大题05 生物技术与工程（2大热点角度剖析）（天津专用）2026年高考生物终极冲刺讲练测

**基本信息** 以“命题解码-解题建模-实战刷题”为框架，系统构建生物技术与工程专项突破体系，通过典例建模提炼解题逻辑，整合发酵工程与基因工程核心知识链。 **专项设计** |模块|题量/典例|方法提炼|知识逻辑| |----|-----------|----------|----------| |命题解码|3年高考真题热点角度拆解|分析重流程推演、技术整合等4大命题趋势|从技术原理到真实科研情境（医药/育种/环境）构建知识网络| |解题建模|4个典例（含2024天津高考真题）|建立“信息提取-思路拆解-模型应用”三步解题法|发酵工程（菌种/条件/检测）与基因工程（载体构建/筛选/PCR）模块内逻辑递进| |实战刷题|5道模拟题（含2026天津多区二模）|通过变式训练强化图表分析与实验设计能力|跨模块整合技术应用（如纤维素酶与发酵工程结合），体现科学思维与探究实践|

大题05 生物技术与工程 内容导航 【命题解码·定方向】命题趋势+3年高考真题热点角度拆解 【解题建模·通技法】析典例，建模型，技法贯通破类题/变式 【实战刷题·冲高分】精选高考大题+名校模拟题，强化实战能力，得高分 命题·趋势·定位 01命题·趋势·定位 1．重工程流程推演：从“识记技术名称”转向“技术流程的动态设计与纠错”。重点考查发酵工程的条件控制、基因工程的操作路径设计，强调逻辑链条的完整性。 2．重技术整合应用：“大技术（基因/细胞工程）+小技术（PCR/电泳）”的综合考查成为常态。试题常将分子生物学技术与传统发酵、生态修复结合，考查解决复杂问题的能力。 3．重真实科研情境：以我国科学家在医药研发、农业育种、环境治理（如你关注的湿地修复）取得的成果为背景，考查在新情境中迁移教材知识的能力。 4．重图表信息处理：以工艺流程图、电泳图谱、微生物培养曲线为核心载体，考查信息转化与定量分析能力（如菌落计数、酶切分析）。 热点·角度·拆解 热点角度 核心考察内容 热点角度01：发酵工程与微生物应用 传统发酵技术（果酒/醋/泡菜）原理；微生物分离、计数（稀释涂布/显微镜计数）；发酵条件优化（温度、pH、溶氧）。 2025·天津河西二模：酿酒酵母的培养基选择、菌落计数及发酵产酸分析。 2024·天津卷：利用谷氨酸棒状杆菌生产苏氨酸的发酵过程分析。 热点角度02：基因工程与分子操作 基因工程四大步骤（获取、构建、导入、检测）；PCR技术原理与应用；限制酶与DNA连接酶的作用；基因表达载体的构建。 2024·天津卷：无缝克隆（同源重组）技术替代传统酶切连接；PCR引物设计及电泳结果分析。 2023·天津模拟：抗虫棉的基因工程育种与安全性评价。 热点角度01发酵工程与微生物应用 析典例·建模型 析典例·建模型 1．（2026·天津红桥·一模）市场上饮用醋种类繁多，口感不一。某学习小组学习了发酵工程知识后，利用葡萄和糯米酿造果粮复合饮用醋，并设计了如下加工工艺流程： (1)对糯米进行蒸煮糊化的目的是_____（写出1点）。 (2)A、B接种的菌种一般要先活化和_____后，再接种于发酵液中。从细胞结构上看，两菌种的主要区别为_____。 (3)酒精发酵的质量决定了醋的品质。为了解酒精发酵进程，可在发酵过程中定期取样，用_____的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。选择高产醋杆菌时，可将醋杆菌涂布培养在白色的培养基上，并挑选_____大的菌落作为发酵菌种，发酵菌种经扩大培养后再接种至酒醪中进行发酵。 (4)由酒精发酵转变为醋酸发酵，需要改变的环境条件是_____。 第一步，思路模板 第一步：信息提取与审题 解题建模分析 第一步：信息提取与审题 1．明确核心主题：本题为发酵工程的综合应用题，聚焦传统果酒、果醋的制作工艺。核心是分析糯米、葡萄为原料，先后接种酵母菌和醋酸菌的两步发酵过程，考查发酵条件控制、菌种特点、检测与筛选方法。 2．识别关键工艺与变量： 第一步发酵：酒精发酵（接种A，即酵母菌）。 第二步发酵：醋酸发酵（接种B，即醋酸菌）。 工艺控制：菌种活化、接种、发酵进程监控、菌种筛选、发酵条件转变。 3．解读潜在逻辑： ①糯米糊化 → 利于酵母菌利用 → 产酒精。 ②酵母菌（真核）与醋酸菌（原核）结构不同 → 培养与生理需求有差异。 ③酒精发酵（厌氧）与醋酸发酵（需氧）条件不同 → 转变时需调整环境。 第二步：思路拆解与建模 解题步骤 具体分析思路 1. 原料处理目的 (第1问) 考查淀粉类原料的预处理原理。 原理应用：糯米主要成分为淀粉，酵母菌不能直接利用大分子的淀粉。蒸煮糊化可使淀粉分子结构变得松散，增大与酶的接触面积，便于酵母菌产生的酶（或外加的糖化酶）将其水解为可发酵性糖（如葡萄糖），从而提高发酵效率。此外，高温蒸煮也能杀灭部分杂菌。 2. 菌种特性与预处理 (第2问) 考查微生物培养的通用步骤及原核、真核细胞的结构差异。 菌种预处理：在工业发酵中，为使菌种快速适应环境、缩短延迟期，接种前常对保藏的菌种进行活化（恢复其生理活性）和扩大培养（增加菌体数量）。 细胞结构差异：酵母菌是真核生物，有以核膜为界限的细胞核；醋酸菌是原核生物，无成形的细胞核（拟核）。这是两者最根本的区别。 3. 发酵进程监控与菌种筛选 (第3问) 考查微生物数量测定方法及根据表型筛选菌株。 发酵进程监控：了解酒精发酵中酵母菌的增殖状况，常用稀释涂布平板法（或显微镜直接计数法）进行菌落计数。 高产菌株筛选：醋酸菌将乙醇氧化为醋酸，会使培养基pH下降。若在培养基中加入指示剂（如溴甲酚紫，酸性变黄），产酸能力强的菌落周围会出现黄色透明圈。透明圈直径与菌落直径的比值越大，通常表示该菌株产酸能力越强。因此，应挑选透明圈直径大的菌落。 4. 发酵条件转变 (第4问) 考查酒精发酵与醋酸发酵的代谢条件差异。 酒精发酵（酵母菌）：厌氧（或无氧）条件。 醋酸发酵（醋酸菌）：需氧条件，醋酸菌是好氧菌，将乙醇氧化为醋酸需要氧气参与。 条件转变：因此，由酒精发酵转为醋酸发酵，需要提供氧气（通入无菌空气），并可能提高发酵温度（醋酸发酵适宜温度通常高于酒精发酵）。 研考点·通技法 破类题·提能力 2．（2026·天津和平·二模）生物技术在迅猛发展，它与人类的生活关系越来越密切，请回答下列有关生物技术与工程的问题。 I．如图1是谷氨酸发酵装置示意图，工业上常用谷氨酸棒状杆菌在30℃下发酵获得谷氨酸；如图2是谷氨酸生产的机理，谷氨酸棒状杆菌以葡萄糖为底物进行了如下过程： (1)图1中1、2处是发酵罐夹层中冷凝水的进出口，水在发酵罐夹层流动的作用是_____。图1中3为搅拌器，可以加快谷氨酸形成的速率，其原理是_____。 (2)改变菌体细胞膜的通透性，及时排出谷氨酸是提升产量的关键措施之一，原因是_____。 (3)对谷氨酸棒状杆菌进行硫酸二乙酯和紫外线相结合的复合诱变，经选育得到高产突变株LG-01。将其接种在含葡萄糖的液体培养基中，于30℃下培养48h。摇匀并取培养液稀释107倍后，向四个培养基中分别涂布0.1mL，四个培养皿中生长的菌落数依次为31个、33个、35个、33个，则稀释前菌液的菌体密度为_____个/mL，计算得到的值比实际值偏小。 Ⅱ．利用纤维素酶降解秸秆生产燃料乙醇，对缓解全球能源危机有重大意义。科研人员开展选育高产纤维素酶菌株的相关研究，过程如图3。 (4)从物理状态来看CMC平板属于固体培养基。富集培养后的菌种常采用稀释涂布平板法或_____法接种于CMC平板，培养一段时间后，可根据菌落的_____（写出一项）等特征，初步鉴定并挑取产纤维素酶菌株XZ-33。 (5)鉴定高产纤维素酶菌株是否产生，可使用刚果红平板法。其原理是纤维素被分解，刚果红无法与纤维素的分解产物结合，培养基中的菌落周围会形成透明圈，如图4。下列叙述错误的是_____（多选）。 A．采集的黑土壤需经过高压蒸汽灭菌再进行富集培养 B．配制CMC平板培养基需加入纤维素为唯一碳源 C．紫外线和γ射线处理可使产纤维素酶菌株发生基因突变和染色体畸变 D．图2中两个透明圈内的微生物均能将分解纤维素的酶分泌到细胞外 热点角度02基因工程与分子操作 析典例·建模型 3．（2024·天津·高考真题）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。 (1)Sa产生抗药性可遗传变异的来源有______（至少答出2点）。 (2)推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。 ①根据图1信息，简述质粒2的构建过程（需包含所选引物和限制酶）：______，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含______的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 ③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含______的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含____________的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是______。 第一步，思路模板 第一步：信息提取与审题 1．明确核心主题：本题为分子生物学与基因工程的综合实验探究题，核心是验证R基因是否与金黄色葡萄球菌（Sa）的头孢霉素抗性有关，并利用同源重组技术敲除R基因进行验证。 2．识别关键信息： 研究目标：探究R基因与抗药性的关系。 基因敲除：利用同源重组技术。 工具构建：需要构建含有R基因上下游同源臂的重组质粒（质粒2）。 筛选策略：运用抗性标记（氯霉素抗性基因 cat和蔗糖致死基因 sacB）进行多轮筛选，以获得敲除成功且去除了质粒的突变菌株。 第二步：思路拆解与建模 解题步骤 具体分析思路 1. 抗药性变异的来源 (第1问) 考查可遗传变异的类型。 细菌可遗传变异：主要包括基因突变（DNA序列改变）、基因重组（如转化、接合、转导等获取外源DNA）以及染色体变异（但细菌为原核生物，通常不涉及染色体结构变异）。 2. 敲除载体的构建 (第2问①) 考查基因工程的操作设计，是本题的核心和难点。 目标：构建质粒2，使其含有R基因的上下游同源臂，以便在Sa基因组中通过同源重组将R基因替换掉。 设计逻辑： 1. 获取同源臂：以Sa基因组DNA为模板，用P1/P2引物扩增获得上游同源臂，用P3/P4引物扩增获得下游同源臂。 2. 选择酶切位点：为使两个片段能依次插入质粒1，需选用不同的限制酶。 3. 第一轮筛选（获得转化子）(第2问②) 考查利用抗性标记进行初步筛选的原理。原理：质粒2上带有氯霉素抗性基因（cat）。用质粒2转化Sa后，只有成功转入并保留了质粒2的Sa细胞才能在含有氯霉素的平板上生长。 4. 第二轮筛选（筛选同源重组及质粒丢失）(第2问③) 考查利用负向选择标记（sacB）和抗生素抗性变化进行精细筛选的策略。 1. 增加同源重组几率：多次传代，给予充足时间发生同源重组事件。同源重组发生后，质粒2上的序列（含cat-sacB）会整合到基因组R基因的位置，但质粒自身可能丢失。 2. 筛选无质粒细胞：质粒2上带有蔗糖致死基因（sacB），该基因在蔗糖存在时表达产物对细菌有毒。因此，在含蔗糖的平板上，仍携带质粒2的细胞会死亡，而丢失了质粒2的细胞（无论是否发生同源重组）可以存活。 研考点·通技法 破类题·提能力 4．（2023·天津·高考真题）构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌株是解决能源危机的手段之一，为此设计表达载体，思路如下。 (1)外源基因的选择    纤维素常见生物降解途径如下。 酿酒酵母通常无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，应向酿酒酵母转入上图中三种酶的基因，并使其表达产物在细胞________(内/外)发挥作用。 (2)外源基因的插入方法 同源重组是碱基序列基本相同的DNA区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株，如甲图所示。 酿酒酵母基因组有多个AB短序列。为通过同源重组将外源基因插入AB之间，在设计表达载体时，可采用PCR技术在外源基因两端分别引入A和B,获得乙图所示长片段。PCR时应选用的一对引物为________(从P1~P6中选)。 (3)标记基因的选择  URA3是尿嘧啶合成关键酶基因，常被用作标记基因。另外，URA3编码的蛋白可将外源5-氟乳清酸转化为有毒物质，导致细胞死亡。 ①为得到成功插入酶I基因的菌株1，需将酶I基因同URA3一起插入URA3缺陷型酿酒酵母基因组AB之间，并利用__________的培养基筛选存活菌株。 ②在后续插入酶Ⅱ基因时，为继续利用URA3作为筛选标记，需切除菌株1的URA3。为此设计表达载体时，还应向URA3两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C和C´,并以下图方式______排列才能通过同源重组达到上述目的。 此后，需要将菌株1在_________的培养基上培养，存活菌株即为URA3被成功切除的菌株1´。 (4)表达载体的构建   综上，为将三种酶基因依次插入酿酒酵母基因组中，在构建表达载体时，A、B、C、C´、URA3和酶基因应采用下图______的排布方式。 （建议用时：45分钟） 刷模拟 1．（2026·天津·二模）某研究小组为研究玉米中Z基因的作用，利用Gibson无缝克隆技术构建了hpRNA表达载体。在受体细胞中，hpRNA表达载体转录产生的hpRNA可诱导Z基因的mRNA特异性降解，进而抑制Z基因表达。 (1)Gibson无缝克隆技术原理如图1所示，在T5核酸外切酶的作用下DNA片段产生黏性末端，两个DNA片段相应互补序列通过氢键结合，然后通过_______酶的作用补全图示缺口部分，再通过_______酶的作用最终获得重组DNA。 (2)为了获得图2中所示的线性化质粒，进行PCR时应该选择的引物组合是_____，在引物的5′端需加入与_______相同的片段。 (3)Gibson无缝克隆技术要求载体插入位点的两端与目的基因的两端有至少15bp的相同序列（不具有限制酶识别序列的特性），图2中序列3和序列4应分别与______和_______相同。线性化质粒两端都是序列1，在Gibson无缝克隆过程中是否会发生自身环化，原因是：_____________。 (4)研究人员将hpRNA表达载体导入到玉米细胞获得转基因玉米植株，取适量一定浓度的_________溶液均匀涂抹在转基因玉米的叶片上，一段时间后叶片颜色_______，说明hpRNA表达载体整合到玉米染色体DNA上。 (5)为了检测hpRNA表达载体是否能够抑制Z基因的表达，对Z基因的表达量进行了实时荧光PCR定量检测，提取转基因玉米相关组织细胞中的_____制作实时荧光PCR的模板，如果转基因玉米的Ct值（PCR产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）______野生型玉米，则说明hpRNA表达载体成功发挥了作用。 2．（2026·天津河东·二模）M蛋白和生物的“记忆形成”过程紧密相关。为了研究M蛋白的具体作用，科研人员培育出了能人工控制M基因表达的实验小鼠。 该实验小鼠的核心设计思路：利用小鼠体内特异性表达的Cre重组酶，敲除两个LoxP位点之间的基因序列；借助小鼠体内表达的蛋白A，激活能启动基因表达的诱导型T启动子。