3.2基因工程的基本操作程序（第3课时） 课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

mRNA Bt抗虫蛋白 抗虫棉 ①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 ④检测是否具有抗虫特性以及抗性程度等 检测水平： 分子水平 个体水平 Bt基因 结合Bt基因表达的过程，推测可以从哪些方面（或水平）进行检测与鉴定？ 检测内容： 分子水平 分子水平 1 第2节 基因工程的基本操作程序 （第3课时） 2 转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 (1)方法1：PCR扩增 转基因生物 提取DNA 根据目的基因的序列设计PCR引物 PCR操作 是否扩增出目的基因 电泳（常用） DNA测序技术；DNA分子杂交技术等 M：marker； 1：阳性质粒 2：原始品系 3-9：转Bt品系 判断标准： （一)分子水平检测 1 检测目的基因是否插入受体细胞染色体DNA上 四目的基因的检测与鉴定 3 (2)方法2：DNA分子杂交技术 4 探针 目的基因 带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带，说明 了。 探针是一段DNA片段（通常结合放射性同位素或荧光蛋白等）， 探针的序列应与目的基因高度互补，避免与其他基因发生非特异性结合 变性 碱基互补配对原则 目的基因整合到受体生物染色体DNA上 5 2 检测目的基因是否转录（mRNA） 转基因生物 PCR操作 电泳检测是否 扩增出目的基因 逆转录 cDNA 提取RNA mRNA作为模板 (2)方法2：分子杂交技术 （1)方法1：PCR扩增 基因探针 转基因生物的mRNA 杂交分子 （可检测） 变性 碱基互补配对原则 基本思路： 1.制作基因探针，并用PCR扩增 2.提取受体细胞全部mRNA，使基因探针和转基因生 物的mRNA杂交，若出现 杂交带，表明转录出了mRNA。 6 注射小鼠体内 苏云金芽孢杆菌 提取 Bt抗虫蛋白 抗体 标记抗体 提取蛋白 电泳分离 抗原 抗体 杂交 转基因生物 放射性检测 （杂交带） 3检测目的基因是否翻译（蛋白质） (1)方法： 抗原—抗体杂交 抗原与抗体的特异性结合 （2)原理： 7 通过抗虫、抗病的接种实验鉴定生物是否具有抗性以及抗性的程度等 例：通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。 如何检测导入的Bt基因是否具有抗虫特性？ (二)个体水平的检测 8 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物（如胰岛素） 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）接种实验 未染病 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能、活性比较 功能、活性正常 9 ①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 ——“抗原—抗体杂交技术” 2.个体生物学水平鉴定 1.分子水平检测 抗性检测： 功能活性比较： PCR技术或分 子杂交技术 抗虫、抗病接种实验； 基因工程产品与天然产品的功能活性比较 ——检测是否具有抗性以及抗性强度等 如：胰岛素注射到糖尿病模型小鼠 小结 10 1.目的基因的筛选和获取-前提 利用PCR获取和扩增 人工合成 构建基因文库 2.构建基因表达载体-核心 目的基因、启动子、终止子、标记基因等 3.将目的基因导入受体细胞-关键 农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、 感受态细胞（如加Ca2+）转化法(微生物); 4.目的基因的检测与鉴定-保证 分子检测：是否插入、转录、翻译 个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。 总结 基因工程的基本操作程序 11 (1)PCR利用了 原理，通过调节 来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。 (2)PCR扩增DNA片段还利用了 的原理。一次PCR一般要经历 次循环。 DNA的热变性 温度 DNA半保留复制 30 5’- -3’ 3’- -5’ 3’- -5’ 5’- -3’ 5’- -3’ -5’ 5’- 3’- -5’ 5’- -3’ -5’ 5’- 3’- -5’ 3’- -3’ 高温 变性 中温 低温 复性 延伸 1次循环 1实验原理 探究 实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 （一)利用PCR在体外进行DNA片段扩增 12 13 ①PCR仪 ②微量离心管 ③微量移液器 ④一次性吸液枪头 2 材料用具 ——自动控温，实现DNA的扩增 ——实际上是进行PCR反应的场所 PCR仪 微量离心管 推动杆 调节旋钮 卸枪头按钮 体积刻度 吸液杆 枪头 （注意：加不同样品时，需要更换枪头） （用于向微量离心管转移PCR配方中的液体） 14 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （1pg～1μg） 5～10μL 总体积 50μL ⑤PCR反应体系的配方 注意：酶和缓冲液要在冰块上缓慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和缓冲液一般分装成小份，避免反复融化导致活性降低甚至失活(P85) 15 (1)加样： 用微量移液器按照PCR反应体系配方，在微量离心管中依次加入各组分。 (2)离心： 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。 ——提高反应速率 3 方法步骤 16 (3)反应：参照右表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min — — 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，10min 使DNA充分变性，双链打开，以利于引物更好地和模板结合。 问题1：预变性的目的是什么？ 问题2：为什么最后1次变性和延伸时间都延长了？ Taq 酶活性会随着循环次数增加而下降。在每一轮循环中，部分片段可能没有完全延伸完，Taq 酶就脱落了。最后1次变性、延伸时间延长，让这些DNA打开，重新充分延伸。 17 问题1：PCR的产物是什么？ 问题2：如何鉴定PCR的产物？ DNA片段 琼脂糖凝胶电泳 （二)利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 18 （1）电泳：DNA分子具有_______________，在一定的 _______下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷________的电极移动，这个过程就是电泳。 可解离的基团 pH 相反 1实验原理 一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带 ，在电场中DNA便向 泳动。 负电荷 正极 磷酸电离形成的磷酸基团带负电 样品点样孔应靠近 极。 负 19 （2)鉴定方法：①PCR的产物一般通过 来鉴定。 琼脂糖为一种多糖，90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶。 琼脂糖凝胶具有网络结构（孔径），孔径大小与琼脂糖凝胶浓度有关，浓度越高，孔径越 ，能够通过的核酸分子越 。 琼脂糖凝胶电泳 ②在凝胶中DNA分子的迁移速率与_____________、 _________________和______等有关 凝胶的浓度 DNA分子的大小 构象 小 小 琼脂糖凝胶浓度越大，分离的DNA分子越小，迁移速率越快 DNA的迁移速率与其构象密切相关，超螺旋结构迁移最快，开环结构最慢。