3.2基因工程的基本操作程序（第2课时）2025-2026学年高二生物同步备课优质课件（人教版2019选择性必修3）

第2节 基因工程的基本操作程序 第3章 基因工程 1 教学目标 TEACHING OBJECTIVES 学习目标： 1.阐明基因工程的原理和基本操作程序。 2.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。 重难点： 1.基因工程基本操作程序的四个步骤。 2.DNA片段的扩增及电泳鉴定。 目的基因的筛选与获取 1 目录 CONTENT 2 基因表达载体的构建 3 将目的基因导入受体细胞 4 目的基因的检测与鉴定 5 DNA片段的扩增及电泳鉴定 由此可知在扩增目的基因时， 设计引物必须依据___________________. PCR进行的前提条件是：_______________________. 思考：PCR 扩增的是完整的模板 DNA 分子吗？ 一般不是；PCR扩增的是两种引物之间特定DNA片段。 目的基因的核苷酸序列 已知目的基因的DNA序列 3’ 5’ 3’ 5’ 引物1 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ 1.延伸时需要加入2种引物，原因是: DNA是 的双链，DNA聚合酶只能从引物 端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。 3′ 2.引物的设计原则： （1）引物及引物之间不应存在互补序列； 同种引物也不能发生碱基互补配对。 （2）引物长度不宜过短，防止引物随机结合。 防止引物之间配对 防止引物自身配对折叠 （3）引物设计需考虑的因素： 扩增的特异性：只扩增出目标DNA的特性 扩增的高效性：单位时间内扩增产物的量 特异性太强，扩增效率下降； 提高扩增效率，扩增特异性下降 反向平行 引物的5' 端决定PCR产物的长度，对扩增特异性影响不大，因此可以被修饰。 修饰包括：加酶切位点、标记荧光，引入蛋白质结合DNA序列，插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。 引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。 （4）引物5'端可以修饰，3'端不可修饰； ①引物长度：PCR的引物一般在20-30核苷酸之间。过长会导致其延伸温度 大于74℃，不适于Taq 酶进行反应。过短特异性差。 ②引物G-C含量：一般在40%~60%之间，G-C含量过高或过低都不利于 引发反应。 ③复性温度：复性温度高，扩增特异性强，复性温度低，扩增效率高。 如果引物碱基数较少，可适当提高复性温度，使PCR的特异性增加； 如果碱基数较多，可适当减低复性温度，使DNA双链结合。 一对引物的复性温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但理想情况 下一对引物的复性温度是一样的。 思考：利用PCR技术扩增目的基因，在第几次循环产物中开始出现 2条脱氧核苷酸链等长的DNA片段（即出现完整的目的基因）？ 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 第3次循环的产物出现等长的目的基因片段（含引物） 细胞内DNA复制 PCR技术 区别 解旋 方式 解旋酶催化 边解旋边复制 场所 主要在细胞核内 酶 解旋酶、DNA聚合酶等 温度 细胞内温和条件 结果 合成整个DNA分子 联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸 ③酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端合成子链 DNA在高温下变性解旋 全部解旋后再复制 细胞外(主要在PCR扩增仪内) 耐高温的DNA聚合酶 控制温度，需在不同温度下进行 形成大量特定的DNA片段或基因 8 习题巩固 1.在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是（ ） A.化学合成法   B.基因组文库法 C.cDNA文库法   D.聚合酶式链反应 D 2.下列获取目的基因的方法中需要模板链的是（ ） ①从基因文库中获取目的基因 ②利用PCR技术扩增目的基因 ③逆转录法 ④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成 A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．②③ D 9 3 PCR的相关计算 引物1 引物2 扩增1次： 扩增次数 1次 2次 DNA总数 长链-中长链DNA 中长链-短链DNA 短链-短链DNA 含引物1(或2)的DNA 含引物1和2的DNA 共需要的引物个数 第n次循环需要的引物 扩增2次： 2 0 0 1 21 0 2 2 2 2 0 3 22 2 6 4 10 扩增次数 1次 2次 3次 n次 DNA总数 长链-中长链DNA 中长链-短链DNA 短链-短链DNA 含引物1(或2)的DNA 含引物1和2的DNA n次循环共需 引物个数 第n次循环所需 引物个数 2 0 0 1 21 0 2 2 2 2 0 3 22 2 6 4 扩增3次： 2 4 2 7 23 6 14 8 2 2(n-1) 2n-2n 2n-1 2n 2n＋1 - 2 2n 2n-2 习题巩固 图中引物中为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占比例为________。 15/16 利用PCR技术扩增目的基本因，其原理与细胞内DNA复制类似。 12 ①DNA聚合酶无法识别RNA；②高温变性步骤会破坏RNA的结构，导致其降解。 P79旁栏思考：用PCR可以扩增mRNA吗？ 不能！ 单链RNA 逆转录酶 RNA-DNA 杂交双链 核酸酶H 单链DNA 引物、 DNA聚合酶 双链DNA PCR扩增 需要将RNA反转录为cDNA，然后再进行扩增。 问题：若要扩增mRNA上的遗传信息，该如何操作？ 4.PCR产物鉴定： 常采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定PCR扩增产物。 3 【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.PCR在体外进行DNA片段扩增的原理： ①利用DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合； PCR仪实质上就是一台自动调控温度的仪器，1次PCR一般要经历30次循环。 ②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。 PCR仪、微量离心管（PCR反应的场所）、 微量移液器（向微量离心管转移PCR配方中的液体） 一次性吸液枪头 微量离心管 （1）器具： PCR仪 加不同样品时，需要更换枪头。 （2）PCR进行体外DNA片段的扩增步骤： ①取样移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方，在微量离心管中依次加入各组分。 ②离心：待所有组分都加入后，盖严离心管盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）。 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶 （即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （1pg～1μg） 5～10μL ③反应：设置好PCR仪的参数和循环程序，将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min — — 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min — — 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min 使DNA充分变性，双链打开，以利于引物更好地和模板结合。 注1：预变性的目的是什么？ 注2：为什么最后1次变性时间延长？ Taq DNA聚合酶活性会随着循环次数增加而下降。在每一轮循环中，部分片段可能没有完全延伸完，Taq DNA聚合酶就脱落了。 因此最后1次变性时间延长，让这些DNA打开，重新延伸。 2.利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的原理 ①电泳：DNA分子具有 ，在一定的pH下，这些基团可以带上_______或 。在电场作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动，这个过程就是电泳。 ②DNA分子的迁移速率：与凝胶浓度、DNA分子的大小和构象等有关 电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等） 可解离的基团 正电荷 负电荷 相反 琼脂糖凝胶浓度越大，分离的DNA分子越小，迁移速率越快. ③检测原理：凝胶中的DNA分子通过_____，可在波长300nm的紫外灯下被检测出来。 试剂： 无菌水、琼脂糖；电泳缓冲液（TAE或TBE） 凝胶载样缓冲液（内含指示剂—溴酚蓝） 核酸染料（常用EB即溴化乙锭） 染色 注1：电泳缓冲液类似色素提取的层析液，点样孔通常位于电极的负极端， pH一般为8，DNA分子在缓冲液中带负电荷，在电场中向正极端移动，从而分离出大小不同的DNA片段。 注2：电泳中要使用DNA Marker（标准参照物）来估计DNA片段大小。 梳子 模具 （2）琼脂糖凝胶电泳的过程 ②制备凝胶：将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子， 以形成加样孔（孔侧连电极负极）。 凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 ① 配制琼脂糖溶液：根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 维持pH值，使DNA带负电荷 梳子孔为加样孔 ③ 加样：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。 指示剂：指示样品迁移的速率、方向，和电泳的进程；使样品呈现颜色，便于加样。 ④ 电泳：接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。 【注意事项】教材P85 1.你是否成功扩增出DNA片段？判断依据是什么？ 可在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。 电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。 实验结果分析： 2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，分析可能原因。 ①如果扩增不成功，可能原因有： ②如果不止一条条带，可能原因有： 漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。 引物设计不合理，与非目的序列有同源性或容易形成二聚体； 复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好；模板DNA出现污染；Mg2＋浓度过高等。 .用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱， 中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是( 　　) A.PCR产物的分子大小 在250至500 bp之间 B.3号样品为不含目的基因 的载体DNA C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 B 拓展——PCR的应用 1.扩增目的基因： 用模板DNA和目的基因相关引物扩增 →产生大量目的基因 2.检测目的基因： 用待测DNA和相关引物扩增 有扩增产物→ 目的基因 无扩增产物→ 目的基因 3.产生突变基因： 可在引物中或引物的5`端引入突变序列 →产生大量突变基因 含有 不含 1．DNA足迹法常用来检测蛋白质在DNA上的结合位点，其原理如图所示。先将待测DNA一条链的一端用放射性同位素标记，加入 DNA 结合蛋白后，再用核酸内切酶DNase I 随机切割待测 DNA，被蛋白质结合的区域可免于切割。最后将酶切后的DNA 片段变性后电泳，放射性同位素标记的DNA经处理后会显示出条带。下列说法错误的是（    ） A．核酸内切酶DNase I 和限制酶均可破坏磷酸二酯键 B．若通过PCR 标记 DNA 末端，仅需一种引物含有放射性同位素 C．电泳结果中显示的是经 DNase I切割后的所有 DNA片段 D．蛋白质的结合位点仅位于乙区域对应的DNA片段 C 感谢观看! 2019人教版·生物·选择性必修3 26 $