同时使用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（记作M-GFP），导入小鼠后既能恢复被敲除的M基因功能、表达正常M蛋白，又能通过绿色荧光直观追踪M蛋白的表达位置和情况。 该实验的注意事项：小鼠自身的内源M基因会干扰实验，只有纯合子floxM/floxM才能保证所有细胞里的M基因都能被Cre重组酶精准“剪掉”，达到人工控制外源M基因的目的。 (1)基因工程与载体构建 用PCR技术扩增基因片段①和②时，通常会在引物的一端添加限制酶识别序列，该序列应添加在引物的______（选填“5'端”或“3'端”）。 构建载体1时，为了阻断A基因的表达： 从转录水平考虑，可以在两个LoxP位点中间连接____________的片段； 从翻译水平考虑，可以在两个LoxP位点中间连接____________的片段。 为了鉴定载体2是否构建成功，需要用限制酶切割载体后，再进行______检测。 (2)胚胎干细胞培养 培养小鼠胚胎干细胞的过程中需要定期更换培养液，这样做的目的是什么？（至少回答2点）____________。 (3)遗传学杂交与基因型分析 为了快速培育出同时拥有4对目标基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，将Cre/+A/+小鼠、M-GFP/+floxM/+小鼠分别与含floxM/floxM基因的纯合小鼠杂交，子代再杂交一次。最终筛选得到实验模型小鼠的基因型为_____________。 (4)基因表达的人工调控 为了实现M基因的表达可控，在给实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A蛋白的四环素。与未添加四环素相比，添加四环素会______（填“促进”、“抑制”）A蛋白活性，进而______（填“促进”、“抑制”）T启动子的活性，最终阻止______表达，实现人工“关闭”，与未添加时该基因正常表达形成对照，达到调控效果。 3．（2026·天津红桥·一模）大豆是重要的粮油作物，研究人员发现基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小）。科研人员开展了相关研究。请分析回答： 研究I：T-DNA插入失活是研究植物基因功能的常用方法，科研人员利用农杆菌转化法成功将T-DNA插入大豆6号染色体的S基因内，使其变为丧失功能的s基因，花粉中S基因功能的缺失会造成其不育。实验利用卡那霉素筛选等技术获得杂合体Ss。 (1)实验中卡那霉素抗性基因位于T-DNA的LB（左边界）和RB（右边界）_____（填“之间”或“之外”）。 (2)为验证基因S的功能，将另一个S基因插入杂合体Ss，该植株自交得到F1，利用图1所示引物P1和P2、P1和P3分别对F1进行PCR检测，电泳结果如图2所示。 ①F1中不能检测到仅扩增出600bp条带的植株，是因为_____。 ②根据电泳结果，F1植株分为I型和II型，其中II型植株占比为1/3，则说明S基因插入的位置_____（填“位于”或者“不位于”）6号染色体，仅考虑基因S和s，I型植株可能的基因型有_____种。 研究Ⅱ：研究人员继续克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。将品种DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种SY。 (3)根据图示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，切割T-DNA可选择的限制酶组合有哪些？_____。为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，不同加样孔加入的材料包括：_____、酶切后的空载体片段、酶切后的重组质粒、启动子D+基因S片段。 (4)用检测后的农杆菌转化品种SY所得再生植株SY-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入SY，所得再生植株SY-2的种子也变大，但小于SY-1，综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是_____。 4．（2025·天津·二模）刺梨是贵州的特产，富含超氧化物歧化酶和维生素C、花青素等营养物质，为发展当地特色农业，建设新农村，某地决定以刺梨为原料制作高品质饮料。刺梨酒和刺梨醋的主要生产流程如图所示。回答下列问题： (1)刺梨鲜果经分选清洗破碎压榨后，要对榨汁进行澄清处理，像破碎形成的果泥中加入____处理一段时间，既能提高出汁率，又能提高果汁的澄清度，该方法处理果泥时，需要控制适宜反应温度，原因是____。 (2)在发酵I阶段的前期，向果汁中通入氧气的作用是____，在发酵Ⅱ阶段，也需要向发酵液中通入氧气的原因是____。 (3)为保证刺梨酒的品质，技术人员需定期对发酵液的酒精浓度进行检测，检测的原理是酒精与_____反应，通过比对____来确定发酵液中酒精的浓度。 (4)在发酵过程中，为判断发酵液中杂菌是否超标，可抽取一定量的发酵液，通过____法接种到培养基上，对杂菌进行计数以判断杂菌是否超标。 5．（2025·天津·二模）癌症是人类健康的重大威胁之一，传统治疗手段难以实现精准治疗。超声波具有非侵入、组织穿透性强、时空特异性等特点，科研人员拟开发“响应超声波的药物递送系统”细菌以实现癌症的精准治疗。 (1)用于培养药物递送细菌的液体培养基中包含水、酵母提取物、蛋白胨等成分，其中蛋白胨主要为细菌提供____和维生素。可利用____的方法快速直观地测定细菌数量，以便即时使用适量的细菌进行治疗。 (2)C蛋白有抗肿瘤作用，超声波可导致局部温度升高到42℃。科研人员制备了工程菌1，其中含有图1所示的基因表达载体。37℃培养的工程菌1接受超声波刺激后，可升温至42℃，____，从而发挥抗肿瘤作用。    (3)T蛋白有T1、T2和T3三种亚型，具有相似的功能，制备分别含有这三种基因的工程菌1，并检测C蛋白表达量，结果如图2所示。科研人员最终选择____（填T1、T2或T3）基因进行后续研究，判断的依据是_____。 (4)工程菌1只能在超声波刺激期间发挥作用，科研人员设计了含图3所示的基因表达载体的工程菌2，可以实现在短时间的超声波刺激后维持长时间的治疗。已知B基因编码的B酶可以作用于识别位点a和b，使a、b处的DNA发生断裂，最终导致a、b之间的DNA片段发生倒转。请根据以上信息，使用下列选项将表达载体补充完整。____；____；____；____；____。    ①P1启动子②P3启动子（持续表达型启动子）③T基因④C基因⑤B基因 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 大题05 生物技术与工程 热点角度01发酵工程与微生物应用 析典例·建模型 1．(1)使淀粉更容易被酶解（或杀灭杂菌、使糯米软化） (2) 扩大培养； 酵母菌有以核膜为界限的细胞核，醋酸菌没有（或有无核膜包被的细胞核） (3) 稀释涂布平板法 透明圈直径与菌落直径比值（或透明圈） (4)通入无菌空气（或有氧环境）、提高发酵温度 破类题·提能力 2．(1) 使温度控制在30℃（利于谷氨酸棒状杆菌发酵） 谷氨酸棒状杆菌为需氧型微生物（或搅拌能增加发酵液中的溶解氧，可使其与营养物质充分接触利于该菌发酵） (2)若谷氨酸积累过量，会抑制谷氨酸脱氢酶的活性（从而导致该合成途径中断） (3)3.3×109 (4) 平板划线 颜色（或形状、隆起程度） (5)AC 热点角度02基因工程与分子操作 析典例·建模型 3．