专题08 基因工程（天津专用）2026年高考生物二模分类汇编

**基本信息** 聚焦基因工程专题，汇编2026年和平区等多区二模非选择题，以反义DNA技术、基因定点突变等真实科研情境为载体，考查工具酶应用、载体构建及表达调控等核心能力。 **题型特征** |题型|题量/分值|知识覆盖|命题特色| |----|-----------|----------|----------| |非选择题|5题|基因工程工具酶（逆转录酶、限制酶）、载体构建（Ti质粒、融合基因）、转化筛选（农杆菌转化法、标记基因）、表达调控（反义基因、诱导型启动子）|情境具时代性（t-PA蛋白改造、Bt抗虫棉培育）；问题呈层次性（基础酶种类到实验方案设计）；突出科学思维（重叠延伸PCR引物设计分析）与探究实践（转基因鉴定实验设计）|

专题08基因工程 1.（2026·和平区·二模）乙烯具有促进果实成熟的作用，ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄细胞内参与合成乙烯的两个关键酶。可利用反义DNA技术（原理如图1）抑制这两个基因的表达，从而使番茄具有耐储存、宜运输的优点。图2为融合了ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因的反义基因表达载体的结构。 回答下列问题： （1）RT-PCR是将RNA分子逆转录为cDNA后在体外进行DNA扩增的技术。从番茄细胞中提取RNA，利用RT-PCR技术获取ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因，即利用RNA和PCR获取目的基因。该技术获取目的基因所需要的酶主要有逆转录酶和________。 （2）合成出的ACC氧化酶基因两端分别含有限制酶BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位点，ACC合成酶基因两端含有SacⅠ和XbaⅠ的酶切位点，用限制酶__________对上述两个基因进行切割后，再将它们拼接成融合基因，相应的Ti质粒和融合基因均使用限制酶________进行切割，以确保融合基因能够插入载体中。 （3）为了实现图1中反义基因的效果，应将融合基因反向插入启动子2A11的下游即可构成反义融合基因，这是因为：只有反向插入，____________________________________，从而抑制乙烯的合成。 （4）将图中表达载体与农杆菌菌液混合后，接种在含有卡那霉素的培养基中，可筛选出含有反义融合基因的农杆菌，再利用农杆菌转化法获得转基因番茄。2A11启动子和反义融合基因都应该位于T-DNA片段内，原因是____________________________________________________________________________。 （5）研究人员尝试从个体水平鉴定转基因是否成功，请设计实验方案并预测实验结果：______________________________________。 2.（2026·河东区·二模）M蛋白和生物的“记忆形成”过程紧密相关。为了研究M蛋白的具体作用，科研人员培育出了能人工控制M基因表达的实验小鼠。 该实验小鼠的核心设计思路：利用小鼠体内特异性表达的Cre重组酶，敲除两个LoxP位点之间的基因序列；借助小鼠体内表达的蛋白A，激活能启动基因表达的诱导型T启动子。同时使用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（记作M-GFP），导入小鼠后既能恢复被敲除的M基因功能、表达正常M蛋白，又能通过绿色荧光直观追踪M蛋白的表达位置和情况。 该实验的注意事项：小鼠自身的内源M基因会干扰实验，只有纯合子floxM/floxM才能保证所有细胞里的M基因都能被Cre重组酶精准“剪掉”，达到人工控制外源M基因的目的。 注：基因型A/＋表示A基因只整合到小鼠细胞同源染色体的其中一条上；两端链接LoxP位点的M基因记为floxM。 补充下列过程： （1）基因工程与载体构建 利用PCR技术扩增基因片段①和②时，通常会在引物的一端添加限制酶识别序列，该序列应添加在引物的________（填“5′端”或“3′端”）。 