专题08 生物技术与工程（3大题型+热点聚焦）（全国通用）2026年高考生物二模分类汇编

**基本信息** 聚焦生物技术与工程核心模块，精选2026年多地二模真题，涵盖发酵、细胞、基因工程及PCR技术，注重真实科研情境与实验能力考查。 **题型特征** |题型|题量|知识覆盖|命题特色| |----|----|----------|----------| |发酵工程|10题|微生物筛选、传统发酵操作（如浆水发酵）|结合西北传统饮品，考查灭菌与菌种计数| |细胞工程|10题|干细胞培养、单克隆抗体制备（如帕利珠单抗）|CRISPR编辑造血干细胞，体现前沿技术| |基因工程及应用|14题|载体构建、酶切位点分析（如pBR322质粒）|多酶切验证重组方向，强化科学思维| |PCR技术及应用|6题|实时荧光定量PCR、电泳鉴定|深海噬菌体DNA聚合酶，关联科技热点|

专题08 生物技术与工程 ( 发酵工程 题型 1 ) 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 A B A A B D A A B B ( 细胞工程 题型 2 ) 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 C A C B C D D D B D ( 基因工程及应用 题型 3 ) 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 答案 C A C B B B D C 9．(1)便于检测目的基因是否导入到受体细胞 (2) 浆（B） 逆转录 Sau3A Ⅰ 目的基因以及质粒自身环化 B (3) 囊胚 胚胎移植 10．(1)EPO基因转录的mRNA (2) XhoI、SalI 只有在引物P1、P2的5′端分别添加XhoI、SalI，①链3′端位于启动子端的表达载体才不会被受体菌中的XhoI、SalI破坏，EPO基因能表达 (3) 2 CaCl2溶液 (4)①在含有氨苄青霉素的培养基上能生长的受体菌可能只有空载质粒；②携带了(反接)目的基因质粒，但又被受体菌中的XhoI、SalI将其从表达载体上切除(合理答案，答出1点即可) 11．(1) SacⅠ和XhoⅠ 避免目的基因、载体自身环化或反向连接（保证目的基因与载体正确连接） D (2) 荧光素 有荧光出现 3′端 (3) 1和4 实验组两种基因的条带都无，对照组两种基因的条带都有 12．(1)β- 胡萝卜素可清除细胞内的自由基，减少对细胞的氧化损伤，延缓细胞衰老 (2) 外 磷酸二酯 黏性 1024（或45） 识别位点与切割位点分离，可使质粒和目的基因产生不同的、非互补的黏性末端，质粒两端无法自身互补连接，目的基因也只能按特定方向与质粒连接 (3) 质粒导入成功 白 目的基因成功插入，Crt基因被破坏，无法表达红色荧光，为白色 13．(1) EcoRI SamⅠ T4DNA连接酶 (2) 230-1 使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 (3)不含组氨酸 (4)酵母菌是真核生物，细胞内有内质网和高尔基体，可以对IL-2进行加工修饰，而大肠杆菌是原核生物，细胞内没有内质网和高尔基体 14．(1) 脱氧（核糖）核苷酸 RNA聚合酶识别和结合的位点，驱动基因转录出mRNA 激活或抑制 (2) 维持稳定和表达 农杆菌侵染烟草细胞后，能将Ti质粒的T-DNA转移到烟草细胞，并将其整合到烟草细胞的染色体DNA上 (3) c EcoRⅠ (4)能吸收周围环境中DNA分子 (5)生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素 ( PCR技术及应用 热点聚焦 ) 题号 1 2 3 4 5 6 答案 D B C D D D 试卷第1页，共3页 试卷第1页，共3页 学科网（北京）股份有限公司 1/1 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题08 生物技术与工程 4大题型概览 题型1 发酵工程 题型2 细胞工程 题型3 基因工程及应用 热点聚焦 PCR技术及应用 ( 发酵工程 题型 1 ) 1．（2026·江西萍乡·二模）浆水是西北地区的传统饮品，常以蔬菜和面汤为原料，主要利用乳酸菌自然发酵而成，味道微酸爽口，有解暑开胃之效。传统发酵过程如下图，发酵工程则多采用人工接种，在现代发酵罐内进行大规模生产。下列分析错误的是（    ） A．两种发酵过程中，乳酸菌都是先无丝分裂快速增殖，再进行无氧发酵产生酸味物质 B．传统发酵时的热烫处理起到消毒作用，发酵工程则须对原料和发酵设备进行严格灭菌 C．发酵工程中接种扩大培养的优良纯种菌液，相当于传统发酵过程中的加“引子” D．为监测发酵进程，利用细菌计数板进行菌种计数的结果通常高于稀释涂布平板法 【答案】A 【详解】A、乳酸菌是原核生物，增殖方式为二分裂；无丝分裂是真核细胞的分裂方式，原核生物不能进行无丝分裂，A错误； B、传统发酵的热烫处理可以杀死原料中部分杂菌，起到消毒作用；现代发酵工程需要避免杂菌污染，因此必须对原料和发酵设备进行严格灭菌，B正确； C、传统发酵的“引子（旧浆水）”含有发酵所需的乳酸菌，发酵工程接种扩大培养的优良纯种，本质都是引入发酵菌种，作用类似，C正确； D、细菌计数板会计数所有菌体（包括死菌和活菌），而稀释涂布平板法计数时，两个或多个细菌连在一起只会统计为一个菌落，计数结果偏小，因此细菌计数板的计数结果通常高于稀释涂布平板法，D正确。 2．（2026·河北保定·二模）科研团队从垃圾填埋场筛选高效降解聚乳酸（PLA）的微生物，流程为：①将土壤样品稀释涂布到以PLA 为唯一碳源的固体培养基上；②挑取单菌落纯化；③刚果红染液处理，筛选透明圈与菌落直径比值大的菌株。下列叙述错误的是（    ） A．步骤①的培养基为选择培养基，可抑制非 PLA 降解菌生长 B．步骤①和②的接种方法均为稀释涂布平板法，需无菌操作 C．透明圈与菌落直径比值越大，一般说明菌株降解 PLA 能力越强 D．筛选出高效降解 PLA 的菌株后，常用液体培养基进行扩大培养 【答案】B 【详解】A、步骤①的培养基以PLA为唯一碳源，属于选择培养基，只有可降解PLA的菌株能利用PLA作为碳源生长，非PLA降解菌因缺乏可利用碳源生长被抑制，A正确； B、步骤①的接种方法为稀释涂布平板法，但步骤②挑取单菌落纯化时，可采用平板划线法或稀释涂布平板法，B错误； C、刚果红可与PLA结合形成红色复合物，当PLA被菌株降解后，菌落周围会出现透明圈，透明圈与菌落直径的比值越大，说明单位菌落降解PLA的能力越强，C正确； D、液体培养基能使微生物与营养物质充分接触，有利于微生物的繁殖，因此筛选出目标菌株后常用液体培养基进行扩大培养，D正确。 3．（2026·广东湛江·二模）“筛选”是分离和培养微生物中常用的方法。下列实验中筛选原理与其他三项明显不同的是（    ） A．从诱变处理的菌液中筛选高产菌株 B．从腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌 C．从被石油污染的土壤中筛选石油降解菌 D．从热泉中筛选水生栖热菌以提取Taq DNA聚合酶 【答案】A 【详解】A、该过程是对诱变处理后的菌群筛选高产突变株，所有菌株均可在普通培养条件下存活，筛选依据是菌株的产物产量，而非特殊生存能力，A符合题意； B、腐烂滤纸的主要成分为纤维素，仅能为纤维素分解菌提供碳源，只有纤维素分解菌可在此环境下存活，属于利用特定生境的选择作用筛选，B不符合题意； C、被石油污染的土壤中石油是主要碳源，仅石油降解菌可利用石油作为碳源生存，属于利用特定生境的选择作用筛选，C不符合题意； D、热泉温度极高，仅耐高温的水生栖热菌可在此高温环境下存活，属于利用特定生境的选择作用筛选，D不符合题意。 4．（2026·福建龙岩·二模）除草剂莠去津是一种含氮的有机物，长期使用易对土壤造成污染。研究人员从土壤中筛选莠去津降解菌的过程如下图所示（含过量莠去津的固体培养基不透明）。下列叙述错误的是（　　） A．从A瓶到C瓶的目的是逐步稀释培养液中的目的菌 B．应选择固体培养基中出现的有透明带菌落进行再纯化 C．图中进行再纯化的接种过程至少需要灼烧6次接种环 D．实验过程中需设置未接种的培养基作为对照 【答案】A 【详解】A、从A、B、C 瓶是在无氮培养液中进行的富集培养，其主要目的是增加目的菌的浓度，而不是单纯的稀释，A错误； B、固体培养基甲中含有过量莠去津，不透明。能降解莠去津的细菌会在菌落周围分解莠去津，形成透明带，因此，应选择有透明带的菌落进行再纯化，B正确； C、图乙展示的是平板划线法纯化菌种，划线 5 次，每次划线前都要灼烧接种环，最后一次划线结束后也要灼烧接种环，共需要灼烧 5+1=6 次，C正确； D、整个实验过程中，需设置未接种的选择培养基作为空白对照，以检验培养基是否被污染，D正确。 5．（2026·安徽马鞍山·二模）某谷氨酸发酵工厂遭遇专性噬菌体污染，技术人员采用双层平板法测定该噬菌体浓度：先在无菌培养皿中倒入含2%琼脂的培养基凝固成底层平板，再将含1%琼脂的培养基与敏感指示菌、待测噬菌体稀释悬液混匀后铺成上层平板（见下图）。恒温培养后，可根据噬菌斑数目计算原液中噬菌体数量。下列叙述正确的是（　　） A．该实验中选用的敏感指示菌为大肠杆菌 B．上下层培养基营养成分应保持一致 C．上层培养基琼脂浓度越低越利于计数 D．对生产空间的灭菌即可彻底杜绝噬菌体污染 【答案】B 【详解】A、该实验中选用的敏感指示菌为谷氨酸棒状杆菌，A错误； B、上层培养基需要支持指示菌生长，同时让噬菌体侵染、裂解细菌形成噬菌斑；底层培养基作为支撑层，也需要提供相同的营养，保证指示菌在整个平板上正常生长，才能形成清晰的噬菌斑。因此上下层营养成分必须一致，这样才能保证敏感指示菌在上下层培养基中都能正常生长，B正确； C、上层培养基琼脂浓度过低会导致上层平板不能凝固，无法形成稳定的平板用于计数，并非浓度越低越利于计数，C错误； D、对生产空间灭菌不能彻底杜绝噬菌体污染，因为噬菌体分布广泛，且可能存在于空气、设备等多种环境中，灭菌后仍可能有噬菌体残留，D错误。 6．（2026·天津·二模）动物细胞培养时操作不当会造成“黑胶虫”细菌的污染，该菌对氯霉素敏感，高温会使氯霉素失活。下列叙述错误的是（    ） A．配制细胞培养基时，湿热灭菌后加血清（含细胞生长必需蛋白）和氯霉素 B．在加入氯霉素防治“黑胶虫”污染过程中，需要同时考虑对细胞和细菌生长的影响 C．考察“黑胶虫”污染程度时，应取细胞培养液等比稀释后涂布在平板上培养计数 D．采用更换培养基、胰蛋白酶处理和分瓶培养等操作可清除“黑胶虫”污染 【答案】D 【详解】A、配制细胞培养基时，湿热灭菌后通过过滤灭菌加入血清（含细胞生长必需蛋白）和氯霉素，A正确； B、在加入氯霉素防治“黑胶虫”污染过程中，需要考虑其对细胞和细菌生长的双重因素，保证动物细胞的正常生长，同时抑制细菌的生长，B正确； C、考察“黑胶虫”污染程度时，应取细胞培养液，稀释后涂布在平板上培养，待菌落数目稳定后进行计数，C正确； D、更换培养基、胰蛋白酶处理和分瓶培养仅能减少“黑胶虫”的数量，无法彻底清除已经存在的细菌污染，需要使用敏感的氯霉素才能起到防治作用，D错误。 7．（2026·河北唐山·二模）某同学利用传统发酵技术酿制葡萄酒，下列操作错误的是（    ） A．为了减少杂菌污染，对葡萄进行消毒处理 B．为防止杂菌污染，排气时没有完全打开罐口 C．为提高酒精发酵效率，控制发酵温度在18～30℃ D．若观察到发酵液表面形成一层菌膜，则应停止发酵 【答案】A 【详解】A、传统葡萄酒发酵依靠葡萄皮表面附着的野生型酵母菌作为发酵菌种，对葡萄进行消毒处理会杀死所需的酵母菌，导致发酵无法正常进行，A错误； B、排气时不完全打开罐口，可避免空气中的杂菌进入发酵装置造成污染，B正确； C、酵母菌酒精发酵的适宜温度范围是18～30℃，该温度下酵母菌活性较高，可提高酒精发酵效率，C正确； D、发酵液表面的菌膜是密封不严时，好氧的醋酸菌等杂菌在液面繁殖形成的，说明发酵已被杂菌污染，继续发酵会导致葡萄酒变质，应停止发酵，D正确。 8．（2026·四川遂宁·二模）《尚书·说命》中“若作酒醴，尔惟曲蘖”的意思是如果你要酿造甜酒（酒醴），关键在于用好曲和蘖（发芽的谷物）。以下说法错误的是（　　） A．实验室纯培养“曲”中菌种使用牛肉膏蛋白胨培养基 B．“曲”中微生物能利用糖化后的有机物发酵产生酒精 C．“蘖”中产生的赤霉素促进淀粉酶合成从而完成糖化 D．在发酵工程制酒过程中代谢物生成在主发酵阶段完成 【答案】A 【详解】A、“曲”中用于酿酒的核心菌种是酵母菌（真菌），牛肉膏蛋白胨培养基属于细菌专用培养基，多用于培养细菌，无法满足真菌纯培养的营养需求，A错误； B、“曲”中的酵母菌等微生物能够利用糖化后生成的葡萄糖等有机物，通过无氧呼吸发酵产生酒精，B正确； C、“蘖”是发芽的谷物，种子发芽过程中产生的赤霉素可促进淀粉酶合成，淀粉酶能催化淀粉水解为还原糖，完成糖化过程，C正确； D、发酵工程制酒时，主发酵阶段酵母菌完成主要的发酵代谢活动，酒精等核心代谢物的生成基本在该阶段完成，后发酵仅做风味调整等后续处理，D正确。 9．（2026·安徽宣城·二模）沙棘汁富含维生素C和黄酮类物质，是天然抗氧化剂。桦树液中则含有桦木酸等成分，两者混合发酵制酒，不仅能延长保质期，还增强了保健功能。桦树液沙棘复合酒发酵工艺加工流程及优化结果如图所示，下列叙述正确的是（    ） A．发酵工程的中心环节是灭菌，经过严格灭菌才能保证产品品质 B．若糖度过高会抑制酵母菌的生长，可通过添加适量纯净水调节 C．接种后的罐内发酵过程应保持严格的无氧环境，从而进行充分的酒精发酵 D．发酵结束后还可从酵母菌中提取单细胞蛋白作为食品添加剂 【答案】B 【详解】A、发酵工程的中心环节是发酵罐内的发酵过程，灭菌只是发酵前的准备操作，不是中心环节，A错误； B、糖度过高会使发酵液渗透压过大，导致酵母菌细胞失水，抑制酵母菌的生长繁殖；添加适量纯净水可以稀释发酵液，降低糖度和渗透压，缓解抑制作用，B正确； C、接种后的酒精发酵过程，初期需要通气，让酵母菌进行有氧呼吸大量增殖，之后才转为无氧环境进行酒精发酵，不需要全程保持严格无氧，C错误； D、单细胞蛋白本质就是微生物菌体，发酵结束后可以收集酵母菌菌体得到单细胞蛋白，可作为食品添加剂，D错误。 10．（2026·山东日照·二模）传统白酒多以泥窖为发酵基础，多年反复利用的老窖池内壁窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物。下列有关说法正确的是（    ） A．从窖泥中分离的酿酒酵母扩大培养时，需在密闭环境中进行 B．从谷物原料发酵形成的酒糟中，可分离出产淀粉酶的微生物 C．发酵过程中，可将发酵池温度调至30～35℃加快发酵进程 D．窖池密封不严使酒变酸可能是混入的乳酸菌产生乳酸引起的 【答案】B 【详解】A、酿酒酵母为兼性厌氧菌，扩大培养时需要提供有氧环境，使其通过有氧呼吸大量繁殖，密闭环境会抑制酵母的有氧呼吸和繁殖，A错误； B、谷物原料的主要成分是淀粉，酿酒时需要先将淀粉水解为葡萄糖，酵母菌才能利用葡萄糖发酵产酒精。酒糟是谷物发酵后的残渣，其中会富集能分泌淀粉酶、分解淀粉的微生物（如根霉、曲霉等），因此可以从酒糟中分离出产淀粉酶的菌株，B正确； C、酿酒酵母的最适发酵温度为18~30℃，30～35℃不属于酵母菌的适宜发酵温度，反而会促进醋酸菌、乳酸菌等杂菌繁殖，无法加快酿酒发酵进程，C错误； D、乳酸菌是厌氧菌，在有氧环境中生长会受到抑制。窖池密封不严，氧气进入后，主要是醋酸菌（好氧菌）大量繁殖，将酒精氧化为醋酸，导致酒变酸。乳酸菌无法在有氧条件下大量增殖产酸，D错误。 ( 细胞工程 题型 2 ) 1．（2026·山东济南·二模）科研人员提取患者自体CD34+造血干细胞，在体外通过CRISPR/Cas9编辑BCL11A基因启动子上游的序列，从而抑制BCL11A基因的表达，重新激活胎儿血红蛋白的表达，替代异常的成人血红蛋白以根治镰状细胞贫血。下列有关说法正确的是（    ） A．该治疗方案使用患者自体造血干细胞进行编辑和回输是由于干细胞在体外更容易增殖 B．经过该疗法治疗的患者，其生殖细胞的基因也被同步修复，后代将不再患病 C．在体外培养和编辑CD34+造血干细胞的过程中，需要严格保持无菌条件 D．若基因编辑过程中存在非目标位点被编辑的现象，其原因是BCL11A基因发生了基因突变 【答案】C 【详解】A、使用患者自体造血干细胞进行编辑和回输的主要原因是避免异体移植带来的免疫排斥反应，并非因为干细胞在体外更容易增殖，A错误； B、该疗法编辑的是造血干细胞，属于体细胞，患者生殖细胞的基因未被编辑，后代仍可能携带致病基因患病，B错误； C、体外培养动物细胞的过程中，杂菌污染会导致细胞死亡、培养失败，因此需要严格保持无菌条件，C正确； D、基因编辑过程中非目标位点被编辑是CRISPR/Cas9的脱靶效应，由向导RNA错误结合其他序列相似的位点导致，并非BCL11A基因发生基因突变，D错误。 2．（2026·广东韶关·二模）牧草紫花苜蓿富含蛋白，但易造成家畜鼓胀病。百脉根富含的单宁可结合蛋白，避免鼓胀病。科学家以二者为材料培育了抗鼓胀病的牧草新品种，如图所示。下列叙述错误的是（    ） 注：IOA抑制细胞呼吸第一阶段，R-6G抑制线粒体功能，两者均为不可逆抑制 A．为获得原生质体，需要在含有体细胞的清水中加入适量的纤维素酶和果胶酶 B．PEG诱导原生质体融合后，未融合或同种融合的细胞无法继续生长和增殖 C．愈伤组织在固体培养基和黑暗条件下培养，可发生基因的选择性表达 D．该过程克服了远缘杂交不亲和的障碍，实现了基因组的重组，但不属于有性生殖 【答案】A 【详解】A、为获得原生质体，需要在含有体细胞的等渗溶液中加入适量的纤维素酶和果胶酶，以去除细胞壁，而不是在清水中，A错误； B、据图注可知，IOA抑制细胞呼吸第一阶段，R-6G抑制线粒体功能，两者均为不可逆抑制。PEG诱导原生质体融合后，未融合或同种融合的细胞因呼吸作用受抑制无法继续生长和增殖，B正确； C、愈伤组织在固体培养基和黑暗条件下培养，可发生基因的选择性表达，进而再分化形成特定的组织和器官，C正确； D、植物体细胞杂交，可将不同物种的原生质体融合，克服了远缘杂交的生殖隔离障碍。杂种细胞包含两个物种的基因组，实现了基因组重组。整个过程没有经过两性生殖细胞的结合，所以不属于有性生殖，D正确。 3．（2026·四川乐山·二模）核苷酸合成有两个途径，物质A可以阻断其中的全合成途径（如图）。正常细胞内含有补救合成途径所必需的转化酶和激酶，制备单克隆抗体时选用的骨髓瘤细胞中缺乏转化酶。现用加入H、A、T三种物质的“HAT培养基”来筛选特定的杂交瘤细胞。下列说法正确的是（    ） A．未融合的B细胞及其同型融合细胞因全合成途径被A阻断而在HAT培养基上不能增殖 B．因为杂交瘤细胞可以进行上述两个途径，所以它能在HAT培养基上大量增殖 C．未融合的骨髓瘤细胞及其同型融合细胞因无法进行上述两个途径而在HAT培养基上不能增殖 D．HAT培养基所筛选出的杂交瘤细胞既能大量增殖又能产生高纯度的目标抗体 【答案】C 【详解】A、未融合的B细胞及其同型融合细胞是正常细胞，细胞内含有补救合成途径所必需的转化酶和激酶，但因高度分化而不能增殖，A错误； B、杂交瘤细胞因为可以进行补救合成途径，能够在HAT培养基上大量增殖，B错误； C、未融合的骨髓瘤细胞及其同型融合细胞因骨髓瘤细胞中缺乏转化酶，无法进行上述两个途径而在HAT培养基上不能增殖，C正确； D、HAT培养基上筛选出的杂交瘤细胞能大量增殖，但并不都能产生高纯度的目标抗体，需要进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞，才可产生高纯度的目标抗体，D错误。 4．（2026·重庆沙坪坝·二模）2009年科学家利用小鼠肠道的成体干细胞培育出首个肠道类器官，类器官是由干细胞在体外诱导分化形成的具有器官特性的细胞集合体｡下列叙述错误的是（　　） A．对类器官中某种细胞的蛋白质种类进行分析，可判断其细胞类型 B．干细胞在体外培育形成类器官，证明动物细胞具有全能性 C．肠道成体干细胞具有组织特异性，一般只能分化成特定的组织或细胞 D．若类器官来源于自体细胞，移植回病人体内理论上可避免免疫排斥反应 【答案】B 【详解】A、细胞分化的实质是基因的选择性表达，不同类型细胞合成的蛋白质种类存在差异，因此分析细胞的蛋白质种类可判断细胞类型，A正确； B、细胞全能性的定义是已经分化的细胞仍具有发育成完整个体的潜能，干细胞培育形成类器官仅得到了具有部分器官特性的细胞集合体，并未发育为完整个体，不能证明动物细胞具有全能性，B错误； C、成体干细胞具有组织特异性，仅存在于特定组织中，一般只能分化形成其对应来源的特定组织或细胞，C正确； D、自体细胞来源的类器官，细胞表面的组织相容性抗原与患者自身一致，移植后不会被免疫系统识别为异物，理论上可避免免疫排斥反应，D正确。 5．（2026·广东江门·二模）我国科研团队利用体细胞核移植技术成功获得一批基因编辑克隆牛，实现了奶牛优良种质的高效扩繁。科研团队首先从高产奶牛耳部采集成纤维细胞进行培养，再将细胞核移植到去核卵母细胞中，从而构建重构胚，并移植到受体牛子宫内，最终获得克隆牛。下列相关叙述正确的是（　　） A．从高产奶牛耳部采集的成纤维细胞具有发育的全能性，可直接发育成完整个体 B．培养成纤维细胞时，若出现接触抑制现象，则常用胃蛋白酶处理后再进行传代培养 C．重构胚可以用电刺激或Ca2+载体等激活，使其完成细胞分裂和早期胚胎发育 D．克隆牛的核遗传物质与高产奶牛的完全一致，因此其性状与高产奶牛的完全相同 【答案】C 【详解】A、高度分化的动物体细胞的全能性受到限制，只有细胞核具有全能性，成纤维细胞是高度分化的体细胞，无法直接发育为完整个体，A错误； B、动物细胞培养的适宜pH为7.2~7.4，胃蛋白酶在该pH条件下会失活，出现接触抑制时需用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理后再传代培养，B错误； C、构建的重构胚需要通过物理法（如电刺激）或化学法（如Ca²⁺载体等）进行激活，才能诱导其完成细胞分裂和早期胚胎发育，C正确； D、克隆牛的核遗传物质来自高产奶牛，但细胞质遗传物质来自提供去核卵母细胞的个体，同时性状还受环境因素影响，因此其性状不会和高产奶牛完全相同，D错误。 6．（2026·广东江门·二模）帕利珠单抗是一种用于预防呼吸道合胞病毒（RSV）感染的单克隆抗体药物，其通过中和病毒发挥保护作用。下列叙述正确的是（　　） A．该单克隆抗体可由细胞毒性T细胞与骨髓瘤细胞融合制备 B．该单克隆抗体与RSV特异性结合后，可直接裂解被病毒感染的靶细胞 C．该单克隆抗体进入机体后，可诱导机体产生长期免疫记忆 D．制备该单克隆抗体时，需要先用RSV抗原对小鼠进行免疫 【答案】D 【详解】A、单克隆抗体由能分泌抗体的B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞制备，细胞毒性T细胞不能分泌抗体，无法用于制备单克隆抗体，A错误； B、抗体与RSV特异性结合后会形成沉淀或细胞集团，最终被吞噬细胞吞噬消化，裂解被病毒感染的靶细胞的是细胞毒性T细胞，抗体无裂解靶细胞的功能，B错误； C、单克隆抗体是外源输入的免疫活性物质，进入机体后不会刺激免疫系统产生记忆细胞，无法诱导机体产生长期免疫记忆，C错误； D、制备单克隆抗体时，需要先用对应抗原（RSV抗原）免疫小鼠，才能获得能分泌抗RSV抗体的B 淋巴细胞，D正确。 7．（2026·河北邯郸·二模）利用囊胚的细胞经过动物细胞培养获得大量的胚胎干细胞，从而获得多种类型的体细胞，以下为培育的流程图。下列叙述正确的是（    ） A．图中a、b细胞的遗传物质完全相同，这两类细胞均发育为胎儿的组织 B．囊胚外面的透明带会一直保护着胚胎，否则胚胎将无法正常发育 C．a处细胞需经胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理，胚胎干细胞在液体培养基中只能悬浮生长 D．②过程为细胞分化，胚胎干细胞可分化为各种组织细胞，这体现胚胎干细胞的全能性 【答案】D 【详解】A、a和b都来自受精卵的分裂分化，核遗传物质相同，但只有a（内细胞团）发育为胎儿的各种组织，b（滋养层）发育为胎膜和胎盘，不会发育为胎儿组织，A错误； B、囊胚发育后期会发生“孵化”，透明带会破裂脱落，不会一直保护胚胎，B错误； C、分离内细胞团确实需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶分散细胞，据图可知胚胎干细胞培养时贴壁生长，C错误； D、②过程是胚胎干细胞分化形成多种不同功能的体细胞，胚胎干细胞在功能上具有发育全能性，可以分化为各种组织细胞，该过程体现了胚胎干细胞的全能性，D正确。 8．（2026·广东东莞·二模）黄曲霉毒素（AFB）是黄曲霉产生的一种致癌物质。为准确检测环境中的AFB，科研人员利用小鼠制备抗AFB的单克隆抗体（AFB单抗），过程如图示。下列叙述正确的是（    ） A．向小鼠注射AFB的目的是刺激机体发生细胞免疫 B．病毒能诱导动物细胞融合，而灭活的病毒失去该能力 C．细胞乙和细胞丙都需先经过克隆化培养再进行筛选 D．悬浮生长的细胞丁传代培养时，可用离心法收集细胞 【答案】D 【详解】A、AFB 作为抗原，注射到小鼠体内后，我们的目标是让小鼠产生能分泌抗 AFB 抗体的 B 淋巴细胞，这个过程依赖体液免疫，A错误； B、在动物细胞融合中，灭活的仙台病毒是常用的诱导剂。灭活的病毒虽然失去了感染能力，但仍保留了其表面的融合蛋白，能够介导细胞膜融合，所以灭活的病毒依然具备诱导细胞融合的能力，B错误； C、细胞乙是融合后得到的混合细胞（包括未融合的亲本细胞、同种细胞融合的细胞、杂交瘤细胞），第一次筛选（选择培养基筛选）的目的是直接筛选出杂交瘤细胞（细胞丙），这一步不需要先克隆化培养。 细胞丙是杂交瘤细胞的混合群，其中只有部分能分泌抗 AFB 的特异性抗体，因此第二次筛选需要先进行克隆化培养，再通过抗体检测筛选出阳性杂交瘤细胞（细胞丁），C错误； D、杂交瘤细胞（细胞丁）通常为悬浮生长型细胞，传代培养时，可通过离心（低速离心）使细胞沉淀，从而收集细胞，再进行后续的传代培养或冻存操作，D正确。 9．（2026·山西·二模）奶牛的自然繁殖率受遗传、营养、管理等多重因素制约，已成为限制高产奶牛种群快速扩繁和牧场经济效益的瓶颈。科研人员利用如图所示的①②两种途径繁殖高产奶牛，以解决上述问题。下列叙述错误的是（　　） A．经①和②路径获得的子代中，仅①需进行性别鉴定 B．细胞甲处于MⅡ期，该细胞含有一个完整的细胞核 C．②路径中，获得重构胚与激活重构胚均可用电处理 D．为获得基因组成相同的子代，可运用胚胎分割技术 【答案】B 【详解】A、途径①（试管动物）：精子和卵子是随机结合的，子代性别无法提前确定，因此必须进行性别鉴定（如通过胚胎分割后取滋养层细胞做 DNA 分析性别鉴定），以获得高产奶牛（通常选择雌性）。 途径②（克隆动物）：核移植的供体细胞来自已知性别的高产奶牛（体细胞的性染色体组成是固定的，如 XX），因此克隆出的子代性别与供体完全一致，无需额外进行性别鉴定，A正确； B、细胞甲是用于体外受精的卵母细胞，体外受精时，卵母细胞需要培养到减数第二次分裂中期（MⅡ 期），此时卵母细胞的特点是： 减数第一次分裂已经完成，次级卵母细胞停留在 MⅡ 中期，染色体排列在赤道板上，但此时的卵母细胞的核膜已经解体，不存在完整的细胞核（核膜破裂，染色体处于细胞质中），B错误； C、将体细胞核注入去核卵母细胞后，可通过电融合的方法使供体细胞的细胞膜与卵母细胞膜融合，使细胞核进入卵母细胞，形成重构胚。 重构胚需要被激活才能像受精卵一样进行分裂发育，常用的激活方法包括电脉冲（电激活）、钙离子载体、乙醇等，C正确； D、胚胎分割技术是将一枚早期胚胎（如囊胚）分割成 2 等份、4 等份或 8 等份，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。 来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质（基因组成），因此可以获得基因组成相同的子代，D正确。 10．（2026·内蒙古赤峰·二模）科研人员通过植物体细胞杂交技术，利用甲种花卉（2N=18）和乙种花卉（2N=24）培育出兼具二者优良性状的新品种。下列叙述正确的是（　　） A．可用电融合法、PEG融合法或灭活的病毒诱导原生质体融合 B．对两种动物细胞进行相似的操作也可在体外诱导多倍体产生 C．整个培育过程需要无菌操作，故不需要更换培养基 D．该过程利用了细胞的全能性和细胞膜的流动性 【答案】D 【详解】A、诱导植物原生质体融合的方法包括物理法（如电融合法）、化学法（如PEG融合法），灭活的病毒是诱导动物细胞融合的特有方法，不能用于植物原生质体融合，A错误； B、动物体细胞的全能性受到严格限制，即使进行细胞融合操作，也无法像植物杂种细胞那样培育为完整个体，不能获得多倍体动物，B错误； C、植物体细胞杂交的培育过程包含原生质体培养、脱分化、再分化等多个阶段，不同阶段对营养物质、植物激素的比例需求不同，即使全程无菌操作也需要更换培养基，C错误； D、原生质体融合过程依赖细胞膜的流动性，将杂种细胞培育为完整植株利用了植物细胞的全能性，D正确。 ( 基因工程及应用 题型 3 ) 1．（2026·陕西榆林·二模）科研人员从耐旱植物拟南芥中分离出耐旱基因DREB1A，并利用基因工程技术将其导入水稻，培育抗旱水稻。大致流程为：利用PCR技术扩增DREB1A基因后，将其与含有花椰菜花叶病毒35S启动子、终止子和潮霉素抗性基因的Ti质粒连接，构建成基因表达载体；随后通过农杆菌转化法导入水稻细胞，经过筛选、培养和鉴定获得转基因水稻植株。下列叙述错误的是（　　） A．PCR扩增DREB1A基因时，需根据DREB1A基因两端的碱基序列设计两种引物 B．构建基因表达载体时，35S启动子应位于DREB1A基因的上游，终止子位于其下游 C．农杆菌转化法中，水稻细胞作为受体细胞时，需先用酶去除其细胞壁制备成原生质体 D．用潮霉素对导入质粒的农杆菌进行筛选，能存活的不一定成功导入了DREB1A基因 【答案】C 【详解】A、PCR扩增目的基因时，需要依据目的基因两端的特异性碱基序列设计两种引物，分别与两条模板链互补结合，才能启动目的基因的扩增，A正确； B、启动子是RNA聚合酶识别结合的位点，可驱动目的基因转录，需位于目的基因上游，终止子是转录终止的信号，需位于目的基因下游，二者共同保证目的基因正常转录，B正确； C、农杆菌转化法的原理是农杆菌Ti质粒上的T-DNA可转移并整合到植物受体细胞的染色体DNA上，该过程无需去除水稻细胞的细胞壁，植物体细胞杂交才需要制备原生质体，C错误； D、潮霉素抗性基因是Ti质粒上的标记基因，导入未插入目的基因的空Ti质粒的农杆菌也可在含潮霉素的培养基上存活，因此筛选得到的农杆菌不一定成功导入了目的基因DREB1A，D正确。 2．（2026·广东韶关·二模）关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”的实验原理及操作步骤。下列叙述错误的是（    ） A．DNA溶于酒精，加入冷酒精析出的白色丝状物即为蛋白质杂质 B．DNA在沸水浴条件下遇二苯胺试剂显蓝色，此时DNA的双螺旋结构已解开 C．DNA片段在电泳时的迁移速率与DNA分子量的大小和构象有关 D．指示剂不会使DNA着色，待指示剂前沿接近凝胶边缘时停止电泳 【答案】A 【详解】A、DNA不溶于酒精，蛋白质等杂质可溶于酒精，加入冷酒精后析出的白色丝状物是粗提取的DNA，A错误； B、用二苯胺试剂鉴定DNA时需沸水浴加热，高温会破坏DNA的双螺旋结构使其解旋，此时DNA遇二苯胺显蓝色，B正确； C、DNA电泳时，迁移速率受DNA分子的分子量大小、构象、凝胶浓度等因素影响，分子量越小、构象越紧凑的DNA迁移速率越快，C正确； D、电泳时加入的指示剂仅用于指示核酸的迁移进度，不会使DNA着色，待指示剂前沿接近凝胶边缘时即可停止电泳，后续再用专门的染色剂对DNA进行染色观察，D正确。 3．（2026·广东佛山·二模）BUF1基因是稻瘟病菌的关键基因，其功能正常时病菌为深色。Cas12a系统包含向导RNA和Cas12a蛋白，向导RNA识别特定DNA位点（靶点）后，Cas12a蛋白可对该位点进行剪切。为获得弱致病性的稻瘟病菌突变体，研究者利用Cas12a系统对BUF1基因进行编辑，如图a。将转化后的稻瘟病菌进行选择培养，并进行PCR和电泳检测，结果如图b。下列分析错误的是（　　） A．Cas12a蛋白通过水解DNA上的磷酸二酯键发挥作用 B．选择培养基上需添加潮霉素，浅色菌落对应目标菌株 C．根据电泳结果，可确定菌株2为编辑成功的目标菌株 D．筛选得到的目标菌株可用于培育抗稻瘟病水稻的研究 【答案】C 【详解】A、Cas12a蛋白可对DNA位点进行剪切，而限制酶也是通过水解DNA上的磷酸二酯键来切割DNA分子的，所以Cas12a蛋白通过水解DNA上的磷酸二酯键发挥作用，A正确； B、由图a可知，导入了含有潮霉素抗性基因的重组质粒的稻瘟病菌能在含有潮霉素的培养基上存活，而BUF1基因功能正常时病菌为深色，功能不正常时为浅色，所以浅色菌落对应BUF1基因被编辑的目标菌株，因此选择培养基上需添加潮霉素，浅色菌落对应目标菌株，B正确； C、编辑成功的菌株，PCR产物因插入潮霉素抗性基因而片段更长，电泳条带迁移距离更短（更靠上）。由图b可知，菌株1、3 的条带位置靠上，说明片段长，是插入了抗性基因的编辑成功产物；菌株 2 的条带位置靠下，说明片段更短，是未编辑的原始BUF1基因，C错误； D、目标菌株是致病性减弱的稻瘟病菌突变体，可用于培育抗稻瘟病水稻的研究，D正确。 4．（2026·山西运城·二模）大肠杆菌的pBR322质粒常用于重组质粒的构建，该质粒上限制酶识别位点如图1所示。受体菌可能导入重组质粒或pBR322质粒，需要在培养基中添加抗生素进行初筛和复筛。将初筛培养基上的菌落原位影印（将菌落按原有位置影印到另一培养基上）到复筛培养上培养，1～6表示菌落，结果如图2所示。下列有关分析正确的是（　　） A．若目的基因和pBR322质粒用BamHⅠ、EcoRⅠ切割，则初筛培养基要添加四环素 B．若目的基因和pBR322质粒用BclⅠ、HindⅢ切割，则复筛培养基要添加氨苄青霉素 C．若目的基因和pBR322质粒用BamHⅠ、EcoRⅠ切割，则菌落3、4、6导入的是重组质粒 D．若目的基因和pBR322质粒用BclⅠ、HindⅢ切割，则菌落1、2、5导入的是pBR322质粒 【答案】B 【详解】A、用BamHⅠ、EcoRⅠ切割，四环素抗性基因失去效应，初筛应添加氨苄青霉素，复筛应添加四环素，A错误； B、用BclⅠ、HindⅢ切割，氨苄青霉素抗性基因失去效应，四环素抗性基因正常，初筛应添加四环素，复筛应添加氨苄青霉素，B正确； C、用BamHⅠ、EcoRⅠ切割，复筛时四环素培养基上死亡的是重组质粒菌落，即菌落3、4、6导入的是pBR322质粒，而非重组质粒，C错误； D、用BclⅠ、HindⅢ切割，复筛时氨苄青霉素培养基上存活的菌落3、4、6是导入pBR322质粒菌落，菌落1、2、5是导入重组质粒菌落，D错误。 5．（2026·山东日照·二模）基因工程中，使用单个限制酶酶切构建的表达载体易出现连接方向错误和重复插入目的基因片段等现象，可通过酶切及筛选标记鉴定出符合预期的重组质粒。研究人员将目的基因CDS插入质粒P的SacⅡ位点后，对重组质粒进行扩增、筛选和检测。P和CDS结构如图所示。下列叙述错误的是（    ） 注：X-gal被LacZ基因表达产物分解成蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则为白色。 A．重组质粒被PstⅠ完全酶切后电泳可能会获得长度为9.4kbDNA片段 B．用EcoRⅠ与SacⅡ完全酶切重组质粒，可得到2个长度的DNA片段 C．用EcoRⅠ与PstⅠ完全酶切重组质粒，可判断CDS基因的连接方向 D．将含重组质粒的细胞涂布在含X-gal的培养基上，菌落颜色为白色 【答案】B 【详解】A、构建重组载体时使用的是单酶酶切，可能出现目的基因重复插入的情况，若2个CDS与载体P连接，则重组载体被PstI酶切后电泳，可能会得到长度约4.2+2.6+2.6=9.4（kb）的DNA片段，A正确； B、若1个CDS和1个载体P连接，该重组载体上有2个SacⅡ酶切位点和一个EcoRI酶切位点，经EcoRI和SacⅡ充分酶切后可以得到长度约0.5kb、2.1kb、4.2kb的DNA片段；若有多个CDS重复插入载体P，也能得到相同结果，B错误； C、1个CDS插入载体P的方式有两种，正向连接和反向连接，两种连接方向下重组载体被EcoRI和PstI酶切后的片段长度不同，因此可以判断CDS片段的连接方向，C正确； D、基因工程构建重组载体时，用SacⅡ酶切割载体P， 破坏了载体P的LacZ基因，含该重组载体的宿主细胞不能合成β-半乳糖苷酶，不能分解X-gal，在含X-gal的培养基上菌落呈白色，D正确。 6．（2026·陕西商洛·二模）基因工程中常用不同限制酶切割DNA，下表为几种限制酶的识别序列及其在某质粒上的切割位点数。下列叙述正确的是（    ） 限制酶 识别序列及切割位点 质粒上切割位点数 EcoRⅠ 5′G↓AATTC3′ 1处 HindⅢ 5′A↓AGCTT3′ 0处 BamHⅠ 5′G↓GATCC3′ 1处 BclⅠ 5′T↓GATCA3′ 1处 Sau3AⅠ 5′↓GATC3′ 3处 A．Sau3AⅠ可切割BamHⅠ和BclⅠ的识别序列，说明Sau3AⅠ不具有专一性 B．质粒经BamHⅠ和BclⅠ双酶切后，在DNA连接酶作用下可重新环化 C．构建重组质粒时，可选择EcoRⅠ和HindⅢ对该质粒和目的基因进行双酶切 D．用BamHⅠ和Sau3AⅠ完全切割该质粒，该质粒可被切割为4段 【答案】B 【详解】A、Sau3AⅠ可切割 BamHⅠ和 BclⅠ的识别序列，不能切割其他序列，说明Sau3AⅠ具有专一性，A错误； B、BamHⅠ和BclⅠ双酶切质粒产生相同的黏性末端，在DNA连接酶作用下可重新环化，B正确； C、该质粒不含有Hind Ⅲ的切割位点，因此不能选择Hind Ⅲ进行酶切，C错误； D、BamHⅠ和 Sau3AⅠ完全切割该质粒，由于被BamHⅠ酶切的位点也可被Sau3AⅠ切割，因此总切割位点为3+1-1=3处，即该质粒可被切割为3段，D错误。 7．（2026·广东广州·二模）为探究猪流行性腹泻病毒蛋白Nsp15是否与宿主蛋白SLC25a3结合，研究人员构建两种重组质粒分别表达融合蛋白Flag-Nsp15和Myc-SLC25a3，转化后获得三组细胞（①、②、③）。利用抗Flag抗体分别收集各组中能与之结合的蛋白，再分别用抗Flag、抗Myc的单克隆抗体检测，同时取各组细胞总蛋白进行相同检测，结果如图所示。下列分析正确的是（    ） A．制备抗Flag单克隆抗体时需在已免疫动物体内分离得到记忆B细胞作为材料 B．若使用抗Myc抗体收集蛋白，则①组中同样会出现Flag条带 C．②组IP产物中无Myc条带，说明细胞内不表达SLC25a3蛋白 D．③组IP产物中有Myc条带，表明Nsp15能与SLC25a3结合 【答案】D 【详解】A、制备单克隆抗体时，需要从已免疫动物体内分离得到能产生抗体的浆细胞（效应B细胞），不是记忆B细胞，A错误； B、①组仅表达Flag-Nsp15，不表达Myc-SLC25a3，若用抗Myc抗体收集蛋白，无法捕获到Flag-Nsp15，不会出现Flag条带，B错误； C、从Input（总蛋白）结果可以看出，②组总蛋白有Myc条带，说明细胞内正常表达SLC25a3蛋白；IP产物无Myc条带是因为②组本身不表达Flag-Nsp15，无法被抗Flag抗体捕获，C错误； D、③组用抗Flag抗体收集蛋白时，沉淀中检测到Myc条带，说明Flag-Nsp15被捕获时，Myc-SLC25a3也一同被拉下来，证明Nsp15能与SLC25a3结合，D正确。 8．（2026·山东德州·二模）亚硫酸氢钠可以使DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，经过PCR扩增，该位置的胞嘧啶将被胸腺嘧啶替代，甲基化的胞嘧啶不受影响。如图为某基因单链部分初始序列和经亚硫酸氢钠处理并进行PCR后的序列。下列叙述错误的是（　　）    A．该基因转录时，图中单链作为转录模板链 B．经亚硫酸氢钠处理并PCR后的序列为a链 C．RNA聚合酶移动到114位对应碱基序列时终止转录 D．图示单链初始序列中共有3个未被甲基化的胞嘧啶 【答案】C 【详解】A、转录是以基因的一条链为模板进行的，图中单链能对应相应的氨基酸位置，说明该链能转录形成mRNA，最后翻译形成蛋白质（由相应的氨基酸连接而成），故该基因转录时，图中单链作为转录模板链，A正确； B、对比a链和b链，a链共有3个位置的C被替换为T，符合“未甲基化C→T”的处理结果，因此经处理PCR后的序列为a链，B正确； C、转录终止依赖DNA上的终止子序列，而终止密码子（UAA/UAG/UGA）是翻译过程中终止肽链合成的信号，位于mRNA上，与转录无关。因此，RNA聚合酶的转录过程不会因终止密码子而终止，C错误。 D、由B可知，共有3个胞嘧啶发生了C→T的替换，说明初始序列中有3个未甲基化的胞嘧啶，D正确。 9．（2026·陕西榆林·二模）利用转基因小鼠生产人源抗体的技术首先要敲除小鼠的抗体基因，再转入人的全套抗体基因，使得小鼠能够产生人源抗体。回答下列问题： (1)科研人员采取同源重组方法将小鼠胚胎干细胞（ES）中的鼠源抗体基因敲除。该方法需构建携带同源重组序列的载体，所用的载体需要含有标记基因，目的是________。 (2)获得敲除小鼠抗体基因的ES细胞后，需将人的抗体基因转入该细胞。该过程所用的BAC载体与含人抗体基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图1、图2所示。 ①为获得人抗体基因，需从人的________细胞中获取mRNA，在________酶的作用下获得cDNA。 ②用图中质粒和目的基因构建基因表达载体时，分别只需要一种限制酶和DNA连接酶便可实现，处理目的基因的限制酶是________，用该方法切割目的基因、质粒后可能出现目的基因的反向连接或________。 ③现已获得A和B两个重组质粒，欲要通过PCR扩增的方法，检测目的基因“正向”还是“反向”插入质粒，可选择图中“甲、丙”处碱基序列设计引物，若A重组质粒扩增出的片段长于B质粒，则_______质粒是“正向”接入的质粒。 (3)将重组的ES细胞注入野生型小鼠的________期胚胎，再通过________技术能够建立嵌合型小鼠，最后经过一系列操作能够产生人源抗体。 【答案】(1)便于检测目的基因是否导入到受体细胞 (2) 浆（B） 逆转录 Sau3A Ⅰ 目的基因以及质粒自身环化 B (3) 囊胚 胚胎移植 【详解】（1）标记基因的目的是便于检测目的基因是否导入到受体细胞（如抗生素抗性基因，可在含抗生素的培养基上筛选出成功导入载体的细胞）。 （2）①抗体基因只在浆（效应 B）细胞中表达，因此需从人的浆细胞中获取mRNA，在逆转录酶的作用下获得cDNA。 ②由图1可知，Hind Ⅲ在质粒上有两个酶切位点，不宜选用Hind Ⅲ来切目的基因，而BamH Ⅰ的识别序列是G↓GATCC，Sau3A Ⅰ 的识别序列是↓GATC，二者切割后产生的黏性末端相同；质粒上的BamH Ⅰ 位点可与目的基因的Sau3A Ⅰ位点互补。因此，处理目的基因的限制酶是Sau3A Ⅰ。 该方法切割后，可能出现的问题除了目的基因反向连接，还有目的基因及质粒自身环化。 ③若A重组质粒扩增出的片段长于B质粒，说明A中插入的目的基因更长，“甲” 与 “丙” 的距离较远，扩增出的片段较长，即A是反向接入的，故B质粒是“正向”接入的质粒。 （3）将重组的ES细胞注入野生型小鼠的囊胚期胚胎（囊胚期的内细胞团可发育为个体的各种组织），再通过胚胎移植技术将胚胎移入代孕母鼠子宫，建立嵌合型小鼠。 10．（2026·安徽淮南·二模）促红细胞生成素(EPO)是一种由肾脏和肝脏分泌的激素样物质，能够促进红细胞生成，用于治疗多种类型的贫血，包括肾性贫血、肿瘤相关性贫血等疾病。科学家拟用某质粒构建EPO基因表达载体，将其转入含有限制酶Xho Ⅰ和限制酶Sal Ⅰ的受体细菌，结合发酵工程来生产人类EPO，质粒上限制酶的酶切位点及这两种限制酶的识别序列如图所示。回答下列问题： (1)一般在肾脏或肝脏细胞中获取___________，再以其为模板合成不带内含子的EPO基因充当目的基因，并进行PCR扩增。 (2)基因表达时，3′端在启动子端的单链为转录模板，已知EPO基因的模板链是①链，为了能在所用受体菌中稳定存在并表达，应该在引物P1、P2的5′端分别添加___________酶的识别序列，原因是___________。 (3)经限制酶处理后的质粒和目的基因，在DNA连接酶的作用下，只带有一个目的基因的重组质粒有___________种类型，将这种重组质粒转入受体菌，一般要先用___________处理这些受体菌。 (4)从质粒上所带抗性基因角度分析，在含有氨苄青霉素的培养基上能够生长的受体菌不一定能合成EPO，理由是___________。 【答案】(1)EPO基因转录的mRNA (2) XhoI、SalI 只有在引物P1、P2的5′端分别添加XhoI、SalI，①链3′端位于启动子端的表达载体才不会被受体菌中的XhoI、SalI破坏，EPO基因能表达 (3) 2 CaCl2溶液 (4)①在含有氨苄青霉素的培养基上能生长的受体菌可能只有空载质粒；②携带了(反接)目的基因质粒，但又被受体菌中的XhoI、SalI将其从表达载体上切除(合理答案，答出1点即可) 【详解】（1）EPO基因在肾脏和肝脏细胞中表达，要获得不带内含子的EPO基因，可以在肾脏和肝脏细胞中获取其转录出的mRNA，再进行逆转录。 （2）题中所给限制酶为两种同尾酶，且受体菌中存在XhoⅠ和SalⅠ，已知EPO基因的模板链是①链，且3'端在启动子端的单链为转录模板，为保证目的基因能正确转录，且构建后的载体不会被受体菌中的XhoⅠ和SalⅠ破坏，所以只有在引物P1、P2的5′端分别添加XhoⅠ和SalⅠ酶的识别序列，这样保证连接后①链3′端位于启动子端的表达载体不会被受体菌中的XhoⅠ和SalⅠ破坏，EPO基因能表达。 （3）由于题中所给限制酶为两种同尾酶，经限制酶处理后的质粒和目的基因，在DNA连接酶的作用下，只带有一个目的基因的重组质粒有正接和反接两种类型，将这种重组质粒转入受体菌，一般用感受态细胞法，即要先用CaCl2溶液处理这些受体菌，让其能吸收周围环境中的DNA。 （4）在含有氨苄青霉素的培养基上能生长的受体菌可能只有空载质粒，空载质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，能在含氨苄青霉素的培养基上生长，但没有目的基因，所以不能合成EPO；也可能携带了(反接)目的基因质粒，会被受体菌中的XhoⅠ、SalⅠ将EPO基因从表达载体上切除，从而无法表达。 11．（2026·山东济宁·二模）为培育耐盐碱大豆新品种，科研人员把耐盐碱基因OsJRL40和荧光素酶基因构建成融合基因，荧光素酶可催化荧光素产生荧光以检测融合基因表达产生融合蛋白的情况，部分操作流程及可能用到的限制酶如图所示，其中DEX启动子在DEX诱导下才可发挥作用；AUG为起始密码子，UAA、UGA、UAG为终止密码子。回答下列问题。 (1)图中构建基因表达载体时，切割载体用到的限制酶有________。与单酶切相比，双酶切的优点是________（答出1点）。已知OsJRL40基因转录的非模板链的序列为：5'-ATGATCCAG……GCTGACTAG-3'，为构建融合基因，引物2的前10个碱基序列为________。 A．5'-AGATCTCTAG-3' B．5'-AGATCTGTCA-3' C．5'-GATCCTAGTC-3' D．5'-GATCGTCAGC-3' (2)在培养大豆细胞的基本培养液中添加________，若检测结果为________说明转化成功。成功后需要去除荧光素酶基因，已知Cre酶可以将DNA上两个相同loxP序列位点之间的片段切除，因此在设计引物3和引物4时需要在限制酶识别序列的________（填“5'端”或“3'端”）添加loxP序列。 (3)为检测荧光素酶基因是否被成功敲除，可用PCR技术进行鉴定。 实验组：首先提取在有DEX环境下培养的转基因大豆细胞质中的总RNA，进行逆转录获得cDNA，然后加入上图中的一对引物________进行PCR扩增后用BglⅡ完全切割，再进行琼脂糖凝胶电泳，观察有无OsJRL40基因和荧光素酶基因的条带。 对照组：用未经DEX环境下培养的转基因大豆细胞，其余同实验组。 若实验组敲除成功，则实验组和对照组的电泳结果分别为________。 【答案】(1) SacⅠ和XhoⅠ 避免目的基因、载体自身环化或反向连接（保证目的基因与载体正确连接） D (2) 荧光素 有荧光出现 3′端 (3) 1和4 实验组两种基因的条带都无，对照组两种基因的条带都有 【详解】（1）构建基因表达载体时，要将目的基因插入启动子和终止子之间，一般选用双酶切，避免目的基因、载体自身环化或反向连接（保证目的基因与载体正确连接），切割载体用到的限制酶有SacⅠ和XhoⅠ，不能选用Bgl II，若用该酶切会破坏质粒上的四环素抗性基因，导致后续无法对重组DNA分子进行筛选。已知OsJRL40转录非模板链末端为5'-…GCTGACTAG-3'，构建融合基因需要去除原终止密码UAG，引物2为下游引物，其5'端需要添加BglⅡ的识别序列（5'-AGATCT-3'，共6个碱基），剩余4个碱基与OsJRL40末端互补，GTCA，因此前10个碱基为5'-AGATCTGTCA-3'，B正确。基因中间有SauAI的识别切割序列， 不能选该酶。 （2）融合基因的表达依赖DEX启动子，而该启动子仅在DEX诱导下才能启动转录，才能诱导融合基因表达出荧光素酶，因此培养液中须添加荧光素，荧光素酶催化荧光素产生荧光，因此检测到细胞有荧光出现即可证明转化成功。loxP等额外序列必须添加在引物的3'端，才能使Cre酶将DNA上两个相同loxP序列位点之间的片段切除，完整保留目的片段两端。 （3）要扩增同时包含OsJRL40和荧光素酶基因的片段，需要选择OsJRL40上游的引物1和荧光素酶基因下游的引物4。Cre酶仅切除两个loxP序列之间的荧光素酶基因，OsJRL40基因不会被切除：实验组：DEX诱导Cre酶表达，荧光素酶基因被敲除，cDNA中仅保留OsIRL40基因，两种基因的条带都无；对照组：无DEX诱导，Cre酶不表达，荧光素酶基因完整保留。 12．（2026·内蒙古赤峰·二模）杜氏盐藻是一种具有极强耐盐性能的微生物，细胞内含有大量类胡萝卜素，如β-胡萝卜素、叶黄素等，现通过基因工程技术大量制备类胡萝卜素。回答下列问题。 (1)β-胡萝卜素具有较强的抗氧化作用，可作为膳食补充剂延缓细胞衰老，推测其作用原理为_____。 (2)DsOR基因参与类胡萝卜素的合成，为将该基因导入杜氏盐藻内，需利用Golden Gate技术构建重组pDTK001载体，过程如图1所示。BsmBⅠ是Golden Gate技术的核心工具酶，该酶的识别序列（5′-CGTCTC-3′）及切割位点如图2。 由图可知，BsmBI酶能识别特定DNA序列，而且切割位点在识别序列_____（填“内”或“外”），切断DNA中的_____键，产生_____（类型）末端，BsmBI酶切产生的末端最多有_____种。使用BsmBI酶可有效避免质粒自身环化、目的基因反向连接，原因是_____。 (3)将重组载体转入大肠杆菌后，接种在含氯霉素的培养基上，如果可以生成菌落，说明_____，但无法确认目的基因是否插入，需进一步筛选颜色为_____（填“红”或“白”）的菌落，即含有目的基因的重组质粒，理由是_____。 【答案】(1)β- 胡萝卜素可清除细胞内的自由基，减少对细胞的氧化损伤，延缓细胞衰老 (2) 外 磷酸二酯 黏性 1024（或45） 识别位点与切割位点分离，可使质粒和目的基因产生不同的、非互补的黏性末端，质粒两端无法自身互补连接，目的基因也只能按特定方向与质粒连接 (3) 质粒导入成功 白 目的基因成功插入，Crt基因被破坏，无法表达红色荧光，为白色 【详解】（1）细胞衰老的一个重要原因是细胞内的自由基会攻击细胞内的生物分子，造成氧化损伤，进而加速细胞衰老。β-胡萝卜素具有较强的抗氧化作用，它可以清除细胞内产生的自由基，减少自由基对细胞的氧化损伤，从而达到延缓细胞衰老的效果。 （2）从图2的酶切位点示意图可以看到，BsmBI酶的切割位点在它识别序列（5'-CGTCTC-3'）的外侧，也就是识别序列之外的DNA区域。限制酶切割DNA分子时，作用的是DNA链中的磷酸二酯键，将其切断从而使DNA链断裂。BsmBI酶切割后产生的是黏性末端，也就是DNA链末端有一段单链突出的部分。因为识别序列里的N代表任意一种碱基，每个N都有4种碱基选择，一共有5个N，所以末端的种类最多有45=1024种。BsmBI酶的识别位点与切割位点是分离的，它切割质粒和目的基因后，会让质粒和目的基因产生不同的、非互补的黏性末端。这样一来，质粒两端的黏性末端无法互补配对，就避免了自身环化；同时目的基因只能按照特定的方向和质粒的黏性末端互补连接，也就防止了目的基因反向连接。 （3）培养基中含有氯霉素，而质粒上带有CmR（氯霉素抗性基因），如果大肠杆菌在这种培养基上能生长形成菌落，说明质粒成功导入了大肠杆菌，因为只有导入质粒的大肠杆菌才能获得氯霉素抗性，在含氯霉素的培养基上存活繁殖。质粒上的Crt是报告基因，它可以使大肠杆菌呈现红色。当目的基因成功插入质粒后，会破坏Crt基因的结构，导致Crt基因无法正常表达，大肠杆菌也就不能合成使它呈现红色的物质，所以含有目的基因的重组质粒的大肠杆菌菌落是白色的。 13．（2026·山西临汾·二模）免疫调节因子白细胞介素-2（IL-2）对机体的免疫应答和抗病毒感染等有重要作用。某科研团队将IL-2基因和质粒pPIC9K构建成重组质粒，并导入酵母菌GS15（组氨酸缺陷菌株，不能合成组氨酸）中，筛选出能分泌IL-2的工程菌。回答下列问题。 (1)为保证连接的准确性，构建携带IL-2基因的重组质粒时应选择限制酶______和______对目的基因和质粒pPIC9K进行双酶切。若限制酶切割后产生了平末端，最好选用______酶进行连接。 (2)PCR扩增IL-2基因需要两种引物。将一个IL-2基因进行PCR扩增，进行30次循环，每种引物至少需要______个。引物的作用是______。 (3)根据题中信息分析，若要筛选出导入质粒的酵母菌，可采用______的培养基培养酵母菌。 (4)制备能分泌IL-2的工程菌选用酵母菌作为受体细胞，而不用大肠杆菌，从细胞结构与功能的角度分析，原因是______。 【答案】(1) EcoRI SamⅠ T4DNA连接酶 (2) 230-1 使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 (3)不含组氨酸 (4)酵母菌是真核生物，细胞内有内质网和高尔基体，可以对IL-2进行加工修饰，而大肠杆菌是原核生物，细胞内没有内质网和高尔基体 【详解】（1）为保证连接的准确性，需要采用双酶切将目的基因和质粒进行切割，由于SacⅠ会破坏启动子，AvrⅠ会破坏目的基因，因此在构建携带IL-2基因的重组质粒时应选择限制酶EcoRI和SamⅠ对目的基因和质粒pPIC9K进行双酶切。若限制酶切割后产生了平末端，最好选用T4DNA连接酶进行连接，因为该酶连接平末端效率较高。 （2）PCR扩增IL-2基因需要两种引物。将一个IL-2基因进行PCR扩增，进行30次循环，获得的DNA片段为230个，每合成一条单链均需要连接相应的引物，且需要两种引物的数目相等，因此在这30次循环中需要每种引物至少（230×2-2）÷2=230-1个。引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，保证子链的延伸。 （3）根据题中信息分析，若要筛选出导入质粒的酵母菌，由于质粒上的标记基因是组氨酸合成基因，因此可采用不含组氨酸的培养基培养酵母菌，在其上能够生长的就是导入质粒的酵母菌。 （4）制备能分泌IL-2的工程菌选用酵母菌作为受体细胞，而不用大肠杆菌，这是因为酵母菌是真核生物，细胞内有内质网和高尔基体，可以对IL-2进行加工修饰，而大肠杆菌是原核生物，细胞内没有内质网和高尔基体，因而其合成的蛋白质还需要在体外进一步加工。 14．（2026·西藏拉萨·二模）烟草花叶病毒（TMV）是导致烟草花叶病的病原体之一，对烟草产量影响极大。为培育抗TMV的转基因烟草，科研人员进行了如图所示的操作。 据图回答下列问题： (1)Ti质粒中启动子的基本组成单位是______；启动子的功能是___________；载体中人工构建的诱导型启动子，在诱导物存在时，可以______目的基因的表达。 (2)农杆菌转化法中的转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内______的过程。为将抗TMV基因整合到烟草细胞的染色体DNA上，应将其插入Ti质粒的T-DNA序列中，该基因能整合到烟草细胞的染色体DNA上的原理是____________________。 (3)过程①中应选择下列引物中的______（填字母），通过PCR技术在抗TMV基因的上游加入限制酶SpeⅠ的识别序列。为构建正确的重组质粒，还应在该基因的下游加入限制酶______的识别序列。 a. b. c. d. (4)过程②中，一般要用处理农杆菌细胞，使农杆菌细胞处于一种____的生理状态，从而提高重组质粒进入农杆菌细胞的效率。 (5)为培育转基因烟草植株，过程④⑤的培养基中需添加生长素和细胞分裂素，原因是________。 【答案】(1) 脱氧（核糖）核苷酸 RNA聚合酶识别和结合的位点，驱动基因转录出mRNA 激活或抑制 (2) 维持稳定和表达 农杆菌侵染烟草细胞后，能将Ti质粒的T-DNA转移到烟草细胞，并将其整合到烟草细胞的染色体DNA上 (3) c EcoRⅠ (4)能吸收周围环境中DNA分子 (5)生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素 【详解】（1） 启动子是一段有特殊结构的DNA片段，而DNA的基本组成单位是脱氧（核糖）核苷酸，所以Ti质粒中启动子的基本组成单位是脱氧（核糖）核苷酸。启动子的功能是RNA聚合酶识别和结合的位点、驱动基因转录出mRNA。载体中人工构建的诱导型启动子，在诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。 （2）农杆菌转化法中的转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。农杆菌侵染烟草细胞后，能将Ti质粒的T-DNA转移到烟草细胞，并将其整合到烟草细胞的染色体DNA上，所以将抗TMV基因插入到Ti质粒的T-DNA序列中。 （3） 根据题意，要通过PCR技术在抗TMV基因的上游加入限制酶SpeⅠ的识别序列，SpeⅠ的识别序列是5'-ACTAGT-3'，且根据抗TMV基因的转录模板链序列可知其对应的互补链碱基序列为5'-TCTGTTGAAT---ATCATCCAAG-3'，由于转录的方向是从模板链的3'端向5'端进行，因此图示的抗TMV基因的转录模板链左侧需有限制酶SpeⅠ的识别序列，因此应选择的引物序列为5'-ACTAGTTCTGTTGAAT-3'（即为c）；为构建正确的重组质粒，还应在该基因的下游加入限制酶EcoRⅠ的识别序列，因为结合Ti质粒的图示及四种限制酶识别序列和切割位点可知，限制酶SpeⅠ和限制酶XbaⅠ切割后会形成相同的黏性末端。 （4）过程②中，用Ca2+处理农杆菌细胞，可使农杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这样能提高重组质粒进入农杆菌细胞的效率。 （5）生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素，所以为培育转基因烟草植株，过程④⑤的培养基中需添加生长素和细胞分裂素。 试卷第1页，共3页 试卷第1页，共3页 学科网（北京）股份有限公司 ( PCR技术及应用 热点聚焦 ) 1．（2026·湖北襄阳·二模）华中科技大学朱斌团队从深海火山细菌体内的噬菌体中发现了一种不依赖于引物的DNA聚合酶，该聚合酶可在没有引物的情况下参与DNA合成，与PCR反应相比，下列叙述正确的是（　　） A．PCR反应中，DNA聚合酶可在引物的5'端添加游离的脱氧核苷酸 B．该DNA聚合酶易在噬菌体中引入基因突变和染色体变异，利于在复杂多变的深海环境中生存 C．PCR反应包括变性、复性、延伸三个阶段，延伸阶段的温度最高，复性阶段的温度最低 D．深海火山的环境有利于DNA解旋成单链，该噬菌体的DNA复制过程可能需要Mg2+的参与 【答案】D 【详解】A、DNA合成的方向为5'→3'，PCR反应中DNA聚合酶只能在引物的3'端添加游离的脱氧核苷酸，A错误； B、噬菌体是DNA病毒，无细胞结构，不存在染色体，无法发生染色体变异，B错误； C、PCR反应的三个阶段中，变性阶段温度最高（通常90~95℃，使DNA解旋为单链），延伸阶段温度次之（通常70~75℃），复性阶段温度最低（通常55~60℃，使引物结合到模板链），C错误； D、深海火山环境温度高，高温可断裂DNA双链间的氢键，有利于DNA解旋成单链；Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，DNA复制过程通常需要Mg2+参与，D正确。 2．（2026·山东济宁·二模）下列关于DNA的粗提取、鉴定、扩增与电泳的叙述，正确的是（    ） A．提取到的白色丝状物直接与二苯胺试剂混合，沸水浴加热后变蓝 B．DNA电泳后，被染色的DNA需置于波长为300nm的紫外灯下观察 C．凝胶载样缓冲液中加入的指示剂能与DNA分子结合，用于观察电泳进程 D．PCR扩增时a个DNA模板分子完成30轮循环共需要a×（230-2）个引物 【答案】B 【详解】A、提取到的白色丝状物需要溶解后，再与二苯胺试剂混合，沸水浴加热后变蓝，A错误； B、DNA进行琼脂糖凝胶电泳后，电泳被染色的DNA在波长为300nm的紫外灯下可观察到对应的条带，B正确； C、凝胶载样缓冲液中的指示剂不会与DNA分子结合，其迁移速率固定，仅通过自身位置指示电泳的进程，C错误； D、PCR扩增时，1个DNA模板完成n轮循环需要的引物总数为2×(2ⁿ-1)，因此a个模板完成30轮循环共需要a×(2³¹-2)个引物，D错误。 3．（2026·内蒙古包头·二模）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列叙述正确的是（    ） A．PCR扩增DNA片段时DNA双链的解聚原理与细胞内相同 B．耐高温的DNA聚合酶可直接在模板链的3′端从头合成子链 C．电泳可鉴定不同长度的DNA分子是因为它们在凝胶中的迁移速率不同 D．染色后的凝胶条带的位置可以反映DNA分子碱基序列的组成 【答案】C 【详解】A、细胞内DNA双链解聚依赖解旋酶断裂氢键，PCR扩增时DNA双链解聚依赖高温使氢键断裂，二者原理不同，A错误； B、耐高温的DNA聚合酶不能从头合成子链，只能从引物的3′端开始延伸子链，反应体系中需要加入引物才能启动子链合成，B错误； C、DNA分子带负电，在电场作用下向正极迁移，不同长度的DNA分子在凝胶中的迁移速率不同（分子量越小迁移速率越快），因此可通过电泳分离鉴定不同长度的DNA分子，C正确； D、染色后的凝胶条带的位置仅反映DNA分子的分子量（长度）大小，无法反映DNA分子的碱基序列组成，D错误。 4．（2026·河北保定·二模）实时荧光定量PCR（qPCR）通过在反应体系中加入荧光探针，实时监测PCR 产物量的变化，进而实现核酸的定量分析（其中荧光强度与PCR 产物量呈正相关）。Ct值指荧光信号达到设定阈值时的循环数。下列关于qPCR 的叙述错误的是（    ） A．qPCR 实验结果中，Ct值越大，说明初始模板核酸的量越少 B．可通过该技术检测样本中病毒核酸的含量，为传染病的诊断提供依据 C．不同浓度的初始核酸样品与其所对应的 Ct值绘制成的坐标曲线属于数学模型 D．qPCR 实验中，引物需与模板DNA 互补配对，且引物含量越多越好 【答案】D 【详解】A、Ct值为荧光信号达到设定阈值时的循环数，初始模板核酸量越少，需要更多次扩增循环才能积累到足够产物使荧光达到阈值，因此Ct值越大说明初始模板核酸量越少，A正确； B、qPCR可定量分析核酸含量，因此可检测样本中病毒核酸的含量，判断是否感染病毒及感染程度，为传染病诊断提供依据，B正确； C、坐标曲线属于数学模型的常见呈现形式，因此不同浓度初始核酸样品和对应Ct值绘制的坐标曲线属于数学模型，C正确； D、qPCR中引物需要和模板DNA互补配对，但引物并非越多越好，引物含量过高易形成引物二聚体、增加非特异性扩增的概率，反而会干扰PCR反应正常进行，D错误。 5．（2026·浙江嘉兴·二模）人类X染色体上的DMD基因发生某些外显子缺失会导致DMD症。检测方法是针对每个外显子的特定序列，设计二段独特的单链DNA探针，每段探针包含两部分序列：特异性序列和通用引物序列。检测时先对受检者的DNA进行变性，再加入探针并退火，如果受检者该外显子序列正常存在，退火时对应的探针两部分会紧邻地结合上去，退火后加入连接酶将两段探针连接成一个完整的探针分子（如图所示）。连接后加入通用引物等物质进行PCR，最后将扩增产物进行电泳分离并分析结果。 下列叙述正确的是（　　） A．PCR时，用于扩增不同外显子的引物是不同的 B．PCR时，未成功连接的探针不能与引物结合 C．电泳分离时，女性携带者会出现某个外显子对应条带的缺失 D．电泳分离时，男性患者会出现某个外显子对应条带的缺失 【答案】D 【详解】A、因为探针是针对每个外显子的特定序列设计的，且每段探针包含特异性序列和通用引物序列，不同外显子的碱基序列不同，因此识别它们的特异性序列不同，但是通用序列一样，而题目说的是特异序列去连接，而通用序列去扩增，所以说用于扩增的引物是通用引物，是一样的，A错误； B、通用引物结合的是探针中的通用引物序列，未成功连接的探针仍然含有完整的通用引物序列，因此完全可以与通用引物结合，只是因为两段探针未连接、且没有对应的特异性序列结合模板DNA，PCR无法有效扩增出目标片段，B错误； C、因为有携带者，所以说DMD是X染色体隐性遗传病，假设女性携带者的基因型为XDXd，女性细胞内有两条X染色体，其中一条正常染色体上的外显子序列完整，能正常结合探针并连接、扩增，所以说女性携带者电泳结果中，所有外显子对应的条带都存在，不会出现条带缺失，C错误； D、男性患者的基因型为XdY，所以说男性仅有的一条X染色体上发生了外显子缺失，该位点无法特异性结合探针并连接形成完整模板，因此PCR无法扩增出该外显子的片段，电泳结果中对应位置的条带会缺失，D正确。 6．（2026·山东枣庄·二模）荧光定量PCR技术是在常规PCR基础上添加了荧光探针，可以通过荧光强弱来反映DNA合成量的多少。荧光探针是一段单链的与目的基因特异性互补片段，其5′端含荧光基团（R），3′端含淬灭基团（Q）。由于淬灭基团与荧光基团距离太近，荧光探针不发荧光如图一，随着DNA的合成，探针被降解，从而发出荧光如图二。PCR的产物一般通过电泳技术进行分离，下列说法错误的是（　　） A．如图所示PCR进行n轮，分解的探针数量为2n-1 B．相同长度的线性DNA和质粒的电泳速度不同 C．电泳缓冲液可以用于配制琼脂糖溶液 D．探针被降解是由于DNA聚合酶可以从其3′端切开磷酸二酯键 【答案】D 【详解】A、探针仅能与目的基因的一条模板链特异性结合，每一轮扩增中，每个待延伸的该模板链都会对应降解1个探针。n轮扩增中，降解探针总数为等比数列求和1+2+4+...+2n−1=2n−1，A正确； B、在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。相同长度的线性DNA和质粒构象不同，质粒多为环状构象，电泳迁移速率与线性DNA不同，因此电泳速度不同，B正确； C、琼脂糖凝胶电泳中，通常用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，保证凝胶的离子环境与缓冲能力，C正确； D、DNA聚合酶沿新链5′→3′方向延伸，探针5′端靠近延伸方向，DNA聚合酶利用5′→3′外切酶活性，从探针的5′端切开磷酸二酯键降解探针，不是从3′端切割，D错误。 ( 1 ) 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题08 生物技术与工程 4大题型概览 题型1 发酵工程 题型2 细胞工程 题型3 基因工程及应用 热点聚焦 PCR技术及应用 ( 发酵工程 题型 1 ) 1．（2026·江西萍乡·二模）浆水是西北地区的传统饮品，常以蔬菜和面汤为原料，主要利用乳酸菌自然发酵而成，味道微酸爽口，有解暑开胃之效。传统发酵过程如下图，发酵工程则多采用人工接种，在现代发酵罐内进行大规模生产。下列分析错误的是（    ） A．两种发酵过程中，乳酸菌都是先无丝分裂快速增殖，再进行无氧发酵产生酸味物质 B．传统发酵时的热烫处理起到消毒作用，发酵工程则须对原料和发酵设备进行严格灭菌 C．发酵工程中接种扩大培养的优良纯种菌液，相当于传统发酵过程中的加“引子” D．为监测发酵进程，利用细菌计数板进行菌种计数的结果通常高于稀释涂布平板法 2．（2026·河北保定·二模）科研团队从垃圾填埋场筛选高效降解聚乳酸（PLA）的微生物，流程为：①将土壤样品稀释涂布到以PLA 为唯一碳源的固体培养基上；②挑取单菌落纯化；③刚果红染液处理，筛选透明圈与菌落直径比值大的菌株。下列叙述错误的是（    ） A．步骤①的培养基为选择培养基，可抑制非 PLA 降解菌生长 B．步骤①和②的接种方法均为稀释涂布平板法，需无菌操作 C．透明圈与菌落直径比值越大，一般说明菌株降解 PLA 能力越强 D．筛选出高效降解 PLA 的菌株后，常用液体培养基进行扩大培养 3．（2026·广东湛江·二模）“筛选”是分离和培养微生物中常用的方法。下列实验中筛选原理与其他三项明显不同的是（    ） A．从诱变处理的菌液中筛选高产菌株 B．从腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌 C．从被石油污染的土壤中筛选石油降解菌 D．从热泉中筛选水生栖热菌以提取Taq DNA聚合酶 4．（2026·福建龙岩·二模）除草剂莠去津是一种含氮的有机物，长期使用易对土壤造成污染。研究人员从土壤中筛选莠去津降解菌的过程如下图所示（含过量莠去津的固体培养基不透明）。下列叙述错误的是（　　） A．从A瓶到C瓶的目的是逐步稀释培养液中的目的菌 B．应选择固体培养基中出现的有透明带菌落进行再纯化 C．图中进行再纯化的接种过程至少需要灼烧6次接种环 D．实验过程中需设置未接种的培养基作为对照 5．（2026·安徽马鞍山·二模）某谷氨酸发酵工厂遭遇专性噬菌体污染，技术人员采用双层平板法测定该噬菌体浓度：先在无菌培养皿中倒入含2%琼脂的培养基凝固成底层平板，再将含1%琼脂的培养基与敏感指示菌、待测噬菌体稀释悬液混匀后铺成上层平板（见下图）。恒温培养后，可根据噬菌斑数目计算原液中噬菌体数量。下列叙述正确的是（　　） A．该实验中选用的敏感指示菌为大肠杆菌 B．上下层培养基营养成分应保持一致 C．上层培养基琼脂浓度越低越利于计数 D．对生产空间的灭菌即可彻底杜绝噬菌体污染 6．（2026·天津·二模）动物细胞培养时操作不当会造成“黑胶虫”细菌的污染，该菌对氯霉素敏感，高温会使氯霉素失活。下列叙述错误的是（    ） A．配制细胞培养基时，湿热灭菌后加血清（含细胞生长必需蛋白）和氯霉素 B．在加入氯霉素防治“黑胶虫”污染过程中，需要同时考虑对细胞和细菌生长的影响 C．考察“黑胶虫”污染程度时，应取细胞培养液等比稀释后涂布在平板上培养计数 D．采用更换培养基、胰蛋白酶处理和分瓶培养等操作可清除“黑胶虫”污染 7．（2026·河北唐山·二模）某同学利用传统发酵技术酿制葡萄酒，下列操作错误的是（    ） A．为了减少杂菌污染，对葡萄进行消毒处理 B．为防止杂菌污染，排气时没有完全打开罐口 C．为提高酒精发酵效率，控制发酵温度在18～30℃ D．若观察到发酵液表面形成一层菌膜，则应停止发酵 8．（2026·四川遂宁·二模）《尚书·说命》中“若作酒醴，尔惟曲蘖”的意思是如果你要酿造甜酒（酒醴），关键在于用好曲和蘖（发芽的谷物）。以下说法错误的是（　　） A．实验室纯培养“曲”中菌种使用牛肉膏蛋白胨培养基 B．“曲”中微生物能利用糖化后的有机物发酵产生酒精 C．“蘖”中产生的赤霉素促进淀粉酶合成从而完成糖化 D．在发酵工程制酒过程中代谢物生成在主发酵阶段完成 9．（2026·安徽宣城·二模）沙棘汁富含维生素C和黄酮类物质，是天然抗氧化剂。桦树液中则含有桦木酸等成分，两者混合发酵制酒，不仅能延长保质期，还增强了保健功能。桦树液沙棘复合酒发酵工艺加工流程及优化结果如图所示，下列叙述正确的是（    ） A．发酵工程的中心环节是灭菌，经过严格灭菌才能保证产品品质 B．若糖度过高会抑制酵母菌的生长，可通过添加适量纯净水调节 C．接种后的罐内发酵过程应保持严格的无氧环境，从而进行充分的酒精发酵 D．发酵结束后还可从酵母菌中提取单细胞蛋白作为食品添加剂 10．（2026·山东日照·二模）传统白酒多以泥窖为发酵基础，多年反复利用的老窖池内壁窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物。下列有关说法正确的是（    ） A．从窖泥中分离的酿酒酵母扩大培养时，需在密闭环境中进行 B．从谷物原料发酵形成的酒糟中，可分离出产淀粉酶的微生物 C．发酵过程中，可将发酵池温度调至30～35℃加快发酵进程 D．窖池密封不严使酒变酸可能是混入的乳酸菌产生乳酸引起的 ( 细胞工程 题型 2 ) 1．（2026·山东济南·二模）科研人员提取患者自体CD34+造血干细胞，在体外通过CRISPR/Cas9编辑BCL11A基因启动子上游的序列，从而抑制BCL11A基因的表达，重新激活胎儿血红蛋白的表达，替代异常的成人血红蛋白以根治镰状细胞贫血。下列有关说法正确的是（    ） A．该治疗方案使用患者自体造血干细胞进行编辑和回输是由于干细胞在体外更容易增殖 B．经过该疗法治疗的患者，其生殖细胞的基因也被同步修复，后代将不再患病 C．在体外培养和编辑CD34+造血干细胞的过程中，需要严格保持无菌条件 D．若基因编辑过程中存在非目标位点被编辑的现象，其原因是BCL11A基因发生了基因突变 2．（2026·广东韶关·二模）牧草紫花苜蓿富含蛋白，但易造成家畜鼓胀病。百脉根富含的单宁可结合蛋白，避免鼓胀病。科学家以二者为材料培育了抗鼓胀病的牧草新品种，如图所示。下列叙述错误的是（    ） 注：IOA抑制细胞呼吸第一阶段，R-6G抑制线粒体功能，两者均为不可逆抑制 A．为获得原生质体，需要在含有体细胞的清水中加入适量的纤维素酶和果胶酶 B．PEG诱导原生质体融合后，未融合或同种融合的细胞无法继续生长和增殖 C．愈伤组织在固体培养基和黑暗条件下培养，可发生基因的选择性表达 D．该过程克服了远缘杂交不亲和的障碍，实现了基因组的重组，但不属于有性生殖 3．（2026·四川乐山·二模）核苷酸合成有两个途径，物质A可以阻断其中的全合成途径（如图）。正常细胞内含有补救合成途径所必需的转化酶和激酶，制备单克隆抗体时选用的骨髓瘤细胞中缺乏转化酶。现用加入H、A、T三种物质的“HAT培养基”来筛选特定的杂交瘤细胞。下列说法正确的是（    ） A．未融合的B细胞及其同型融合细胞因全合成途径被A阻断而在HAT培养基上不能增殖 B．因为杂交瘤细胞可以进行上述两个途径，所以它能在HAT培养基上大量增殖 C．未融合的骨髓瘤细胞及其同型融合细胞因无法进行上述两个途径而在HAT培养基上不能增殖 D．HAT培养基所筛选出的杂交瘤细胞既能大量增殖又能产生高纯度的目标抗体 4．（2026·重庆沙坪坝·二模）2009年科学家利用小鼠肠道的成体干细胞培育出首个肠道类器官，类器官是由干细胞在体外诱导分化形成的具有器官特性的细胞集合体｡下列叙述错误的是（　　） A．对类器官中某种细胞的蛋白质种类进行分析，可判断其细胞类型 B．干细胞在体外培育形成类器官，证明动物细胞具有全能性 C．肠道成体干细胞具有组织特异性，一般只能分化成特定的组织或细胞 D．若类器官来源于自体细胞，移植回病人体内理论上可避免免疫排斥反应 5．（2026·广东江门·二模）我国科研团队利用体细胞核移植技术成功获得一批基因编辑克隆牛，实现了奶牛优良种质的高效扩繁。科研团队首先从高产奶牛耳部采集成纤维细胞进行培养，再将细胞核移植到去核卵母细胞中，从而构建重构胚，并移植到受体牛子宫内，最终获得克隆牛。下列相关叙述正确的是（　　） A．从高产奶牛耳部采集的成纤维细胞具有发育的全能性，可直接发育成完整个体 B．培养成纤维细胞时，若出现接触抑制现象，则常用胃蛋白酶处理后再进行传代培养 C．重构胚可以用电刺激或Ca2+载体等激活，使其完成细胞分裂和早期胚胎发育 D．克隆牛的核遗传物质与高产奶牛的完全一致，因此其性状与高产奶牛的完全相同 6．（2026·广东江门·二模）帕利珠单抗是一种用于预防呼吸道合胞病毒（RSV）感染的单克隆抗体药物，其通过中和病毒发挥保护作用。下列叙述正确的是（　　） A．该单克隆抗体可由细胞毒性T细胞与骨髓瘤细胞融合制备 B．该单克隆抗体与RSV特异性结合后，可直接裂解被病毒感染的靶细胞 C．该单克隆抗体进入机体后，可诱导机体产生长期免疫记忆 D．制备该单克隆抗体时，需要先用RSV抗原对小鼠进行免疫 7．（2026·河北邯郸·二模）利用囊胚的细胞经过动物细胞培养获得大量的胚胎干细胞，从而获得多种类型的体细胞，以下为培育的流程图。下列叙述正确的是（    ） A．图中a、b细胞的遗传物质完全相同，这两类细胞均发育为胎儿的组织 B．囊胚外面的透明带会一直保护着胚胎，否则胚胎将无法正常发育 C．a处细胞需经胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理，胚胎干细胞在液体培养基中只能悬浮生长 D．②过程为细胞分化，胚胎干细胞可分化为各种组织细胞，这体现胚胎干细胞的全能性 8．（2026·广东东莞·二模）黄曲霉毒素（AFB）是黄曲霉产生的一种致癌物质。为准确检测环境中的AFB，科研人员利用小鼠制备抗AFB的单克隆抗体（AFB单抗），过程如图示。下列叙述正确的是（    ） A．向小鼠注射AFB的目的是刺激机体发生细胞免疫 B．病毒能诱导动物细胞融合，而灭活的病毒失去该能力 C．细胞乙和细胞丙都需先经过克隆化培养再进行筛选 D．悬浮生长的细胞丁传代培养时，可用离心法收集细胞 9．（2026·山西·二模）奶牛的自然繁殖率受遗传、营养、管理等多重因素制约，已成为限制高产奶牛种群快速扩繁和牧场经济效益的瓶颈。科研人员利用如图所示的①②两种途径繁殖高产奶牛，以解决上述问题。下列叙述错误的是（　　） A．经①和②路径获得的子代中，仅①需进行性别鉴定 B．细胞甲处于MⅡ期，该细胞含有一个完整的细胞核 C．②路径中，获得重构胚与激活重构胚均可用电处理 D．为获得基因组成相同的子代，可运用胚胎分割技术 10．（2026·内蒙古赤峰·二模）科研人员通过植物体细胞杂交技术，利用甲种花卉（2N=18）和乙种花卉（2N=24）培育出兼具二者优良性状的新品种。下列叙述正确的是（　　） A．可用电融合法、PEG融合法或灭活的病毒诱导原生质体融合 B．对两种动物细胞进行相似的操作也可在体外诱导多倍体产生 C．整个培育过程需要无菌操作，故不需要更换培养基 D．该过程利用了细胞的全能性和细胞膜的流动性 试卷第1页，共3页 试卷第1页，共3页 学科网（北京）股份有限公司 ( 基因工程及应用 题型 3 ) 1．（2026·陕西榆林·二模）科研人员从耐旱植物拟南芥中分离出耐旱基因DREB1A，并利用基因工程技术将其导入水稻，培育抗旱水稻。大致流程为：利用PCR技术扩增DREB1A基因后，将其与含有花椰菜花叶病毒35S启动子、终止子和潮霉素抗性基因的Ti质粒连接，构建成基因表达载体；随后通过农杆菌转化法导入水稻细胞，经过筛选、培养和鉴定获得转基因水稻植株。下列叙述错误的是（　　） A．PCR扩增DREB1A基因时，需根据DREB1A基因两端的碱基序列设计两种引物 B．构建基因表达载体时，35S启动子应位于DREB1A基因的上游，终止子位于其下游 C．农杆菌转化法中，水稻细胞作为受体细胞时，需先用酶去除其细胞壁制备成原生质体 D．用潮霉素对导入质粒的农杆菌进行筛选，能存活的不一定成功导入了DREB1A基因 2．（2026·广东韶关·二模）关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”的实验原理及操作步骤。下列叙述错误的是（    ） A．DNA溶于酒精，加入冷酒精析出的白色丝状物即为蛋白质杂质 B．DNA在沸水浴条件下遇二苯胺试剂显蓝色，此时DNA的双螺旋结构已解开 C．DNA片段在电泳时的迁移速率与DNA分子量的大小和构象有关 D．指示剂不会使DNA着色，待指示剂前沿接近凝胶边缘时停止电泳 3．（2026·广东佛山·二模）BUF1基因是稻瘟病菌的关键基因，其功能正常时病菌为深色。Cas12a系统包含向导RNA和Cas12a蛋白，向导RNA识别特定DNA位点（靶点）后，Cas12a蛋白可对该位点进行剪切。为获得弱致病性的稻瘟病菌突变体，研究者利用Cas12a系统对BUF1基因进行编辑，如图a。将转化后的稻瘟病菌进行选择培养，并进行PCR和电泳检测，结果如图b。下列分析错误的是（　　） A．Cas12a蛋白通过水解DNA上的磷酸二酯键发挥作用 B．选择培养基上需添加潮霉素，浅色菌落对应目标菌株 C．根据电泳结果，可确定菌株2为编辑成功的目标菌株 D．筛选得到的目标菌株可用于培育抗稻瘟病水稻的研究 4．（2026·山西运城·二模）大肠杆菌的pBR322质粒常用于重组质粒的构建，该质粒上限制酶识别位点如图1所示。受体菌可能导入重组质粒或pBR322质粒，需要在培养基中添加抗生素进行初筛和复筛。将初筛培养基上的菌落原位影印（将菌落按原有位置影印到另一培养基上）到复筛培养上培养，1～6表示菌落，结果如图2所示。下列有关分析正确的是（　　） A．若目的基因和pBR322质粒用BamHⅠ、EcoRⅠ切割，则初筛培养基要添加四环素 B．若目的基因和pBR322质粒用BclⅠ、HindⅢ切割，则复筛培养基要添加氨苄青霉素 C．若目的基因和pBR322质粒用BamHⅠ、EcoRⅠ切割，则菌落3、4、6导入的是重组质粒 D．若目的基因和pBR322质粒用BclⅠ、HindⅢ切割，则菌落1、2、5导入的是pBR322质粒 5．（2026·山东日照·二模）基因工程中，使用单个限制酶酶切构建的表达载体易出现连接方向错误和重复插入目的基因片段等现象，可通过酶切及筛选标记鉴定出符合预期的重组质粒。研究人员将目的基因CDS插入质粒P的SacⅡ位点后，对重组质粒进行扩增、筛选和检测。P和CDS结构如图所示。下列叙述错误的是（    ） 注：X-gal被LacZ基因表达产物分解成蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则为白色。 A．重组质粒被PstⅠ完全酶切后电泳可能会获得长度为9.4kbDNA片段 B．用EcoRⅠ与SacⅡ完全酶切重组质粒，可得到2个长度的DNA片段 C．用EcoRⅠ与PstⅠ完全酶切重组质粒，可判断CDS基因的连接方向 D．将含重组质粒的细胞涂布在含X-gal的培养基上，菌落颜色为白色 6．（2026·陕西商洛·二模）基因工程中常用不同限制酶切割DNA，下表为几种限制酶的识别序列及其在某质粒上的切割位点数。下列叙述正确的是（    ） 限制酶 识别序列及切割位点 质粒上切割位点数 EcoRⅠ 5′G↓AATTC3′ 1处 HindⅢ 5′A↓AGCTT3′ 0处 BamHⅠ 5′G↓GATCC3′ 1处 BclⅠ 5′T↓GATCA3′ 1处 Sau3AⅠ 5′↓GATC3′ 3处 A．Sau3AⅠ可切割BamHⅠ和BclⅠ的识别序列，说明Sau3AⅠ不具有专一性 B．质粒经BamHⅠ和BclⅠ双酶切后，在DNA连接酶作用下可重新环化 C．构建重组质粒时，可选择EcoRⅠ和HindⅢ对该质粒和目的基因进行双酶切 D．用BamHⅠ和Sau3AⅠ完全切割该质粒，该质粒可被切割为4段 7．（2026·广东广州·二模）为探究猪流行性腹泻病毒蛋白Nsp15是否与宿主蛋白SLC25a3结合，研究人员构建两种重组质粒分别表达融合蛋白Flag-Nsp15和Myc-SLC25a3，转化后获得三组细胞（①、②、③）。利用抗Flag抗体分别收集各组中能与之结合的蛋白，再分别用抗Flag、抗Myc的单克隆抗体检测，同时取各组细胞总蛋白进行相同检测，结果如图所示。下列分析正确的是（    ） A．制备抗Flag单克隆抗体时需在已免疫动物体内分离得到记忆B细胞作为材料 B．若使用抗Myc抗体收集蛋白，则①组中同样会出现Flag条带 C．②组IP产物中无Myc条带，说明细胞内不表达SLC25a3蛋白 D．③组IP产物中有Myc条带，表明Nsp15能与SLC25a3结合 8．（2026·山东德州·二模）亚硫酸氢钠可以使DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，经过PCR扩增，该位置的胞嘧啶将被胸腺嘧啶替代，甲基化的胞嘧啶不受影响。如图为某基因单链部分初始序列和经亚硫酸氢钠处理并进行PCR后的序列。下列叙述错误的是（　　）    A．该基因转录时，图中单链作为转录模板链 B．经亚硫酸氢钠处理并PCR后的序列为a链 C．RNA聚合酶移动到114位对应碱基序列时终止转录 D．图示单链初始序列中共有3个未被甲基化的胞嘧啶 9．（2026·陕西榆林·二模）利用转基因小鼠生产人源抗体的技术首先要敲除小鼠的抗体基因，再转入人的全套抗体基因，使得小鼠能够产生人源抗体。回答下列问题： (1)科研人员采取同源重组方法将小鼠胚胎干细胞（ES）中的鼠源抗体基因敲除。该方法需构建携带同源重组序列的载体，所用的载体需要含有标记基因，目的是________。 (2)获得敲除小鼠抗体基因的ES细胞后，需将人的抗体基因转入该细胞。该过程所用的BAC载体与含人抗体基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图1、图2所示。 ①为获得人抗体基因，需从人的________细胞中获取mRNA，在________酶的作用下获得cDNA。 ②用图中质粒和目的基因构建基因表达载体时，分别只需要一种限制酶和DNA连接酶便可实现，处理目的基因的限制酶是________，用该方法切割目的基因、质粒后可能出现目的基因的反向连接或________。 ③现已获得A和B两个重组质粒，欲要通过PCR扩增的方法，检测目的基因“正向”还是“反向”插入质粒，可选择图中“甲、丙”处碱基序列设计引物，若A重组质粒扩增出的片段长于B质粒，则_______质粒是“正向”接入的质粒。 (3)将重组的ES细胞注入野生型小鼠的________期胚胎，再通过________技术能够建立嵌合型小鼠，最后经过一系列操作能够产生人源抗体。 10．（2026·安徽淮南·二模）促红细胞生成素(EPO)是一种由肾脏和肝脏分泌的激素样物质，能够促进红细胞生成，用于治疗多种类型的贫血，包括肾性贫血、肿瘤相关性贫血等疾病。科学家拟用某质粒构建EPO基因表达载体，将其转入含有限制酶Xho Ⅰ和限制酶Sal Ⅰ的受体细菌，结合发酵工程来生产人类EPO，质粒上限制酶的酶切位点及这两种限制酶的识别序列如图所示。回答下列问题： (1)一般在肾脏或肝脏细胞中获取___________，再以其为模板合成不带内含子的EPO基因充当目的基因，并进行PCR扩增。 (2)基因表达时，3′端在启动子端的单链为转录模板，已知EPO基因的模板链是①链，为了能在所用受体菌中稳定存在并表达，应该在引物P1、P2的5′端分别添加___________酶的识别序列，原因是___________。 (3)经限制酶处理后的质粒和目的基因，在DNA连接酶的作用下，只带有一个目的基因的重组质粒有___________种类型，将这种重组质粒转入受体菌，一般要先用___________处理这些受体菌。 (4)从质粒上所带抗性基因角度分析，在含有氨苄青霉素的培养基上能够生长的受体菌不一定能合成EPO，理由是___________。 11．（2026·山东济宁·二模）为培育耐盐碱大豆新品种，科研人员把耐盐碱基因OsJRL40和荧光素酶基因构建成融合基因，荧光素酶可催化荧光素产生荧光以检测融合基因表达产生融合蛋白的情况，部分操作流程及可能用到的限制酶如图所示，其中DEX启动子在DEX诱导下才可发挥作用；AUG为起始密码子，UAA、UGA、UAG为终止密码子。回答下列问题。 (1)图中构建基因表达载体时，切割载体用到的限制酶有________。与单酶切相比，双酶切的优点是________（答出1点）。已知OsJRL40基因转录的非模板链的序列为：5'-ATGATCCAG……GCTGACTAG-3'，为构建融合基因，引物2的前10个碱基序列为________。 A．5'-AGATCTCTAG-3' B．5'-AGATCTGTCA-3' C．5'-GATCCTAGTC-3' D．5'-GATCGTCAGC-3' (2)在培养大豆细胞的基本培养液中添加________，若检测结果为________说明转化成功。成功后需要去除荧光素酶基因，已知Cre酶可以将DNA上两个相同loxP序列位点之间的片段切除，因此在设计引物3和引物4时需要在限制酶识别序列的________（填“5'端”或“3'端”）添加loxP序列。 (3)为检测荧光素酶基因是否被成功敲除，可用PCR技术进行鉴定。 实验组：首先提取在有DEX环境下培养的转基因大豆细胞质中的总RNA，进行逆转录获得cDNA，然后加入上图中的一对引物________进行PCR扩增后用BglⅡ完全切割，再进行琼脂糖凝胶电泳，观察有无OsJRL40基因和荧光素酶基因的条带。 对照组：用未经DEX环境下培养的转基因大豆细胞，其余同实验组。 若实验组敲除成功，则实验组和对照组的电泳结果分别为________。 12．（2026·内蒙古赤峰·二模）杜氏盐藻是一种具有极强耐盐性能的微生物，细胞内含有大量类胡萝卜素，如β-胡萝卜素、叶黄素等，现通过基因工程技术大量制备类胡萝卜素。回答下列问题。 (1)β-胡萝卜素具有较强的抗氧化作用，可作为膳食补充剂延缓细胞衰老，推测其作用原理为_____。 (2)DsOR基因参与类胡萝卜素的合成，为将该基因导入杜氏盐藻内，需利用Golden Gate技术构建重组pDTK001载体，过程如图1所示。BsmBⅠ是Golden Gate技术的核心工具酶，该酶的识别序列（5′-CGTCTC-3′）及切割位点如图2。 由图可知，BsmBI酶能识别特定DNA序列，而且切割位点在识别序列_____（填“内”或“外”），切断DNA中的_____键，产生_____（类型）末端，BsmBI酶切产生的末端最多有_____种。使用BsmBI酶可有效避免质粒自身环化、目的基因反向连接，原因是_____。 (3)将重组载体转入大肠杆菌后，接种在含氯霉素的培养基上，如果可以生成菌落，说明_____，但无法确认目的基因是否插入，需进一步筛选颜色为_____（填“红”或“白”）的菌落，即含有目的基因的重组质粒，理由是_____。 13．（2026·山西临汾·二模）免疫调节因子白细胞介素-2（IL-2）对机体的免疫应答和抗病毒感染等有重要作用。某科研团队将IL-2基因和质粒pPIC9K构建成重组质粒，并导入酵母菌GS15（组氨酸缺陷菌株，不能合成组氨酸）中，筛选出能分泌IL-2的工程菌。回答下列问题。 (1)为保证连接的准确性，构建携带IL-2基因的重组质粒时应选择限制酶______和______对目的基因和质粒pPIC9K进行双酶切。若限制酶切割后产生了平末端，最好选用______酶进行连接。 (2)PCR扩增IL-2基因需要两种引物。将一个IL-2基因进行PCR扩增，进行30次循环，每种引物至少需要______个。引物的作用是______。 (3)根据题中信息分析，若要筛选出导入质粒的酵母菌，可采用______的培养基培养酵母菌。 (4)制备能分泌IL-2的工程菌选用酵母菌作为受体细胞，而不用大肠杆菌，从细胞结构与功能的角度分析，原因是______。 14．（2026·西藏拉萨·二模）烟草花叶病毒（TMV）是导致烟草花叶病的病原体之一，对烟草产量影响极大。为培育抗TMV的转基因烟草，科研人员进行了如图所示的操作。 据图回答下列问题： (1)Ti质粒中启动子的基本组成单位是______；启动子的功能是___________；载体中人工构建的诱导型启动子，在诱导物存在时，可以______目的基因的表达。 (2)农杆菌转化法中的转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内______的过程。为将抗TMV基因整合到烟草细胞的染色体DNA上，应将其插入Ti质粒的T-DNA序列中，该基因能整合到烟草细胞的染色体DNA上的原理是____________________。 (3)过程①中应选择下列引物中的______（填字母），通过PCR技术在抗TMV基因的上游加入限制酶SpeⅠ的识别序列。为构建正确的重组质粒，还应在该基因的下游加入限制酶______的识别序列。 a. b. c. d. (4)过程②中，一般要用处理农杆菌细胞，使农杆菌细胞处于一种____的生理状态，从而提高重组质粒进入农杆菌细胞的效率。 (5)为培育转基因烟草植株，过程④⑤的培养基中需添加生长素和细胞分裂素，原因是________。 ( PCR技术及应用 热点聚焦 ) 1．（2026·湖北襄阳·二模）华中科技大学朱斌团队从深海火山细菌体内的噬菌体中发现了一种不依赖于引物的DNA聚合酶，该聚合酶可在没有引物的情况下参与DNA合成，与PCR反应相比，下列叙述正确的是（　　） A．PCR反应中，DNA聚合酶可在引物的5'端添加游离的脱氧核苷酸 B．该DNA聚合酶易在噬菌体中引入基因突变和染色体变异，利于在复杂多变的深海环境中生存 C．PCR反应包括变性、复性、延伸三个阶段，延伸阶段的温度最高，复性阶段的温度最低 D．深海火山的环境有利于DNA解旋成单链，该噬菌体的DNA复制过程可能需要Mg2+的参与 2．（2026·山东济宁·二模）下列关于DNA的粗提取、鉴定、扩增与电泳的叙述，正确的是（    ） A．提取到的白色丝状物直接与二苯胺试剂混合，沸水浴加热后变蓝 B．DNA电泳后，被染色的DNA需置于波长为300nm的紫外灯下观察 C．凝胶载样缓冲液中加入的指示剂能与DNA分子结合，用于观察电泳进程 D．PCR扩增时a个DNA模板分子完成30轮循环共需要a×（230-2）个引物 3．（2026·内蒙古包头·二模）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列叙述正确的是（    ） A．PCR扩增DNA片段时DNA双链的解聚原理与细胞内相同 B．耐高温的DNA聚合酶可直接在模板链的3′端从头合成子链 C．电泳可鉴定不同长度的DNA分子是因为它们在凝胶中的迁移速率不同 D．染色后的凝胶条带的位置可以反映DNA分子碱基序列的组成 4．（2026·河北保定·二模）实时荧光定量PCR（qPCR）通过在反应体系中加入荧光探针，实时监测PCR 产物量的变化，进而实现核酸的定量分析（其中荧光强度与PCR 产物量呈正相关）。Ct值指荧光信号达到设定阈值时的循环数。下列关于qPCR 的叙述错误的是（    ） A．qPCR 实验结果中，Ct值越大，说明初始模板核酸的量越少 B．可通过该技术检测样本中病毒核酸的含量，为传染病的诊断提供依据 C．不同浓度的初始核酸样品与其所对应的 Ct值绘制成的坐标曲线属于数学模型 D．qPCR 实验中，引物需与模板DNA 互补配对，且引物含量越多越好 5．（2026·浙江嘉兴·二模）人类X染色体上的DMD基因发生某些外显子缺失会导致DMD症。检测方法是针对每个外显子的特定序列，设计二段独特的单链DNA探针，每段探针包含两部分序列：特异性序列和通用引物序列。检测时先对受检者的DNA进行变性，再加入探针并退火，如果受检者该外显子序列正常存在，退火时对应的探针两部分会紧邻地结合上去，退火后加入连接酶将两段探针连接成一个完整的探针分子（如图所示）。连接后加入通用引物等物质进行PCR，最后将扩增产物进行电泳分离并分析结果。 下列叙述正确的是（　　） A．PCR时，用于扩增不同外显子的引物是不同的 B．PCR时，未成功连接的探针不能与引物结合 C．电泳分离时，女性携带者会出现某个外显子对应条带的缺失 D．电泳分离时，男性患者会出现某个外显子对应条带的缺失 6．（2026·山东枣庄·二模）荧光定量PCR技术是在常规PCR基础上添加了荧光探针，可以通过荧光强弱来反映DNA合成量的多少。荧光探针是一段单链的与目的基因特异性互补片段，其5′端含荧光基团（R），3′端含淬灭基团（Q）。由于淬灭基团与荧光基团距离太近，荧光探针不发荧光如图一，随着DNA的合成，探针被降解，从而发出荧光如图二。PCR的产物一般通过电泳技术进行分离，下列说法错误的是（　　） A．如图所示PCR进行n轮，分解的探针数量为2n-1 B．相同长度的线性DNA和质粒的电泳速度不同 C．电泳缓冲液可以用于配制琼脂糖溶液 D．探针被降解是由于DNA聚合酶可以从其3′端切开磷酸二酯键 试卷第1页，共3页 试卷第1页，共3页 学科网（北京）股份有限公司 试卷第1页，共3页 试卷第1页，共3页 学科网（北京）股份有限公司 试卷第1页，共3页 试卷第1页，共3页 学科网（北京）股份有限公司 ( PCR技术及应用 热点聚焦 ) ( 1 ) 学科网（北京）股份有限公司 $