【答案】(1)基因突变、基因重组、表观遗传等 (2) 采用引物1和4进行PCR扩增（或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切 氯霉素（或氯霉素+头孢霉素） 脱水四环素 头孢霉素 D 破类题·提能力 4．【答案】(1)外 (2)P1和P6 (3) 不含尿嘧啶 2 含有5-氟乳清酸和尿嘧啶（只答含有5-氟乳清酸得2分） (4)4 （建议用时：45分钟） 刷模拟 1．【答案】(1) DNA聚合酶 DNA连接酶 (2) 引物1和引物4 序列1 (3) 序列2 序列2 不会，右侧的序列1是倒置连接，T5外切酶切割后形成的序列与左侧序列1切割后形成的序列不互补 (4) 潮霉素 无明显变化 (5) mRNA（RNA，总RNA） 高于（大于） 2．(1) 5′端 终止子 能够转录成终止密码子的DNA片段 琼脂糖凝胶电泳 (2)补充胚胎干细胞生长所需的营养物质和生长因子；及时清除细胞代谢产生的废弃物，防止其积累对细胞造成毒害；维持培养液适宜的pH和渗透压 (3)Cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM (4) 抑制 抑制 M基因（或M-GFP） 3．【答案】(1) 之间 (2) s基因的花粉不育，因此后代不含有只含有s基因的植株 不位于 5 (3) HindIII和Spe I或Hind III和Xba I 已知大小的DNA片段(指示分子大小的标准参照物) (4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大 4．(1) 果胶酶 温度对果胶酶活性有影响，在最适温度下酶活性最高，出汁率高 (2) 酵母菌在有氧条件下大量繁殖 醋酸菌为需氧菌，在有氧条件下可将酒精转化为乙醛，乙醛再转化为醋酸 (3) 酸性的重铬酸钾 颜色深浅 (4)稀释涂布平板 5．(1) 碳源、氮源 显微镜直接计数 (2)解除T蛋白二聚体对P1启动子的抑制，启动C基因的表达 (3) T3 温度由37℃到42℃时，含有T3亚型的C蛋白表达量变化最大 (4) P3启动子 C基因 P1启动子 B基因 T基因 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 大题05 生物技术与工程 内容导航 【命题解码·定方向】命题趋势+3年高考真题热点角度拆解 【解题建模·通技法】析典例，建模型，技法贯通破类题/变式 【实战刷题·冲高分】精选高考大题+名校模拟题，强化实战能力，得高分 命题·趋势·定位 01命题·趋势·定位 1．重工程流程推演：从“识记技术名称”转向“技术流程的动态设计与纠错”。重点考查发酵工程的条件控制、基因工程的操作路径设计，强调逻辑链条的完整性。 2．重技术整合应用：“大技术（基因/细胞工程）+小技术（PCR/电泳）”的综合考查成为常态。试题常将分子生物学技术与传统发酵、生态修复结合，考查解决复杂问题的能力。 3．重真实科研情境：以我国科学家在医药研发、农业育种、环境治理（如你关注的湿地修复）取得的成果为背景，考查在新情境中迁移教材知识的能力。 4．重图表信息处理：以工艺流程图、电泳图谱、微生物培养曲线为核心载体，考查信息转化与定量分析能力（如菌落计数、酶切分析）。 热点·角度·拆解 热点角度 核心考察内容 热点角度01：发酵工程与微生物应用 传统发酵技术（果酒/醋/泡菜）原理；微生物分离、计数（稀释涂布/显微镜计数）；发酵条件优化（温度、pH、溶氧）。 2025·天津河西二模：酿酒酵母的培养基选择、菌落计数及发酵产酸分析。 2024·天津卷：利用谷氨酸棒状杆菌生产苏氨酸的发酵过程分析。 热点角度02：基因工程与分子操作 基因工程四大步骤（获取、构建、导入、检测）；PCR技术原理与应用；限制酶与DNA连接酶的作用；基因表达载体的构建。 2024·天津卷：无缝克隆（同源重组）技术替代传统酶切连接；PCR引物设计及电泳结果分析。 2023·天津模拟：抗虫棉的基因工程育种与安全性评价。 热点角度01发酵工程与微生物应用 析典例·建模型 1．（2026·天津红桥·一模）市场上饮用醋种类繁多，口感不一。某学习小组学习了发酵工程知识后，利用葡萄和糯米酿造果粮复合饮用醋，并设计了如下加工工艺流程： (1)对糯米进行蒸煮糊化的目的是_____（写出1点）。 (2)A、B接种的菌种一般要先活化和_____后，再接种于发酵液中。从细胞结构上看，两菌种的主要区别为_____。 (3)酒精发酵的质量决定了醋的品质。为了解酒精发酵进程，可在发酵过程中定期取样，用_____的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。选择高产醋杆菌时，可将醋杆菌涂布培养在白色的培养基上，并挑选_____大的菌落作为发酵菌种，发酵菌种经扩大培养后再接种至酒醪中进行发酵。 (4)由酒精发酵转变为醋酸发酵，需要改变的环境条件是_____。 第一步，思路模板 第一步：信息提取与审题 解题建模分析 第一步：信息提取与审题 1．明确核心主题：本题为发酵工程的综合应用题，聚焦传统果酒、果醋的制作工艺。核心是分析糯米、葡萄为原料，先后接种酵母菌和醋酸菌的两步发酵过程，考查发酵条件控制、菌种特点、检测与筛选方法。 2．识别关键工艺与变量： 第一步发酵：酒精发酵（接种A，即酵母菌）。 第二步发酵：醋酸发酵（接种B，即醋酸菌）。 工艺控制：菌种活化、接种、发酵进程监控、菌种筛选、发酵条件转变。 3．解读潜在逻辑： ①糯米糊化 → 利于酵母菌利用 → 产酒精。 ②酵母菌（真核）与醋酸菌（原核）结构不同 → 培养与生理需求有差异。 ③酒精发酵（厌氧）与醋酸发酵（需氧）条件不同 → 转变时需调整环境。 第二步：思路拆解与建模 解题步骤 具体分析思路 1. 原料处理目的 (第1问) 考查淀粉类原料的预处理原理。 原理应用：糯米主要成分为淀粉，酵母菌不能直接利用大分子的淀粉。蒸煮糊化可使淀粉分子结构变得松散，增大与酶的接触面积，便于酵母菌产生的酶（或外加的糖化酶）将其水解为可发酵性糖（如葡萄糖），从而提高发酵效率。此外，高温蒸煮也能杀灭部分杂菌。 2. 菌种特性与预处理 (第2问) 考查微生物培养的通用步骤及原核、真核细胞的结构差异。 菌种预处理：在工业发酵中，为使菌种快速适应环境、缩短延迟期，接种前常对保藏的菌种进行活化（恢复其生理活性）和扩大培养（增加菌体数量）。 细胞结构差异：酵母菌是真核生物，有以核膜为界限的细胞核；醋酸菌是原核生物，无成形的细胞核（拟核）。这是两者最根本的区别。 3. 发酵进程监控与菌种筛选 (第3问) 考查微生物数量测定方法及根据表型筛选菌株。 发酵进程监控：了解酒精发酵中酵母菌的增殖状况，常用稀释涂布平板法（或显微镜直接计数法）进行菌落计数。 高产菌株筛选：醋酸菌将乙醇氧化为醋酸，会使培养基pH下降。若在培养基中加入指示剂（如溴甲酚紫，酸性变黄），产酸能力强的菌落周围会出现黄色透明圈。透明圈直径与菌落直径的比值越大，通常表示该菌株产酸能力越强。因此，应挑选透明圈直径大的菌落。 4. 发酵条件转变 (第4问) 考查酒精发酵与醋酸发酵的代谢条件差异。 酒精发酵（酵母菌）：厌氧（或无氧）条件。 醋酸发酵（醋酸菌）：需氧条件，醋酸菌是好氧菌，将乙醇氧化为醋酸需要氧气参与。 条件转变：因此，由酒精发酵转为醋酸发酵，需要提供氧气（通入无菌空气），并可能提高发酵温度（醋酸发酵适宜温度通常高于酒精发酵）。 第三步：规范作答 (1)使淀粉更容易被酶解（或杀灭杂菌、使糯米软化） (2) 扩大培养； 酵母菌有以核膜为界限的细胞核，醋酸菌没有（或有无核膜包被的细胞核） (3) 稀释涂布平板法 透明圈直径与菌落直径比值（或透明圈） (4)通入无菌空气（或有氧环境）、提高发酵温度 研考点·通技法 破类题·提能力 2．（2026·天津和平·二模）生物技术在迅猛发展，它与人类的生活关系越来越密切，请回答下列有关生物技术与工程的问题。 I．如图1是谷氨酸发酵装置示意图，工业上常用谷氨酸棒状杆菌在30℃下发酵获得谷氨酸；如图2是谷氨酸生产的机理，谷氨酸棒状杆菌以葡萄糖为底物进行了如下过程： (1)图1中1、2处是发酵罐夹层中冷凝水的进出口，水在发酵罐夹层流动的作用是_____。图1中3为搅拌器，可以加快谷氨酸形成的速率，其原理是_____。 (2)改变菌体细胞膜的通透性，及时排出谷氨酸是提升产量的关键措施之一，原因是_____。 (3)对谷氨酸棒状杆菌进行硫酸二乙酯和紫外线相结合的复合诱变，经选育得到高产突变株LG-01。将其接种在含葡萄糖的液体培养基中，于30℃下培养48h。摇匀并取培养液稀释107倍后，向四个培养基中分别涂布0.1mL，四个培养皿中生长的菌落数依次为31个、33个、35个、33个，则稀释前菌液的菌体密度为_____个/mL，计算得到的值比实际值偏小。 Ⅱ．利用纤维素酶降解秸秆生产燃料乙醇，对缓解全球能源危机有重大意义。科研人员开展选育高产纤维素酶菌株的相关研究，过程如图3。 (4)从物理状态来看CMC平板属于固体培养基。富集培养后的菌种常采用稀释涂布平板法或_____法接种于CMC平板，培养一段时间后，可根据菌落的_____（写出一项）等特征，初步鉴定并挑取产纤维素酶菌株XZ-33。 (5)鉴定高产纤维素酶菌株是否产生，可使用刚果红平板法。其原理是纤维素被分解，刚果红无法与纤维素的分解产物结合，培养基中的菌落周围会形成透明圈，如图4。下列叙述错误的是_____（多选）。 A．采集的黑土壤需经过高压蒸汽灭菌再进行富集培养 B．配制CMC平板培养基需加入纤维素为唯一碳源 C．紫外线和γ射线处理可使产纤维素酶菌株发生基因突变和染色体畸变 D．图2中两个透明圈内的微生物均能将分解纤维素的酶分泌到细胞外 【答案】(1) 使温度控制在30℃（利于谷氨酸棒状杆菌发酵） 谷氨酸棒状杆菌为需氧型微生物（或搅拌能增加发酵液中的溶解氧，可使其与营养物质充分接触利于该菌发酵） (2)若谷氨酸积累过量，会抑制谷氨酸脱氢酶的活性（从而导致该合成途径中断） (3)3.3×109 (4) 平板划线 颜色（或形状、隆起程度） (5)AC 【详解】（1）图1中1、2处是发酵罐夹层中冷凝水的进出口，这样可以降低发酵罐内的温度，因为微生物发酵过程中会产生热量，导致温度上升，即水在发酵罐夹层流动的作用是降温至30℃利于谷氨酸棒状杆菌发酵。图1中3为搅拌器，谷氨酸棒状杆菌为需氧型微生物，搅拌能增加发酵液中的溶解氧，可使其与营养物质充分接触利于该菌发酵，可以加快谷氨酸形成的速率。 （2）发酵过程中，若谷氨酸积累过量，会抑制谷氨酸脱氢酶的活性，从而导致该合成途径中断，因此提高产物产量的关键是改变菌体细胞膜的通透性，使谷氨酸释放出来，提高产量。 （3）对谷氨酸棒状杆菌进行硫酸二乙酯和紫外线相结合的复合诱变，经选育得到高产突变株LG-01。将其接种在含葡萄糖的液体培养基中，于30℃下培养48h。摇匀并取培养液稀释107倍后，向四个培养皿中分别涂布0.1mL，四个培养皿中生长的菌落数依次为31个、33个、35个、33个，则稀释前菌液的菌体密度为（31+33+35+33）÷4÷0.1×107=3.3×109个/mL， （4）从物理状态来看CMC平板属于固体培养基。富集培养后的菌种常采用稀释涂布平板法或平板划线接种于CMC平板，实现菌种的筛选和分离，培养一段时间后，可根据菌落的特征（颜色、形状、隆起程度）初步鉴定并挑取产纤维素酶菌株XZ-33。 （5）A、采集的黑土壤中含有目标菌株，若经过高压蒸汽灭菌，会杀死土壤中的所有微生物，后续无法进行富集培养来筛选产纤维素酶的菌株。因此不能灭菌，A错误。 B、CMC（羧甲基纤维素钠）是纤维素的衍生物，配制以 CMC 为唯一碳源的平板培养基，只有能分解利用 CMC（纤维素类碳源）的菌株才能生长，可起到选择作用，B正确。 C、产纤维素酶的菌株多为细菌（原核生物），原核生物没有染色体，因此紫外线和 γ 射线处理只能诱发基因突变，无法发生染色体畸变，C错误。 D、刚果红染色法中，透明圈的形成是因为菌株分泌到细胞外的纤维素酶将菌落周围的纤维素分解，刚果红无法与分解产物结合，从而形成透明圈。因此透明圈内的微生物均能分泌胞外纤维素酶，D正确。 热点角度02基因工程与分子操作 析典例·建模型 3．（2024·天津·高考真题）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。 (1)Sa产生抗药性可遗传变异的来源有______（至少答出2点）。 (2)推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。 ①根据图1信息，简述质粒2的构建过程（需包含所选引物和限制酶）：______，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含______的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 ③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含______的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含____________的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是______。 第一步，思路模板 第一步：信息提取与审题 1．明确核心主题：本题为分子生物学与基因工程的综合实验探究题，核心是验证R基因是否与金黄色葡萄球菌（Sa）的头孢霉素抗性有关，并利用同源重组技术敲除R基因进行验证。 2．识别关键信息： 研究目标：探究R基因与抗药性的关系。 基因敲除：利用同源重组技术。 工具构建：需要构建含有R基因上下游同源臂的重组质粒（质粒2）。 筛选策略：运用抗性标记（氯霉素抗性基因 cat和蔗糖致死基因 sacB）进行多轮筛选，以获得敲除成功且去除了质粒的突变菌株。 第二步：思路拆解与建模 解题步骤 具体分析思路 1. 抗药性变异的来源 (第1问) 考查可遗传变异的类型。 细菌可遗传变异：主要包括基因突变（DNA序列改变）、基因重组（如转化、接合、转导等获取外源DNA）以及染色体变异（但细菌为原核生物，通常不涉及染色体结构变异）。 2. 敲除载体的构建 (第2问①) 考查基因工程的操作设计，是本题的核心和难点。 目标：构建质粒2，使其含有R基因的上下游同源臂，以便在Sa基因组中通过同源重组将R基因替换掉。 设计逻辑： 1. 获取同源臂：以Sa基因组DNA为模板，用P1/P2引物扩增获得上游同源臂，用P3/P4引物扩增获得下游同源臂。 2. 选择酶切位点：为使两个片段能依次插入质粒1，需选用不同的限制酶。 3. 第一轮筛选（获得转化子）(第2问②) 考查利用抗性标记进行初步筛选的原理。原理：质粒2上带有氯霉素抗性基因（cat）。用质粒2转化Sa后，只有成功转入并保留了质粒2的Sa细胞才能在含有氯霉素的平板上生长。 4. 第二轮筛选（筛选同源重组及质粒丢失）(第2问③) 考查利用负向选择标记（sacB）和抗生素抗性变化进行精细筛选的策略。 1. 增加同源重组几率：多次传代，给予充足时间发生同源重组事件。同源重组发生后，质粒2上的序列（含cat-sacB）会整合到基因组R基因的位置，但质粒自身可能丢失。 2. 筛选无质粒细胞：质粒2上带有蔗糖致死基因（sacB），该基因在蔗糖存在时表达产物对细菌有毒。因此，在含蔗糖的平板上，仍携带质粒2的细胞会死亡，而丢失了质粒2的细胞（无论是否发生同源重组）可以存活。 