Ⅰ.构建载体1时，为了阻断A基因的表达：从转录水平考虑，可以在两个LoxP位点中间连接________的片段；从翻译水平考虑，可以在两个LoxP位点中间连接________的片段。 Ⅱ.为了鉴定载体2是否构建成功，需要用限制酶切割载体后再进行________检测。 （2）胚胎干细胞培养 培养小鼠胚胎干细胞的过程中需要定期更换培养液，这样做的目的是______________________________________（至少答出2点）。 （3）遗传学杂交与基因型分析 为了快速培育出同时拥有4对目标基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，将Cre/＋A/＋小鼠、M-GFP/＋floxM/＋小鼠分别与含floxM/floxM基因的纯合小鼠杂交，子代再杂交一次。最终筛选得到的实验模型小鼠的基因型为________________________________。 （4）基因表达的人工调控 为了实现M基因的表达可控，在给实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A蛋白的四环素。与未添加四环素相比，添加四环素会________（填“促进”或“抑制”，后同）A蛋白活性，进而________T启动子的活性，最终阻止____________的表达，实现人工“关闭”，与未添加四环素时该基因正常表达形成对照，达到调控效果。 3.（2026·河北区·二模）t-PA蛋白能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的t-PA会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA蛋白第84位的氨基酸替换后，能显著降低出血副作用。请回答下列问题： （1）改造t-PA基因序列可以利用如图1所示的基因定点突变技术。图1表示重叠延伸PCR技术，其中第1对引物是指________________，两对引物参与的PCR过程不能在同一反应系统中进行，原因是_________________________________。不选择产物A进一步延伸的原因是_________________________。 （2）据图1可知，重叠延伸后的PCR需要的引物是________________，引物的作用是________________。若扩增图中序列时引物选择正确，PCR操作过程没有问题，但对产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，请分析出现此情况的原因可能是___________________________。 （3）若获得的t-PA突变基因如图2所示，那么质粒pCLY11需用限制酶________________切开，才能与t-PA突变基因高效连接。mlacZ表达产物会把细胞染为蓝色，否则为白色。将转化后的大肠杆菌接种在含有________________的培养基上进行筛选，含重组质粒的大肠杆菌的菌落呈________________颜色。 4.（2026·部分区·二模）苏云金杆菌产生的Bt毒素蛋白具有杀虫能力，科研人员利用由Bt毒素蛋白基因（Bt基因）改造而来的目的基因，成功培育出转基因抗虫棉。目的基因的改造过程如图所示，数字表示基因序列中对应的核苷酸序号，其中穿梭质粒载体由天然Ti质粒改造而来，含T-DNA但不含Vir基因（该基因可表达出限制酶从而促进T-DNA转移）。 注：F1～F3和R1～R3均表示引物。T-DNA-LB表示左边界，T-DNA-RB表示右边界。Ori表示复制原点，KanR表示卡那霉素抗性基因，HygBR表示潮霉素B抗性基因。 回答下列问题： （1）从苏云金杆菌中提取DNA操作中，加入的酒精所起作用是____________和沉淀DNA。以提取的DNA作模板，选用图中的引物____________进行PCR，可扩增Bt基因。 （2）改造目的基因时，一方面利用特定酶断开____________键，去除与毒性无关的部分序列，以减小分子量，便于将重组DNA导入受体细胞；另一方面，由于细菌和棉花对密码子的偏好有所不同，还需人工合成部分基因序列，以进一步得到________偏好的密码子序列，从而提高基因表达的效率。 （3）与直接导入同时含有T-DNA和Vir基因的Ti质粒相比，将穿梭质粒和辅助质粒（含Vir基因但不含T-DNA）分别导入农杆菌的优点是______________________________________。 （4）将转化的农杆菌与棉花叶片共培养一段时间后，向培养基中加入____________可初步筛选得到转化的棉花愈伤组织。通常会出现较多的假阳性植株，为检测目的基因是否成功导入植株，可提取总DNA作模板进行PCR，则选用的引物应是__________。 5.（2026·十二区重点校·一模）某研究小组为研究玉米中Z基因的作用，利用Gibson无缝克隆技术构建了hpRNA表达载体。在受体细胞中，hpRNA表达载体转录产生的hpRNA可诱导Z基因的mRNA特异性降解，进而抑制Z基因表达。 （1）Gibson无缝克隆技术原理如图1所示，在T5核酸外切酶的作用下DNA片段产生黏性末端，两个DNA片段相应互补序列通过氢键结合，然后通过_______酶的作用补全图示缺口部分，再通过_______酶的作用最终获得重组DNA。 （2）为了获得图2中所示的线性化质粒，进行PCR时应该选择的引物组合是_____，在引物的5′端需加入与_______相同的片段。 （3）Gibson无缝克隆技术要求载体插入位点的两端与目的基因的两端有至少15bp的相同序列（不具有限制酶识别序列的特性），图2中序列3和序列4应分别与______和_______相同。线性化质粒两端都是序列1，在Gibson无缝克隆过程中是否会发生自身环化，原因是：_____________。 （4）研究人员将hpRNA表达载体导入到玉米细胞获得转基因玉米植株，取适量一定浓度的_________溶液均匀涂抹在转基因玉米的叶片上，一段时间后叶片颜色_______，说明hpRNA表达载体整合到玉米染色体DNA上。 （5）为了检测hpRNA表达载体是否能够抑制Z基因的表达，对Z基因的表达量进行了实时荧光PCR定量检测，提取转基因玉米相关组织细胞中的_____制作实时荧光PCR的模板，如果转基因玉米的Ct值（PCR产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）______野生型玉米，则说明hpRNA表达载体成功发挥了作用。 1 / 6 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题08基因工程 1.（1）耐高温的DNA聚合酶（或TaqDNA聚合酶） （2）XbaⅠ　BamHⅠ和SacⅠ （3）转录出的mRNA才能与目的基因转录出的mRNA形成互补双链RNA，使目的基因不能表达出ACC氧化酶和ACC合成酶 （4）T-DNA可以整合到植物细胞的染色体DNA上 （5）取转基因番茄和非转基因番茄，检测二者的乙烯含量（或在同等条件下的成熟程度），若发现转基因番茄的乙烯含量更低（或成熟程度更低），说明转基因成功 2.（1）5′端 Ⅰ.终止子　能转录成终止密码子的DNA片段 Ⅱ.琼脂糖凝胶电泳 （2）补充胚胎干细胞生长所需的营养物质和生长因子；及时清除细胞代谢产生的废弃物，防止其积累对细胞造成毒害；维持培养液适宜的pH和渗透压 （3）Cre/＋A/＋M-GFP/＋floxM/floxM （4）抑制　抑制　M基因（或M-GFP） 3.（1）突变引物FP2和通用引物RP2　突变引物FP2和突变引物RP1之间能碱基互补配对，会造成引物形成双链，不能与模板链结合，降低扩增的效率　DNA子链只能从引物的3’端延伸，与产物A的方向相反 （2）通用引物FP1和通用引物RP2　使DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸　退火（复性）温度过低、引物特异性不高 （3）XmaⅠ、BglⅡ　新霉素　菌落呈白色 4.（1）溶解某些蛋白质　F1和R3 （2）磷酸二酯　棉花 （3）质粒小，转化成功率高 （4）潮霉素B　F3和R2 5.（1）DNA聚合酶　DNA连接酶 （2）引物1和引物4　序列1 （3）序列2　序列2　不会，右侧的序列1是倒置连接，T5外切酶切割后形成的序列与左侧序列1切割后形成的序列不互补 （4）潮霉素　无明显变化 （5）mRNA（RNA，总RNA）　高于（大于） 1 / 2 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题08基因工程 1.（2026·和平区·二模）乙烯具有促进果实成熟的作用，ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄细胞内参与合成乙烯的两个关键酶。可利用反义DNA技术（原理如图1）抑制这两个基因的表达，从而使番茄具有耐储存、宜运输的优点。图2为融合了ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因的反义基因表达载体的结构。 回答下列问题： （1）RT-PCR是将RNA分子逆转录为cDNA后在体外进行DNA扩增的技术。从番茄细胞中提取RNA，利用RT-PCR技术获取ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因，即利用RNA和PCR获取目的基因。该技术获取目的基因所需要的酶主要有逆转录酶和________。 （2）合成出的ACC氧化酶基因两端分别含有限制酶BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位点，ACC合成酶基因两端含有SacⅠ和XbaⅠ的酶切位点，用限制酶__________对上述两个基因进行切割后，再将它们拼接成融合基因，相应的Ti质粒和融合基因均使用限制酶________进行切割，以确保融合基因能够插入载体中。 （3）为了实现图1中反义基因的效果，应将融合基因反向插入启动子2A11的下游即可构成反义融合基因，这是因为：只有反向插入，____________________________________，从而抑制乙烯的合成。 （4）将图中表达载体与农杆菌菌液混合后，接种在含有卡那霉素的培养基中，可筛选出含有反义融合基因的农杆菌，再利用农杆菌转化法获得转基因番茄。2A11启动子和反义融合基因都应该位于T-DNA片段内，原因是____________________________________________________________________________。 （5）研究人员尝试从个体水平鉴定转基因是否成功，请设计实验方案并预测实验结果：______________________________________。 【答案】（1）耐高温的DNA聚合酶（或TaqDNA聚合酶） （2）XbaⅠ　BamHⅠ和SacⅠ （3）转录出的mRNA才能与目的基因转录出的mRNA形成互补双链RNA，使目的基因不能表达出ACC氧化酶和ACC合成酶 （4）T-DNA可以整合到植物细胞的染色体DNA上 （5）取转基因番茄和非转基因番茄，检测二者的乙烯含量（或在同等条件下的成熟程度），若发现转基因番茄的乙烯含量更低（或成熟程度更低），说明转基因成功 【解析】（1）参考PCR技术所需的酶可知，RT-PCR技术除了需要逆转录酶外，还需要耐高温的DNA聚合酶。 （2）ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因都含有XbaⅠ的酶切位点，所以应该用XbaⅠ对其进行切割，再将它们拼接为融合基因。融合后的基因含有BamHⅠ和SacⅠ的酶切位点，所以应该用这两种酶切割融合基因和Ti质粒。 （3）结合题目所给信息可知，番茄细胞内原本就存在ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因，正常情况下会转录出相应的mRNA并进行后续表达过程。利用本题所述的方法将融合基因导入番茄细胞的染色体上之后，番茄不仅具有ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因，还有二者的融合基因。启动子是驱动转录的DNA片段，将融合基因反向插入启动子2A11的下游后，转录出的片段是反义RNA，结合题图1中的原理分析可知，这一反义RNA可以与番茄细胞内正常的ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因转录出的mRNA结合，形成互补双链RNA，于是已知ACC氧化酶和ACC合成酶的合成，从而抑制乙烯的合成。 （4）根据农杆菌转化法的原理可知，转化时，只有T-DNA片段才能整合到植物的染色体上，T-DNA片段外的基因无法整合，所以2A11启动子和反义融合基因都应该位于T-DNA片段内。 （5）若要从个体水平鉴定转基因是否成功，应该对番茄果实本身进行检测：可对比转基因番茄和非转基因番茄中乙烯的含量，若发现转基因番茄的乙烯含量更低，说明转基因成功；同时，乙烯具有促进果实成熟的作用，所以也可比较这两种番茄在相同条件下的成熟程度，若转基因番茄成熟程度更低，说明转基因成功。 2.（2026·河东区·二模）M蛋白和生物的“记忆形成”过程紧密相关。为了研究M蛋白的具体作用，科研人员培育出了能人工控制M基因表达的实验小鼠。 该实验小鼠的核心设计思路：利用小鼠体内特异性表达的Cre重组酶，敲除两个LoxP位点之间的基因序列；借助小鼠体内表达的蛋白A，激活能启动基因表达的诱导型T启动子。同时使用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（记作M-GFP），导入小鼠后既能恢复被敲除的M基因功能、表达正常M蛋白，又能通过绿色荧光直观追踪M蛋白的表达位置和情况。 该实验的注意事项：小鼠自身的内源M基因会干扰实验，只有纯合子floxM/floxM才能保证所有细胞里的M基因都能被Cre重组酶精准“剪掉”，达到人工控制外源M基因的目的。 注：基因型A/＋表示A基因只整合到小鼠细胞同源染色体的其中一条上；两端链接LoxP位点的M基因记为floxM。 补充下列过程： （1）基因工程与载体构建 利用PCR技术扩增基因片段①和②时，通常会在引物的一端添加限制酶识别序列，该序列应添加在引物的________（填“5′端”或“3′端”）。 Ⅰ.构建载体1时，为了阻断A基因的表达：从转录水平考虑，可以在两个LoxP位点中间连接________的片段；从翻译水平考虑，可以在两个LoxP位点中间连接________的片段。 Ⅱ.为了鉴定载体2是否构建成功，需要用限制酶切割载体后再进行________检测。 （2）胚胎干细胞培养 培养小鼠胚胎干细胞的过程中需要定期更换培养液，这样做的目的是______________________________________（至少答出2点）。 （3）遗传学杂交与基因型分析 为了快速培育出同时拥有4对目标基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，将Cre/＋A/＋小鼠、M-GFP/＋floxM/＋小鼠分别与含floxM/floxM基因的纯合小鼠杂交，子代再杂交一次。最终筛选得到的实验模型小鼠的基因型为________________________________。 （4）基因表达的人工调控 为了实现M基因的表达可控，在给实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A蛋白的四环素。与未添加四环素相比，添加四环素会________（填“促进”或“抑制”，后同）A蛋白活性，进而________T启动子的活性，最终阻止____________的表达，实现人工“关闭”，与未添加四环素时该基因正常表达形成对照，达到调控效果。 【答案】（1）5′端 Ⅰ.终止子　能转录成终止密码子的DNA片段 Ⅱ.琼脂糖凝胶电泳 （2）补充胚胎干细胞生长所需的营养物质和生长因子；及时清除细胞代谢产生的废弃物，防止其积累对细胞造成毒害；维持培养液适宜的pH和渗透压 （3）Cre/＋A/＋M-GFP/＋floxM/floxM （4）抑制　抑制　M基因（或M-GFP） 【解析】（1）应将限制酶的识别序列添加到引物的5′端。Ⅰ.基因的表达过程需要启动子、终止子、起始密码子和终止密码子等参与，其中终止子可以终止转录过程，终止密码子可以终止翻译过程，所以若要阻断载体1中A基因的表达：从转录水平考虑应阻止A基因被转录，可以在两个LoxP位点之间连接一个终止子片段；从翻译水平考虑应阻止A基因被翻译，可以在两个LoxP位点之间连接一个能转录出终止密码子的DNA片段。Ⅱ.若要鉴定载体2是否构建成功，需要先用限制酶切割载体，再进行琼脂糖凝胶电泳检测。 （2）培养动物细胞的过程中需要定期更换培养液，不仅可以补充胚胎干细胞生长所需的营养物质和生长因子，还能及时清除细胞代谢产生的废弃物，防止其积累对细胞造成毒害，此外还可维持培养液适宜的pH和渗透压。 （3）实验模型小鼠需要同时拥有Cre基因、A基因、M-GPF基因，并且由题干所给信息可知“只有纯合子floxM/floxM才能……达到人工控制外源M基因的目的”，所以小鼠需要floxM基因纯合，因此小鼠的基因型应为Cre/＋A/＋M-GFP/＋floxM/floxM。 （4）由题干信息可知，A蛋白可以激活T启动子，而T启动子可以启动相应基因的表达，参考后文提到“最终实现人工关闭”可推测，添加四环素会抑制A蛋白的活性，进而抑制T启动子的活性。题干信息提到该实验通过绿色荧光直观追踪M蛋白的表达位置和情况，而绿色荧光与M-GFP基因有关，所以四环素最终阻止的是M-GFP基因的表达，也就是人工阻止绿色荧光的产生，从而与M-GFP基因正常表达的小鼠形成对照。 3.（2026·河北区·二模）t-PA蛋白能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的t-PA会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA蛋白第84位的氨基酸替换后，能显著降低出血副作用。请回答下列问题： （1）改造t-PA基因序列可以利用如图1所示的基因定点突变技术。图1表示重叠延伸PCR技术，其中第1对引物是指________________，两对引物参与的PCR过程不能在同一反应系统中进行，原因是_________________________________。不选择产物A进一步延伸的原因是_________________________。 （2）据图1可知，重叠延伸后的PCR需要的引物是________________，引物的作用是________________。若扩增图中序列时引物选择正确，PCR操作过程没有问题，但对产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，请分析出现此情况的原因可能是___________________________。 （3）若获得的t-PA突变基因如图2所示，那么质粒pCLY11需用限制酶________________切开，才能与t-PA突变基因高效连接。mlacZ表达产物会把细胞染为蓝色，否则为白色。将转化后的大肠杆菌接种在含有________________的培养基上进行筛选，含重组质粒的大肠杆菌的菌落呈________________颜色。 【答案】（1）突变引物FP2和通用引物RP2　突变引物FP2和突变引物RP1之间能碱基互补配对，会造成引物形成双链，不能与模板链结合，降低扩增的效率　DNA子链只能从引物的3’端延伸，与产物A的方向相反 （2）通用引物FP1和通用引物RP2　使DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸　退火（复性）温度过低、引物特异性不高 （3）XmaⅠ、BglⅡ　新霉素　菌落呈白色 【解析】（1）改造t-PA基因序列可以利用如图1所示的基因定点突变技术。图1表示重叠延伸PCR技术，第1对引物扩增右边一段DNA且对中间部分进行突变，因此第一对引物为突变引物FP2和通用引物RP2；突变引物FP2和突变引物RP1之间能碱基互补配对，会造成引物形成双链，不能与模板链结合，降低扩增的效率，所以两对引物参与的PCR过程不能在同一反应系统中进行；DNA子链只能从引物的3’端延伸，与产物A的方向相反，因此不选择产物A进一步延伸。 （2）据图1可知，重叠延伸后的PCR需要的引物是通用引物FP1和通用引物RP2；DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3'端开始延伸DNA链，因此引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。若扩增图中序列时引物选择正确，PCR操作过程没有问题，但对产物进行电泳时，出现非目的序列产物的原因有：引物特异性不强、两引物之间碱基互补配对（形成引物二聚体）、复性温度过低、DNA模板出现污染等。 （3）根据图中目的基因两端的黏性末端（5'-CCGG-3'和5'-GATC-3'）以及各种限制酶的切割位点可知，在构建重组质粒时，选用限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割质粒，才能与目的基因t-PA改良基因高效连接。在构建重组质粒时，其中的新霉素抗性基因没有被破坏，因此可以根据对新霉素的抗性将成功导入质粒的大肠杆菌筛选出来，即新霉素抗性基因为标记基因，作用是便于筛选出成功导入质粒（普通质粒和重组质粒）的大肠杆菌。培养基中形成菌落的受体细胞应该包含两种类型：一类是导入普通质粒的大肠杆菌，这类大肠杆菌细胞因为含有mlacZ基因而呈蓝色；另一类是导入重组质粒的大肠杆菌，因为其中的mlacZ基因在构建重组质粒时被破坏，则该细菌表现为白色。因此需选择呈白色的菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育出能生产改良t-PA蛋白的工程菌。 4.（2026·部分区·二模）苏云金杆菌产生的Bt毒素蛋白具有杀虫能力，科研人员利用由Bt毒素蛋白基因（Bt基因）改造而来的目的基因，成功培育出转基因抗虫棉。目的基因的改造过程如图所示，数字表示基因序列中对应的核苷酸序号，其中穿梭质粒载体由天然Ti质粒改造而来，含T-DNA但不含Vir基因（该基因可表达出限制酶从而促进T-DNA转移）。 注：F1～F3和R1～R3均表示引物。T-DNA-LB表示左边界，T-DNA-RB表示右边界。Ori表示复制原点，KanR表示卡那霉素抗性基因，HygBR表示潮霉素B抗性基因。 回答下列问题： （1）从苏云金杆菌中提取DNA操作中，加入的酒精所起作用是____________和沉淀DNA。以提取的DNA作模板，选用图中的引物____________进行PCR，可扩增Bt基因。 （2）改造目的基因时，一方面利用特定酶断开____________键，去除与毒性无关的部分序列，以减小分子量，便于将重组DNA导入受体细胞；另一方面，由于细菌和棉花对密码子的偏好有所不同，还需人工合成部分基因序列，以进一步得到________偏好的密码子序列，从而提高基因表达的效率。 （3）与直接导入同时含有T-DNA和Vir基因的Ti质粒相比，将穿梭质粒和辅助质粒（含Vir基因但不含T-DNA）分别导入农杆菌的优点是______________________________________。 （4）将转化的农杆菌与棉花叶片共培养一段时间后，向培养基中加入____________可初步筛选得到转化的棉花愈伤组织。通常会出现较多的假阳性植株，为检测目的基因是否成功导入植株，可提取总DNA作模板进行PCR，则选用的引物应是__________。 【答案】（1）溶解某些蛋白质　F1和R3 （2）磷酸二酯　棉花 （3）质粒小，转化成功率高 （4）潮霉素B　F3和R2 【解析】（1）提取DNA时，酒精可用于溶解蛋白质和沉淀DNA。由题图可知，Bt基因包括与毒性有关的片段和与毒性无关的片段，其左端（1号核苷酸）用F1作为引物，右端（3540号核苷酸）用R3作为引物。 （2）若要去除DNA序列，应断开核酸链中的磷酸二酯键。由于实验目的是让Bt基因在棉花中表达出来，所以应该添加棉花偏好的密码子序列。 （3）结合题目所给信息可知，穿梭质粒含T-DNA但不含Vir基因，辅助质粒含Vir基因但不含T-DNA，这两种质粒的DNA序列长度均小于同时含有T-DNA和Vir基因的Ti质粒，所以将穿梭质粒和辅助质粒分别导入农杆菌的优点是质粒小，转化成功率高。 （4）穿梭质粒含潮霉素B抗性基因，若棉花愈伤组织已转化成功，则具有潮霉素B抗性，所以可向培养基中加入潮霉素B，筛选得到转化的棉花愈伤组织。由题图可知，重组质粒含有Bt基因中1─1362这一段基因序列，对应的引物是F3和R2，所以若要检测目的基因是否成功导入植株，在PCR时应该选用F3和R2作为引物。 5.（2026·十二区重点校·一模）某研究小组为研究玉米中Z基因的作用，利用Gibson无缝克隆技术构建了hpRNA表达载体。在受体细胞中，hpRNA表达载体转录产生的hpRNA可诱导Z基因的mRNA特异性降解，进而抑制Z基因表达。 （1）Gibson无缝克隆技术原理如图1所示，在T5核酸外切酶的作用下DNA片段产生黏性末端，两个DNA片段相应互补序列通过氢键结合，然后通过_______酶的作用补全图示缺口部分，再通过_______酶的作用最终获得重组DNA。 （2）为了获得图2中所示的线性化质粒，进行PCR时应该选择的引物组合是_____，在引物的5′端需加入与_______相同的片段。 （3）Gibson无缝克隆技术要求载体插入位点的两端与目的基因的两端有至少15bp的相同序列（不具有限制酶识别序列的特性），图2中序列3和序列4应分别与______和_______相同。线性化质粒两端都是序列1，在Gibson无缝克隆过程中是否会发生自身环化，原因是：_____________。 （4）研究人员将hpRNA表达载体导入到玉米细胞获得转基因玉米植株，取适量一定浓度的_________溶液均匀涂抹在转基因玉米的叶片上，一段时间后叶片颜色_______，说明hpRNA表达载体整合到玉米染色体DNA上。 （5）为了检测hpRNA表达载体是否能够抑制Z基因的表达，对Z基因的表达量进行了实时荧光PCR定量检测，提取转基因玉米相关组织细胞中的_____制作实时荧光PCR的模板，如果转基因玉米的Ct值（PCR产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）______野生型玉米，则说明hpRNA表达载体成功发挥了作用。 【答案】（1）DNA聚合酶　DNA连接酶 （2）引物1和引物4　序列1 （3）序列2　序列2　不会，右侧的序列1是倒置连接，T5外切酶切割后形成的序列与左侧序列1切割后形成的序列不互补 （4）潮霉素　无明显变化 （5）mRNA（RNA，总RNA）　高于（大于） 【解析】（1）Gibson无缝克隆技术原理如图1所示，在T5核酸外切酶的作用下DNA片段产生黏性末端，两个DNA片段相应互补序列通过氢键结合，然后通过DNA聚合酶实现子链延伸，补全图示缺口部分，再通过DNA连接酶的作用将片段之间的磷酸二酯键连接起来，最终获得重组DNA。 （2）为了获得图2中所示的线性化质粒，根据引物的方向可知，进行PCR时应该选择的引物组合是引物1和引物4，同时需要在两种引物的5′端需加入与序列1相同的片段，进而获得图示的线性化质粒。 （3）Gibson无缝克隆技术要求载体插入位点的两端与目的基因的两端有至少15bp的相同序列，结合图2中重组质粒中相关基因的顺序可知，图2中序列3和序列4应均需要与序列2相同，进而可以实现Z基因片段的正向和反向链接。线性化质粒两端都是序列1，但在Gibson无缝克隆过程中不会发生自身环化，这是因为右侧的序列1是倒置连接，T5外切酶切割后形成的序列与左侧序列1切割后形成的序列不互补，因而不能实现自连。 （4）研究人员将hpRNA表达载体导入到玉米细胞获得转基因玉米植株，取适量一定浓度的潮霉素溶液均匀涂抹在转基因玉米的叶片上，一段时间后叶片颜色无明显变化，因为重组质粒中潮霉素抗性基因，因而会抵消潮霉素抑制叶绿素合成的作用，因而叶片表现为无明显变化，说明hpRNA表达载体整合到玉米染色体DNA上。 （5）为了检测hpRNA表达载体是否能够抑制Z基因的表达，对Z基因的表达量进行了实时荧光PCR定量检测，提取转基因玉米相关组织细胞中的mRNA（RNA，总RNA）通过逆转录过程制作实时荧光PCR的模板，如果转基因玉米的Ct值（PCR产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）大于野生型玉米，则说明hpRNA表达载体成功发挥了作用，表现为hpRNA表达载体转录产生的hpRNA可诱导Z基因的mRNA特异性降解，因而RNA含量少，相应的Ct值变大。 1 / 10 学科网（北京）股份有限公司 $