在实验中，可通过优化凝胶条件（如浓度、电压）和DNA构象（如酶切处理）来提高分辨率和分离效果。DNA的构象:迁移速率：双螺旋环状DNA＞双螺旋链状DNA＞单链DNA。 20 ③DNA染色:凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长300nm的紫外灯下被检测出来 常用的核酸染色剂有EB（溴化乙锭）、GoldView等，EB能插入DNA分子中的碱基对之间，导致EB与DNA结合。嵌入核酸碱基间的EB能吸收300nm波长的紫外光，发出可见荧光。其荧光强度与DNA分子的含量成正比。 21 标准参照物（Marker） DNA Marker是 的片段，在实验时和样本DNA同时进行凝胶电泳，通过对比两者的迁移速率，可以大致估计 。 样本DNA的大小 已知的DNA分子大小 22 琼脂糖凝胶电泳装置 2 材料用具 电泳缓冲液 凝胶载样缓冲液 核酸染料 23 制备凝胶 观察鉴定 进行电泳 电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 ①熔化： ②倒模: ③凝固: 3方法步骤 24 制备凝胶 观察鉴定 进行电泳 将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（marker）。 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待 前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 ①加液 ②加样 ③电泳 指示剂 ①有颜色，使样品呈现颜色，便于加样。 ②分子量较小，指示样品迁移的速率及方向。 25 制备凝胶 观察鉴定 进行电泳 取出凝胶置于 下观察和照相。 紫外灯 26 一条条带（目的基因片段） 1.本实验进行电泳鉴定的结果应该是几条条带？ 2.如图所示，该片段大小约为 。 750bp 思考·讨论 0次 12次 12次 30次 30次 Marker 根据条带的 及 来评价扩增的结果 3.判断成功扩增出DNA片段的依据是什么？ 分布 粗细程度 估计DNA的大小 估计DNA的数量 27 4.如果电泳鉴定的结果没有条带或不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？ 未出现扩增条带可能的原因有： ①引物出现质量问题； ②变性时温度 ，变性时间 ，模板DNA链未打开。 ③Taq酶失活； ④Mg2+浓度过 。 出现非特异性扩增带可能的原因有： ①引物特异性不强或容易聚合成二聚体 ②复性时的温度过低，引物随机连接到非目的基因片段 ③DNA聚合酶的浓度过高，即使引物与模板的结合并不完全匹配，酶仍可能催化延伸反应，生成非特异性扩增产物。 ④Mg2+浓度过高 ⑤模板DNA出现污染 低 低 短 28 注意： 1. 为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行 处理。 2. 该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在 储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上 。 3. 在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须 。 4. 在进行操作时，一定要戴好 。 5. PCR扩增不能随意加大试剂用量。 高压灭菌 -20℃ 缓慢融化 更换 一次性手套 29 1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。 （1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ） （2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（ ） （3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（ ） √ × × 一、概念检测 练习与应用 30 2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（ ） A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶 B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶 C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸 D 脱氧核苷酸 31 二、拓展应用 1. 研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。 外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。 32 2. 八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示） 和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtl表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtl基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为 “黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。 （1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrl 和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN 12424。该项研究的目的基因是______________________ ，标记基因是_____________ ，质粒pSYN 12424的作用是______________________________ 。 ctrl 基因和psy基因 Pmi基因 将目的基因送入水稻细胞 33 （2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？ 不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。 34 （3）请查找相关资料，了解科学家为什么 要培育“黄金大米”以及当前关于“是否要推广 '黄金大米’”的各种争论。你还可以提出自己的看法，并与同学交流讨论。 维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。β-胡萝ト素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β-胡萝ト素合成的酶的基因转入了籼稻中，使其胚乳中富含β-胡萝ト素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广“黄金大米””的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。 35 EVCapture4.1.9软件录制 Lavf57.25.100 本视频由湖南一唯信息科技开发的EV录屏软件录制，www.ieway.cn EVCapture4.1.9软件录制 Lavf57.25.100 本视频由湖南一唯信息科技开发的EV录屏软件录制，www.ieway.cn EVCapture4.1.9软件录制 Lavf57.25.100 本视频由湖南一唯信息科技开发的EV录屏软件录制，www.ieway.cn Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) Lavf58.20.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $$