3.2 基因工程的基本操作程序（第2课时）课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

该高中生物学课件聚焦基因工程中PCR扩增与琼脂糖凝胶电泳鉴定，通过探究实践活动衔接基因工程基本操作程序，以实验原理、材料用具、步骤及问题解答为支架，构建“扩增-鉴定”完整实践链条。 其亮点在于以科学探究为主线，融合实验原理分析（科学思维）、操作规范（态度责任）和问题诊断（探究实践），如设置PCR失败原因分析、电泳条带解读等问题，培养学生实验设计与分析能力，帮助教师高效开展实践教学，提升学生核心素养。

第3章 基因工程 第2节 基因工程的基本操作程序 （第2课时） ①PCR利用了 原理，通过调节 来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。 【探究·实践一】利用PCR在体外进行DNA片段扩增 1. 实验原理 变性 90˚C 延伸 72˚C 复性 50˚C PCR(扩增)仪 DNA的热变性 温度 ②PCR扩增DNA片段还利用了 , 的原理。一次PCR一般要经历 次循环。 DNA 半保留复制 30 【探究·实践一】利用PCR在体外进行DNA片段扩增 2. 材料用具 PCR仪 1 微量离心管 2 微量移液器 4 一次性 吸液枪头 5 离心机 3 自动控温，实现DNA的扩增 实际上是进行PCR反应的场所 分离组分 微量移液器每吸取一种试剂后，需更换枪头 用于向微量离心管转移PCR配方中的液体 调节旋钮 推动杆 体积刻度 吸液杆 枪头 卸枪头 按钮 【探究·实践一】利用PCR在体外进行DNA片段扩增 2. 材料用具 10倍浓缩的扩增缓冲液 5 μL 20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1 μL 20 μmol/L的引物Ⅰ 2.5 μL 20 μmol/L的引物Ⅱ 2.5 μL H2O 28～33 μL 1～5 U/μL的Taq DNA聚合酶 1～2 U 模板DNA 5～10 μL 总体积 50 μL PCR反应体系的配方 6 注：模板DNA的用量为1gp～1μg ①酶和缓冲液要在冰块上缓慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。 ②实验所需材料可以直接从公司购买，酶和缓冲液一般分装成小份，避免反复融化导致活性降低甚至失活。 【探究·实践一】利用PCR在体外进行DNA片段扩增 3. 方法步骤 (1)加样： 用微量移液器按照右栏中的配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。 (2)离心： 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min 【探究·实践一】利用PCR在体外进行DNA片段扩增 3. 方法步骤 (3)反应： 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 1. 预变性的目的是什么? 使DNA充分变性，双链打开，以利于引物更好地和模板结合 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min 【探究·实践一】利用PCR在体外进行DNA片段扩增 3. 方法步骤 (3)反应： 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 2. 为什么最后1次变性和延伸时间都延长了？ Taq DNA聚合酶活性会随着循环次数增加而下降。在每一轮循环中，部分片段可能没有完全延伸完，Taq DNA聚合酶就脱落了。最后1次变性、延伸时间延长，让这些DNA打开，重新充分延伸。 【探究·实践二】利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR的产物 1. 实验原理 ①电泳：DNA分子具有 ，在一定的 下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动，这个过程就是电泳。 可解离的基团 pH 相反 一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带负电荷，在电场中DNA便向 泳动。 正极 磷酸电离形成的磷酸基团带负电 3. 如何鉴定PCR的产物？ 琼脂糖凝胶电泳 ③在凝胶中DNA分子的迁移速率与 、 和 等有关。 【探究·实践二】利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR的产物 1. 实验原理 ②PCR的产物一般通过 , 来鉴定。 琼脂糖凝胶 电泳 凝胶的浓度 电极 电极 缓冲液 电泳槽 琼脂糖 电泳胶 电极 DNA分子的大小 构象 DNA琼脂糖凝胶 琼脂糖的微结构 ④核酸染色剂： 【探究·实践二】利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR的产物 1. 实验原理 常用的核酸染色剂有EB（溴化乙锭）、GoldView等，EB能插入DNA分子中的碱基对之间，导致EB与DNA结合。嵌入核酸碱基间的EB能吸收300nm波长的紫外光，发出可见荧光。其荧光强度与DNA分子的含量成正比。 ⑤标准参照物（Marker）： 【探究·实践二】利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR的产物 1. 实验原理 DNA Marker是 的片段，在实验时和样本DNA同时进行凝胶电泳，通过对比两者的迁移速率，可以大致估计 , 。 已知的DNA分子大小 样本DNA 的大小 【探究·实践二】利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR的产物 2. 实验器材 琼脂糖凝胶电泳装置 【探究·实践二】利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR的产物 3. 方法步骤 ①熔化： 电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 制备凝胶 进行电泳 观察鉴定 【探究·实践二】利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR的产物 3. 方法步骤 ②倒模： 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 ③凝固： 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 制备凝胶 进行电泳 观察鉴定 【探究·实践二】利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR的产物 3. 方法步骤 ①加液： 将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 制备凝胶 进行电泳 观察鉴定 【探究·实践二】利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR的产物 3. 方法步骤 ②加样： 扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。 制备凝胶 进行电泳 观察鉴定 16 【探究·实践二】利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR的产物 3. 方法步骤 ③电泳： 制备凝胶 进行电泳 观察鉴定 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 17 【探究·实践二】利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR的产物 3. 方法步骤 制备凝胶 进行电泳 观察鉴定 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 Q1：PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前应如何处理？ 【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定 为避免外源DNA等因素的污染，这些材料用具必须进行高压灭菌处理 一定要戴好一次性手套 Q2：在进行整个实验操作过程中，操作者的手要进行什么处理？ 一条条带（目的基因片段） Q3：本实验进行电泳鉴定的结果应该是几条条带？ 【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定 750bp Q4：如图所示，该片段大小约为 。 Q5：判断成功扩增出DNA片段的依据是什么？ 可以通过在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。 0次 12次 12次 30次 30次 Marker 【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定 Q6：进行电泳鉴定的结果是只有Marker具有条带，为什么？ 目的基因扩增不成功 Q7：目的基因扩增不成功，可能有哪些原因？ ①漏加了PCR的反应成分； ②各反应成分的用量不当； ③PCR程序设置不当； ④Taq DNA聚合酶失活； ⑤变性时温度低，变性时间短，模板DNA链未打开 ①引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体； 【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定 Q8：进行电泳鉴定的结果是不止一条条带，为什么？ 出现非特异性扩增带 Q9：出现非特异性扩增带，可能有哪些原因？ ②复性时的温度过低，引物随机连接到非目的基因片段； ③DNA聚合酶的质量不好 课堂小测 4、关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物的实验，下列叙述正确的是（ ） A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C. 在同一电场作用下，DNA 片段越长，向负极迁移速率越快 D. 琼脂糖凝胶中的 DNA分子可在紫灯下被检测出来 A 课堂小测 5、构建基因表达载体是基因工程的核心步骤。可通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段长度，初步判断基因表达载体是否构建成功。下图是用限制酶完全酶切后（不考虑相同 DNA 之间的连接和目的基因的自身环化)的电泳结果。下列叙述错误的是（ ） A. 琼脂糖凝胶中的DNA分子可以在特定波长的紫外灯照射下被检测出来 B. 酶切后，相同条件下 DNA分子越小，在凝胶中的迁移速率越快 C. 泳道1为单酶切空载体后的产物， 泳道2为单酶切重组载体后的产物 D. 泳道3为双酶切重组载体后的产物， 且目的基因与载体正确连接 D Lavf58.29.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Lavf58.20.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $