专题03 基因工程（期末真题汇编，河南专用）高二生物下学期

**基本信息** 聚焦基因工程核心考点，整合河南多地高二期末真题，覆盖工具操作、程序设计、蛋白质工程及综合应用，注重实验技能与科学思维结合。 **题型特征** |题型|题量|知识覆盖|命题特色| |----|----|----------|----------| |单选题|28|限制酶作用、PCR引物设计、DNA提取鉴定等|结合DNA电泳图谱分析酶切位点，通过抗虫棉培育考查载体构建| |非选择题|14|基因表达载体构建、筛选鉴定、蛋白质工程改造等|以干扰素制备、抗草甘膦作物培育为情境，综合考查双酶切策略与目的基因检测|

专题03 基因工程 4大高频考点概览 考点01 重组DNA技术的基本工具 考点02 基因工程的基本操作程序 考点03 蛋白质工程 考点04 基因工程综合 地 城 考点01 重组DNA技术的基本工具 一、单选题 1．（24-25高二下·河南商丘·期末）某同学以鸡血细胞为材料进行“DNA粗提取和鉴定”实验。下列叙述错误的是（　　） A．向鸡血细胞液中加入蒸馏水并搅拌，可加快血细胞破裂，释放DNA B．向DNA溶液中加入2mol/LNaCl溶液，能析出DNA并提高其纯度 C．向DNA溶液中加入体积分数为95%的预冷酒精，可对DNA进行纯化 D．DNA溶液与二苯胺试剂反应后，溶液呈现的蓝色越深，说明提取的DNA越多 2．（24-25高二下·河南三门峡·期末）基因工程是在DNA分子水平上进行的，需要有专门的工具。下列关于基因工程所需基本工具酶的叙述，错误的是（    ） A．不同限制酶切割后产生的DNA片段可能被某种DNA连接酶连接 B．T4 DNA连接酶可以催化磷酸二酯键形成进而连接黏性末端或平末端 C．大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，并且只在其中一条链的特定部位切割 D．原核细胞内的限制酶可切割入侵的DNA分子，通常不切割细菌自身的DNA分子 3．（24-25高二下·河南南阳·期末）在基因工程操作中，科研人员利用两种限制酶（和）处理基因工程载体，进行电泳检测，结果如图所示。下列相关叙述错误的是（　　） A．该载体最可能是环状DNA分子 B．该DNA分子上有关于和的酶切位点共3个 C．和的切点之间最短相距约1kb D．限制酶作用于该载体的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键 4．（24-25高二下·河南洛阳·期末）五种限制酶的切割位点如图所示，下列叙述正确的是（    ） A．Spe I处理的目的基因和 Xho I处理的质粒能用 E. coli DNA 连接酶连接 B．EcoR V处理的目的基因和 SmaⅠ处理的质粒能用T4 DNA 连接酶连接 C．Xho I处理的目的基因和 Xba I处理的质粒能用T4 DNA 连接酶连接 D．SmaⅠ处理的目的基因和XhoⅠ处理的质粒能用E. coli DNA连接酶连接 5．（24-25高二下·河南南阳·期末）DNA、RNA、蛋白质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选择适宜的方法对它们进行提取。下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（　　） A．不能选用哺乳动物血液作为材料，因为血液有颜色会影响后续对DNA鉴定的观察 B．对材料进行充分研磨后需用单层滤纸过滤以除去研磨液中的杂质 C．用预冷的酒精溶液析出DNA可防止DNA的结构被破坏 D．根据DNA的特殊组成分析，二苯胺最可能与脱氧核糖或任一碱基发生反应而出现蓝色 6．（24-25高二下·河南南阳·期末）下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液 B．鉴定DNA时，将粗提取的DNA丝状物加入二苯胺，沸水浴后冷却出现蓝色 C．进行琼脂糖凝胶电泳时，通过观察DNA片段在凝胶中的迁移距离判断其大小 D．利用PCR扩增DNA片段3次后得到含两种引物的DNA片段所占比例为3/4 地 城 考点02 基因工程的基本操作程序 一、单选题 1．（24-25高二下·河南信阳·期末）引物的设计是影响PCR扩增反应的效率和特异性的关键因素，下列相关叙述正确的是（　　） A．引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 B．适当提高退火温度会增加PCR产生非特异性产物的可能性 C．想在目的基因两端增加限制酶切位点，相应碱基序列应加在引物的3端 D．经过30次PCR循环，消耗引物和原料，合成了230个目的基因 2．（24-25高二下·河南洛阳·期末）关于DNA粗提取与鉴定及PCR 技术，下列叙述正确的是（    ） A．过滤液在4 ℃冰箱中静置和离心的目的是加速 DNA 的沉淀 B．利用二苯胺试剂鉴定时，白色丝状物中的DNA不会变性 C．PCR 反应缓冲液中一般要添加 Mg²⁺来激活DNA 聚合酶 D．加入微量离心管中的模板可以是 DNA，也可以是RNA 3．（24-25高二下·河南焦作·期末）牛乳铁蛋白肽（LfcinB）是一种抗菌肽，利用基因工程生产LfcinB时，其所带正电荷易使宿主工程菌死亡，故常用带负电荷的蛋白（如APBSP）与LfcinB形成融合蛋白。研究者采用PCR技术对酵母菌内的APBSP-LcinB融合基因进行检测，过程如图所示。下列叙述正确的是（　　） A．所用的一对引物可分别与APBSP基因和LfcinB基因结合 B．步骤1可促进APBSP-LfcinB融合基因边解旋边复制 C．步骤3过程中TaqDNA聚合酶会与引物的5'端结合 D．若检测到PCR扩增的产物，则可证明融合基因成功表达 4．（24-25高二下·河南驻马店·期末）幽门螺杆菌（Hp）与胃炎、胃食管反流病等多种疾病有关。科研人员将Hp的Ipp20基因作为目的基因，通过基因工程制备出相应的疫苗，操作流程如图所示。下列相关叙述错误的是（    ） A．PCR扩增目的基因时理论上第4次循环产物中含两种引物的DNA片段占7/8 B．将目的基因插入质粒时，最佳方案中需要用的酶有XhoI、PstI和DNA连接酶 C．培养基A中添加的抗生素是潮霉素，培养基B中添加的抗生素是氯霉素 D．过程③需要用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于易于吸收周围环境中DNA分子的状态 5．（24-25高二下·河南郑州·期末）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得 Gata3-GFP 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4 只新生小鼠的基因型，设计了引物 1 和引物 2 用于 PCR 扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列叙述错误的是（    ） A．启动子区域含有 RNA 聚合酶的结合位点 B．1号和3 号为杂合子、2号和4号为纯合子 C．4号小鼠是野生型，2号小鼠是 Gata3-GFP 基因纯合子 D．若用引物1和引物3进行 PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 6．（24-25高二下·河南商丘·期末）传统抗虫棉有两种类型，抗虫基因分别为R19和SGK。将这两种传统抗虫棉进行基因融合后，利用基因工程可培育出新型转基因抗虫棉。如图为通过PCR扩增两种目的基因后，获得新型抗虫基因的流程示意图。下列叙述正确的是（　　） A．PCR1和PCR2反应体系中需加入K+，以激活耐高温的DNA聚合酶 B．在个体水平上，可通过新型抗虫棉是否抗虫来判断其融合基因是否表达 C．应在引物1和引物4的5'端添加同种限制酶识别序列，酶切后能保证两目的基因融合 D．用引物2和引物4扩增转基因抗虫棉DNA后，通过电泳鉴定可判断棉花细胞是否导入融合基因 7．（24-25高二下·河南新乡·期末）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A．加入酒精的目的是溶解DNA，使其与蛋白质分离 B．DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同，能溶于2mol·L-1的NaCl溶液 C．白色丝状物是粗提取的DNA，可直接用光学显微镜观察其双螺旋结构 D．鉴定DNA时，把二苯胺试剂加入含DNA的溶液中即可观察到颜色变化 8．（24-25高二下·河南三门峡·期末）有关“DNA粗提取与鉴定”“DNA扩增”“琼脂糖凝胶电泳”实验的叙述，错误的是（　　） A．提取DNA时，在研磨液中加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤取沉淀物进行粗提取 B．琼脂糖凝胶浓度的选择需要考虑待分离DNA片段的大小 C．PCR扩增反应体系中dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）既可以为扩增提供原料，也可以为子链的合成提供能量 D．将DNA丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，然后加入二苯胺试剂，沸水浴加热5min，试管冷却后溶液呈现蓝色 9．（24-25高二下·河南驻马店·期末）DNA琼脂糖凝胶电泳是一种分离、纯化DNA片段的技术。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子构象等有关。超螺旋DNA以超螺旋形式存在，分子体积小；线性DNA分子伸展，在凝胶中移动时受到的摩擦力较大；开环DNA是由环状DNA双链中的一条链发生断裂形成，分子更松散。下列说法正确的是（    ） A．电泳缓冲液在电泳过程中能维持合适的pH，并具有一定的导电性 B．DNA分子在电场作用下，会朝着与它们所带电荷相同的电极移动 C．电泳时电泳指示剂加在凝胶中，核酸染料与PCR产物混合加入加样孔 D．三种构象的DNA在不同浓度的凝胶中迁移速率一定不同 10．（24-25高二下·河南南阳·期末）下图为利用定点突变技术改造基因的过程示意图，相关错误的是（　　） A．需要设计并合成一段含有突变碱基的DNA引物 B．该技术能够实现特异性地替换任何一个特定碱基 C．通过电泳检测产物大小，即可确认基因突变是否成功 D．利用上述技术能够改造蛋白质的结构和功能 二、非选择题 11．（24-25高二下·河南三门峡·期末）干扰素是一类具有抗病毒、抑制细胞增殖等多种功能的糖蛋白。研究发现鼹鼠纤维母细胞体外培养时，细胞增殖到一定程度会分泌β-干扰素，使这些细胞迅速死亡。研究人员通过基因工程的方法获得β干扰素。回答下列问题： (1)获取目的基因：提取纤维母细胞的mRNA，在逆转录酶的催化下得到cDNA并进行PCR扩增。将PCR体系各成分加入已灭菌的微量离心管后以3000r/min的转速离心，离心的目的是_______。 (2)构建表达载体：选用的质粒为pBR322（结构如下图所示），图中①属于_____。为避免目的基因的反向连接和自身环化，提高表达载体的获得率，应选用限制酶______切割pBR322和干扰素基因，获得重组质粒。 (3)筛选含重组质粒的大肠杆菌：科研人员将表达载体导入大肠杆菌后，采用了影印法筛选目标菌种，部分操作过程及结果如下图所示，即用无菌的线毡布压在添加________的培养基A上，带出少许菌种，平移并压在添加________的培养基B上。符合要求的大肠杆菌菌落是_______（填培养基中数字），理由是________。 (4)干扰素的生物活性测定：检测不同浓度干扰素影响下VSV病毒（可用Vero细胞培养）的增殖情况，请完善实验思路： a．将30μg/mL的干扰素________。 b．将Vero细胞接种到多孔细胞培养板中，培养24h后每孔加入等量不同浓度的干扰素溶液，同时设置对照组。 c．继续培养24h，试验组每孔接入_______。 d．培养至对照组有75%的Vero细胞出现病变时，检测各组VSV病毒的拷贝数。 12．（24-25高二下·河南南阳·期末）I．下图是将人的胰岛素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”示意图，所用载体为质粒A。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因，质粒A导入细菌B后，其上的基因能得到表达。请回答下列问题： (1)目前把重组质粒导入细菌细胞时，效率还不高，导入完成后得到的细菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒A，只有少数导入的是重组质粒。采用什么方法将根本没有导入质粒的细菌筛选掉________。 (2)若把通过鉴定证明导入了普通质粒A或重组质粒的细菌，放在含有四环素的培养基上培养，生存下来的细菌为导入_______的细菌，为什么_________。 (3)导入细菌B细胞中的目的基因成功表达的标志是什么？________。 Ⅱ.嗜热土壤芽孢杆菌产生的β葡萄糖苷酶（bglB）是一种耐热纤维素酶，为bglB基因表达的产物。bglB基因不含图中限制酶识别序列。为使其在工业生产中更好地应用，利用大肠杆菌表达bglB酶。 注，图中限制酶的识别序列及切割形成的黏性末端均不相同 (4)获取bglB基因除了可以采用PCR技术扩增外，还有________方法，利用PCR扩增时，缓冲液里除了需要添加DNA母链和耐高温DNA聚合酶外，还需要添加________。为激活DNA聚合酶，缓冲液里一般还需要添加________。 (5)上图为质粒限制酶酶切图谱。bglB基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的bglB基因重组进该质粒，扩增的bglB基因两端需分别引入______限制酶的识别序列。 13．（24-25高二下·河南商丘·期末）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业研究领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列（如图所示），并开展相关研究。回答下列问题： (1)构建基因表达载体时，最好选用______两种限制酶切割表达载体和含有启动子D-基因S的DNA片段，与单一限制酶切相比，选用两种限制酶切的优势是______。 (2)构建好的基因表达载体除了含有启动子、基因S、标记基因和终止子外，还应含有______。其中启动子的作用是______。卡那霉素抗性基因的作用是______。 (3)将构建好的基因表达载体通过农杆菌转化法导入大豆。为提高表达载体进入农杆菌的效率，可采用的方法是______。为了更好地筛选转基因植株，研究人员将农杆菌分为两组，分别将GFP（绿色荧光蛋白）基因连接至甲组农杆菌质粒的T-DNA内部基因启动子下游和乙组农杆菌质粒的T-DNA外部基因启动子下游。导入大豆细胞形成愈伤组织后，可在甲组_____中检测到绿色荧光，乙组________中检测到绿色荧光。 14．（24-25高二下·河南南阳·期末）为使甜椒获得抗病毒性状，科研人员将病毒抗性基因导入甜椒植株，获得转基因甜椒。限制酶EcoRⅠ、PstⅠ的识别序列和切割位点分别为G↓AATTC、CTGCA↓G，抗病毒基因以b链作为模板进行转录。请回答下列问题： (1)PCR技术利用的原理是________。利用该技术扩增抗病毒基因时，应选择引物________（填图中数字）。 (2)为了将抗病毒基因准确连接至图中的质粒上，可在引物的5′端添加相应的限制酶识别序列，请写出PCR扩增时左侧引物按照5′到3′方向的前10个碱基序列________。 (3)将重组质粒导入农杆菌之前，一般先用______处理农杆菌，目的是________。 (4)若抗病毒基因成功转入甜椒细胞中，可检测到______（填“TetR”或“KanR”或“TetR”和“KanR”）的表达产物。 15．（24-25高二下·河南洛阳·期末）科研人员将A基因和B基因利用重叠延伸PCR 技术构建A-B融合基因，从而培育出优良性状的转基因花生植株。融合基因构建过程如图1所示，所用 Ti质粒各结构组分如图2所示。回答下列问题。 (1)利用重叠延伸PCR 技术进行基因融合时，______  填(“能”或“不能”)将图1中PCR1和 PCR2放入同一个反应体系中进行，原因是 ______ 。在杂交链延伸成等长的融合基因时，_____   (填“需要”或“不需要”)添加引物，原因是_______ 。 (2)为保证A-B融合基因正确插入质粒，利用PCR扩增融合基因时需要在引物 _______ (从图1中选择)的5'端分别添加限制酶 _______(从图2中选择)的识别序列。 (3)据图2分析筛选转化细胞的过程：第一次在培养基中添加______  筛选导入重组Ti质粒的农杆菌菌株，第二次在培养基中添加 ______ 筛选染色体DNA 上整合T-DNA的花生愈伤组织细胞。此方法筛选出的花生细胞中，A-B融合基因是否一定表达，理由是________。 16．（24-25高二下·河南新乡·期末）科研人员利用农杆菌转化法，将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin-Ⅱ导入杨树细胞，培育抗虫杨树。利用含Pin-Ⅱ的DNA分子和Ti质粒构建基因表达载体的过程如图所示，图中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neoR表示新霉素抗性基因，箭头表示限制酶的酶切位点，相关酶的识别位点如表所示。回答下列问题： (1)利用PCR扩增目的基因时，应该选择的引物是________，引物的作用是________。为使Pin-Ⅱ与Ti质粒正确连接，应在所选引物的5′端分别添加限制酶________的识别序列。 (2)为了更好地将表达载体导入农杆菌，一般要先用________处理农杆菌细胞，目的是________。 (3)用含重组Ti质粒的农杆菌侵染杨树后，应在含________的培养基中进行筛选。为检测转基因杨树的Pin-Ⅱ是否成功表达出相应蛋白质，常用的方法是________。 17．（24-25高二下·河南驻马店·期末）除草剂的有效成分草甘膦能够专一地抑制植物细胞内有些酶的活性，从而使植物体内多种代谢途径受到影响而导致植物死亡。草甘膦没有选择性，它在除掉杂草的同时也会使作物受损。解决这个问题的方法之一就是培育抗草甘膦的作物。我国云南大学的科研人员从青麻、长芒苋、黑麦草等生物体内获得抗草甘膦（EPSPS）的基因并利用农杆菌转化法成功培育出了抗草甘膦的油菜、玉米、棉花及烟草等植物。其大致流程如图所示，回答下列问题： (1)①过程需要加入_______酶，获得抗EPSPS基因后，可利用_______技术大量扩增，其前提是_______，以便合成相应引物。若外源抗EPSPS基因两端序列与Ti质粒上限制酶识别序列不同，为保证二者定向拼接，据图分析可在两种引物的______端添加相应的限制酶识别序列。 (2)过程②构建的基因表达载体除了含目的基因、标记基因和复制原点外还必须有位于基因上游的______和位于基因下游的________，前者的作用为_______。 (3)给转基因玉米幼苗，喷施致死浓度的草甘膦（除草剂）可以筛选出转基因玉米植株，依据是_______。 18．（24-25高二下·河南南阳·期末）胆碱脱氢酶（beta）在植物体内的作用主要体现在提高植物的耐盐性和耐低温能力上。研究人员通过转基因技术将beta基因导入棉花中（部分过程如图所示），beta基因的表达显著提高了棉花叶片中甜菜碱的含量，进而增强了棉花的耐盐和耐低温能力。回答下列问题： (1)为了获得相同的末端，应用两种限制酶________同时切割目的基因片段和质粒，用限制酶切割目的基因和质粒时，破坏的化学键是________；与只用一种限制酶酶切相比，采用双酶切的目的在于避免________。 (2)利用PCR技术对beta基因进行扩增时，为了合成引物需要已知________，且设计的引物序列不能过短，原因是________。 (3)基因表达载体上具有启动子，其作用为_______；应将beta基因插入到质粒的位置是________。 (4)获得的重组质粒可通过________（写出2种）方法导入到棉花细胞中。 (5)若要鉴定beta基因是否表达，从分子水平上可以用________的方法。 19．（24-25高二下·河南南阳·期末）为研究编码铁运输相关蛋白的基因A（约963bp）在拟南芥缺铁胁迫响应中的作用，需要构建超量表达A的拟南芥转基因株系。质粒的结构如图2所示。回答下列问题 (1)图1中，过程①指的是从拟南芥中提取mRNA，经________催化，合成cDNA；过程②指的是以cDNA为模板，通过PCR扩增目的基因，需要在引物的_____端，加入限制酶___________的识别序列。 (2)获取了足够量的目的基因后，需要构建基因表达载体，其目的是__________。 (3)构建表达载体时，将PCR产物与质粒分别双酶切后，先进行琼脂糖凝胶电泳，将目标片段与无关片段分离，从琼脂糖凝胶中只回收目标片段，再用DNA连接酶进行连接，以避免_____。 (4)将转化后得到的单克隆农杆菌进行PCR鉴定，如图3所示，选择“1、2”号菌进行测序的原因是_____。 (5)将拟南芥的花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并将得到的种子接种在含有____（抗生素）的固体培养基上培养，以筛选出成功导入目的基因的阳性植株。 (6)提取转基因及野生型植株的蛋白质进行电泳检测（如图4），若其中_______号为转基因植株的蛋白质电泳结果，则说明成功构建超量表达A的拟南芥转基因株系。 20．（24-25高二下·河南开封·期末）干旱胁迫严重影响玉米产量，科研人员从戈壁异常球菌中提取csp2基因（其编码的蛋白质能增强植物对干旱的抗性），利用如图所示Ti质粒，通过农杆菌转化法将csp2基因转入玉米幼胚细胞，最终获得耐旱性显著且抗草甘膦的转基因植株。已知除草剂草甘膦可抑制植物体内EPSP合酶的活性，使植物体内多种代谢途径受到影响，导致植物死亡。回答下列问题。 (1)研究人员根据植物密码子偏好性优化csp2基因序列，该操作的目的是为了提高csp2基因的_________。为保证目的基因正确插入质粒，需在优化后的csp2基因α链5′端和3'端分别添加_______酶切位点。 (2)为成功获得转基因玉米，科研人员首先进行了分子水平检测。下图表示各种引物在玉米相应染色体上的识别位点，为检测csp2基因是否整合到玉米染色体上，需选择引物组合______（①csp2-F/玉米内源基因-R、②G10aroA-F/csp2-R、③玉米内源基因-F/玉米内源基因-R）对玉米细胞内的DNA进行PCR扩增，再对扩增产物进行_____，观察是否存在特异性DNA条带；后在_____条件下进行个体生物学水平的检测。 (3)csp2基因可能通过花粉进入野生玉米种群导致基因扩散，为阻断该路径，可将csp2基因导入_______（一种细胞器）中。若要将csp2基因导入小麦，可使用我国独创的______法。 地 城 考点03 蛋白质工程 一、单选题 1．（24-25高二下·河南洛阳·期末）T4溶菌酶是一种重要的工业用酶，在温度较高时容易失去活性。将T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变为半胱氨酸后，该酶的耐热性得到提高。下列说法错误的是（    ） A．实施该项工作的前提条件是了解该酶结构和功能的关系 B．引起该酶空间结构发生改变的直接原因是氨基酸序列改变 C．该项工作需要对相关基因定向改造，属于基因工程的范畴 D．改造工作完成后，需要重新明确该酶催化反应的最适温度 2．（24-25高二下·河南商丘·期末）AI技术通过大数据分析、深度学习解析蛋白质序列与三维结构的关系，可实现从头设计全新蛋白质的结构或对蛋白质进行改造的目的。下列叙述错误的是（　　） A．AI技术能设计某些蛋白质，这属于蛋白质工程的范畴 B．AI技术在设计全新蛋白质时，需先预期该蛋白质的功能 C．AI技术设计的某种蛋白质的氨基酸序列对应的基因序列是唯一的 D．AI技术改造蛋白质可能需用基因的定点突变技术来进行碱基的替换 3．（24-25高二下·河南新乡·期末）水蛭素是由65个氨基酸组成的单链多肽，具有良好的抗凝血作用。研究人员拟通过蛋白质 工程改造水蛭素，提高其抗凝血活性，基本思路如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．物质b是mRNA，物质b到物质a的过程表示翻译 B．根据物质a只能推测出一种对应的DNA序列 C．对水蛭素的改造是通过改造水蛭素基因来完成的 D．通过蛋白质工程能生产自然界中不存在的蛋白质 4．（24-25高二下·河南南阳·期末）某公司拟开发一种新型碱性蛋白酶，用于高效去除衣物上的蛋白质污渍。已知天然蛋白酶X在pH=10时活性较低，且易被洗涤剂中的氧化剂破坏。研究人员计划通过蛋白质工程改造酶X，使其在碱性环境中活性提升并增强抗氧化能力。为实现上述目标，下列哪项技术手段不属于蛋白质工程的关键步骤（　　） A．利用冷冻电镜解析酶X的三维结构，确定影响pH敏感性和抗氧化性的关键氨基酸位点 B．通过体外定向进化技术，在模拟洗涤环境的培养基中筛选高活性突变体 C．将人工设计的突变基因导入毕赤酵母表达系统，验证改造后酶的催化性能 D．对产酶X的枯草芽孢杆菌进行紫外线诱变，随机筛选耐碱性菌株 5．（24-25高二下·河南信阳·期末）南极磷虾细胞中得到的基因A，其表达产物抗菌肽NR-13具有较强抑菌能力，但副作用是溶血毒性偏高。科学家计划利用蛋白质工程在抗菌肽NR-13的基础上研发保留了较强的抑菌能力，但副作用很小的多肽类新药。下列四个选项是依次进行的四个研发环节。哪项不符合生物技术的安全性原则 A．在分子水平上研究NR-13的结构（氨基酸序列和空间结构）与功能的关系 B．设计出新结构的抗菌肽，并按照中心法则推导出对应的基因序列 C．改造原有的基因A，或者人工合成新基因，将新基因导入大肠杆菌细胞中 D．利用大肠杆菌生产出新抗菌肽，并征集志愿者进行新抗菌肽人体实验 6．（24-25高二下·河南南阳·期末）天然胰岛素易形成二聚体或六聚体，皮下注射胰岛素后往往要经历一个逐渐解离为单体的过程，这在一定程度上延缓了疗效。科研人员发现，将胰岛素B28位的脯氨酸替换为天冬氨酸或与B29位的赖氨酸交换位置，可有效抑制胰岛素的聚合，由此研发出的速效胰岛素类似物产品已经在临床上广泛应用。下列叙述正确的是（　　） A．该工程属于蛋白质工程，其生产的蛋白质是自然界已有的蛋白质 B．胰岛素改造的基本思路与天然蛋白质的合成过程相同 C．替换氨基酸时需要用特定的蛋白酶将特定部位的肽键水解 D．胰岛素类似物蛋白想要达到预设的疗效，还需检测其高级结构是否正确 地 城 考点04 基因工程综合 一、单选题 1．（24-25高二下·河南开封·期末）干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的蛋白质，可用于治疗病毒感染性疾病。我国科学家已成功研制出第一个基因工程药物重组人干扰素。天然干扰素在体外保存时间较短，若将干扰素分子上的一个半胱氨酸变为丝氨酸，可使干扰素更稳定，在一定条件下可以延长保存时间。下列叙述错误的是（    ） A．逆转录得到干扰素基因需要用逆转录酶催化 B．PCR需要以四种游离的脱氧核苷酸作为原料 C．大肠杆菌先用Ca2+处理有利于重组质粒导入 D．可以改造多肽链中的氨基酸生产稳定干扰素 2．（2025·河南·模拟预测）为降低寄生虫疫苗候选抗原蛋白异位表达毒性等副作用，研究者将增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因与线虫肌动蛋白（Act-1）启动子核心片段重组，利用大肠杆菌表达荧光蛋白，来确定Act-1基因启动子核心片段的活性，其主要步骤如图所示。下列叙述正确的是（    ） 注：Ori表示复制原点；AmpR表示氨苄青霉素抗性基因。 A．利用PCR扩增Act-1基因启动子时，需用到SalⅠ酶和HindⅢ酶 B．在添加氨苄青霉素的培养基上，获得的菌落均能发出荧光 C．Ori可能富含G—C碱基对，有利于DNA从此处开始解旋 D．启动子与质粒重组前需添加XhoⅠ酶的识别序列 3．（24-25高二下·河南南阳·期末）基因工程技术在迅猛发展，为人类的生产生活带来很多便利，但同时也带来了一些安全性问题，下列说法正确的是（　　） A．乳腺生物反应器是将药用蛋白基因与药用蛋白启动子重组后导入动物的受精卵中 B．将外源生长素基因导入羊体内可提高羊的生长速度 C．向奶牛乳腺细胞导入肠乳糖酶基因，该奶牛分泌的牛奶适合乳糖不耐受人群 D．在转基因研究中，科学家通过阻断淀粉储藏使花粉失去活性来防止基因污染 4．（2025·河南·模拟预测）抗体结构分为可变区（V区）和恒定区（C区），与抗原特异性结合的区域为CDR区，位于V区中。在医药领域，单克隆抗体在疾病诊断和病原体鉴定中发挥重要作用，但鼠源的单抗容易在人体内引发人抗鼠抗体反应（HAMA），从而削弱其治疗的有效性。科学家对鼠源杂交抗体进行改造，生产出效果更好的鼠—人嵌合抗体，主要流程如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．鼠—人嵌合抗体至少含有4个游离氨基，其抗体特异性由肽链的C区决定 B．上述表达载体的构建过程主要利用了基因突变的生物学原理 C．为提高嵌合基因与载体的连接效率，扩增时应在两条引物的3'端添加同种限制酶酶切位点 D．鼠—人嵌合抗体的研制过程属于蛋白质工程，图中转染细胞的方法可能是显微注射法 5．（24-25高二下·河南开封·期末）为解决草莓品种抗虫性差和因病毒积累导致品种退化的问题，育种工作者进行了以下尝试：①利用草莓茎尖进行组织培养；②将草莓细胞与抗虫植物细胞进行体细胞杂交；③对草莓愈伤组织细胞进行液体悬浮培养。下列叙述错误的是（    ） A．①技术可以获得草莓脱毒苗 B．②技术的原理是细胞膜的流动性 C．③技术不能得到草莓新品种 D．用基因工程技术可培育抗虫品种 6．（24-25高二下·河南三门峡·期末）研究人员仿照制备乳腺生物反应器的思路，制备了一种膀胱生物反应器用其获得人体特殊功能蛋白W，基本过程如下图所示。下列有关叙述错误的是（　　） A．图中①和③过程代表的操作分别是显微注射和胚胎移植 B．转基因动物乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞的遗传信息不同 C．需用激素对代孕母体进行同期发情处理 D．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受转基因动物性别和年龄的限制 二、非选择题 7．（24-25高二下·河南鹤壁·期末）植物络合素（PCs）是植物细胞中的小分子多肽，可以螯合重金属离子并储存于液泡中，起到富集重金属和降低毒性的作用。研究发现，向烟草中导入基因TaPCs，获得的转基因烟草对重金属如Pb、Cd的耐性大大增强，故可以利用转基因烟草进行土壤的植物修复。回答下列问题： T-DNA序列 引物序列 5'-AACTATGCGC……CGTAGCCTAT-3' ①5'-GCGCATAGTT-3' 3'-TTGATACGCG……GCATCGGATA-5' ②5'-CGTAGCCTAT-3' (1)可用_______法将携带TaPCs的基因表达载体导入烟草细胞，该方法可利用农杆菌细胞中Ti质粒的T-DNA将基因TaPCs转移到烟草细胞的_______上。 (2)研究人员欲利用PCR扩增基因TaPCs，该技术的前提是设计相关引物，设计的每一种引物自身不能存在互补序列，目的是_______。PCR扩增过程中温度呈“升温→降温→升温”的周期性变化，其中“降温”的目的是_______。 (3)若用SalⅠ处理图中的转基因烟草DNA，断开DNA分子，再利用DNA连接酶将两端的黏性末端连接成环，以此为模板，利用表中的引物①、引物②进行PCR，能扩增出图中的未知序列，则该扩增的主要产物_______（填“含”或“不含”）T-DNA的完整序列；表中的引物①、引物②分别对应于图中的引物_______。 (4)与物理、化学方法修复重金属污染土壤相比，利用转基因植物修复重金属污染土壤的优点有_______（答出2点）。 8．（24-25高二下·河南洛阳·期末）白细胞介素-2(IL-2)是一种具有抗肿瘤作用的细胞因子。研究通过在肿瘤细胞中表达IL-2，诱导机体产生抗肿瘤免疫应答，为IL-2基因治疗进入临床提供依据，部分实验过程如图所示。回答下列问题。 (1)已知IL-2能诱导细胞毒性T细胞的活化。转基因肿瘤细胞分泌的细胞因子(IL-2)能激活人或动物体内的_______免疫反应，使机体产生抗肿瘤免疫效应。 (2)重组载体的构建与筛选：根图甲分析，对逆转录病毒载体及IL-2基因片段都要使用_______酶进行切割，并在DNA 连接酶的作用下连接________(填化学键名称)获得含IL-2基因的重组载体。将该重组载体导入预先用______  处理的大肠杆菌细胞，扩增后提取大肠杆菌DNA 鉴定目的基因。利用上述限制酶进行酶切，由图乙可知，IL-2基因已定向插入载体内，基因长度约为 _______bp。再将含IL-2基因的重组载体转染至 CRC细胞，在多孔细胞板进行_______培养并筛选阳性细胞，收集含有IL-2基因的病毒载体的上清液。 (3)IL-2基因导入肿瘤细胞及表达检测：取含病毒载体的上清液感染小鼠胰腺癌细胞，提取肿瘤细胞内 ______，构建逆转录-聚合酶链式反应体系，PCR 结果利用 _____分析，确定肿瘤细胞内IL-2基因已正常转录；进而提取肿瘤细胞内的蛋白质，加入单克隆体作探针，利用 ______ 技术检测 IL-2基因已正常翻译。 (4)体内致瘤性实验：将同品系小鼠分成2组，背部皮下注射________肿瘤细胞的小鼠作为对照组，皮下注射________肿瘤细胞的小鼠为实验组，观察并测量小鼠肿瘤的生长情况。预测实验结果________。 9．（24-25高二下·河南郑州·期末）水稻基因组中的B基因仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不能转录。为研究 B基因表达对卵细胞的影响，科研人员设计了下图所示的实验（表达载体上的启动子可在水稻卵细胞中启动转录，使导入的基因能够正常表达）。回答下列问题。 (1)构建表达载体时，需使用DNA 连接酶，如果目的基因两端和运载体上均为平末端，选用_____（填“T4DNA连接酶”或“E. coliDNA连接酶”）效率更高。如果目的基因两端无限制酶切点，质粒经限制酶切割后产生了黏性末端，为了正确连接，可以用PCR 扩增目的基因时，在引物的_____（填“5'或“3'）端添加与质粒相同限制酶的识别序列。 (2)将水稻B基因编码蛋白的序列与荧光素酶 Luc基因拼接成 B-Luc融合基因，其目的是_____。表达载体中潮霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因作为_____，可用于筛选含有表达载体的水稻细胞。表达载体除了图中各种结构外，还应具有_____。 (3)①过程一般用Ca2+处理农杆菌，使之处于一种_____的生理状态。②过程中，农杆菌侵染水稻愈伤组织，使T-DNA 整合到水稻细胞的_____上。鉴定筛选水稻幼苗时，检测指标除了幼苗对潮霉素和卡那霉素的抗性外，还可以检测_____。 (4)利用愈伤组织作为受体细胞的原因是_____，愈伤组织发育成转基因番茄幼苗时，培养基中需要添加_____等植物激素。 10．（24-25高二下·河南许昌·期末）黄瓜是我们常见的瓜果之一，是中国各地夏季主要菜蔬之一。在冬季利用温室大棚生产反季节黄瓜经济效益显著，但易受冻害而造成减产。科研人员利用转基因技术培育出了抗冻黄瓜，过程如图所示。回答下列问题。 (1)构建基因表达载体时若选择限制酶BamH I切割抗冻蛋白基因，则需要选择限制酶______切割质粒，但其缺点是______(答出2点即可)。为避免此情况的出现，需要选择限制酶______切割抗冻蛋白基因，同时选择限制酶______切割质粒。 (2)图中将抗冻蛋白基因导入黄瓜细胞的方法是____。该过程会发生2次DNA分子之间的拼接，分别是_____。 (3)将抗冻蛋白基因导入黄瓜细胞后，需要进行______才能获得转基因黄瓜植株，该过程使用的培养基一般要添加蔗糖，其作用是______(答出2点即可)。 11．（24-25高二下·河南信阳·期末）正常人体细胞内分解蛋白质会产生氨，氨在肝脏中转化为尿素，然后通过肾脏排出体外。人体细胞若缺乏氨甲酰磷酸合成酶1（CPS1），将无法完成该转化过程。CPS1缺乏症的患者致死率高达50%，存活个体也有严重后遗症。2025年有研究团队开发出了个体化CRISPR基因编辑疗法，经过安全性和有效性测试及伦理委员会的审核批准后，成功应用于是一名患该病的男婴。这一事件标志着人类首次真正实现了为单个病患量身定制的基因编辑治疗。 (1)为了诊断、靶点确认和疗效评估，在基因编辑前后，都需要对患者的所有基因进行测序，这些基因分布在____________（填细胞结构名称）中。 (2)检测发现，患者的两个CPS1基因中都出现了一个碱基对的替换，导致翻译提前终止，无法合成CPS1.若计划编辑患者的异常CPS1 基因，需要编辑_________（填器官名称）细胞的CPS1基因，理由是________。 (3)研究人员采用了经改造的CRISPR—Cas9系统，它能够直接将一个碱基精确地转换为另一个碱基（如上图所示）。SgRNA是一段人工合成的单链RNA，与CPS1基因中特定序列互补，能够精确地引导 nCas9进行切割。sgRNA序列长度不能过短，原因是_____。nCas9相当于基因工程中的限制酶，能够破坏待编辑序列的______（填化学键名称）。 (4)脂质纳米颗粒是将基因编辑工具送人细胞发挥作用的“运输车”，推测脂质纳米颗粒的作用还有_______（写出一个作用即可）。经过三次静脉注射后，患者已经健康到可以计划出院回家的程度，当然，还需要更长时间的随访以全面评估该疗法的长期疗效和安全性。 (5)假设对某成年女性患者进行上述基因编辑，使靶细胞内的CPS1基因恢复正常。该患者的后代体细胞中______（填“可能有”或“没有”）异常的CPS1基因。 12．（24-25高二下·河南周口·期末）某团队欲将人生长激素基因(GH基因)导入大肠杆菌，通过基因工程大量制备该激素，操作流程如下，其中P1、P2为引物。已知质粒上EcoRI和PstI酶切位点之间短片段为10kb，回答下列问题： (1)构建GH基因重组质粒时，应选择的限制酶是___________，将构建好的重组质粒导入大肠杆菌前，常用___________处理大肠杆菌。 (2)将大肠杆菌接种到含四环素的培养基上进行培养，出现图1所示菌落，接种大肠杆菌的方法是___________，其中1号培养基没有菌落出现的原因可能是___________。 (3)采用PCR技术对2号、3号培养基中的大肠杆菌进行目的基因的筛选，利用P1、P2引物进行PCR，得到如图2所示电泳条带，___________号培养基是目的菌株，判断依据是___________。 (4)筛选得到的目的菌株经发酵获得的生长激素没有生物活性，原因是___________。 13．（24-25高二下·河南濮阳·期末）MAP30蛋白存在于某些植物的果实和种子中。实验表明，MAP30蛋白具有抗肿瘤、抗菌和抗病毒等功能。现欲利用MAP30基因和质粒构建重组质粒，以大规模生产MAP30蛋白。图1是含MAP30基因的DNA片段，图2是农杆菌中的Ti质粒的结构示意图。图中SalⅠ、XbaⅠ、HindⅢ三种限制酶切割后产生的黏性末端不同。请回答下列问题： (1)构建重组质粒时，不能选择限制酶SalⅠ的原因是________；也不能同时选择XbaⅠ、HindⅢ进行双酶切，其原因是________（答出一点）。 (2)用XbaⅠ或HindⅢ将切割后的MAP30基因与Ti质粒用DNA连接酶连接，都可能会得到______种重组DNA。为筛选出含有目的基因的重组质粒，将连接产物导入农杆菌后，先在含______的培养基上培养，能生长的农杆菌可能含有_______（填质粒类型），还需进一步鉴定。 (3)若要判断重组质粒是否成功导入农杆菌，可先向农杆菌菌液中加入新鲜的液体培养基，并置于摇床上慢速培养一段时间，接着利用_____法将菌悬液接种至选择培养基上进行培养，最后挑取单菌落进行后续的鉴定。后续用该农杆菌侵染植物细胞，Ti质粒上的____会携带MAP30基因转移至植物细胞，并整合到___上。 (4)检测MAP30基因是否成功表达，在分子水平上可用_______技术。 14．（24-25高二下·河南焦作·期末）为提高内源微生物降解石油烃的效率，研究者通过基因工程改造，将外源酶基因alm4和mdhA分别与质粒pHY-P43构建成重组载体后导入B．subtilisWB800枯草芽孢杆菌中获得基因工程菌，其中一个表达载体的部分结构如图1所示。回答下列问题： (1)构建重组质粒pHY-P43-almA和pHY-P43-mdhA的过程中需要使用的酶有_______（答出2种）。重组质粒中的氨苄青霉素抗性基因，其作用是_________。 (2)almA和mdhA都是分泌蛋白。B．subtilisWB800是将枯草芽孢杆菌B．subtilis168的8个胞外分泌蛋白酶基因敲除后获得的，敲除8个胞外分泌蛋白酶基因的目的是______。 (3)为鉴定基因工程菌是否转化成功，研究者对目的基因(almA和mdhA)进行了检测与鉴定，部分过程如下： ①目的基因转录产物的PCR检测：提取基因工程菌的总RNA，通过_____过程使其形成cDNA（一种单链DNA），然后根据_____的特定碱基序列设计特异性引物并进行PCR扩增，随后进行电泳，若结果是凝胶中出现______，则可初步说明目的基因在基因工程菌中成功转录。 ②个体水平上的鉴定：石油烃的主要成分是C12和C17，图2和图3是相关的实验结果，据图可得出的结论是______（答出2点）。 注：甲为对照，乙为B．subtilisWB800，丙为转入pHY-P43-almA的B．subtilisWB800，丁为转入pHY-P43-mdhA的B．subtilisWB800。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题03 基因工程 答案版 地 城 考点01 重组DNA技术的基本工具 一、单选题 1．B 2．C 3．B 4．B 5．C 6．B 地 城 考点02 孟德尔自由组合定律 一、单选题 1．A 2．C 3．A 4．B 5．D 6．D 7．B 8．A 9．A 10．C 二、非选择题 11．(1)使反应液集中于离心管底部，有利于反应进行 (2)终止子 BamHI和XhoI (3)氨苄青霉素 四环素 3、5 重组质粒中四环素抗性基因被破坏，不能在添加了四环素的培养基B中生长 (4)稀释配制成系列浓度梯度的干扰素溶液 相同浓度（等量）的VSV病毒 12．(1)将导入完成得到的细菌涂布（接种）在含有氨苄青霉素的培养基上 ，能够生长下来的就是导入了质粒A或重组质粒，未导入质粒的不能生存 (2)普通质粒A 普通质粒A中具有四环素抗性基因，重组质粒中四环素抗性基因被破坏 (3)工程菌合成出人的胰岛素 (4)从基因文库中获取，人工合成目的基因 4种脱氧核苷酸和（2种）引物 Mg2+/镁离子 (5)NdeI、BamHI 13．(1)HindⅢ和SpeI 可防止目的基因和表达载体自身环化，能保证目的基因和表达载体准确连接 (2)复制原点 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 筛选出含有重组质粒的受体细胞 (3)用Ca2+处理农杆菌 农杆菌细胞、大豆愈伤组织细胞 农杆菌细胞 14．(1)DNA半保留复制 2和3 (2)5′-GAATTCTTAC-3′（或-GAATTCTTAC-） (3)Ca2+ 使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 (4)TetR 15．(1)不能 引物互补影响 PCR 不需要 两条 DNA 的交错部分即可作为其延伸的引物 (2)①和④ BglⅡ和 NcoⅠ (3)庆大霉素 潮霉素 不一定，基因选择性表达 16．(1)引物2和引物3 使DNA聚合酶能够从引物3′端开始连接脱氧核苷酸 KpnⅠ、HindⅢ (2)Ca2+ 使农杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 (3)新霉素 抗原—抗体杂交法 17．(1)逆转录 PCR 已知抗EPSPS基因两端部分核苷酸序列 5' (2)启动子 终止子 是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因的转录 (3)抗草甘膦(EPSPS）基因随T-DNA整合到玉米细胞染色体上，使转基因玉米植株具有抗除草剂草甘膦的特性，可以抵抗草甘膦的影响而不死亡，而转基因未成功的玉米植株没有除草剂抗性基因，不具备抵抗草甘膦的特性，喷施致死浓度的草甘膦(除草剂)后会死亡 18．(1)SmaI和PstI 磷酸二酯键 含目的基因的DNA片段或质粒的自身环化以及错误(反向）连接 (2)beta基因的一段（或两端的）碱基序列（或一段目的基因的核苷酸序列，合理即可） 引物过短特异性弱，容易与多个DNA片段进行结合（增加引物与非目标序列的随机结合概率) (3)启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点，驱动基因的转录 启动子与终止子之间 (4)花粉管通道法、农杆菌转化法 (5)抗原一抗体杂交 19．(1)逆转录酶 5＇ BamHI、Sa1l (2)要让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时使目的基因能够表达和发挥作用 (3)目标片段与无关片段重新连接（目的基因自连以及质粒自连） (4)图3结果显示1、2的PCR产物长度与A基因相符，但无法确定PCR产物的碱基序列是否与A基因相同 (5)潮霉素 (6)① 20．(1)在玉米细胞中的翻译效率 PstI和BamHI (2)① 琼脂糖凝胶电泳 干旱、喷施草甘膦 (3)叶绿体 花粉管通道法 地 城 考点03 蛋白质工程 一、单选题 1．C 2．C 3．B 4．D 5．D 6．D 地 城 考点04 基因工程综合 一、单选题 1．D 2．D 3．D 4．D 5．B 6．B 二、非选择题 7．(1)农杆菌转化 染色体DNA (2)避免引物自身发生碱基互补配对，不能与目的基因结合 使引物通过碱基互补配对与DNA单链结合 (3)不含 F1、R2（顺序不能颠倒） (4)对环境污染小、安全且经济有效、可持续修复（答出2点且合理即可） 8．(1)细胞 (2)EcoRI和 BamH I 磷酸二酯键 Ca²⁺ 300 克隆化 (3)RNA 琼脂糖凝胶电泳(电泳) 抗原-抗体杂交 (4)导入空载体(或未转基因或未导入外源基因) 导入IL-2基因 与对照组相比，实验组小鼠的肿瘤生长受抑制 9．(1)T4DNA连接酶 5′ (2)便于检测B基因在卵细胞中的表达情况 标记基因 复制原点 (3)能吸收周围环境中DNA 分子 染色体DNA 是否有荧光 (4)愈伤组织分化程度低，全能性高，更易获得转基因植株 生长素、细胞分裂素 10．(1)Sau3AⅠ 易造成质粒和目的基因的自身环化以及反向连接 EcoRI和BamHⅠ Sau3AI和EcoRI (2)农杆菌转化法 将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上和插入目的基因的T­DNA拼接到受体细胞染色体DNA上 (3)植物组织培养 提供碳源、能源、调节渗透压 11．(1)细胞核和线粒体 (2)肝脏 CPS1 在肝脏中催化氨转化为尿素，编辑肝脏细胞基因可恢复代谢功能 (3)短序列特异性差，易脱靶 磷酸二酯键 (4)保护基因编辑工具不被降解（或促进细胞摄取 ） (5)可能有 12．(1)EcoRI和PstI Ca2+（或CaCl2） (2)稀释涂布平板法 1号培养基中大肠杆菌未导入质粒 (3)3 GH基因26kb，质粒80kb，2号培养基PCR产物电泳条带接近80kb，说明只导入空质粒，3号培养基PCR产物电泳条带在100kb附近，说明导入了含有目的基因的重组质粒 (4)大肠杆菌不含内质网和高尔基体等细胞器，不能对生长激素（或GH）进行空间结构的加工修饰，因此生长激素（或GH）不具有生物活性 13．(1)质粒中SalⅠ的切割位点不在T-DNA上，因此目的基因不能插入T-DNA序列 目的基因两端会形成HindⅢ的黏性末端，而质粒上有XbaⅠ、HindⅢ的黏性末端，不能插入质粒 (2)3 卡拉霉素 目的基因与质粒 (3)平板划线法和稀释涂布平板法 T-DNA 植物细胞染色体 (4)PCR 14．(1)限制酶和DNA连接酶 鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 (2)防止胞外分泌蛋白酶分解almA和mdhA (3)逆转录/反转录 目的基因（almA和mdhA） 电泳条带 alm4和mdhA都降解石油烃、almA的分解作用更强 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题03 基因工程 4大高频考点概览 考点01 重组DNA技术的基本工具 考点02 基因工程的基本操作程序 考点03 蛋白质工程 考点04 基因工程综合 地 城 考点01 重组DNA技术的基本工具 一、单选题 1．（24-25高二下·河南商丘·期末）某同学以鸡血细胞为材料进行“DNA粗提取和鉴定”实验。下列叙述错误的是（　　） A．向鸡血细胞液中加入蒸馏水并搅拌，可加快血细胞破裂，释放DNA B．向DNA溶液中加入2mol/LNaCl溶液，能析出DNA并提高其纯度 C．向DNA溶液中加入体积分数为95%的预冷酒精，可对DNA进行纯化 D．DNA溶液与二苯胺试剂反应后，溶液呈现的蓝色越深，说明提取的DNA越多 【答案】B 【分析】DNA粗提取的原理主要基于DNA与其他物质在物理和化学性质上的差异，通过相应处理将DNA分离出来。DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同： DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，此时易析出；而在浓度较高的2mol/LNaCl溶液中溶解度较高，能溶解在溶液中。利用这一特性，可通过调整NaCl溶液浓度，使DNA溶解或析出，与其他杂质分离。 DNA不溶于酒精，而某些杂质可溶。 体积分数为95%的冷酒精能使DNA沉淀析出，而蛋白质等许多杂质可溶于酒精，因此可用酒精进一步纯化DNA。 【详解】A、向鸡血细胞液中加入蒸馏水，由于细胞内液浓度高于外界蒸馏水浓度，细胞会吸水涨破，搅拌可以加快血细胞破裂，从而释放DNA，A正确；    B、DNA在2mol/L的NaCl溶液中溶解度较高，不会析出DNA，B错误；    C、DNA不溶于体积分数为95%的预冷酒精，而一些杂质如蛋白质可以溶于酒精，所以向DNA溶液中加入体积分数为95%的预冷酒精，可对DNA进行纯化，C正确；    D、在沸水浴条件下，DNA与二苯胺试剂反应呈现蓝色，溶液呈现的蓝色越深，说明提取的DNA越多，D正确。    故选B。 2．（24-25高二下·河南三门峡·期末）基因工程是在DNA分子水平上进行的，需要有专门的工具。下列关于基因工程所需基本工具酶的叙述，错误的是（    ） A．不同限制酶切割后产生的DNA片段可能被某种DNA连接酶连接 B．T4 DNA连接酶可以催化磷酸二酯键形成进而连接黏性末端或平末端 C．大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，并且只在其中一条链的特定部位切割 D．原核细胞内的限制酶可切割入侵的DNA分子，通常不切割细菌自身的DNA分子 【答案】C 【分析】限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。 【详解】A、不同限制酶切割后产生的DNA片段，若具有相同的末端，则可被某种DNA连接酶连接，A正确； B、T4DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，也可连接双链DNA片段的平末端，B正确； C、限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，C错误； D、原核生物内的限制酶可切割入侵的DNA分子而保护自身，一般不切割自身的DNA分子，D正确。 故选C。 3．（24-25高二下·河南南阳·期末）在基因工程操作中，科研人员利用两种限制酶（和）处理基因工程载体，进行电泳检测，结果如图所示。下列相关叙述错误的是（　　） A．该载体最可能是环状DNA分子 B．该DNA分子上有关于和的酶切位点共3个 C．和的切点之间最短相距约1kb D．限制酶作用于该载体的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键 【答案】B 【详解】A、由题图可知，当仅用NotⅠ切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段（10kb），因此该载体最有可能为环状DNA分子，该DNA分子上只有1个NotⅠ酶切位点，A正确； B、由于该载体是环状DNA分子，由题图可知，当仅用EcoRⅠ切割载体时，产生2种长度的DNA片段：2kb和6kb，该载体DNA片段长10kb，所以用EcoRⅠ切割载体应产生3个DNA片段：2个2kb和1个6kb。该DNA分子上有3个EcoRⅠ酶切位点，故该DNA分子上有关于EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点共4个，B错误； C、由题图可知，两种限制酶同时切割时产生6bp、2bp和1bp3种长度的DNA片段：1个6kb、1个2kb、2个1kb，所以两种限制酶的酶切位点最短相距约1kb，C正确； D、限制酶切割载体时直接破坏的是作用位点上两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，D正确。 故选B。 4．（24-25高二下·河南洛阳·期末）五种限制酶的切割位点如图所示，下列叙述正确的是（    ） A．Spe I处理的目的基因和 Xho I处理的质粒能用 E. coli DNA 连接酶连接 B．EcoR V处理的目的基因和 SmaⅠ处理的质粒能用T4 DNA 连接酶连接 C．Xho I处理的目的基因和 Xba I处理的质粒能用T4 DNA 连接酶连接 D．SmaⅠ处理的目的基因和XhoⅠ处理的质粒能用E. coli DNA连接酶连接 【答案】B 【分析】E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端；T4DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。 【详解】A、由图可知，SpeⅠ 处理后产生的是黏性末端，XhoⅠ 处理后产生的也是黏性末端，但它们的末端序列不互补，E. coli DNA 连接酶只能连接黏性末端，且要求末端序列互补，所以 SpeⅠ 处理的目的基因和 XhoⅠ 处理的质粒不能用 E. coli DNA 连接酶连接，A错误； B、EcoR V处理后产生的是平末端，SmaⅠ处理后产生的也是平末端，T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端，也可以连接平末端，所以 EcoR V 处理的目的基因和 SmaⅠ 处理的质粒能用 T4 DNA 连接酶连接，B正确； C、XhoⅠ 处理后产生的是黏性末端，XbaⅠ 处理后产生的也是黏性末端，但它们的末端序列不互补，T4 DNA 连接酶连接黏性末端时要求末端序列互补，所以 XhoⅠ 处理的目的基因和 XbaⅠ 处理的质粒不能用 T4 DNA 连接酶连接，C错误； D、SmaⅠ 处理后产生的是平末端，XhoⅠ 处理后产生的是黏性末端，E. coli DNA 连接酶只能连接黏性末端，所以 SmaⅠ 处理的目的基因和 XhoⅠ 处理的质粒不能用 E. coli DNA 连接酶连接，D错误。 故选B。 5．（24-25高二下·河南南阳·期末）DNA、RNA、蛋白质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选择适宜的方法对它们进行提取。下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（　　） A．不能选用哺乳动物血液作为材料，因为血液有颜色会影响后续对DNA鉴定的观察 B．对材料进行充分研磨后需用单层滤纸过滤以除去研磨液中的杂质 C．用预冷的酒精溶液析出DNA可防止DNA的结构被破坏 D．根据DNA的特殊组成分析，二苯胺最可能与脱氧核糖或任一碱基发生反应而出现蓝色 【答案】C 【分析】DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。例如，DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。 【详解】A、不能选用哺乳动物血液作为材料，是因为哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核，无法提取到DNA，而不是因为血液颜色影响后续对DNA鉴定的观察，A错误； B、对材料进行充分研磨后需用多层纱布过滤以除去研磨液中的杂质，而不是单层滤纸，因为DNA会吸附在滤纸上，B错误； C、用预冷的酒精溶液析出DNA可防止DNA的结构被破坏，因为低温能降低酶的活性，减少DNA的分解，同时酒精可以使DNA沉淀析出，C正确； D、根据DNA的特殊组成分析，DNA特有结构是脱氧核糖和碱基T，二苯胺最可能与脱氧核糖或碱基T发生反应而出现蓝色，而不是任一碱基，D错误，D错误。 故选C。 6．（24-25高二下·河南南阳·期末）下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液 B．鉴定DNA时，将粗提取的DNA丝状物加入二苯胺，沸水浴后冷却出现蓝色 C．进行琼脂糖凝胶电泳时，通过观察DNA片段在凝胶中的迁移距离判断其大小 D．利用PCR扩增DNA片段3次后得到含两种引物的DNA片段所占比例为3/4 【答案】B 【分析】DNA粗提取的原理主要基于DNA与其他物质在物理和化学性质上的差异，通过一系列处理将DNA分离出来。DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同：DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，而在2mol/L的NaCl溶液中溶解度较高。DNA不溶于酒精，而蛋白质等杂质可溶。 【详解】A、DNA在低浓度（如0.14mol/L）的NaCl溶液中溶解度最低，而在高浓度（如2mol/L）的NaCl溶液中溶解度较高，因此DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液，A正确； B、鉴定DNA时，需将粗提取的DNA丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，后加入二苯胺试剂混合后沸水浴加热会出现蓝色，B错误； C、琼脂糖凝胶电泳中，DNA片段因分子量不同导致迁移速率不同，分子量越小迁移距离越远，因此可通过迁移距离判断DNA片段大小，C正确； D、PCR扩增3次后，1个DNA分子会产生8个DNA分子，含有1个引物的DNA分子为2个，含两种引物的DNA分子数为6个，故含两种引物的DNA片段所占比例为6/8=3/4，D正确。 故选B。 地 城 考点02 基因工程的基本操作程序 一、单选题 1．（24-25高二下·河南信阳·期末）引物的设计是影响PCR扩增反应的效率和特异性的关键因素，下列相关叙述正确的是（　　） A．引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 B．适当提高退火温度会增加PCR产生非特异性产物的可能性 C．想在目的基因两端增加限制酶切位点，相应碱基序列应加在引物的3端 D．经过30次PCR循环，消耗引物和原料，合成了230个目的基因 【答案】A 【详解】A、引物是短单链结构，能与DNA母链上一段碱基序列互补配对，为DNA聚合酶提供3'端，A正确； B、提高退火温度可增强引物与模板结合的特异性，减少非特异性产物，B错误； C、若需在目的基因两端添加限制酶切位点，应将该序列设计在引物的5'端（因DNA聚合酶从引物的3'端延伸），C错误； D、若只有一个模板DNA分子，PCR扩增30次循环后，目的基因数量为230个，且该过程消耗引物和原料（四种脱氧核苷酸），D错误。 故选A。 2．（24-25高二下·河南洛阳·期末）关于DNA粗提取与鉴定及PCR 技术，下列叙述正确的是（    ） A．过滤液在4 ℃冰箱中静置和离心的目的是加速 DNA 的沉淀 B．利用二苯胺试剂鉴定时，白色丝状物中的DNA不会变性 C．PCR 反应缓冲液中一般要添加 Mg²⁺来激活DNA 聚合酶 D．加入微量离心管中的模板可以是 DNA，也可以是RNA 【答案】C 【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是：①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的；②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离。 【详解】A 、过滤液在4℃冰箱中静置和离心，是为了加速杂质的沉淀，而不是 DNA 的沉淀，A错误; B、利用二苯胺试剂鉴定时，需要进行沸水浴加热，在这个过程中白色丝状物中的 DNA 会变性，B错误； C、PCR 反应缓冲液中一般要添加Mg2+，Mg2+可以激活 DNA 聚合酶，C正确； D、PCR 技术中加入微量离心管中的模板只能是 DNA，不能是 RNA，因为 PCR 是在 DNA 聚合酶的作用下扩增 DNA 的过程，D错误。 故选C。 3．（24-25高二下·河南焦作·期末）牛乳铁蛋白肽（LfcinB）是一种抗菌肽，利用基因工程生产LfcinB时，其所带正电荷易使宿主工程菌死亡，故常用带负电荷的蛋白（如APBSP）与LfcinB形成融合蛋白。研究者采用PCR技术对酵母菌内的APBSP-LcinB融合基因进行检测，过程如图所示。下列叙述正确的是（　　） A．所用的一对引物可分别与APBSP基因和LfcinB基因结合 B．步骤1可促进APBSP-LfcinB融合基因边解旋边复制 C．步骤3过程中TaqDNA聚合酶会与引物的5'端结合 D．若检测到PCR扩增的产物，则可证明融合基因成功表达 【答案】A 【分析】PCR技术是对体内DNA复制过程的模仿，也需要模板、原料、酶和引物等。待扩增的DNA分子是模板，原料是4种脱氧核苷三磷酸，即dNTP，N代表A、T、G、C四种碱基。 【详解】A、PCR检测中，引物设计用于扩增特定的DNA片段，由于目标是检测APBSP-LfcinB融合基因，一对引物应分别针对融合基因的两端:一个引物结合APBSP部分，另一个引物结合LfcinB部分，A正确； B、步骤1(94°C)是变性步骤，目的是使DNA双链解旋，形成单链模板，以便引物结合，B错误； C、在步骤3(延伸步骤， 72°C) ，Taq DNA聚合酶结合到引物-模板复合物上，并从引物的3'端开始合成 DNA (5'→3'方向)。Taq酶不会与引物的5'端结合，C错误； D、PCR扩增产物仅能证明融合基因的DNA序列存在，但不能证明其成功表达为蛋白质，D错误。 故选A。 4．（24-25高二下·河南驻马店·期末）幽门螺杆菌（Hp）与胃炎、胃食管反流病等多种疾病有关。科研人员将Hp的Ipp20基因作为目的基因，通过基因工程制备出相应的疫苗，操作流程如图所示。下列相关叙述错误的是（    ） A．PCR扩增目的基因时理论上第4次循环产物中含两种引物的DNA片段占7/8 B．将目的基因插入质粒时，最佳方案中需要用的酶有XhoI、PstI和DNA连接酶 C．培养基A中添加的抗生素是潮霉素，培养基B中添加的抗生素是氯霉素 D．过程③需要用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于易于吸收周围环境中DNA分子的状态 【答案】B 【分析】基因工程技术的基本步骤：1.目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。2.基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。3.将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 【详解】A 、对于 PCR 扩增，第n次循环后产生的 DNA 片段总数为2n个。第n次循环中，含两种引物的 DNA 片段数为2n−2个。当n=4时，DNA 片段总数为24=16个，含两种引物的 DNA 片段数为24−2=14个。则含两种引物的 DNA 片段占比为14/16=7/8，A 正确； B、观察质粒和目的基因的酶切位点：如果用 XhoI、PstI 切割质粒和目的基因，再用 DNA 连接酶连接，可以将目的基因正确插入质粒，同时能保留潮霉素抗性基因和氯霉素抗性基因作为标记基因，但是本题采用同位影印，只能保留一个抗性基因，因此最好用Xho I和Xba I或者是Pst Ⅰ和XbaI切割质粒和Ipp20基因，B错误； C、该过程使用了限制酶 Xho I和Xba I或者是Pst Ⅰ和XbaI切割质粒和Ipp20基因，结合图示可知，在构建目的基因表达载体的过程中氯霉素抗性基因被切割掉，保留了潮霉素抗性基因，不管是正常质粒还是重组质粒都含有潮霉素抗性基因，但只有正常质粒才同时含有氯霉素抗性基因，因此，可以先用含有潮霉素的培养基A筛选出导入正常质粒、重组质粒的大肠杆菌，再采用同位影印接种到含有氯霉素的培养基B和含有潮霉素的培养基A中，此时含有重组质粒的大肠杆菌不能在含有氯霉素的培养基 B上生长，从而与培养基A（对照）相比会消失一些菌落，对照两个平板上减少的菌落就是符合要求的大肠杆菌菌落，C正确； D、过程③将重组质粒导入大肠杆菌，需要用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于感受态，这种状态下的大肠杆菌易于吸收周围环境中的 DNA 分子，D 正确。 故选B。 5．（24-25高二下·河南郑州·期末）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得 Gata3-GFP 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4 只新生小鼠的基因型，设计了引物 1 和引物 2 用于 PCR 扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列叙述错误的是（    ） A．启动子区域含有 RNA 聚合酶的结合位点 B．1号和3 号为杂合子、2号和4号为纯合子 C．4号小鼠是野生型，2号小鼠是 Gata3-GFP 基因纯合子 D．若用引物1和引物3进行 PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 【答案】D 【分析】PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 【详解】A、启动子是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出 mRNA，A 正确； BC、根据图甲，杂合子小鼠含有正常 Gata3 基因和 Gata3 - GFP 融合基因。用引物 1 和引物 2 进行 PCR 扩增，野生型小鼠只能扩增出小片段，Gata3 - GFP 基因纯合子小鼠只能扩增出大片段，杂合子小鼠能扩增出大片段和小片段。由图乙可知，1 号和 3 号既有大片段又有小片段，为杂合子；2 号只有大片段，为 Gata3 - GFP 基因纯合子；4 号只有小片段，为野生型，BC正确； D、若用引物 1 和引物 3 进行 PCR，杂合子和 Gata3 - GFP 基因纯合子都能扩增出相同的片段，不能更好地区分杂合子和纯合子，D错误。 故选D。 6．（24-25高二下·河南商丘·期末）传统抗虫棉有两种类型，抗虫基因分别为R19和SGK。将这两种传统抗虫棉进行基因融合后，利用基因工程可培育出新型转基因抗虫棉。如图为通过PCR扩增两种目的基因后，获得新型抗虫基因的流程示意图。下列叙述正确的是（　　） A．PCR1和PCR2反应体系中需加入K+，以激活耐高温的DNA聚合酶 B．在个体水平上，可通过新型抗虫棉是否抗虫来判断其融合基因是否表达 C．应在引物1和引物4的5'端添加同种限制酶识别序列，酶切后能保证两目的基因融合 D．用引物2和引物4扩增转基因抗虫棉DNA后，通过电泳鉴定可判断棉花细胞是否导入融合基因 【答案】D 【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】A、PCR反应体系中Mg2+是耐高温DNA聚合酶的激活剂，A错误； B、传统抗虫棉也能抗虫，无法通过新型抗虫棉是否抗虫判断其融合基因是否表达，B错误； C、为保证R19和SGK基因融合，应在引物1和引物3的5'端添加相同限制酶或产生相同黏性末端的不同限制酶识别序列，C错误； D、鉴定融合基因时，选用引物2和引物4扩增转基因抗虫棉DNA后，用琼脂糖凝胶电泳鉴定产物，可判断棉花细胞是否导入融合基因，D正确。 故选D。 7．（24-25高二下·河南新乡·期末）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A．加入酒精的目的是溶解DNA，使其与蛋白质分离 B．DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同，能溶于2mol·L-1的NaCl溶液 C．白色丝状物是粗提取的DNA，可直接用光学显微镜观察其双螺旋结构 D．鉴定DNA时，把二苯胺试剂加入含DNA的溶液中即可观察到颜色变化 【答案】B 【详解】A、酒精的作用是去除不溶的蛋白质，同时使DNA析出沉淀，而非溶解DNA，A错误； B、DNA在2mol/L的NaCl溶液中溶解度较高，而在0.14mol/L时溶解度最低，B正确； C、光学显微镜无法直接观察DNA的双螺旋结构，需借助更高分辨率的技术（如X射线衍射），C错误； D、二苯胺试剂需在沸水浴条件下与DNA反应才会显蓝色，直接加入无法立即观察颜色变化，D错误。 故选B。 8．（24-25高二下·河南三门峡·期末）有关“DNA粗提取与鉴定”“DNA扩增”“琼脂糖凝胶电泳”实验的叙述，错误的是（　　） A．提取DNA时，在研磨液中加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤取沉淀物进行粗提取 B．琼脂糖凝胶浓度的选择需要考虑待分离DNA片段的大小 C．PCR扩增反应体系中dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）既可以为扩增提供原料，也可以为子链的合成提供能量 D．将DNA丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，然后加入二苯胺试剂，沸水浴加热5min，试管冷却后溶液呈现蓝色 【答案】A 【分析】DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精；鉴定DNA时，需要先将DNA溶解在NaCl溶液中，再与二苯胺溶液混合，并在水浴加热条件下呈现蓝色。 【详解】A、使用洋葱提取DNA时，先在切碎的洋葱中加入适量洗涤剂和食盐，充分研磨后过滤，取滤液进行粗提取，A错误； B、琼脂糖凝胶浓度影响凝胶孔径大小，浓度高适合分离小片段DNA，浓度低适合大片段，因此需根据待分离DNA片段大小选择浓度，B正确； C、PCR反应中，dNTP作为原料参与子链合成，其特殊的化学键水解可为反应提供能量，C正确； D、DNA溶于2mol/L NaCl溶液后，加入二苯胺试剂，沸水浴加热会与DNA结合显蓝色，步骤描述正确，D正确。 故选A。 9．（24-25高二下·河南驻马店·期末）DNA琼脂糖凝胶电泳是一种分离、纯化DNA片段的技术。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子构象等有关。超螺旋DNA以超螺旋形式存在，分子体积小；线性DNA分子伸展，在凝胶中移动时受到的摩擦力较大；开环DNA是由环状DNA双链中的一条链发生断裂形成，分子更松散。下列说法正确的是（    ） A．电泳缓冲液在电泳过程中能维持合适的pH，并具有一定的导电性 B．DNA分子在电场作用下，会朝着与它们所带电荷相同的电极移动 C．电泳时电泳指示剂加在凝胶中，核酸染料与PCR产物混合加入加样孔 D．三种构象的DNA在不同浓度的凝胶中迁移速率一定不同 【答案】A 【分析】DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 【详解】A、电泳缓冲液的作用是维持溶液的pH稳定（确保DNA带负电荷）并提供导电离子，保证电流传导，A正确； B、DNA分子带负电荷，在电场中应向正极移动，故DNA分子在电场作用下，会朝着与它们所带电荷相反的电极移动，B错误； C、电泳指示剂通常与DNA样品混合后加入加样孔，而核酸染料需在电泳后染色或预先加入凝胶中，C错误； D、三种构象的DNA迁移速率受凝胶浓度影响，但不同浓度的凝胶可能导致某些构象的DNA迁移速率相同，D错误。 故选A。 10．（24-25高二下·河南南阳·期末）下图为利用定点突变技术改造基因的过程示意图，相关错误的是（　　） A．需要设计并合成一段含有突变碱基的DNA引物 B．该技术能够实现特异性地替换任何一个特定碱基 C．通过电泳检测产物大小，即可确认基因突变是否成功 D．利用上述技术能够改造蛋白质的结构和功能 【答案】C 【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。 【详解】A、定点突变技术通常需要设计并合成一段含有突变碱基的DNA引物，用于引导DNA合成过程中的特定碱基替换，A正确； B、定点突变技术能够实现特异性地替换任何一个特定碱基，这是该技术的主要优势之一，B正确； C、通过电泳检测产物大小不能直接确认基因突变是否成功。电泳主要用于检测DNA片段的大小，而确认突变是否成功通常需要进一步的测序分析，C错误； D、定点突变技术可以通过改变基因的碱基序列来改变蛋白质的结构和功能，这是该技术的重要应用之一，D正确。 故选C。 二、非选择题 11．（24-25高二下·河南三门峡·期末）干扰素是一类具有抗病毒、抑制细胞增殖等多种功能的糖蛋白。研究发现鼹鼠纤维母细胞体外培养时，细胞增殖到一定程度会分泌β-干扰素，使这些细胞迅速死亡。研究人员通过基因工程的方法获得β干扰素。回答下列问题： (1)获取目的基因：提取纤维母细胞的mRNA，在逆转录酶的催化下得到cDNA并进行PCR扩增。将PCR体系各成分加入已灭菌的微量离心管后以3000r/min的转速离心，离心的目的是_______。 (2)构建表达载体：选用的质粒为pBR322（结构如下图所示），图中①属于_____。为避免目的基因的反向连接和自身环化，提高表达载体的获得率，应选用限制酶______切割pBR322和干扰素基因，获得重组质粒。 (3)筛选含重组质粒的大肠杆菌：科研人员将表达载体导入大肠杆菌后，采用了影印法筛选目标菌种，部分操作过程及结果如下图所示，即用无菌的线毡布压在添加________的培养基A上，带出少许菌种，平移并压在添加________的培养基B上。符合要求的大肠杆菌菌落是_______（填培养基中数字），理由是________。 (4)干扰素的生物活性测定：检测不同浓度干扰素影响下VSV病毒（可用Vero细胞培养）的增殖情况，请完善实验思路： a．将30μg/mL的干扰素________。 b．将Vero细胞接种到多孔细胞培养板中，培养24h后每孔加入等量不同浓度的干扰素溶液，同时设置对照组。 c．继续培养24h，试验组每孔接入_______。 d．培养至对照组有75%的Vero细胞出现病变时，检测各组VSV病毒的拷贝数。 【答案】(1)使反应液集中于离心管底部，有利于反应进行 (2)终止子 BamHI和XhoI (3)氨苄青霉素 四环素 3、5 重组质粒中四环素抗性基因被破坏，不能在添加了四环素的培养基B中生长 (4)稀释配制成系列浓度梯度的干扰素溶液 相同浓度（等量）的VSV病毒 【分析】基因工程的操作步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 由图可知，由于HindⅢ会破坏启动子，质粒上EcoRⅠ 有两个识别位点，所以应选用限制酶BamHⅠ和XhoⅠ切割pBR322和干扰素基因。 【详解】（1）PCR时，将PCR体系各成分加入已灭菌的微量离心管后以3000r/min的转速离心，可使反应液集中于离心管底部，有利于反应进行，提高PCR的反应速率。 （2）由图可知，箭头为启动子，①为终止子，启动子能被RNA聚合酶识别，启动基因的转录。为避免目的基因的反向连接和自身环化，提高表达载体的获得率，常用两种限制酶切割目的基因和质粒，由于HindⅢ会破坏启动子，质粒上EcoRⅠ 有两个识别位点，所以应选用限制酶BamHⅠ和XhoⅠ切割pBR322和干扰素基因，随后用DNA连接酶连接目的基因和质粒获得重组质粒。 （3）由图可知，质粒中的标记基因为氨苄青霉素抗性基因，所以培养基A添加了氨苄青霉素，可筛选出带有质粒的大肠杆菌，在构建重组质粒时，破坏了四环素抗性基因，所以培养基B中添加了四环素，其上的菌落表示未导入目的基因的大肠杆菌。综上，符合要求的大肠杆菌为3、5。 （4）检测不同浓度干扰素影响下VSV病毒（可用Vero细胞培养）的增殖情况。所以应将干扰素稀释为不同浓度的干扰素溶液，即自变量是干扰素的浓度，因变量是VSV病毒的增殖情况，故实验可将Vero细胞接种到多孔细胞培养板中，培养24h后每孔加入等量不同浓度的干扰素溶液，同时设置对照组，再继续培养24h，试验组每孔接入相同浓度的VSV病毒，最后检测实验组和对照组中VSV病毒的增殖情况，VSV病毒的增殖数量最少的组对应的浓度为效果较好的浓度。 12．（24-25高二下·河南南阳·期末）I．下图是将人的胰岛素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”示意图，所用载体为质粒A。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因，质粒A导入细菌B后，其上的基因能得到表达。请回答下列问题： (1)目前把重组质粒导入细菌细胞时，效率还不高，导入完成后得到的细菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒A，只有少数导入的是重组质粒。采用什么方法将根本没有导入质粒的细菌筛选掉________。 (2)若把通过鉴定证明导入了普通质粒A或重组质粒的细菌，放在含有四环素的培养基上培养，生存下来的细菌为导入_______的细菌，为什么_________。 (3)导入细菌B细胞中的目的基因成功表达的标志是什么？________。 Ⅱ.嗜热土壤芽孢杆菌产生的β葡萄糖苷酶（bglB）是一种耐热纤维素酶，为bglB基因表达的产物。bglB基因不含图中限制酶识别序列。为使其在工业生产中更好地应用，利用大肠杆菌表达bglB酶。 注，图中限制酶的识别序列及切割形成的黏性末端均不相同 (4)获取bglB基因除了可以采用PCR技术扩增外，还有________方法，利用PCR扩增时，缓冲液里除了需要添加DNA母链和耐高温DNA聚合酶外，还需要添加________。为激活DNA聚合酶，缓冲液里一般还需要添加________。 (5)上图为质粒限制酶酶切图谱。bglB基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的bglB基因重组进该质粒，扩增的bglB基因两端需分别引入______限制酶的识别序列。 【答案】(1)将导入完成得到的细菌涂布（接种）在含有氨苄青霉素的培养基上 ，能够生长下来的就是导入了质粒A或重组质粒，未导入质粒的不能生存 (2)普通质粒A 普通质粒A中具有四环素抗性基因，重组质粒中四环素抗性基因被破坏 (3)工程菌合成出人的胰岛素 (4)从基因文库中获取，人工合成目的基因 4种脱氧核苷酸和（2种）引物 Mg2+/镁离子 (5)NdeI、BamHI 【分析】分析题图：图示表示将人的胰岛素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的过程。质粒A上含有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，构建基因表达载体后，破坏了质粒A 的四环素抗性基因，但氨苄青霉素抗性基因正常，所以导入重组质粒或普通质粒的大肠杆菌都能抗氨苄青霉素，但导入重组质粒的大肠杆菌不能抗四环素。 【详解】（1）将得到的细菌涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，能够生长的就是导入了普通质粒A或重组质粒，反之则没有，使用这种方法鉴别的原因是普通质粒和重组质粒均含有抗氨苄青霉素基因。 （2）若把通过鉴定证明导入普通质粒A或重组质粒的细菌放在含有四环素的培养基上培养，由于普通质粒A上有抗四环素基因，重组质粒上的该基因由于目的基因的插入而被破坏，因此培养基中导入普通质粒A的细菌能生长，导入重组质粒的细菌不能生长。 （3）该过程中目的基因是人胰岛素基因，故导入细菌B细胞中的目的基因成功表达的标志是合成人胰岛素。 （4）获取bglB基因除了可以采用PCR技术扩增外，还有从基因文库中获取，人工合成目的基因两种方法，利用PCR扩增时，缓冲液里除了需要添加DNA母链和耐高温DNA聚合酶外，还需要添加4种脱氧核苷酸和（2种）引物。为激活DNA聚合酶，缓冲液里一般还需要添加Mg2+。 （5）根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间。图中看出，两者之间存在于三种限制酶切点，但是由于XbaI在质粒上不止一个酶切位点，因此为使PCR 扩增的bglB基因重组进该质粒，扩增的bglB基因两端需分别引入NdeI和BamHI不同限制酶的识别序列。 13．（24-25高二下·河南商丘·期末）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业研究领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列（如图所示），并开展相关研究。回答下列问题： (1)构建基因表达载体时，最好选用______两种限制酶切割表达载体和含有启动子D-基因S的DNA片段，与单一限制酶切相比，选用两种限制酶切的优势是______。 (2)构建好的基因表达载体除了含有启动子、基因S、标记基因和终止子外，还应含有______。其中启动子的作用是______。卡那霉素抗性基因的作用是______。 (3)将构建好的基因表达载体通过农杆菌转化法导入大豆。为提高表达载体进入农杆菌的效率，可采用的方法是______。为了更好地筛选转基因植株，研究人员将农杆菌分为两组，分别将GFP（绿色荧光蛋白）基因连接至甲组农杆菌质粒的T-DNA内部基因启动子下游和乙组农杆菌质粒的T-DNA外部基因启动子下游。导入大豆细胞形成愈伤组织后，可在甲组_____中检测到绿色荧光，乙组________中检测到绿色荧光。 【答案】(1)HindⅢ和SpeI 可防止目的基因和表达载体自身环化，能保证目的基因和表达载体准确连接 (2)复制原点 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 筛选出含有重组质粒的受体细胞 (3)用Ca2+处理农杆菌 农杆菌细胞、大豆愈伤组织细胞 农杆菌细胞 【分析】基因工程技术步骤：①目的基因的获取；②基因表达载体构建(载体组成：启动子+目的基因+终止子+标记基因)；③目的基因导入受体细胞；④目的基因检测与鉴定(采用分子检测、个体生物学水平鉴定)。 【详解】（1）EcoRI在②中有酶切位点，用EcoRI酶切割会破坏启动子和基因S，同时用SpeI和XbaI切割会产生相同的黏性末端，导致目的基因自身环化，因此不适宜选SpeI和XbaI切割。故宜选用HindⅢ和SpeI（或HindⅢ和XbaI）两种限制酶切割表达载体和含启动子D-基因S的DNA片段，以确保目的基因和载体正确连接，防止目的基因（启动子D-基因S片段）和表达载体自身环化。 （2）构建好的基因表达载体除了含有启动子、基因S、标记基因和终止子外，还应含有复制原点。启动子是RNA聚合酶识别和结合的序列，可驱动基因转录出mRNA。卡那霉素抗性基因属于标记基因，可用于筛选出含有重组质粒的受体细胞。 （3）将重组DNA导入受体细胞农杆菌，可用Ca2+处理农杆菌，增大细胞的通透性，使其容易吸收周围的DNA分子。甲组将GFP基因连接至农杆菌质粒的T-DNA内部基因启动子下游，T-DNA会整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上，随着染色体DNA的转录和翻译，可在愈伤组织细胞中检测到绿色荧光，同时农杆菌细胞中含有重组DNA，也会检测到绿光；乙组将GFP基因连接至农杆菌质粒的T-DNA外部基因启动子下游，T-DNA不会整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上，但是由于启动子能启动转录，所以在农杆菌自身细胞中（因为基因在农杆菌质粒上，在农杆菌内进行转录和翻译）可检测到绿色荧光。即甲组（大豆）细胞、农杆菌细胞中检测到绿色荧光，乙组农杆菌细胞中检测到绿色荧光。 14．（24-25高二下·河南南阳·期末）为使甜椒获得抗病毒性状，科研人员将病毒抗性基因导入甜椒植株，获得转基因甜椒。限制酶EcoRⅠ、PstⅠ的识别序列和切割位点分别为G↓AATTC、CTGCA↓G，抗病毒基因以b链作为模板进行转录。请回答下列问题： (1)PCR技术利用的原理是________。利用该技术扩增抗病毒基因时，应选择引物________（填图中数字）。 (2)为了将抗病毒基因准确连接至图中的质粒上，可在引物的5′端添加相应的限制酶识别序列，请写出PCR扩增时左侧引物按照5′到3′方向的前10个碱基序列________。 (3)将重组质粒导入农杆菌之前，一般先用______处理农杆菌，目的是________。 (4)若抗病毒基因成功转入甜椒细胞中，可检测到______（填“TetR”或“KanR”或“TetR”和“KanR”）的表达产物。 【答案】(1)DNA半保留复制 2和3 (2)5′-GAATTCTTAC-3′（或-GAATTCTTAC-） (3)Ca2+ 使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 (4)TetR 【分析】基因工程中，PCR 技术基于DNA半保留复制原理扩增抗病毒基因，因基因以b链转录，选引物1和4保证扩增方向；为将基因连入质粒，引物5’端添限制酶识别序列，如左侧引物5’→3’前10个碱基适配酶切需求；导入农杆菌前用Ca2+处理使其成感受态，便于重组质粒进入；重组质粒导入甜椒细胞后，因T-DNA 插入破坏四环素抗性基因，仅卡那霉素抗性基因表达，可检测其产物判断基因是否成功导入，各环节围绕目的基因的扩增、连接、导入及检测，实现抗病毒基因转入甜椒的操作。 【详解】（1）PCR技术的原理是DNA半保留复制。PCR扩增时，子链延伸的方向是5′→3′，DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，因此要扩增目的基因，应选用引物2和3。 （2）已知抗病毒基因以b链作为模板进行转录，转录方向为从左往右，为保证抗病毒基因以正确的方向插入质粒的启动子和终止子之间，左侧引物5′端应添加EcoR Ⅰ的识别序列，故左侧引物序列为5′-GAATTCTTAC-3′（或-GAATTCTTAC-）。 （3）将重组质粒导入农杆菌之前，一般先用Ca2+处理农杆菌，从而使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，进而可提高转化效率。 （4）农杆菌侵染甜椒细胞后，其中的T-DNA转移到甜椒的染色体上，KanR不在T-DNA上，TetR在T-DNA上，因此若抗病毒基因成功转入甜椒细胞中，可检测到TetR的表达产物。 15．（24-25高二下·河南洛阳·期末）科研人员将A基因和B基因利用重叠延伸PCR 技术构建A-B融合基因，从而培育出优良性状的转基因花生植株。融合基因构建过程如图1所示，所用 Ti质粒各结构组分如图2所示。回答下列问题。 (1)利用重叠延伸PCR 技术进行基因融合时，______  填(“能”或“不能”)将图1中PCR1和 PCR2放入同一个反应体系中进行，原因是 ______ 。在杂交链延伸成等长的融合基因时，_____   (填“需要”或“不需要”)添加引物，原因是_______ 。 (2)为保证A-B融合基因正确插入质粒，利用PCR扩增融合基因时需要在引物 _______ (从图1中选择)的5'端分别添加限制酶 _______(从图2中选择)的识别序列。 (3)据图2分析筛选转化细胞的过程：第一次在培养基中添加______  筛选导入重组Ti质粒的农杆菌菌株，第二次在培养基中添加 ______ 筛选染色体DNA 上整合T-DNA的花生愈伤组织细胞。此方法筛选出的花生细胞中，A-B融合基因是否一定表达，理由是________。 【答案】(1)不能 引物互补影响 PCR 不需要 两条 DNA 的交错部分即可作为其延伸的引物 (2)①和④ BglⅡ和 NcoⅠ (3)庆大霉素 潮霉素 不一定，基因选择性表达 【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】（1）由于不同的PCR体系其模板、引物不同，引物间可能会互补相互影响，故不能将图1中PCR1和PCR2放入同一个反应体系中进行。在杂交链延伸成等长的融合基因时不需要额外添加引物，因为两条DNA的交错部分即可作为其延伸的引物。 （2）由于PCR扩增融合基因的方向是子链的5'→3'，故选择的是引物①和④，又因为AB融合基因转录方向为从右到左，故引物①该添加限制酶Bgl II的序列，引物④该添加限制酶 Nco I的序列。 （3）第一次是筛选导入重组Ti质粒的农杆菌菌株，故需要在培养基中添加庆大霉素，第二次筛选染色体DNA上整合T- DNA的花生愈伤组织细胞，由于只有T-DNA可以转移整合，故第二次需要在培养基上添加潮霉素。筛选出的花生细胞中，由于基因的选择性表达，故A-B融合基因不一定表达。 16．（24-25高二下·河南新乡·期末）科研人员利用农杆菌转化法，将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin-Ⅱ导入杨树细胞，培育抗虫杨树。利用含Pin-Ⅱ的DNA分子和Ti质粒构建基因表达载体的过程如图所示，图中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neoR表示新霉素抗性基因，箭头表示限制酶的酶切位点，相关酶的识别位点如表所示。回答下列问题： (1)利用PCR扩增目的基因时，应该选择的引物是________，引物的作用是________。为使Pin-Ⅱ与Ti质粒正确连接，应在所选引物的5′端分别添加限制酶________的识别序列。 (2)为了更好地将表达载体导入农杆菌，一般要先用________处理农杆菌细胞，目的是________。 (3)用含重组Ti质粒的农杆菌侵染杨树后，应在含________的培养基中进行筛选。为检测转基因杨树的Pin-Ⅱ是否成功表达出相应蛋白质，常用的方法是________。 【答案】(1)引物2和引物3 使DNA聚合酶能够从引物3′端开始连接脱氧核苷酸 KpnⅠ、HindⅢ (2)Ca2+ 使农杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 (3)新霉素 抗原—抗体杂交法 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）根据引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物3'端开始连接脱氧核苷酸，利用PCR扩增目的基因时，应该选择引物2和引物3。为使Pin-Ⅱ与T质粒正确连接，应在所选引物的5'端添加限制酶Kpn I、HindⅢ的识别位点，因为EoRI会破坏目的基因。 （2）原核生物作为受体细胞时，一般要先用Ca2+处理受体细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 （3）用含重组Ti质粒的农杆菌侵染杨树后，T-DNA区段会导入杨树细胞的染色体，T-DNA区段含有新霉素抗性基因，因此应在含新霉素的培养基中进行筛选。为了检测目的基因是否表达，需从转基因杨树中提取蛋白质，用相应的抗体进行检测，该方法称为抗原一抗体杂交法。 17．（24-25高二下·河南驻马店·期末）除草剂的有效成分草甘膦能够专一地抑制植物细胞内有些酶的活性，从而使植物体内多种代谢途径受到影响而导致植物死亡。草甘膦没有选择性，它在除掉杂草的同时也会使作物受损。解决这个问题的方法之一就是培育抗草甘膦的作物。我国云南大学的科研人员从青麻、长芒苋、黑麦草等生物体内获得抗草甘膦（EPSPS）的基因并利用农杆菌转化法成功培育出了抗草甘膦的油菜、玉米、棉花及烟草等植物。其大致流程如图所示，回答下列问题： (1)①过程需要加入_______酶，获得抗EPSPS基因后，可利用_______技术大量扩增，其前提是_______，以便合成相应引物。若外源抗EPSPS基因两端序列与Ti质粒上限制酶识别序列不同，为保证二者定向拼接，据图分析可在两种引物的______端添加相应的限制酶识别序列。 (2)过程②构建的基因表达载体除了含目的基因、标记基因和复制原点外还必须有位于基因上游的______和位于基因下游的________，前者的作用为_______。 (3)给转基因玉米幼苗，喷施致死浓度的草甘膦（除草剂）可以筛选出转基因玉米植株，依据是_______。 【答案】(1)逆转录 PCR 已知抗EPSPS基因两端部分核苷酸序列 5' (2)启动子 终止子 是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因的转录 (3)抗草甘膦(EPSPS）基因随T-DNA整合到玉米细胞染色体上，使转基因玉米植株具有抗除草剂草甘膦的特性，可以抵抗草甘膦的影响而不死亡，而转基因未成功的玉米植株没有除草剂抗性基因，不具备抵抗草甘膦的特性，喷施致死浓度的草甘膦(除草剂)后会死亡 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）①过程为逆转录过程，需要逆转录酶，获得抗EPSPS基因后，可利用PCR技术大量扩增，扩增过程中需要根据目的基因两端的核苷酸序列设计两种引物。构建基因表达载体时需要用相同的限制酶处理目的基因和载体，据图可知目的基因插入到了载体中BamHⅠ 和 HindⅢ识别序列之间，由于引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'段开始连接脱氧核苷酸，若外源抗EPSPS基因两端序列与Ti质粒上限制酶识别序列不同，应在引物的5'添加BamHⅠ 和 HindⅢ的识别序列。 （2）通过②构建的基因表达载体除了目的基因、标记基因复制原点外还必须有位于基因上游的启动子和位于基因下游的终止子，启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因的转录。 （3）抗草甘膦(EPSPS)基因随T-DNA整合到玉米细胞染色体上，使转基因玉米植株具有抗除草剂草甘膦的特性，可以抵抗草甘膦的影响而不死亡，而转基因未成功的玉米植株没有除草剂抗性基因，不具备抵抗草甘膦的特性，喷施致死浓度的草甘膦(除草剂)后会死亡. 18．（24-25高二下·河南南阳·期末）胆碱脱氢酶（beta）在植物体内的作用主要体现在提高植物的耐盐性和耐低温能力上。研究人员通过转基因技术将beta基因导入棉花中（部分过程如图所示），beta基因的表达显著提高了棉花叶片中甜菜碱的含量，进而增强了棉花的耐盐和耐低温能力。回答下列问题： (1)为了获得相同的末端，应用两种限制酶________同时切割目的基因片段和质粒，用限制酶切割目的基因和质粒时，破坏的化学键是________；与只用一种限制酶酶切相比，采用双酶切的目的在于避免________。 (2)利用PCR技术对beta基因进行扩增时，为了合成引物需要已知________，且设计的引物序列不能过短，原因是________。 (3)基因表达载体上具有启动子，其作用为_______；应将beta基因插入到质粒的位置是________。 (4)获得的重组质粒可通过________（写出2种）方法导入到棉花细胞中。 (5)若要鉴定beta基因是否表达，从分子水平上可以用________的方法。 【答案】(1)SmaI和PstI 磷酸二酯键 含目的基因的DNA片段或质粒的自身环化以及错误(反向）连接 (2)beta基因的一段（或两端的）碱基序列（或一段目的基因的核苷酸序列，合理即可） 引物过短特异性弱，容易与多个DNA片段进行结合（增加引物与非目标序列的随机结合概率) (3)启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点，驱动基因的转录 启动子与终止子之间 (4)花粉管通道法、农杆菌转化法 (5)抗原一抗体杂交 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）据图可知，AluI会破坏目的基因，故不能选择，为了获得相同的末端，应用两种限制酶是SmaI和PstI；限制酶切割DNA时，破坏的是 磷酸二酯键，这是连接核苷酸的化学键；双酶切可以避免含目的基因的DNA片段或质粒的自身环化以及错误(反向）连接，因为使用两种不同的限制酶切割后，目的基因和质粒的末端不同，无法自连，只能与匹配的末端连接。 （2）PCR扩增需要根据目标基因的序列设计引物，因此必须已知beta基因的一段（或两端的）碱基序列；引物过短会导致 特异性弱， 容易与多个DNA片段进行结合（增加引物与非目标序列的随机结合概率)，即引物可能会与非目标序列结合，导致扩增出非目标产物。 （3）启动子是基因表达的关键元件，是RNA聚合酶识别与结合的位点，驱动基因的转录；启动子和终止子可以控制转录的开始和结束，故应将beta基因插入到质粒的位置是启动子与终止子之间。 （4）将重组质粒导入植物细胞的方法是花粉管通道法、农杆菌转化法。 （5）该过程中基因表达产物是蛋白质，而抗原与抗体的结合具有特异性，故若要鉴定beta基因是否表达，从分子水平上可以用抗原-抗体杂交技术。 19．（24-25高二下·河南南阳·期末）为研究编码铁运输相关蛋白的基因A（约963bp）在拟南芥缺铁胁迫响应中的作用，需要构建超量表达A的拟南芥转基因株系。质粒的结构如图2所示。回答下列问题 (1)图1中，过程①指的是从拟南芥中提取mRNA，经________催化，合成cDNA；过程②指的是以cDNA为模板，通过PCR扩增目的基因，需要在引物的_____端，加入限制酶___________的识别序列。 (2)获取了足够量的目的基因后，需要构建基因表达载体，其目的是__________。 (3)构建表达载体时，将PCR产物与质粒分别双酶切后，先进行琼脂糖凝胶电泳，将目标片段与无关片段分离，从琼脂糖凝胶中只回收目标片段，再用DNA连接酶进行连接，以避免_____。 (4)将转化后得到的单克隆农杆菌进行PCR鉴定，如图3所示，选择“1、2”号菌进行测序的原因是_____。 (5)将拟南芥的花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并将得到的种子接种在含有____（抗生素）的固体培养基上培养，以筛选出成功导入目的基因的阳性植株。 (6)提取转基因及野生型植株的蛋白质进行电泳检测（如图4），若其中_______号为转基因植株的蛋白质电泳结果，则说明成功构建超量表达A的拟南芥转基因株系。 【答案】(1)逆转录酶 5＇ BamHI、Sa1l (2)要让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时使目的基因能够表达和发挥作用 (3)目标片段与无关片段重新连接（目的基因自连以及质粒自连） (4)图3结果显示1、2的PCR产物长度与A基因相符，但无法确定PCR产物的碱基序列是否与A基因相同 (5)潮霉素 (6)① 【分析】基因工程狭义指基因拼接技术，将外源基因导入受体细胞，使其表达。本题通过酶切、连接构建含基因 A 的质粒，转入拟南芥，实现超量表达，属于基因工程操作 。本题中图 1 呈现基因 A 的结构及 KpnⅠ 等酶切位点 ；图 2 是质粒结构，有启动子、T - DNA、潮霉素抗性基因等，含 KpnⅠ、BamHⅠ 等酶切位点 ；图 3 为 DNA 分子标记（M）及样本 1、2 的电泳条带；图 4 是蛋白电泳结果，有目的蛋白和内参蛋白条带，用于基因表达检测 。 【详解】（1）以 mRNA 为模板合成 cDNA 的过程是逆转录，需逆转录酶催化。DNA 复制时子链从 5′→3′ 延伸，引物需与模板链 3′ 端结合，故在引物的5′ 端添加限制酶识别序列。结合质粒图谱（图2），需选择不破坏目的基因且能构建载体的酶，故为 BamHⅠ、SalⅠ（保证目的基因插入正确位置）。 （2）构建基因表达载体的目的是：使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给后代 ，同时保证目的基因能表达和发挥功能（如转录、翻译）。 （3）回收目标片段后再连接，可避免目标片段与无关片段重新连接（或目的基因自连、质粒自连） ，保证载体构建的准确性（只有目的基因与质粒正确连接的重组载体）。 （4）图3中1、2号菌的PCR产物长度与A基因相符，但PCR产物的碱基序列未知 ，需测序确认是否与A基因完全一致，故选择1、2号菌测序。 （5）质粒含潮霉素抗性基因（标记基因），故将种子接种在含潮霉素的培养基上，能存活的植株为成功导入目的基因的阳性植株（标记基因表达赋予抗性）。 （6）转基因株系超量表达A基因，其蛋白质电泳结果中目标蛋白条带（①号 ）应更明显（与野生型对比），故①号为转基因植株的蛋白质电泳结果。 20．（24-25高二下·河南开封·期末）干旱胁迫严重影响玉米产量，科研人员从戈壁异常球菌中提取csp2基因（其编码的蛋白质能增强植物对干旱的抗性），利用如图所示Ti质粒，通过农杆菌转化法将csp2基因转入玉米幼胚细胞，最终获得耐旱性显著且抗草甘膦的转基因植株。已知除草剂草甘膦可抑制植物体内EPSP合酶的活性，使植物体内多种代谢途径受到影响，导致植物死亡。回答下列问题。 (1)研究人员根据植物密码子偏好性优化csp2基因序列，该操作的目的是为了提高csp2基因的_________。为保证目的基因正确插入质粒，需在优化后的csp2基因α链5′端和3'端分别添加_______酶切位点。 (2)为成功获得转基因玉米，科研人员首先进行了分子水平检测。下图表示各种引物在玉米相应染色体上的识别位点，为检测csp2基因是否整合到玉米染色体上，需选择引物组合______（①csp2-F/玉米内源基因-R、②G10aroA-F/csp2-R、③玉米内源基因-F/玉米内源基因-R）对玉米细胞内的DNA进行PCR扩增，再对扩增产物进行_____，观察是否存在特异性DNA条带；后在_____条件下进行个体生物学水平的检测。 (3)csp2基因可能通过花粉进入野生玉米种群导致基因扩散，为阻断该路径，可将csp2基因导入_______（一种细胞器）中。若要将csp2基因导入小麦，可使用我国独创的______法。 【答案】(1)在玉米细胞中的翻译效率 PstI和BamHI (2)① 琼脂糖凝胶电泳 干旱、喷施草甘膦 (3)叶绿体 花粉管通道法 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】（1）由图可知，密码子偏好性实质在蛋白质合成过程中，对某些密码子的使用频率表现出明显的倾向性，研究人员根据植物密码子偏好性优化csp2基因序列，使得csp2基因的密码子使用频率更高，提高了该基因在玉米细胞中的翻译效率。由题意可知，α链为模板链，转录方向是按模板链的3′端-5′端进行的，即转录出的子链延伸方向是5′端-3′端，结合质粒的启动子和终止子位置可知，应在csp2基因α链5′端和3'端分别添加PstI和BamHI酶切位点，以保证转录的正常进行。 （2）为检测csp2基因是否整合到玉米染色体上，扩增是要保证同时扩增到csp2基因和玉米的内源基因，所以应选择引物组合为csp2-F/玉米内源基因-R。PCR 扩增后，需对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，进而通过电泳分离不同长度的 DNA 片段，观察是否有特异性条带，判断是否含目的基因。由题意可知，通过农杆菌转化法将csp2基因转入玉米幼胚细胞，最终获得耐旱性显著且抗草甘膦的转基因植株，所以个体生物学水平检测需验证转基因玉米的抗旱和抗草甘膦特性，故在干旱、喷施草甘膦条件下检测，可以模拟干旱胁迫和草甘膦处理环境，观察植株是否存活、生长 。 （3）花粉中一般不含叶绿体，将csp2基因导入叶绿体中，可避免基因通过花粉扩散到野生玉米种群，因为叶绿体遗传为细胞质遗传，不随花粉传播。我国独创的将基因导入植物的方法是花粉管通道法。 地 城 考点03 蛋白质工程 一、单选题 1．（24-25高二下·河南洛阳·期末）T4溶菌酶是一种重要的工业用酶，在温度较高时容易失去活性。将T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变为半胱氨酸后，该酶的耐热性得到提高。下列说法错误的是（    ） A．实施该项工作的前提条件是了解该酶结构和功能的关系 B．引起该酶空间结构发生改变的直接原因是氨基酸序列改变 C．该项工作需要对相关基因定向改造，属于基因工程的范畴 D．改造工作完成后，需要重新明确该酶催化反应的最适温度 【答案】C 【分析】蛋白质工程是以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要。 【详解】A、蛋白质的结构决定功能，T4溶菌酶是否耐热取决于蛋白质的空间结构，A正确； B、若将T4溶菌酶第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，可在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成一个二硫键，提高T4溶菌酶的耐热性，引起该酶空间结构发生改变的直接原因是氨基酸序列改变，B正确； C、蛋白质工程操作的对象为基因，故直接操作对象是T4溶菌酶基因，替换T4溶菌酶第3位氨基酸的操作中，属于蛋白质工程，C错误； D、改造工作完成后，蛋白质的结构发生改变，需要重新明确该酶催化反应的最适温度，D正确。 故选C。 2．（24-25高二下·河南商丘·期末）AI技术通过大数据分析、深度学习解析蛋白质序列与三维结构的关系，可实现从头设计全新蛋白质的结构或对蛋白质进行改造的目的。下列叙述错误的是（　　） A．AI技术能设计某些蛋白质，这属于蛋白质工程的范畴 B．AI技术在设计全新蛋白质时，需先预期该蛋白质的功能 C．AI技术设计的某种蛋白质的氨基酸序列对应的基因序列是唯一的 D．AI技术改造蛋白质可能需用基因的定点突变技术来进行碱基的替换 【答案】C 【分析】蛋白质工程概念及基本原理： （1）蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）； （2）蛋白质工程崛起的缘由：基因工程只能生产自然界已存在的蛋白质； （3）蛋白质工程的基本原理：它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构，又称为第二代的基因工程； （4）基本途径：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因），最终还是回到基因工程上来解决蛋白质的合成。 【详解】A、蛋白质工程通过基因修饰或合成来设计蛋白质，AI技术辅助设计属于该范畴，A正确； B、蛋白质工程设计需先明确预期蛋白质的功能，再推导结构，B正确； C、由于遗传密码的简并性（多个密码子对应同一氨基酸），同一氨基酸序列可能由不同基因序列编码，C错误； D、蛋白质工程常通过定点突变技术修改基因中的碱基，从而改变蛋白质结构，D正确。 故选C。 3．（24-25高二下·河南新乡·期末）水蛭素是由65个氨基酸组成的单链多肽，具有良好的抗凝血作用。研究人员拟通过蛋白质 工程改造水蛭素，提高其抗凝血活性，基本思路如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．物质b是mRNA，物质b到物质a的过程表示翻译 B．根据物质a只能推测出一种对应的DNA序列 C．对水蛭素的改造是通过改造水蛭素基因来完成的 D．通过蛋白质工程能生产自然界中不存在的蛋白质 【答案】B 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。蛋白质工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找出相对应的脱氧核苷酸序列（基因）。 【详解】A、根据蛋白质工程的知识，物质a是改造后具有特定氨基酸序列的水蛭素肽链，物质b是与之对应的mRNA，A正确； B、由于密码子具有简并性，推导获得的DNA序列可能多样，即虽物质b的碱基序列可能不同，但所合成水蛭素的功能可能相同，B错误； C、生物体内的蛋白质是基因指导合成的，因此，对水蛭素的改造需要通过改造水蛭素基因来完成，C正确； D、基因工程原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，而蛋白质工程则是通过改造或合成基因来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，若改造、合成后的基因能正确表达，则所产生的水蛭素是自然界中不存在的蛋白质，D正确。 故选B。 4．（24-25高二下·河南南阳·期末）某公司拟开发一种新型碱性蛋白酶，用于高效去除衣物上的蛋白质污渍。已知天然蛋白酶X在pH=10时活性较低，且易被洗涤剂中的氧化剂破坏。研究人员计划通过蛋白质工程改造酶X，使其在碱性环境中活性提升并增强抗氧化能力。为实现上述目标，下列哪项技术手段不属于蛋白质工程的关键步骤（　　） A．利用冷冻电镜解析酶X的三维结构，确定影响pH敏感性和抗氧化性的关键氨基酸位点 B．通过体外定向进化技术，在模拟洗涤环境的培养基中筛选高活性突变体 C．将人工设计的突变基因导入毕赤酵母表达系统，验证改造后酶的催化性能 D．对产酶X的枯草芽孢杆菌进行紫外线诱变，随机筛选耐碱性菌株 【答案】D 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 【详解】A、蛋白质工程的核心是基于结构的理性设计或可控的定向进化。结构解析为改造提供理论依据，利用冷冻电镜解析酶X的三维结构，确定影响pH敏感性和抗氧化性的关键氨基酸位点，这是为蛋白质工程提供理论支撑，不符合题意，A错误； B、定向进化属于蛋白质工程的体外筛选技术，不符合题意，B错误； C、将人工设计的突变基因导入毕赤酵母表达系统，验证改造后酶的催化性能，这是基因表达验证阶段，该阶段是蛋白质工程化改造的必要环节，不符合题意，C错误； D、紫外线诱变属于传统随机诱变技术，未针对目标蛋白进行定向设计，不属于蛋白质工程，符合题意，D正确。 故选D。 5．（24-25高二下·河南信阳·期末）南极磷虾细胞中得到的基因A，其表达产物抗菌肽NR-13具有较强抑菌能力，但副作用是溶血毒性偏高。科学家计划利用蛋白质工程在抗菌肽NR-13的基础上研发保留了较强的抑菌能力，但副作用很小的多肽类新药。下列四个选项是依次进行的四个研发环节。哪项不符合生物技术的安全性原则 A．在分子水平上研究NR-13的结构（氨基酸序列和空间结构）与功能的关系 B．设计出新结构的抗菌肽，并按照中心法则推导出对应的基因序列 C．改造原有的基因A，或者人工合成新基因，将新基因导入大肠杆菌细胞中 D．利用大肠杆菌生产出新抗菌肽，并征集志愿者进行新抗菌肽人体实验 【答案】D 【分析】1、根据安全性原则，新药研发需经过严格的临床前试验（如体外实验、动物实验）才能进行人体实验。2、蛋白质工程的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 【详解】A、在分子水平上研究NR-13的结构（氨基酸序列和空间结构）与功能的关系，这是蛋白质工程研究的常规内容，符合安全性原则，A正确； B、设计出新结构的抗菌肽，并按照中心法则推导出对应的基因序列，这是蛋白质工程中合理的设计步骤，符合安全性原则，B正确； C、改造原有的基因A，或者人工合成新基因，将新基因导入大肠杆菌细胞中，这是基因工程中常用的手段，符合安全性原则，C正确； D、利用大肠杆菌生产出新抗菌肽，并征集志愿者进行新抗菌肽人体实验，这是不符合安全性原则的，因为在进行人体实验之前，需要进行严格的动物实验等安全性和有效性评估，直接征集志愿者进行人体实验存在较大的安全风险，D错误。 故选D。 6．（24-25高二下·河南南阳·期末）天然胰岛素易形成二聚体或六聚体，皮下注射胰岛素后往往要经历一个逐渐解离为单体的过程，这在一定程度上延缓了疗效。科研人员发现，将胰岛素B28位的脯氨酸替换为天冬氨酸或与B29位的赖氨酸交换位置，可有效抑制胰岛素的聚合，由此研发出的速效胰岛素类似物产品已经在临床上广泛应用。下列叙述正确的是（　　） A．该工程属于蛋白质工程，其生产的蛋白质是自然界已有的蛋白质 B．胰岛素改造的基本思路与天然蛋白质的合成过程相同 C．替换氨基酸时需要用特定的蛋白酶将特定部位的肽键水解 D．胰岛素类似物蛋白想要达到预设的疗效，还需检测其高级结构是否正确 【答案】D 【分析】蛋白质工程是通过修改基因或创造合成新基因来改变生物的遗传和表达性状，合成新的蛋白质，蛋白质工程从属于基因工程，蛋白质工程是第二代基因工程。 【详解】A、该工程通过对天然胰岛素的氨基酸序列进行改造，属于蛋白质工程，改造后生产的蛋白质是自然界不 存在的，A错误； B、天然蛋白质的合成过程是按照中心法则进行的，蛋白质工程的基本思路与中心法则相反，B 错误； C、蛋白质工程的实质是对基因进行改造，需要用限制酶和DNA连接酶等工具，不需要蛋白酶，C错误； D、物质的结构决定功能，蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，D正确。 故选D。 地 城 考点04 基因工程综合 一、单选题 1．（24-25高二下·河南开封·期末）干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的蛋白质，可用于治疗病毒感染性疾病。我国科学家已成功研制出第一个基因工程药物重组人干扰素。天然干扰素在体外保存时间较短，若将干扰素分子上的一个半胱氨酸变为丝氨酸，可使干扰素更稳定，在一定条件下可以延长保存时间。下列叙述错误的是（    ） A．逆转录得到干扰素基因需要用逆转录酶催化 B．PCR需要以四种游离的脱氧核苷酸作为原料 C．大肠杆菌先用Ca2+处理有利于重组质粒导入 D．可以改造多肽链中的氨基酸生产稳定干扰素 【答案】D 【详解】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）。 【分析】A、逆转录是以RNA为模板合成DNA的过程，需逆转录酶催化，A正确； B、PCR扩增DNA时，需四种脱氧核苷酸作为原料，B正确； C、用Ca2+处理大肠杆菌可使其处于感受态，便于吸收重组质粒，C正确； D、直接改造多肽链中的氨基酸无法遗传，需通过基因工程修改DNA序列来改变多肽链中的氨基酸，D错误； 故选D。 2．（2025·河南·模拟预测）为降低寄生虫疫苗候选抗原蛋白异位表达毒性等副作用，研究者将增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因与线虫肌动蛋白（Act-1）启动子核心片段重组，利用大肠杆菌表达荧光蛋白，来确定Act-1基因启动子核心片段的活性，其主要步骤如图所示。下列叙述正确的是（    ） 注：Ori表示复制原点；AmpR表示氨苄青霉素抗性基因。 A．利用PCR扩增Act-1基因启动子时，需用到SalⅠ酶和HindⅢ酶 B．在添加氨苄青霉素的培养基上，获得的菌落均能发出荧光 C．Ori可能富含G—C碱基对，有利于DNA从此处开始解旋 D．启动子与质粒重组前需添加XhoⅠ酶的识别序列 【答案】D 【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 【详解】A、利用PCR扩增Act-1基因启动子时，无需加入SalⅠ酶和HindⅢ酶，而是在引物上引入这两种酶的识别序列，A错误； B、在添加氨苄青霉素的培养基上获得的菌落有两种：导入空白质粒的大肠杆菌和导入重组质粒的大肠杆菌，只有后者能发出荧光，B错误； C、Ori可能富含A—T碱基对，氢键数量少，DNA不稳定，有利于DNA从此处开始解旋，C错误； D、启动子的两边为SalⅠ酶和HindⅢ酶序列，重组质粒中酶识别序列为XhoⅠ酶和HindⅢ酶序列，因此启动子与质粒重组前需添加XhoⅠ酶的识别序列，以便质粒与基因重组，D正确。 故选D。 3．（24-25高二下·河南南阳·期末）基因工程技术在迅猛发展，为人类的生产生活带来很多便利，但同时也带来了一些安全性问题，下列说法正确的是（　　） A．乳腺生物反应器是将药用蛋白基因与药用蛋白启动子重组后导入动物的受精卵中 B．将外源生长素基因导入羊体内可提高羊的生长速度 C．向奶牛乳腺细胞导入肠乳糖酶基因，该奶牛分泌的牛奶适合乳糖不耐受人群 D．在转基因研究中，科学家通过阻断淀粉储藏使花粉失去活性来防止基因污染 【答案】D 【分析】动物乳腺生物反应器是基于转基因技术平台，使外源基因导入动物基因组中并定位表达于动物乳腺，利用动物乳腺天然、高效合成并分泌蛋白的能力，在动物的乳汁中生产一些具有重要价值产品的转基因动物的总称。 【详解】A、乳腺生物反应器的构建需要将药用蛋白基因与乳腺组织特异性表达基因的启动子（如乳球蛋白启动子）重组，而非药用蛋白自身的启动子，A错误； B、生长素是植物激素，动物体内缺乏其作用机制，导入外源生长素基因无法提高动物生长速度，B错误； C、为了解决某些人乳糖不耐受的问题，科学家将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵（不是将肠乳糖酶基因导入奶牛乳腺细胞），可以培育出产低乳糖牛乳的奶牛，使获得的转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低，而其他营养成分不受影响，C错误； D、阻断花粉中淀粉的储藏会导致花粉失去活性，无法传播，从而防止转基因植物的基因污染。此措施属于应对安全性问题的有效方法，D正确。 故选D。 4．（2025·河南·模拟预测）抗体结构分为可变区（V区）和恒定区（C区），与抗原特异性结合的区域为CDR区，位于V区中。在医药领域，单克隆抗体在疾病诊断和病原体鉴定中发挥重要作用，但鼠源的单抗容易在人体内引发人抗鼠抗体反应（HAMA），从而削弱其治疗的有效性。科学家对鼠源杂交抗体进行改造，生产出效果更好的鼠—人嵌合抗体，主要流程如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．鼠—人嵌合抗体至少含有4个游离氨基，其抗体特异性由肽链的C区决定 B．上述表达载体的构建过程主要利用了基因突变的生物学原理 C．为提高嵌合基因与载体的连接效率，扩增时应在两条引物的3'端添加同种限制酶酶切位点 D．鼠—人嵌合抗体的研制过程属于蛋白质工程，图中转染细胞的方法可能是显微注射法 【答案】D 【分析】单克隆抗体的制备： 1、细胞来源：B淋巴细胞：能产生特异性抗体，在体外不能无限繁殖；骨髓瘤细胞：不产生专一性抗体，体外能无限繁殖； 2、杂交瘤细胞的特点：既能大量增殖，又能产生特异性抗体； 3、两次次筛选：①筛选得到杂交瘤细胞(去掉未杂交细胞以及自身融合的细胞)；②筛选出能够产生特异性抗体的细胞群； 4、两次抗体检测：专一抗体检验阳性； 5、提取单克隆抗体：从培养液或小鼠腹水中提取； 6、单克隆抗体的优点：特异性强、灵敏度高，并可能大量制备。 【详解】A、由图可知，鼠一人嵌合抗体含有4条肽链，因此至少含有4个游离氨基，其抗体特异性由肽链的V区决定，A错误； B、表达载体的构建过程主要利用了基因重组的生物学原理，不是基因突变，B错误； C、子链延伸只能从5′端向3′端，为避免自身环化和反向链接，应使用两种不同的限制酶进行酶切，因此应在两条引物的5′端添加不同的限制酶酶切位点，C错误； D、鼠-人嵌合抗体是对鼠源抗体改造，即对蛋白质改造，属于蛋白质工程；将基因表达载体导入动物细胞（Sp2/0细胞 ）常用显微注射法，D正确。 故选D。 5．（24-25高二下·河南开封·期末）为解决草莓品种抗虫性差和因病毒积累导致品种退化的问题，育种工作者进行了以下尝试：①利用草莓茎尖进行组织培养；②将草莓细胞与抗虫植物细胞进行体细胞杂交；③对草莓愈伤组织细胞进行液体悬浮培养。下列叙述错误的是（    ） A．①技术可以获得草莓脱毒苗 B．②技术的原理是细胞膜的流动性 C．③技术不能得到草莓新品种 D．用基因工程技术可培育抗虫品种 【答案】B 【分析】植物组织培养：1、过程：离体的植物组织，器官或细胞（外植体）经过脱分化形成愈伤组织，愈伤组织再分化形成胚状体，最后发育成植株（新植体）。决定植物脱分化和再分化的关键因素是植物激素的种类和比例，特别是生长素和细胞分裂素的协同作用在组织培养过程中非常重要。2、原理：植物细胞的全能性。3、应用：植物繁殖的新途径（快速繁殖优良品种、作物脱毒、人工种子）、作物新品种的培育（单倍体育种和突变体的利用）、细胞产物的工厂化生产。 【详解】A、茎尖分生区细胞病毒极少，通过组织培养可获得脱毒苗，A正确； B、体细胞杂交需细胞膜流动性实现融合，但整个技术还需细胞全能性形成植株，B错误； C、液体悬浮培养仅增殖细胞，未诱发遗传变异，无法得到新品种，C正确； D、基因工程可导入抗虫基因，培育抗虫草莓，D正确。 故选B。 6．（24-25高二下·河南三门峡·期末）研究人员仿照制备乳腺生物反应器的思路，制备了一种膀胱生物反应器用其获得人体特殊功能蛋白W，基本过程如下图所示。下列有关叙述错误的是（　　） A．图中①和③过程代表的操作分别是显微注射和胚胎移植 B．转基因动物乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞的遗传信息不同 C．需用激素对代孕母体进行同期发情处理 D．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受转基因动物性别和年龄的限制 【答案】B 【详解】A、图中①表示将目的基因导入受体细胞，利用受精卵作为重组表达载体的宿主细胞常采用显微注射的方法将载体注入，③表示胚胎移植，A正确； B、转基因动物乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞是体细胞有丝分裂再经分化而来，遗传信息相同，B错误； C、对代孕母体进行同期发情处理，以使其子宫处于与供体相同的生理状态，C正确； D、由于只有雌性动物哺乳期才能产奶，因此与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受转基因动物性别和年龄的限制，D正确。 故选B。 二、非选择题 7．（24-25高二下·河南鹤壁·期末）植物络合素（PCs）是植物细胞中的小分子多肽，可以螯合重金属离子并储存于液泡中，起到富集重金属和降低毒性的作用。研究发现，向烟草中导入基因TaPCs，获得的转基因烟草对重金属如Pb、Cd的耐性大大增强，故可以利用转基因烟草进行土壤的植物修复。回答下列问题： T-DNA序列 引物序列 5'-AACTATGCGC……CGTAGCCTAT-3' ①5'-GCGCATAGTT-3' 3'-TTGATACGCG……GCATCGGATA-5' ②5'-CGTAGCCTAT-3' (1)可用_______法将携带TaPCs的基因表达载体导入烟草细胞，该方法可利用农杆菌细胞中Ti质粒的T-DNA将基因TaPCs转移到烟草细胞的_______上。 (2)研究人员欲利用PCR扩增基因TaPCs，该技术的前提是设计相关引物，设计的每一种引物自身不能存在互补序列，目的是_______。PCR扩增过程中温度呈“升温→降温→升温”的周期性变化，其中“降温”的目的是_______。 (3)若用SalⅠ处理图中的转基因烟草DNA，断开DNA分子，再利用DNA连接酶将两端的黏性末端连接成环，以此为模板，利用表中的引物①、引物②进行PCR，能扩增出图中的未知序列，则该扩增的主要产物_______（填“含”或“不含”）T-DNA的完整序列；表中的引物①、引物②分别对应于图中的引物_______。 (4)与物理、化学方法修复重金属污染土壤相比，利用转基因植物修复重金属污染土壤的优点有_______（答出2点）。 【答案】(1)农杆菌转化 染色体DNA (2)避免引物自身发生碱基互补配对，不能与目的基因结合 使引物通过碱基互补配对与DNA单链结合 (3)不含 F1、R2（顺序不能颠倒） (4)对环境污染小、安全且经济有效、可持续修复（答出2点且合理即可） 【分析】植物络合素（PCs ）是植物细胞内小分子多肽，可螯合重金属离子并储存于液泡，降低毒性。本题中，通过基因工程，利用农杆菌转化法，将编码 PCs 的基因 TaPCs 借助 Ti 质粒的 T - DNA 整合到烟草细胞染色体 DNA 上，使转基因烟草大量表达 PCs 。这些 PCs 能结合土壤中 Pb、Cd 等重金属离子，实现对重金属的富集与固定，达到修复受重金属污染土壤的目的 ，同时 PCR 技术用于扩增 TaPCs 基因，其引物设计避免自身互补确保有效扩增，“降温” 环节促进引物与模板链结合，保障基因扩增顺利进行，为修复机制的基因导入与功能实现提供技术支撑 。 【详解】（1）可用农杆菌转化法将携带TaPCs的基因表达载体导入烟草细胞，该方法可利用农杆菌细胞中Ti质粒的T-DNA将基因TaPCs转移到烟草细胞的染色体DNA上。 （2）设计引物时，引物自身不能存在互补序列，以避免引物自身发生碱基互补配对，形成双链区，导致不能与目的基因结合。在PCR扩增过程中，加热到90℃的目的是使DNA受热变性后解旋成单链，然后冷却到50℃左右即降温的目的是使两种引物通过碱基互补配对与DNA单链结合，温度继续升高到72℃左右的目的是使4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶作用下根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 （3）以此为模板，利用表中的引物①、引物②进行PCR，能扩增出图中的未知序列，未知序列在T-DNA两侧，故PCR扩增的主要产物不含T-DNA的完整序列。结合图示可知，复制的方向是从模板链的3'到5'端，故应选择图中的引物F1、R2进行扩增，F1与T-DNA中的5'-AACTATGCGC-3'互补，R2与T-DNA中的3'-GCATCGGATA-5'互补，F1、R2分别与表中的引物①、引物②对应。 （4）与物理、化学方法修复重金属污染土壤相比，利用转基因植物修复重金属污染土壤的优点有对环境污染小、安全且经济有效、可持续修复等。 8．（24-25高二下·河南洛阳·期末）白细胞介素-2(IL-2)是一种具有抗肿瘤作用的细胞因子。研究通过在肿瘤细胞中表达IL-2，诱导机体产生抗肿瘤免疫应答，为IL-2基因治疗进入临床提供依据，部分实验过程如图所示。回答下列问题。 (1)已知IL-2能诱导细胞毒性T细胞的活化。转基因肿瘤细胞分泌的细胞因子(IL-2)能激活人或动物体内的_______免疫反应，使机体产生抗肿瘤免疫效应。 (2)重组载体的构建与筛选：根图甲分析，对逆转录病毒载体及IL-2基因片段都要使用_______酶进行切割，并在DNA 连接酶的作用下连接________(填化学键名称)获得含IL-2基因的重组载体。将该重组载体导入预先用______  处理的大肠杆菌细胞，扩增后提取大肠杆菌DNA 鉴定目的基因。利用上述限制酶进行酶切，由图乙可知，IL-2基因已定向插入载体内，基因长度约为 _______bp。再将含IL-2基因的重组载体转染至 CRC细胞，在多孔细胞板进行_______培养并筛选阳性细胞，收集含有IL-2基因的病毒载体的上清液。 (3)IL-2基因导入肿瘤细胞及表达检测：取含病毒载体的上清液感染小鼠胰腺癌细胞，提取肿瘤细胞内 ______，构建逆转录-聚合酶链式反应体系，PCR 结果利用 _____分析，确定肿瘤细胞内IL-2基因已正常转录；进而提取肿瘤细胞内的蛋白质，加入单克隆体作探针，利用 ______ 技术检测 IL-2基因已正常翻译。 (4)体内致瘤性实验：将同品系小鼠分成2组，背部皮下注射________肿瘤细胞的小鼠作为对照组，皮下注射________肿瘤细胞的小鼠为实验组，观察并测量小鼠肿瘤的生长情况。预测实验结果________。 【答案】(1)细胞 (2)EcoRI和 BamH I 磷酸二酯键 Ca²⁺ 300 克隆化 (3)RNA 琼脂糖凝胶电泳(电泳) 抗原-抗体杂交 (4)导入空载体(或未转基因或未导入外源基因) 导入IL-2基因 与对照组相比，实验组小鼠的肿瘤生长受抑制 【详解】（1）细胞毒性T细胞参与细胞免疫过程。 （2）分析题图，逆转录病毒载体上便于目的基因插入的限制酶有EcoR Ⅰ 、Hpa Ⅰ、Xho Ⅰ和BamH Ⅰ，IL-2基因片段及旁侧序列上有四个限制酶，分别是EcoR Ⅰ 、Hind Ⅲ 、Hpa Ⅰ和BamH Ⅰ，其中Hind Ⅲ 、Hpa Ⅰ位于基因内部，不能用于构建表达载体，所以选择逆转录病毒载体和IL-2基因片段共有的限制酶，即EcoR Ⅰ 和BamH Ⅰ。DNA连接酶作用于磷酸二酯键。用Ca²⁺处理大肠杆菌细胞，使其成为感受态。比较图乙中空载体和重组载体的酶切图，重组载体比空载体多出300 bp的电泳条带，所以基因长度约为300 bp。再将含IL-2基因的重组载体转染至 CRC细胞，在多孔细胞板进行克隆化培养和筛选阳性细胞，收集含有IL-2基因的病毒载体的上清液。 （3）IL-2基因导入肿瘤细胞及表达检测：取病毒上清液感染小鼠胰腺癌细胞，提取肿瘤细胞内RNA,构建RT-PCR（逆转录·聚合酶链式反应）体系，PCR结果利用琼脂糖凝胶电泳分析，确定肿瘤细胞内IL-2基因已正常转录。进而提取肿瘤细胞内的蛋白质，加入单克隆体作探针，利用抗原-抗体杂交技术检测 IL-2基因已正常翻译。 （4）将同品系小鼠分成三组，背部皮下注射未导入外源基因肿瘤细胞的小鼠作为对照组，皮下注射导入IL-2基因的肿瘤细胞、导入IL-2和B7双基因的肿瘤细胞作为实验组，观察小鼠肿瘤的生长情况。预测实验结果：与对照组相比，实验组小鼠的肿瘤生长受抑制。 9．