第三步：规范作答 【答案】(1)基因突变、基因重组、表观遗传等 (2) 采用引物1和4进行PCR扩增（或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切 氯霉素（或氯霉素+头孢霉素） 脱水四环素 头孢霉素 D 研考点·通技法 破类题·提能力 4．（2023·天津·高考真题）构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌株是解决能源危机的手段之一，为此设计表达载体，思路如下。 (1)外源基因的选择    纤维素常见生物降解途径如下。 酿酒酵母通常无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，应向酿酒酵母转入上图中三种酶的基因，并使其表达产物在细胞________(内/外)发挥作用。 (2)外源基因的插入方法 同源重组是碱基序列基本相同的DNA区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株，如甲图所示。 酿酒酵母基因组有多个AB短序列。为通过同源重组将外源基因插入AB之间，在设计表达载体时，可采用PCR技术在外源基因两端分别引入A和B,获得乙图所示长片段。PCR时应选用的一对引物为________(从P1~P6中选)。 (3)标记基因的选择  URA3是尿嘧啶合成关键酶基因，常被用作标记基因。另外，URA3编码的蛋白可将外源5-氟乳清酸转化为有毒物质，导致细胞死亡。 ①为得到成功插入酶I基因的菌株1，需将酶I基因同URA3一起插入URA3缺陷型酿酒酵母基因组AB之间，并利用__________的培养基筛选存活菌株。 ②在后续插入酶Ⅱ基因时，为继续利用URA3作为筛选标记，需切除菌株1的URA3。为此设计表达载体时，还应向URA3两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C和C´,并以下图方式______排列才能通过同源重组达到上述目的。 此后，需要将菌株1在_________的培养基上培养，存活菌株即为URA3被成功切除的菌株1´。 (4)表达载体的构建   综上，为将三种酶基因依次插入酿酒酵母基因组中，在构建表达载体时，A、B、C、C´、URA3和酶基因应采用下图______的排布方式。 【答案】(1)外 (2)P1和P6 (3) 不含尿嘧啶 2 含有5-氟乳清酸和尿嘧啶（只答含有5-氟乳清酸得2分） (4)4 【详解】（1）由于酵母菌无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，所以导入分解纤维素的酶发挥作用的场所在细胞外。 （2）根据题干信息“当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入”，要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同，需要选择P1和P6这对引物进行PCR。 （3）①URA3 作为标记基因，其表达产物可以合成细胞代谢所必需的尿嘧啶，所以在筛选被转化的受体细胞时，需在培养基中去除尿密啶，无URA3(连同目的基因)的酵母细胞将无法存活，因此可筛选出含有目的基因及 URA3 的受体细胞。 ②如题图所示，方式1中URA3 两侧C、C’是反向同源序列，方式2中URA3 两侧C、C’是同向同源序列。在发生同源重组时，方式1只是导致URA3序列倒位，但不会切除 URA3；而方式2将导致 URA3 以环状小分子形式被切除，并在细胞分裂过程中因不能复制而丢失。故选方式 2。由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质，所以应该在含有5-氟乳清酸的培养基上，如果切割成功，则不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，则会产生有毒物质，不能形成菌落。 （4）在明确了表达载体整体构建思路后，最终的表达载体需要同 时满足两个条件：一是需要将UR43标记基因与目的基因（酶基因）一起 插入酿酒酵母基因组AB之间，所以A、B应置于标记基因与目的基因最 外侧；二是需要利用C、C片段切除URA3 标记基因，同时不能影响酶基因，所以C、 C应紧邻URA3两侧。同时满足上述条件 的只有图4。 （建议用时：45分钟） 刷模拟 1．（2026·天津·二模）某研究小组为研究玉米中Z基因的作用，利用Gibson无缝克隆技术构建了hpRNA表达载体。在受体细胞中，hpRNA表达载体转录产生的hpRNA可诱导Z基因的mRNA特异性降解，进而抑制Z基因表达。 (1)Gibson无缝克隆技术原理如图1所示，在T5核酸外切酶的作用下DNA片段产生黏性末端，两个DNA片段相应互补序列通过氢键结合，然后通过_______酶的作用补全图示缺口部分，再通过_______酶的作用最终获得重组DNA。 (2)为了获得图2中所示的线性化质粒，进行PCR时应该选择的引物组合是_____，在引物的5′端需加入与_______相同的片段。 (3)Gibson无缝克隆技术要求载体插入位点的两端与目的基因的两端有至少15bp的相同序列（不具有限制酶识别序列的特性），图2中序列3和序列4应分别与______和_______相同。线性化质粒两端都是序列1，在Gibson无缝克隆过程中是否会发生自身环化，原因是：_____________。 (4)研究人员将hpRNA表达载体导入到玉米细胞获得转基因玉米植株，取适量一定浓度的_________溶液均匀涂抹在转基因玉米的叶片上，一段时间后叶片颜色_______，说明hpRNA表达载体整合到玉米染色体DNA上。 (5)为了检测hpRNA表达载体是否能够抑制Z基因的表达，对Z基因的表达量进行了实时荧光PCR定量检测，提取转基因玉米相关组织细胞中的_____制作实时荧光PCR的模板，如果转基因玉米的Ct值（PCR产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）______野生型玉米，则说明hpRNA表达载体成功发挥了作用。 【答案】(1) DNA聚合酶 DNA连接酶 (2) 引物1和引物4 序列1 (3) 序列2 序列2 不会，右侧的序列1是倒置连接，T5外切酶切割后形成的序列与左侧序列1切割后形成的序列不互补 (4) 潮霉素 无明显变化 (5) mRNA（RNA，总RNA） 高于（大于） 【详解】（1）Gibson无缝克隆技术原理如图1所示，在T5核酸外切酶的作用下DNA片段产生黏性末端，两个DNA片段相应互补序列通过氢键结合，然后通过DNA聚合酶实现子链延伸，补全图示缺口部分，再通过DNA连接酶的作用将片段之间的磷酸二酯键连接起来，最终获得重组DNA。 （2）为了获得图2中所示的线性化质粒，根据引物的方向可知，进行PCR时应该选择的引物组合是引物1和引物4，同时需要在两种引物的5′端需加入与序列1相同的片段，进而获得图示的线性化质粒。 （3）Gibson无缝克隆技术要求载体插入位点的两端与目的基因的两端有至少15bp的相同序列，结合图2中重组质粒中相关基因的顺序可知，图2中序列3和序列4应均需要与序列2相同，进而可以实现Z基因片段的正向和反向链接。线性化质粒两端都是序列1，但在Gibson无缝克隆过程中不会发生自身环化，这是因为右侧的序列1是倒置连接，T5外切酶切割后形成的序列与左侧序列1切割后形成的序列不互补，因而不能实现自连。 （4）研究人员将hpRNA表达载体导入到玉米细胞获得转基因玉米植株，取适量一定浓度的潮霉素溶液均匀涂抹在转基因玉米的叶片上，一段时间后叶片颜色无明显变化，因为重组质粒中潮霉素抗性基因，因而会抵消潮霉素抑制叶绿素合成的作用，因而叶片表现为无明显变化，说明hpRNA表达载体整合到玉米染色体DNA上。 （5）为了检测hpRNA表达载体是否能够抑制Z基因的表达，对Z基因的表达量进行了实时荧光PCR定量检测，提取转基因玉米相关组织细胞中的mRNA（RNA，总RNA）通过逆转录过程制作实时荧光PCR的模板，如果转基因玉米的Ct值（PCR产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）大于野生型玉米，则说明hpRNA表达载体成功发挥了作用，表现为hpRNA表达载体转录产生的hpRNA可诱导Z基因的mRNA特异性降解，因而RNA含量少，相应的Ct值变大。 2．（2026·天津河东·二模）M蛋白和生物的“记忆形成”过程紧密相关。为了研究M蛋白的具体作用，科研人员培育出了能人工控制M基因表达的实验小鼠。 该实验小鼠的核心设计思路：利用小鼠体内特异性表达的Cre重组酶，敲除两个LoxP位点之间的基因序列；借助小鼠体内表达的蛋白A，激活能启动基因表达的诱导型T启动子。同时使用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（记作M-GFP），导入小鼠后既能恢复被敲除的M基因功能、表达正常M蛋白，又能通过绿色荧光直观追踪M蛋白的表达位置和情况。 该实验的注意事项：小鼠自身的内源M基因会干扰实验，只有纯合子floxM/floxM才能保证所有细胞里的M基因都能被Cre重组酶精准“剪掉”，达到人工控制外源M基因的目的。 (1)基因工程与载体构建 用PCR技术扩增基因片段①和②时，通常会在引物的一端添加限制酶识别序列，该序列应添加在引物的______（选填“5'端”或“3'端”）。 构建载体1时，为了阻断A基因的表达： 从转录水平考虑，可以在两个LoxP位点中间连接____________的片段； 从翻译水平考虑，可以在两个LoxP位点中间连接____________的片段。 为了鉴定载体2是否构建成功，需要用限制酶切割载体后，再进行______检测。 (2)胚胎干细胞培养 培养小鼠胚胎干细胞的过程中需要定期更换培养液，这样做的目的是什么？（至少回答2点）____________。 (3)遗传学杂交与基因型分析 为了快速培育出同时拥有4对目标基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，将Cre/+A/+小鼠、M-GFP/+floxM/+小鼠分别与含floxM/floxM基因的纯合小鼠杂交，子代再杂交一次。最终筛选得到实验模型小鼠的基因型为_____________。 (4)基因表达的人工调控 为了实现M基因的表达可控，在给实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A蛋白的四环素。与未添加四环素相比，添加四环素会______（填“促进”、“抑制”）A蛋白活性，进而______（填“促进”、“抑制”）T启动子的活性，最终阻止______表达，实现人工“关闭”，与未添加时该基因正常表达形成对照，达到调控效果。 【答案】(1) 5′端 终止子 能够转录成终止密码子的DNA片段 琼脂糖凝胶电泳 (2)补充胚胎干细胞生长所需的营养物质和生长因子；及时清除细胞代谢产生的废弃物，防止其积累对细胞造成毒害；维持培养液适宜的pH和渗透压 (3)Cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM (4) 抑制 抑制 M基因（或M-GFP） 【详解】（1）PCR扩增时DNA子链沿5′→3′方向延伸，引物的3′端负责结合模板延伸，因此限制酶识别序列只能添加在引物的5′端。转录水平阻断A基因表达，可插入转录终止子终止转录；翻译水平阻断可插入终止密码子对应的DNA片段，使翻译提前终止，阻断A蛋白合成。载体构建后，用限制酶切割载体后，通过琼脂糖凝胶电泳，根据片段大小判断构建是否成功。 （2）胚胎干细胞培养中，定期换培养液的目的是：补充胚胎干细胞生长所需的营养物质和生长因子；及时清除细胞代谢产生的废弃物，防止其积累对细胞造成毒害；维持培养液适宜的pH和渗透压。 （3）实验的目的是制备M基因表达可控的实验模型小鼠，对M基因的控制是通过蛋白A激活诱导型T启动子来调控的。为了便于追踪，构建了带绿色荧光蛋白基因的M基因，方便观察M基因的表达情况，而自身所带的M基因则需要被敲除，已知两端添加LoxP位点的M基因可被Cre重组酶敲除，所以需要构建两端添加了LoxP 位点的M 基因纯合小鼠，相关基因型为floxM/floxM。该小鼠体内需要有Cre重组酶来切除自身的M基因，同时还要有表达蛋白A的基因以及融合了绿色荧光蛋白基因的M基因来替换被敲除的M基因。综上分析，需进行如下杂交： 最终获得基因型为Cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM的实验模型小鼠。 （4）四环素竞争性结合A蛋白，会抑制A蛋白的活性；A蛋白的功能是激活诱导型T启动子，A活性被抑制后T启动子活性也被抑制；T启动子负责启动M基因（或M-GFP）表达，因此最终会阻止M基因（M-GFP）表达，实现人工关闭。 3．（2026·天津红桥·一模）大豆是重要的粮油作物，研究人员发现基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小）。科研人员开展了相关研究。请分析回答： 研究I：T-DNA插入失活是研究植物基因功能的常用方法，科研人员利用农杆菌转化法成功将T-DNA插入大豆6号染色体的S基因内，使其变为丧失功能的s基因，花粉中S基因功能的缺失会造成其不育。实验利用卡那霉素筛选等技术获得杂合体Ss。 (1)实验中卡那霉素抗性基因位于T-DNA的LB（左边界）和RB（右边界）_____（填“之间”或“之外”）。 (2)为验证基因S的功能，将另一个S基因插入杂合体Ss，该植株自交得到F1，利用图1所示引物P1和P2、P1和P3分别对F1进行PCR检测，电泳结果如图2所示。 ①F1中不能检测到仅扩增出600bp条带的植株，是因为_____。 ②根据电泳结果，F1植株分为I型和II型，其中II型植株占比为1/3，则说明S基因插入的位置_____（填“位于”或者“不位于”）6号染色体，仅考虑基因S和s，I型植株可能的基因型有_____种。 研究Ⅱ：研究人员继续克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。将品种DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种SY。 (3)根据图示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，切割T-DNA可选择的限制酶组合有哪些？_____。为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，不同加样孔加入的材料包括：_____、酶切后的空载体片段、酶切后的重组质粒、启动子D+基因S片段。 (4)用检测后的农杆菌转化品种SY所得再生植株SY-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入SY，所得再生植株SY-2的种子也变大，但小于SY-1，综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是_____。 【答案】(1) 之间 (2) s基因的花粉不育，因此后代不含有只含有s基因的植株 不位于 5 (3) HindIII和Spe I或Hind III和Xba I 已知大小的DNA片段(指示分子大小的标准参照物) (4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大 【详解】（1）T-DNA 是农杆菌中可转移到植物基因组的 DNA 片段，其转移区域是LB（左边界）和 RB（右边界）之间的序列。因此，要让抗性基因随 T-DNA 插入大豆基因组，需将卡那霉素抗性基因置于 LB 和 RB 之间。 （2）①由于s基因的花粉不育，因此后代不含有只含有s基因的植株，即不能检测到仅扩增出600bp条带的植株。 ②若S基因插入6号染色体上，且与原有的S基因连锁，则产生的雌配子为SS：s=1:1，产生的雄配子为S，则后代只含有S基因的Ⅱ型植株占比1/2，与原有的s基因连锁，则产生的雌配子为S：Ss=1:1，产生的雄配子为S：Ss=1:1，则后代只含有S基因的Ⅱ型植株占比1/4，均与Ⅱ型植株占比为1/3不符，则说明S基因插入的位置不位于6号染色体。S基因插入非同源染色体上，基因型为SsSO，其产生的可育花粉为SS：SO：Ss=1:1:1, 含有s的花粉比例为1/3。产生的雌配子的基因型为SS:SO:Ss:sO=1:1:1:1，Ⅰ型植株包含S和s基因，则Ⅰ型植株的基因型有SSSs、SSsO、SSss、SsOO，SsSO、SssO共5种。 （3）根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列，因此不能用EcoR Ⅰ限制酶去切割质粒，酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段单向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达，因此这两种限制酶只能用一种，则切割T-DNA可选择的限制酶组合为HindIII和Spe I或Hind III和Xba I。为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，需要有参照，则加样孔需要加入已知大小的DNA片段(指示分子大小的标准参照物)。 （4）根据题干信息可知，再生植株SY-1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株SY-2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。 4．（2025·天津·二模）刺梨是贵州的特产，富含超氧化物歧化酶和维生素C、花青素等营养物质，为发展当地特色农业，建设新农村，某地决定以刺梨为原料制作高品质饮料。刺梨酒和刺梨醋的主要生产流程如图所示。回答下列问题： (1)刺梨鲜果经分选清洗破碎压榨后，要对榨汁进行澄清处理，像破碎形成的果泥中加入____处理一段时间，既能提高出汁率，又能提高果汁的澄清度，该方法处理果泥时，需要控制适宜反应温度，原因是____。 (2)在发酵I阶段的前期，向果汁中通入氧气的作用是____，在发酵Ⅱ阶段，也需要向发酵液中通入氧气的原因是____。 (3)为保证刺梨酒的品质，技术人员需定期对发酵液的酒精浓度进行检测，检测的原理是酒精与_____反应，通过比对____来确定发酵液中酒精的浓度。 (4)在发酵过程中，为判断发酵液中杂菌是否超标，可抽取一定量的发酵液，通过____法接种到培养基上，对杂菌进行计数以判断杂菌是否超标。 【答案】(1) 果胶酶 温度对果胶酶活性有影响，在最适温度下酶活性最高，出汁率高 (2) 酵母菌在有氧条件下大量繁殖 醋酸菌为需氧菌，在有氧条件下可将酒精转化为乙醛，乙醛再转化为醋酸 (3) 酸性的重铬酸钾 颜色深浅 (4)稀释涂布平板 【详解】（1） 植物细胞壁的主要成分为果胶和纤维素，刺梨鲜果经分选清洗破碎压榨后，要对榨汁进行澄清处理，像破碎形成的果泥中加入果胶酶处理一段时间，既能提高出汁率，又能提高果汁的澄清度。酶的活性受温度影响大，所以需要控制适宜反应温度，因为温度对果胶酶活性有影响，在最适温度下酶活性最高，出汁率高。 （2）在发酵Ⅰ阶段的前期，需增加酵母菌的数量，所以通入氧气的作用是使酵母菌在有氧条件下大量繁殖。发酵II阶段，为醋酸菌利用酒精产生醋酸的过程，醋酸菌为需氧菌，可将酒精转化为乙醛，乙醛再转化为醋酸，该过程需要氧气。 （3）检测酒精用酸性的重铬酸钾，酒精与酸性的重铬酸钾反应，会由橙红色变成灰绿色，通过比对颜色深浅来确定发酵液中酒精的浓度。 （4）对菌种计数一般采用稀释涂布平板法，在发酵过程中，可抽取一定量的发酵液，通过稀释涂布平板法接种到培养基上，对杂菌进行计数以判断杂菌是否超标。 5．（2025·天津·二模）癌症是人类健康的重大威胁之一，传统治疗手段难以实现精准治疗。超声波具有非侵入、组织穿透性强、时空特异性等特点，科研人员拟开发“响应超声波的药物递送系统”细菌以实现癌症的精准治疗。 (1)用于培养药物递送细菌的液体培养基中包含水、酵母提取物、蛋白胨等成分，其中蛋白胨主要为细菌提供____和维生素。可利用____的方法快速直观地测定细菌数量，以便即时使用适量的细菌进行治疗。 (2)C蛋白有抗肿瘤作用，超声波可导致局部温度升高到42℃。科研人员制备了工程菌1，其中含有图1所示的基因表达载体。37℃培养的工程菌1接受超声波刺激后，可升温至42℃，____，从而发挥抗肿瘤作用。    (3)T蛋白有T1、T2和T3三种亚型，具有相似的功能，制备分别含有这三种基因的工程菌1，并检测C蛋白表达量，结果如图2所示。科研人员最终选择____（填T1、T2或T3）基因进行后续研究，判断的依据是_____。 (4)工程菌1只能在超声波刺激期间发挥作用，科研人员设计了含图3所示的基因表达载体的工程菌2，可以实现在短时间的超声波刺激后维持长时间的治疗。已知B基因编码的B酶可以作用于识别位点a和b，使a、b处的DNA发生断裂，最终导致a、b之间的DNA片段发生倒转。请根据以上信息，使用下列选项将表达载体补充完整。____；____；____；____；____。    ①P1启动子②P3启动子（持续表达型启动子）③T基因④C基因⑤B基因 【答案】(1) 碳源、氮源 显微镜直接计数 (2)解除T蛋白二聚体对P1启动子的抑制，启动C基因的表达 (3) T3 温度由37℃到42℃时，含有T3亚型的C蛋白表达量变化最大 (4) P3启动子 C基因 P1启动子 B基因 T基因 【详解】（1）蛋白胨的作用：蛋白胨是由蛋白质水解得到的产物，含有多种氨基酸、多肽等，可为细菌生长提供碳源、氮源（合成蛋白质、核酸等的原料），同时也可提供部分碳源和维生素。 细菌计数方法：题目要求 “快速直观” 测定细菌数量，常用方法为显微镜直接计数法（如血球计数板法），通过显微镜直接观察并计数菌体，无需培养，适合即时检测。 （2）根据图 1，工程菌 1 的基因表达载体中，C 基因由 P1 启动子驱动，且 T 基因（编码 T 蛋白）由持续表达型启动子 P2 驱动。 37℃时，T 蛋白可能抑制 P1 启动子活性，导致 C 基因不表达；当超声波刺激升温至 42℃，温度变化可能使 T 蛋白的抑制作用解除（或 P1 启动子在高温下激活），从而启动 C 基因转录，产生具有抗肿瘤作用的 C 蛋白。 （3）图 2 纵坐标为 C 蛋白表达量，横坐标为温度。观察不同 T 蛋白亚型（T1、T2、T3）对应的曲线，T3 亚型在 37℃时表达量最低，42℃时表达量最高，即温度响应最显著（表达量变化幅度最大）。 选择 T3 基因的原因是：在超声波升温（37℃→42℃）后，其驱动的 C 基因表达量激增最明显，能更高效地发挥抗肿瘤作用。 （4）目标：工程菌 2 需在短时间超声波刺激后维持长时间治疗，即通过一次刺激启动持续表达。 B 酶的作用：B 酶可识别位点 a 和 b，使中间 DNA 片段倒转。倒转后，启动子方向需与转录方向一致。 载体设计逻辑：P2启动子之后应连接T3基因；a、b之间应为持续表达型启动子，即P3启动子，其后应连接的是④C 基因；中间应为P1 启动子和B 基因，超声刺激升温后，P1启动子的抑制解除，启动B基因转录，表达的B酶使a、b之间DNA片段逆转，进而启动C基因的持续表达。 / 学科网（北京）股份有限公司 $