酸序列时，需结合TsMYB1转录因子的结构与功能关系，例如增强其与靶基因启动子的结合能力 C.推测脱氧核苷酸序列后，可通过人工合成基因或对原有基因进行定点突变，获得改造后的TsMYB1基因 D.该过程无需进行基因表达和功能验证，因为根据氨基酸序列推测的基因序列一定能表达出预期功能的蛋白质 12.（原创）类黄酮具有抗氧化、抗炎等多种功效，基因A 表达产物促进番茄细胞内类黄酮的分解。将基因A 反向插入载体，使其在番茄细胞内转录出与内源基因A 的mRNA 互补的反义RNA，抑制内源基因A 的表达，从而提高类黄酮的含量，实验部分流程如图3。下列分析合理的是（） 图3.转基因部分流程图 A. 与细胞内基因A 复制相比，PCR 扩增基因A时无需消耗能量 B. 扩增基因A 所用引物1 的5′端应添加限制酶 HindⅢ识别序列 C. 未转化的叶肉细胞可以在含有潮霉素的培养基中实现脱分化 D. 通过以上技术获得的转基因番茄与原番茄之间存在生殖隔离 13.（原创）基因组文库与cDNA文库是获取目的基因的重要途径，在紫贻贝SULT1B1基因与紫贻贝解毒功能相关，该基因在四溴双酚A胁迫下高表达，在SULT1B1基因的克隆中，研究人员需选择合适的文库获取该基因。下列关于二者的比较，结合该情境错误的是（） A.若要获取SULT1B1基因的完整序列（含启动子和内含子），需构建紫贻贝的基因组文库 B.若仅需获取SULT1B1基因的编码区，可构建cDNA文库，原料为四溴双酚A胁迫后的紫贻贝mRNA C.基因组文库中SULT1B1基因的长度大于cDNA文库中该基因的长度，因为cDNA不含内含子 D.基因组文库适用于原核生物基因克隆，cDNA文库适用于真核生物基因克隆，因此该实验需选用cDNA文库 14.（原创）CRISPR/Cas9技术可精准编辑月季RmEXPB2基因（调控生长性状），其技术原理如图4所示（向导RNA与靶基因特异性结合，Cas9蛋白切割双链DNA）。下列关于该技术的应用及分析错误的是（） 图4.CRISPR/Cas9基因编辑系统 A.向导RNA的设计需依据RmEXPB2基因的特定碱基序列，确保其能特异性结合靶基因，避免脱靶效应 B.Cas9蛋白可切割靶基因的双链DNA，产生平末端或黏性末端，其功能与基因工程中的限制酶类似 C.该技术可实现RmEXPB2基因的定点敲除，若要获得该基因功能缺失的月季植株，无需构建表达载体 D.基因编辑后，需通过PCR扩增靶基因片段并测序，确认编辑是否成功，避免出现碱基错配等异常情况 15.（原创）目的基因的检测与鉴定是基因工程的关键步骤，羊口疮病毒的某基因与病毒毒力相关，在羊口疮病毒基因组重要基因的功能研究中，需验证目的基因是否导入受体细胞并表达。下列关于分子水平检测的叙述正确的是（） A.分子杂交技术可检测目的基因是否导入宿主细胞，探针需与该病毒基因的mRNA互补 B.逆转录PCR（RT-PCR）可检测目的基因是否转录，需从感染后的宿主细胞中提取总RNA C.抗原-抗体杂交可检测目的基因是否翻译，抗体需针对该病毒基因编码的蛋白制备 D.若分子杂交和抗原-抗体杂交均出现阳性结果，说明目的基因已整合到宿主细胞染色体DNA上 第二部分（非选择题 共55分） 二、非选择题：本题共5小题，共55分。 16.（原创）（12分）奶牛乳腺炎是全球畜牧业的重大病害，由金黄色葡萄球菌感染引发，传统抗生素防治易导致耐药性问题。φC31 整合酶系统是新型定点基因整合工具，可精准识别attB位点，介导外源基因单向、稳定、定点整合，彻底解决传统转基因随机整合引发的基因沉默、插入突变等缺陷。 科研人员利用该系统，将溶葡萄球菌素基因（表达产物特异性杀灭金黄色葡萄球菌）构建为乳腺特异性表达载体，与 φC31 整合酶质粒共转染牛耳成纤维细胞，经筛选、鉴定后结合体细胞核移植技术，培育出抗乳腺炎转基因奶牛，为绿色畜牧育种提供全新方案。技术流程与重组载体如下图所示： A抗乳腺炎转基因奶牛培育流程图 （注：G418 是一种新霉素类似物，常用于实验室细胞筛选） B重组表达载体结构示意图 图5. φC31 整合酶质粒共转染牛耳成纤维细胞过程图 结合基因工程知识，回答下列问题： （1） 科研人员采用 PCR 技术体外扩增溶葡萄球菌素基因，该技术中使目的基因解旋的原理是_______ _____（1分）；反应体系除模板、引物、酶外，还需添加______ _____ _（2分）（答 2 种）。 （2）构建重组载体是基因工程的核心步骤，该过程必需的两种工具酶是__ _ _ ________（1分） ；载体中乳腺特异性启动子的作用是________ ___（1分）；attB位点在该技术中的核心功能是_________ ____（1分）。 （3） 实验需将重组载体与 φC31 整合酶质粒共转染成纤维细胞，结合题干信息分析，必须共转染的原因是_______ __ _____（2分）；能在含 G418 培养基中存活的细胞，其本质特点是______ __ _______（1分）。 （4）转基因奶牛乳腺细胞表达的目的产物是___ _________（1分）；该产物预防乳腺炎的机理是_______ __ ______（1分）；与传统转基因技术相比，φC31 整合酶系统的核心优势是物安全评估，列举一项评估内容： _ _ __ _（1分）。 17.（9分）黄瓜花叶病毒（CMV）是危害黄瓜生产的主要病毒之一，该病毒侵染植株后会导致叶片皱缩、光合作用减弱，严重影响产量和品质。CMV的基因组中的RNA4负责编码病毒的外壳蛋白。为培育抗CMV的黄瓜新品种，科研人员进行了如图所示的基因工程操作。回答下列问题： 图6.抗CMV的黄瓜新品种载体构建过程 注：P35S：花椰菜花叶病毒35S启动子，是植物中常用的强组成型启动子；RBC终止子：基因的终止子 ori：复制原点；T-DNA-RB / T-DNA-LB：T-DNA的右边界/左边界； Spcᴿ：壮观霉素抗性基因；PNOS：NOS基因的启动子，驱动NPTⅡ基因的转录NOS：NOS终止子，终止NPTⅡ基因的转录。 （1）为获得CMV的RNA4，应从______ _____（2分）中提取总RNA．然后以RNA4为模板，通过逆转录过程来合成其互补DNA（cDNA）。 （2）使用两种不同的限制酶切割T-DNA．同时对合成的cDNA的两端加装接头，该接头的序列的特点应该是_____ __ ______（2分），其目的是_____ __ ______ __（2分）。 （3）图中将病毒RNA4-cDNA反向连接到Ti质粒上，这种连接方式的目的是______ _____（1分），从而达到抗CMV的作用。 （4）检测转基因黄瓜是否成功获得抗性，可采用的个体生物学水平鉴定方法是___ ________（1分）。与传统的农药防治相比，培育抗病毒转基因黄瓜的优点是____ __ ______（1分）（写出1点）。 18.（11分）CRISPR/Cas9基因编辑技术中，gRNA（单向导RNA）是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与gRNA配对的靶基因DNA序列。PMP22蛋白是神经髓鞘形成的关键蛋白质，但神经胶质细胞中PMP22过量表达可能会引起腓骨肌萎缩症（CMT1A）。科研人员希望利用基因编辑技术治疗CMT1A，下图为CRISPR/Cas9基因编辑技术的机制示意图，请据图回答问题： 图7.CRISPR/Cas9基因编辑技术的机制示意图 (1)CRISPR/Cas9基因编辑技术源于细菌抵御噬菌体的机理研究。细菌被特定噬菌体感染后，会形成“免疫记忆”。从功能上来看，CRISPR/Cas9系统类似基因工程中使用的_____酶（1分）。从免疫的类型来看，细菌的CRISPR/Cas9是一种____ ___（1分）（填“特异性免疫”或“非特异性免疫”）防御机制。 (2)CRISPR/Cas9系统中gRNA的靶向序列长度一般为20个核苷酸左右。从靶向序列与模板的结合分析，靶向序列不可过短的原因是_______ __ ____（2分）。gRNA位点不位于PMP22基因内部的原因是______ __ _____（2分）。 (3)为了进一步探究CRISPR/Cas9治疗CMT1A的可行性，科研人员构建了下图8所示表达载体，并利用CMT1A疾病模型小鼠进行了相关实验，请完成下表（每空1分）： 图8.治疗CMT1A的表达载体 实验目的 简要操作步骤 构建表达载体 PCR扩增gRNA对应的DNA序列，并在上游和下游引物的5'端分别添加限制酶①________和②________。 自变量处理 A组为正常小鼠，不做处理；B组为疾病模型小鼠，坐骨神经中注射构建成功的表达载体：C组为③____ __ _ 测定相关指标 通过荧光PCR技术测定三组PMP22基因拷贝数；通过④___ _______技术测定三组PMP22蛋白表达量：最后还需从个体水平测定三组小鼠⑤_____ _____。 19. （9分）普通水稻含铁量极低，研究人员通过改良相关基因，培育出了铁含量比普通水稻高60%的转基因水稻。图甲为改良基因及农杆菌的Ti 质粒的示意图，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因及一些酶切位点，图乙为后续培养过程。回答下列问题： 图9.转基因水稻培育过程 （1）DNA 粗提取实验中，DNA 不溶于 （1分），但某些蛋白质可以溶于其中。如图甲构建的基因表达载体需用限制酶 （1分）对Ti 质粒进行切割。 （2）在含氨苄青霉素的培养基中能够生长的农杆菌中 （1分）（“一定”或“不一定”）含有改良基因。菌落大量培养后，提取农杆菌的Ti 质粒，用SmaⅠ酶切，酶切产物PCR 扩增，电泳分析，结果如下图。由下图分析可知，样品 （1分）的农杆菌含有重组Ti 质粒。筛选出的含重组Ti 质粒的农杆菌，侵染水稻的愈伤组织。 （3） PCR 等技术还可以用于鉴定被侵染的愈伤组织中是否含有改良基因。已知该基因的部分序列如下： 5'-ATGGCT AGGAAC-3' 3'-TACCGA TCCTTG-5' 根据上述序列应选择引物 （2分）（填字母）进行PCR。 A. 引物：5'-TACCGA-3' B. 引物：5'-GTTCCT-3' C. 引物：5'-AUGGCU-3' D. 引物：5'-ATGGCT-3' （4）图乙中愈伤组织经 （1分）过程形成转基因水稻苗，培养基2 与培养基3 的区别是 _ __ __ _ （2分）。 20.（14分）二化螟和田间杂草极大影响了稻米的产量和品质，科学家利用转基因技术将抗虫（cry1C）基因和抗草甘膦（EPSPS）基因成功转入水稻细胞中，并利用Cre/loxP重组酶系统特异性删除种子胚乳中的外源基因，获得了胚乳中无外源基因的抗虫、抗除草剂转基因水稻。转基因水稻的部分培育过程如图A所示。 Cre/loxP重组酶系统由Cre重组酶和loxP位点组成，多基因串联体左侧loxP位点的部分序列如图B所示。当DNA分子中存在两个相同的loxP序列且同向时，Cre重组酶能特异性识别并删除两个位点间的DNA序列。 A B 注：LB、RB：多基因串联体左右边界序列，Kan':卡那霉素抗性基因，PstI、SacI、EcoRI:限制性核酸内切酶 (1)据题意推测，Cre重组酶的功能类似于_______（1分）。 (2)结合图2信息，为删除两个loxP位点间的DNA序列，多基因串联体右侧loxP位点间隔区的编码链序列为5'-_____ ____-3'（2分）。 (3)人类食用的精米主要是由水稻种子的胚乳加工制成，二化螟主要通过钻蛀叶鞘、叶心、茎秆等绿色组织而危害水稻。结合题干信息，为实现水稻中外源基因的精准表达与特异性删除，启动子1、2、3分别为_______、_______、______（每空1分）（编号选填）。 ①胚乳特异性启动子 ②绿色组织特异性启动子 ③组成型启动子（在所有组织中都能保持活性） (4)为使多基因串联体与质粒PC1300Z高效连接，需在其两侧添加______（1分）（编号选填） ①SacI的识别序列②EcoRI的识别序列③PstI的识别序列 (5)下列关于转基因水稻To培育过程的叙述，正确的是________（1分）。 A．农杆菌应不具有卡那霉素抗性 B．过程I常用显微注射法 C．过程Ⅱ在含草甘膦的培养基中筛选 D．过程Ⅲ中培养基中适当增加生长素的浓度以诱导生根 (6)将转基因水稻T0自交得到T1，在T1幼苗期喷施适量的草甘膦，发现抗除草剂水稻与不抗除草剂水稻之比约为3:1，则T1中抗二化螟水稻的比例为________（2分）。（不考虑突变和交换） 为评估外源基因的敲除是否具有组织特异性，科研人员分别提取转基因水稻各组织细胞的总RNA，通过RT-PCR和凝胶电泳检测各细胞中不同基因的表达情况。结果如表所示，“+”表示“表达”，“-”表示“不表达”。 (7)RT-PCR是以mRNA为模板进行的特殊PCR，主要过程如图C所示。该反应体系中需添加的物质有___ __ _____（2分）。（编号选填） C ①水、缓冲液②RNA模板③dNTP④DNA模板⑤逆转录酶⑥耐高温的DNA聚合酶⑦RNA引物 (8)表格结果中分别符合目标水稻的根细胞及胚乳细胞的是____ ___（2分）。（编号选填） 学科网（北京）股份有限公司 $