（24-25高二下·河南郑州·期末）水稻基因组中的B基因仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不能转录。为研究 B基因表达对卵细胞的影响，科研人员设计了下图所示的实验（表达载体上的启动子可在水稻卵细胞中启动转录，使导入的基因能够正常表达）。回答下列问题。 (1)构建表达载体时，需使用DNA 连接酶，如果目的基因两端和运载体上均为平末端，选用_____（填“T4DNA连接酶”或“E. coliDNA连接酶”）效率更高。如果目的基因两端无限制酶切点，质粒经限制酶切割后产生了黏性末端，为了正确连接，可以用PCR 扩增目的基因时，在引物的_____（填“5'或“3'）端添加与质粒相同限制酶的识别序列。 (2)将水稻B基因编码蛋白的序列与荧光素酶 Luc基因拼接成 B-Luc融合基因，其目的是_____。表达载体中潮霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因作为_____，可用于筛选含有表达载体的水稻细胞。表达载体除了图中各种结构外，还应具有_____。 (3)①过程一般用Ca2+处理农杆菌，使之处于一种_____的生理状态。②过程中，农杆菌侵染水稻愈伤组织，使T-DNA 整合到水稻细胞的_____上。鉴定筛选水稻幼苗时，检测指标除了幼苗对潮霉素和卡那霉素的抗性外，还可以检测_____。 (4)利用愈伤组织作为受体细胞的原因是_____，愈伤组织发育成转基因番茄幼苗时，培养基中需要添加_____等植物激素。 【答案】(1)T4DNA连接酶 5′ (2)便于检测B基因在卵细胞中的表达情况 标记基因 复制原点 (3)能吸收周围环境中DNA 分子 染色体DNA 是否有荧光 (4)愈伤组织分化程度低，全能性高，更易获得转基因植株 生长素、细胞分裂素 【分析】图中①表示将目的基因导入农杆菌，②表示采用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞，之后再采用植物组织培养技术获得转基因植株。 【详解】（1）T4DNA连接酶既可以连接黏性末端，也可以连接平末端，而E.coli DNA连接酶连接平末端的效率较低，所以当目的基因两端和运载体上均为平末端时，选用T4DNA连接酶效率更高。在PCR扩增目的基因时，引物与模板链结合后，DNA聚合酶从引物的3'端开始延伸DNA链，为了能将目的基因与经限制酶切割产生黏性末端的质粒正确连接，需要在引物的5'端添加与质粒相同限制酶的识别序列，这样扩增出的目的基因两端就有了相应的限制酶切割位点。 （2）将水稻B基因编码蛋白的序列与荧光素酶Luc基因拼接成B-Luc融合基因，由于荧光素酶Luc基因表达的产物荧光素酶能催化荧光素产生荧光，所以这样做的目的是便于检测B基因在卵细胞中的表达情况（通过检测荧光来判断）。表达载体中的潮霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因作为标记基因，含有这些标记基因的水稻细胞能够在含有相应抗生素的培养基中生长，从而可用于筛选含有表达载体的水稻细胞。表达载体除了图中的启动子、终止子、目的基因（B-Luc融合基因）、标记基因外，还应具有复制原点，以便在宿主细胞中进行自我复制。 （3）①过程一般用Ca2+处理农杆菌，使之处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种状态称为感受态。②过程中，农杆菌侵染水稻愈伤组织，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA会整合到水稻细胞染色体DNA上。因为构建的是B-Luc融合基因，所以鉴定筛选水稻幼苗时，检测指标除幼苗对潮霉素和卡那霉素的抗性外，还可检测是否有荧光（检测荧光来确定B-Luc融合基因是否表达，进而确定B基因是否表达）。 （4）利用愈伤组织作为受体细胞的原因是愈伤组织分化程度低，全能性高，更易获得转基因植株，愈伤组织发育成转基因番茄幼苗时，培养基中需要添加生长素和细胞分裂素等植物激素，以调控细胞分裂和分化。 10．（24-25高二下·河南许昌·期末）黄瓜是我们常见的瓜果之一，是中国各地夏季主要菜蔬之一。在冬季利用温室大棚生产反季节黄瓜经济效益显著，但易受冻害而造成减产。科研人员利用转基因技术培育出了抗冻黄瓜，过程如图所示。回答下列问题。 (1)构建基因表达载体时若选择限制酶BamH I切割抗冻蛋白基因，则需要选择限制酶______切割质粒，但其缺点是______(答出2点即可)。为避免此情况的出现，需要选择限制酶______切割抗冻蛋白基因，同时选择限制酶______切割质粒。 (2)图中将抗冻蛋白基因导入黄瓜细胞的方法是____。该过程会发生2次DNA分子之间的拼接，分别是_____。 (3)将抗冻蛋白基因导入黄瓜细胞后，需要进行______才能获得转基因黄瓜植株，该过程使用的培养基一般要添加蔗糖，其作用是______(答出2点即可)。 【答案】(1)Sau3AⅠ 易造成质粒和目的基因的自身环化以及反向连接 EcoRI和BamHⅠ Sau3AI和EcoRI (2)农杆菌转化法 将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上和插入目的基因的T­DNA拼接到受体细胞染色体DNA上 (3)植物组织培养 提供碳源、能源、调节渗透压 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1） 由图示可知，限制酶BamHⅠ和Sau3A Ⅰ切割DNA后会产生相同的黏性末端，若选择单一限制酶BamH Ⅰ切割抗冻蛋白基因，则需要选择限制酶Sau3A Ⅰ切割质粒才能实现二者的连接。用单一限制酶切割质粒和目的基因片段，易造成质粒和目的基因的自身环化以及反向连接，而双酶切可以避免以上情况的发生。因抗冻蛋白基因内部有Sau3A Ⅰ切割位点，故使用限制酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ切割含有抗冻蛋白基因的DNA片段。限制酶BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ切割DNA后会产生相同的黏性末端，需要使用限制酶Sau3A Ⅰ和EcoR Ⅰ切割质粒， （2）图中将抗冻蛋白基因导入黄瓜细胞的方法是农杆菌转化法。利用该方法获得转基因黄瓜细胞过程中会发生2次DNA分子之间的拼接，第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上，第二次拼接是将插入了目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体DNA上。 （3）将抗冻蛋白基因导入黄瓜细胞后，通过植物组织培养技术获得的转基因黄瓜植株，该过程的原理是植物细胞的全能性，该过程使用的培养基一般要添加蔗糖，蔗糖的作用是提供碳源、能源、调节渗透压，进而保证植物组织培养技术的正常进行。 11．（24-25高二下·河南信阳·期末）正常人体细胞内分解蛋白质会产生氨，氨在肝脏中转化为尿素，然后通过肾脏排出体外。人体细胞若缺乏氨甲酰磷酸合成酶1（CPS1），将无法完成该转化过程。CPS1缺乏症的患者致死率高达50%，存活个体也有严重后遗症。2025年有研究团队开发出了个体化CRISPR基因编辑疗法，经过安全性和有效性测试及伦理委员会的审核批准后，成功应用于是一名患该病的男婴。这一事件标志着人类首次真正实现了为单个病患量身定制的基因编辑治疗。 (1)为了诊断、靶点确认和疗效评估，在基因编辑前后，都需要对患者的所有基因进行测序，这些基因分布在____________（填细胞结构名称）中。 (2)检测发现，患者的两个CPS1基因中都出现了一个碱基对的替换，导致翻译提前终止，无法合成CPS1.若计划编辑患者的异常CPS1 基因，需要编辑_________（填器官名称）细胞的CPS1基因，理由是________。 (3)研究人员采用了经改造的CRISPR—Cas9系统，它能够直接将一个碱基精确地转换为另一个碱基（如上图所示）。SgRNA是一段人工合成的单链RNA，与CPS1基因中特定序列互补，能够精确地引导 nCas9进行切割。sgRNA序列长度不能过短，原因是_____。nCas9相当于基因工程中的限制酶，能够破坏待编辑序列的______（填化学键名称）。 (4)脂质纳米颗粒是将基因编辑工具送人细胞发挥作用的“运输车”，推测脂质纳米颗粒的作用还有_______（写出一个作用即可）。经过三次静脉注射后，患者已经健康到可以计划出院回家的程度，当然，还需要更长时间的随访以全面评估该疗法的长期疗效和安全性。 (5)假设对某成年女性患者进行上述基因编辑，使靶细胞内的CPS1基因恢复正常。该患者的后代体细胞中______（填“可能有”或“没有”）异常的CPS1基因。 【答案】(1)细胞核和线粒体 (2)肝脏 CPS1 在肝脏中催化氨转化为尿素，编辑肝脏细胞基因可恢复代谢功能 (3)短序列特异性差，易脱靶 磷酸二酯键 (4)保护基因编辑工具不被降解（或促进细胞摄取 ） (5)可能有 【分析】本题围绕 CRISPR 基因编辑治疗 CPS1 缺乏症展开，涉及基因分布、基因编辑靶点选择、CRISPR - Cas9 系统机制、纳米颗粒功能及生殖细胞遗传等知识，考查对基因编辑技术与细胞生物学、遗传学的综合理解，培养科学思维与知识应用能力。 【详解】（1）人体基因分布在细胞核(染色体)和线粒体中(核基因位于细胞核染色体，质基因位于线粒体)。 （2）需要编辑肝脏细胞的 CPS1 基因。理由：CPS1 的功能是在肝脏中催化氨转化为尿素（题干 “氨在肝脏中转化为尿素” ），肝脏是该代谢的关键器官，编辑肝脏细胞基因可恢复代谢功能。 （3）sgRNA 序列长度不能过短，原因是短序列特异性差，易与非靶序列结合，导致脱靶（保证精准识别 CPS1 基因特定序列）。nCas9 是限制酶，破坏 DNA 的磷酸二酯键（切割 DNA 骨架 ）。 （4）脂质纳米颗粒的作用还有保护基因编辑工具（如 sgRNA、nCas9 ）不被降解（避免被细胞内核酸酶、蛋白酶破坏 ），或促进细胞摄取基因编辑工具（增强递送效率 ）。 （5）基因编辑仅修复体细胞（如肝脏细胞 ）的 CPS1 基因，生殖细胞（卵细胞 ）未被编辑。后代体细胞的基因由生殖细胞遗传，若生殖细胞含异常 CPS1 基因，则后代体细胞可能有异常基因。 12．（24-25高二下·河南周口·期末）某团队欲将人生长激素基因(GH基因)导入大肠杆菌，通过基因工程大量制备该激素，操作流程如下，其中P1、P2为引物。已知质粒上EcoRI和PstI酶切位点之间短片段为10kb，回答下列问题： (1)构建GH基因重组质粒时，应选择的限制酶是___________，将构建好的重组质粒导入大肠杆菌前，常用___________处理大肠杆菌。 (2)将大肠杆菌接种到含四环素的培养基上进行培养，出现图1所示菌落，接种大肠杆菌的方法是___________，其中1号培养基没有菌落出现的原因可能是___________。 (3)采用PCR技术对2号、3号培养基中的大肠杆菌进行目的基因的筛选，利用P1、P2引物进行PCR，得到如图2所示电泳条带，___________号培养基是目的菌株，判断依据是___________。 (4)筛选得到的目的菌株经发酵获得的生长激素没有生物活性，原因是___________。 【答案】(1)EcoRI和PstI Ca2+（或CaCl2） (2)稀释涂布平板法 1号培养基中大肠杆菌未导入质粒 (3)3 GH基因26kb，质粒80kb，2号培养基PCR产物电泳条带接近80kb，说明只导入空质粒，3号培养基PCR产物电泳条带在100kb附近，说明导入了含有目的基因的重组质粒 (4)大肠杆菌不含内质网和高尔基体等细胞器，不能对生长激素（或GH）进行空间结构的加工修饰，因此生长激素（或GH）不具有生物活性 【分析】为避免目的基因与质粒的反向连接和自身环化，应选择质粒和目的基因上都存在的限制酶识别序列进行双酶切。 【详解】（1）为避免目的基因与质粒的反向连接和自身环化，应选择质粒和目的基因上都存在的限制酶识别序列进行双酶切，即选择EcoRI和PstI；将目的基因导入微生物细胞常用Ca2+处理。 （2）根据图1含四环素的培养基上菌落的生长状况可判断是用稀释涂布平板法对大肠杆菌进行接种；1号培养基没有大肠杆菌生长，表明大肠杆菌不含四环素抗性基因，应是未导入质粒所致。 （3）GH基因26kb，质粒80kb，2号培养基PCR产物电泳条带接近80kb，说明只导入空质粒，3号培养基PCR产物电泳条带在100kb附近，说明导入了含有目的基因的重组质粒，根据目的基因26kb和质粒80kb相加的大小与C对应的条带更接近，可判断3号培养基的大肠杆菌导入了重组质粒。 （4）大肠杆菌是原核生物，细胞中没有内质网和高尔基体等可对蛋白质进行空间结构加工的细胞器，所以筛选得到的目的菌株经发酵获得的生长激素没有生物活性。 13．（24-25高二下·河南濮阳·期末）MAP30蛋白存在于某些植物的果实和种子中。实验表明，MAP30蛋白具有抗肿瘤、抗菌和抗病毒等功能。现欲利用MAP30基因和质粒构建重组质粒，以大规模生产MAP30蛋白。图1是含MAP30基因的DNA片段，图2是农杆菌中的Ti质粒的结构示意图。图中SalⅠ、XbaⅠ、HindⅢ三种限制酶切割后产生的黏性末端不同。请回答下列问题： (1)构建重组质粒时，不能选择限制酶SalⅠ的原因是________；也不能同时选择XbaⅠ、HindⅢ进行双酶切，其原因是________（答出一点）。 (2)用XbaⅠ或HindⅢ将切割后的MAP30基因与Ti质粒用DNA连接酶连接，都可能会得到______种重组DNA。为筛选出含有目的基因的重组质粒，将连接产物导入农杆菌后，先在含______的培养基上培养，能生长的农杆菌可能含有_______（填质粒类型），还需进一步鉴定。 (3)若要判断重组质粒是否成功导入农杆菌，可先向农杆菌菌液中加入新鲜的液体培养基，并置于摇床上慢速培养一段时间，接着利用_____法将菌悬液接种至选择培养基上进行培养，最后挑取单菌落进行后续的鉴定。后续用该农杆菌侵染植物细胞，Ti质粒上的____会携带MAP30基因转移至植物细胞，并整合到___上。 (4)检测MAP30基因是否成功表达，在分子水平上可用_______技术。 【答案】(1)质粒中SalⅠ的切割位点不在T-DNA上，因此目的基因不能插入T-DNA序列 目的基因两端会形成HindⅢ的黏性末端，而质粒上有XbaⅠ、HindⅢ的黏性末端，不能插入质粒 (2)3 卡拉霉素 目的基因与质粒 (3)平板划线法和稀释涂布平板法 T-DNA 植物细胞染色体 (4)PCR 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）从图中看出，SalⅠ的切割位点不在T-DNA上，因此目的基因不能插入T-DNA序列。如果同时使用XbaⅠ和HindⅢ，HindⅢ在目的基因两端都有酶切位点，如果使用该酶，目的基因两端会形成HindⅢ的黏性末端，而质粒上有XbaⅠ、HindⅢ的黏性末端，不能插入质粒。 （2）用XbaⅠ或HindⅢ将切割后的MAP30基因与Ti质粒用DNA连接酶连接，由于形成了相同的黏性末端，因此可能形成目的基因-目的基因连接，质粒与质粒连接，目的基因和质粒连接共3种DNA分子，为筛选出含有目的基因的重组质粒，将连接产物导入农杆菌后，先在含卡拉霉素的培养基上培养，能生长的农杆菌可能含有目的基因与质粒相连的重组质粒。 （3）将菌悬液接种至选择培养基上进行培养，获得单菌落，可以利用平板划线法和稀释涂布平板法。Ti质粒上的T-DNA会携带MAP30基因转移至植物细胞，并整合到植物细胞染色体上。 （4）检测MAP30基因是否成功表达，在分子水平上可用PCR技术检测。 14．（24-25高二下·河南焦作·期末）为提高内源微生物降解石油烃的效率，研究者通过基因工程改造，将外源酶基因alm4和mdhA分别与质粒pHY-P43构建成重组载体后导入B．subtilisWB800枯草芽孢杆菌中获得基因工程菌，其中一个表达载体的部分结构如图1所示。回答下列问题： (1)构建重组质粒pHY-P43-almA和pHY-P43-mdhA的过程中需要使用的酶有_______（答出2种）。重组质粒中的氨苄青霉素抗性基因，其作用是_________。 (2)almA和mdhA都是分泌蛋白。B．subtilisWB800是将枯草芽孢杆菌B．subtilis168的8个胞外分泌蛋白酶基因敲除后获得的，敲除8个胞外分泌蛋白酶基因的目的是______。 (3)为鉴定基因工程菌是否转化成功，研究者对目的基因(almA和mdhA)进行了检测与鉴定，部分过程如下： ①目的基因转录产物的PCR检测：提取基因工程菌的总RNA，通过_____过程使其形成cDNA（一种单链DNA），然后根据_____的特定碱基序列设计特异性引物并进行PCR扩增，随后进行电泳，若结果是凝胶中出现______，则可初步说明目的基因在基因工程菌中成功转录。 ②个体水平上的鉴定：石油烃的主要成分是C12和C17，图2和图3是相关的实验结果，据图可得出的结论是______（答出2点）。 注：甲为对照，乙为B．subtilisWB800，丙为转入pHY-P43-almA的B．subtilisWB800，丁为转入pHY-P43-mdhA的B．subtilisWB800。 【答案】(1)限制酶和DNA连接酶 鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 (2)防止胞外分泌蛋白酶分解almA和mdhA (3)逆转录/反转录 目的基因（almA和mdhA） 电泳条带 alm4和mdhA都降解石油烃、almA的分解作用更强 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）在构建基因表达载体时需要是由限制酶和DNA连接酶。重组质粒中的氨苄青霉素抗性基因属于标记基因，其作用是是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 （2）根据酶的专一性，蛋白酶会分解蛋白质，almA和mdhA都是分泌蛋白，为防止胞外分泌蛋白酶分解almA和mdhA，因此在构建基因表达载体的时候需敲除8个胞外分泌蛋白酶基因。 （3）①取基因工程菌的总RNA，通过逆转录过程使其形成cDNA，再根据目的基因almA和mdhA的特定碱基序列设计特异性引物并进行PCR扩增，随后进行电泳，若结果是凝胶中出现电泳条带，则可初步说明目的基因在基因工程菌中成功转录。 ②石油烃的主要成分是C12和C17，培养基中C12和C17的浓度越低说明工程菌的分解能力越强。由图2和图三可知，丙组和丁组培养基中C12和C17都小于甲组和乙组，且丙组培养基中C12和C17的浓度最低，说明alm4和mdhA都降解石油烃，且almA的分解作用更强。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $