3.2基因工程的基本操作程序(第3课时） 课件-2025-2026学年高二下学期人教版生物选择性必修3

3.2基因工程的基本操作程序(第3课时) 1.如果已知某目的基因的序列和结构， 利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？ 根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物 2.利用PCR获取和扩增目的基因的过程是？ 变性（ 90℃以上，断开氢键，解开双链） 复性（ 50℃左右，使引物与两条单链DNA结合） 延伸（ 72℃左右，Taq酶合成新的DNA链 ） 琼脂糖凝胶电泳 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。 思考 · 讨论 1.如何对产物进行鉴定？（p79） ①DNA聚合酶无法识别RNA； ②高温变性步骤会破坏RNA的结构，导致其降解。 2.用PCR可以扩增mRNA吗？（p79） 不能！ 单链RNA 逆转录酶 杂交双链 核酸酶H 单链DNA 引物、DNA聚合酶 双链DNA PCR扩增 需要将RNA反转录为cDNA，然后再进行扩增。 3.如果需要扩增mRNA上的遗传信息，该如何操作？ 思考 · 讨论 mRNA是单链RNA分子，无法直接作为PCR的模板。 1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；核酸酶H（RNase H）是一类能够特异性识别并切割RNA-DNA杂交体中RNA链的核酸内切酶。 2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA； 3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA 5 4.要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？ 5′端修饰： 在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列，使得最后获得的目的基因两端有限制酶的识别位点。 不是在引物的3′端加识别序列，要保证子链能正常延延伸。 思考 · 讨论 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 苏云金杆菌 Bt蛋白基因 棉花细胞 （核心） 抗虫棉 培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤呢？ 载体载着什么呢？目的基因。 载着目的基因区干嘛？有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。 载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。 才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。 7 DNA主要存在于细胞核中 蛋白质在细胞质（核糖体）中合成 RNA作为信使 转录 翻译 如果你想确定确实是RNA有用，可以有哪些实验思路？ RNA聚合酶将DNA双螺旋的两条链解开 核糖核苷酸 RNA分子 mRNA tRNA rRNA （其中mRNA作为翻译的模板） 基因上有启动子和终止子 决定转录的开始和结束 游离在细胞质中的各种氨基酸，以mRNA为模板合成具有一定氨基酸顺序的蛋白质的过程，称为遗传信息的翻译。 翻译 碱基排列顺序 氨基酸排列顺序 翻译 4种碱基 21种氨基酸 转录得到的RNA仍是碱基序列，而不是蛋白质。 氨基酸的序列不是随机乱排的， 那么，RNA上的碱基序列如何能变成蛋白质中氨基酸的种类、数量和排列顺序呢？ A U G C A C U G G C G U U G C U G U C C U U A A 甲 C A U 组 G U G 位点1 位点2 3’ 5’ 密码子 反密码子 mRNA tRNA 核糖体 甲 组 色 精 半 半 脯 终止密码子 无tRNA与之配对 A U G C A C U G G C G U U G C U G U C C U U A A 3’ 5’ G G A mRNA上有起始密码子和终止密码子决定翻译的开始与终止 RNA聚合酶 的识别和结合位点 原核细胞的基因结构 能转录 编码区 不能转录 非编码区 不能转录 非编码区 启动子 转录 调控 调控 上游 下游 mRNA 翻译 蛋白质 终止子 基因A 基因B 基因C 大蓝P62 启动子 外显子 内含子 1 2 3 4 5 下游 非编码区 非编码区 编码区 转录 前体mRNA 加工 成熟mRNA 翻译 肽链 真核细胞的基因结构 上游 终止子 （去掉内含子，拼接外显子） 外显子：一段能进一步能编码蛋白质的DNA序列。 内含子：一段不能编码蛋白质的DNA序列。 cDNA文库中没有内含子 大蓝P62 获得了足量的Bt基因后，不能直接将游离的Bt蛋白基因送入棉花细胞 （1）游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解； （2）就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。 （1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代； （2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。 构建基因表达载体的目的 基因表达载体应该具备什么结构才能到达以上目的？ 第二步：基因表达载体的构建 15 ②启动子： 位置：基因的上游 功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 ④复制原点： DNA复制的起始位点 ③终止子： 位置：基因的下游 功能：终止转录 ⑤标记基因：便于重组DNA分子的筛选和鉴定。 ①多个限制酶切位点 第二步：基因表达载体的构建 基因表达载体的组成部分 【拓展】 启动子的类型大蓝P62 ① 组成型启动子（一直干活） 这类启动子一般来自管家基因，可连续不断地启动基因的表达。 如：基本代谢酶的基因、Bt毒蛋白基因 ② 组织特异性启动子 （特定组织中干活） 其调控作用使基因往往只在某些特定器官或组织中表达，且表现出发育调节的特性。 如：乳腺生物反应器 ③ 诱导型启动子 （特定诱导物下干活） 可通过光、温度等诱导物来激活或抑制目的基因的表达。 如：基因治疗中的安全控制 17 ① 用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口。 ② 用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切(同尾酶)割含有目的基因的DNA片段。 ③ 加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。 载体 基因表达载体 基因表达载体的构建过程 第二步：基因表达载体的构建 DNA 连接酶 （1）选择限制酶切割时，不能用： ，原因： 。 HindⅢ SpeⅠ 破坏标记基因和目的基因 （2）若只用一种限制酶切割质粒和含有目的基因的片段，用： 。 EcoRⅠ （3）也可用双酶切，切割质粒和含有目的基因的片段，用： 。 EcoRⅠ 和 Xho Ⅰ 与单酶切相比，双酶切的优势是 。 ①防止质粒、目的基因自身环化 ②防止质粒与目的基因反向连接 （4）为了使目的基因与质粒正确连接，应人为在目的基因两边添加合适的识别序列，具体做法是在进行PCR时，在设计引物时插入合适的识别序列。 限制酶的识别序列及切割位点 在引物1左侧添加 的识别序列，在引物2添加 的识别序列 用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用ScaⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Tet(四环素)的培养基中能形成菌落 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 解析　若用Hind Ⅲ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因(TetR)中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 $