大题05 基因工程与细胞工程类 （3大热点角度剖析）（山东专用）2026年高考生物终极冲刺讲练测

**基本信息** 以高考真题为载体，构建“命题趋势-解题建模-实战应用”三维体系，通过逻辑推理路径和通用模板实现基因工程与细胞工程类大题的系统性突破。 **专项设计** |模块|题量/典例|方法提炼|知识逻辑| |----|-----------|----------|----------| |命题解码|3年高考真题拆解3大热点角度|重程序闭环、原理迁移等4大命题趋势分析|从工具选用到功能验证的完整技术逻辑链| |解题建模|3个高考典例+3类通用模板|酶切方案设计、PCR策略推理等6类路径|基因工程工具→操作程序→检测鉴定的递进关系| |实战刷题|10道模拟题+名校题|破类题技法训练|结合科学思维与探究实践，强化知识迁移应用|

大题05基因工程与细胞工程类 内容导航 【命题解码·定方向】命题趋势+3年高考真题热点角度拆解 【解题建模·通技法】析典例，建模型，技法贯通破类题 【实战刷题·冲高分】精选高考大题+名校模拟题，强化实战能力，得高分 命题·趋势·定位 1.重程序闭环：命题拒绝碎片化设问，强调从“工具选用→载体构建→导入检测→功能验证”的完整逻辑链，要求考生在因果衔接与条件控制的动态推演中，展现出运用基因工程技术方法进行方案设计与过程分析的科学探究能力。 2.重原理迁移：不再停留于标准步骤复述，而要求学生将核心原理应用于反向PCR扩增未知序列、限制酶末端种类组合推演等陌生情境中，要求考生摆脱标准操作复述的思维定式，依托归纳与演绎、模型与建模等科学思维方法阐释新情境中的分子事件。 3.重证据推理：电泳条带模式、抗体杂交信号等实验数据作为实证信息普遍出现，设问指向由此逆向推断限制酶类型、基因型构成或蛋白表达来源，要求考生具备基于数据记录与分析结果、运用逻辑推理建构科学解释并作出合理判断的探究素养。 4.重因果归因：命题深入“基因操作→表达调控→表型显现”各环节的条件性，引导辨析基因存在与性状实现之间的非必然关系，要求考生能够运用演绎推理认识基因表达调控网络的层次性，以严谨的科学思维审视基因功能验证中的复杂性。 热点·角度·拆解 热点角度01 基因工程工具与操作程序的多层次精细考查 2025年山东卷 载体结构识别、限制酶组合策略、补平酶选用、电泳条带逆向推断 2024年山东卷 填空计算与识别：限制酶末端种类上限计算及特异性序列书写 2023年山东卷 填空识记：启动子功能（RNA聚合酶）、载体结构完整性 热点角度02 PCR技术与分子检测策略的综合应用与迁移创新 2025年山东卷 反向PCR的片段环化策略、电泳与测序的检测目的区分 2024年山东卷 填空判断：引物长度与特异性关系；填空推理：从电泳条带模式逆向推断限制酶类型及植株基因型 2023年山东卷 填空策略选择：PCR引物组合筛选逻辑及模板链方向判定 热点角度03 目的基因检测与鉴定方法的多维考查 2025年山东卷 表型逻辑辨析：基因存在≠功能恢复，涉及表达调控、基因沉默 2024年山东卷 个体水平鉴定：通过遗传分离比筛选特定基因型 2023年山东卷 分子水平鉴定：抗体检测融合蛋白表达产物及表达来源判定 热点角度01基因工程工具与操作程序的多层次精细考查 析典例·建模型 1.（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为_____。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和_____对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是_____。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶_____进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为_____bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为_____（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段_____，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为_____（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 (3) 通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，_____（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 【解题建模分析】 一、题型定位 情境来源 学术探究情境——利用农杆菌转化法构建T-DNA插入突变体，筛选种子休眠相关基因并鉴定突变位点 核心知识 Ti质粒结构与功能+限制酶的选择与酶切策略+DNA连接酶与DNA聚合酶的功能辨析+PCR引物设计与扩增策略+基因工程中的鉴定方法 设问结构 三问递进：载体构建与酶切方案设计→突变基因鉴定策略→基因型与表型关系判断（识记→应用→评价） 能力要求 图谱信息解读+酶切方案逻辑推理+PCR策略设计+分子生物学技术综合应用 二、通用解题模板 第一步：信息提取与定位 操作要点 具体做法 本题示例 读题干 ①抓研究背景与核心技术 ②理实验流程 ③审设问指向 背景：农杆菌转化法、T-DNA随机整合、种子休眠突变体筛选； 核心技术：Ti质粒改造、限制酶酶切、PCR扩增； 设问：复制结构、酶切方案、正向重组鉴定、限制酶选择、PCR策略、表型判断 看附图 识图谱元件，辨酶切位点，析片段长度 图甲：Ti质粒图谱，含卡那霉素抗性基因、T-DNA边界、PstI/BamHI/SpeI/SmaI/XbaI酶切位点、抗除草剂基因X、启动子/终止子位置； 图乙：T-DNA插入基因组片段，含引物P1/P2位置 划关键词 圈出题目中的核心名词 复制原点、T-DNA、启动子、终止子；酶名词：SmaI、XbaI、DNA聚合酶、DNA连接酶、限制酶；条件词：“一长一短2条带”“较短条带近似____bp”“4/6/8碱基对”“环化”“测序还是电泳” 第二步：逻辑建模与推理 ①功能-结构对应类 推理路径 本题示例 ① 识别题干描述的功能 ② 调用教材中质粒对应结构名称 题干：“Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构” → 功能：复制 DNA复制起点=复制原点 答案：复制原点 ②酶切方案设计类问题的推理路径（重点） 操作步骤 具体做法 本题应用 解读图谱信息 ①识别载体图谱中各元件位置 ②标注已知片段的长度与酶切位点分布 启动子→终止子之间为插入区域； SmaI切后为平末端； PstI、BamHI、SpeI、XbaI识别序列及位置已知；抗除草剂基因X片段约550bp 分析单酶切局限 ① 识别单一限制酶的产物特征 ② 判断可能导致的问题 仅用SmaI酶切： 产生平末端→插入片段可正向也可反向连接 问题：无法区分正反向重组子 设计双酶切方案 ① 逐一排查候选酶，排除不可用者 ② 明确排除理由 候选酶：PstI、BamHI、XbaI 排除BamHI：酶切位点在终止子内，会破坏终止子功能 排除PstI：PstI产生3'凸出黏性末端，DNA聚合酶须从5'→3'方向延伸子链，无法以3'凸出末端为模板补平 选择XbaI：不破坏关键元件，且产生的黏性末端可被DNA聚合酶补平 设计正向鉴定方案 ① 选择能区分正反向的酶切位点组合 ② 计算预期条带长度 见下方 可用位点排查： SmaI：插入片段左右两侧原本各有一个SmaI位点 SpeI：位于T-DNA上，插入片段内部无此位点 ①梳理鉴定时可用的酶切位点及其有效性 构建重组质粒时，左侧是SmaI切出的平末端与XbaI切出后补平的平末端连接。SmaI的识别序列是CCC↓GGG，XbaI的识别序列是T↓CTAGA。补平后的XbaI末端序列与SmaI末端序列不同，两者连接后形成的序列既非SmaI识别序列也非XbaI识别序列，因此左侧SmaI位点已丢失，无法再被SmaI识别切割。 可用的有效位点：插入片段右侧的SmaI位点、T-DNA上的SpeI位点 结论：用SmaI+SpeI双酶切 ②定位正向重组时有效酶切位点的空间关系，计算短片段长度 双酶切（SmaI+SpeI）产生两个片段： 【正向重组】 左边界…启动子—[左侧SmaI丢失]—[基因X 550bp]—SmaI—SpeI—终止子…右边界 └── 短片段 ──┘ ≈ 550bp 从SpeI到SmaI 双酶切(SmaI+SpeI) → 长带 + 短带(≈550bp) ③插入位点鉴定策略类问题的推理路径 操作步骤 具体做法 本题应用 理解实验目的 ① 明确要验证的科学问题 ② 识别已知与未知信息 目的：证明两个突变体的T-DNA插入同一基因 已知：小麦基因组序列已知、T-DNA序列已知 未知：T-DNA两侧的基因组序列未知 选择限制酶策略 ① “PCR难以扩增大片段”的限制 ② 选择酶切频率更高的酶 PCR限制：片段太长无法有效扩增→ 需产生较短片段 识别序列越短，切割频率越高，片段越小 识别序列4bp > 6bp > 8bp（频率）→ 选择：4bp 设计未知序列扩增策略 ① 识别引物设计的基础要求 ② 推导获取未知序列的策略 引物P1/P2位于已知T-DNA序列上，方向向外 若直接扩增：无反向引物结合位点，无法扩增 策略：将酶切片段环化（自连）→ 环化后P1/P2成为向内的引物对，可扩增中间的未知序列 选择鉴定方法 ① 区分“电泳”与“测序比对”的功能差异 ② 匹配实验目的选择方法 目的：判断未知序列是否属于同一基因 电泳：仅知片段长度，长度相同≠序列相同 测序+序列比对：精确判断碱基序列是否一致 → 选择：测序和序列比对 ④基因型与表型关系判断类问题的推理路径 操作步骤 具体做法 本题应用 （1）识别实验操作 ① 明确转基因操作的内容 ② 区分“检测到基因”与“检测到蛋白/功能” 操作：将野生型基因的表达载体转入突变植株 检测结果：检测到野生型基因（DNA水平） （2）构建因果链条 ① 梳理从基因到表型的完整路径 ② 识别可能的断裂环节 基因→转录→mRNA→翻译→蛋白质→功能→表型 → 检测到基因仅证明DNA存在 → 表达受多种因素影响（启动子强度、mRNA稳定性、蛋白折叠等） （3）给出严谨判断 ① 明确“不能确定”及其理由 ② 区分“可能”与“必然” 基因存在≠基因表达≠功能恢复 → 结论：不能确定表型为野生型 三、规范作答 (1) 复制原点 XbaI DNA聚合酶 SmaI和SpeI 550bp (2) 4 环化 测序和序列比对 (3) 不能 研考点·通技法 一、基因工程的工具 (1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)——“分子手术刀” 切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶。 （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。（真核生物也有） （2）功能：能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 ①限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。 ②在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在C和G之间。 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。 (2)DNA连接酶——“分子缝合针” (3)载体——“分子运输车” （1）作用：将目的基因转入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 （2）种类：质粒、噬菌体和动植物病毒等。 （3）最常用的载体——质粒 （其基因属于细胞质基因） 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。（不是细胞器） （4）载体需具备的条件： ①有一个至多个限制酶切割切点。（作用：供外源DNA片段（基因）插入其中） ②能在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。（作用：使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制） ③有特殊的标记基因。（作用：便于重组DNA分子的筛选） ④对受体细胞无害。（真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。） （5）重组质粒的形成：获取目的基因和切割载体时，通常使用同种限制酶,目的是为了产生相同的黏性末端，便于连接。 缺点：易发生目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接，为了避免上述情况发生，可分别使用两种限制酶去切割目的基因和载体。 （6）选择限制酶切割位点的基本原则： ①切割目的基因时：能切下目的基因且不破坏目的基因。 ②切割质粒时：至少保留一个完整的标记基因，便于筛选。 二、基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 三、基因表达载体的组成 四、基因表达载体的构建过程 (1)首先用一定的限制酶切割载体。 (2)然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。 (3)再利用DNA连接酶将含目的基因的DNA片段拼接到载体的切口处(如图所示)。 破类题·提能力 （2026·山东青岛·二模）图1为一段DNA，需要利用反向PCR的原理扩增已知序列及两侧序列。由于DNA过长，需要使用限制酶进行切割。 (1)限制酶会使DNA中的________水解，从而使DNA链断开。切割时，左侧限制酶I切割之后形成的末端类型为________，因此右侧限制酶切割后，需要使用________酶进行处理，然后用________酶将切割后的DNA片段连接成环。 (2)连接成环后，需要根据已知序列设计一对引物（两引物不重叠）。请写出9个核苷酸的左侧引物5′________3′。利用这对引物进行PCR，将得到的产物继续连接成环，然后用一种限制酶将其切开，即可得到含“需扩增序列（方向一致且完整）”的DNA片段，若达到此目的，最初切割右侧时所用的限制酶应为________，选用该酶的原因是________。 (3)得到大量PCR产物之后，研究人员进一步对已知序列两侧的部分使用双脱氧链末端终止法进行测序。双脱氧链末端终止法通过使用链终止剂——类似于正常dNTP的2′，3′-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），将延伸的DNA链特异性地终止，其反应体系也包括单链模板、引物、4种dNTP和Taq酶。共分四组，每组按一定比例加入一种（ddNTP），它能随机渗入合成的DNA链，一旦渗入合成即终止，于是各种不同大小片段的末端核苷酸必定为该种核苷酸。使用左侧引物的测序结果如图2（只显示部分结果）。要得到上述条带，一般需要对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，产物迁移速率和________有关。请根据显示的结果写出已知序列左侧对应的A链序列5′________3′。 热点角度02 PCR技术与分子检测策略的综合应用与迁移创新 析典例·建模型 （2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越______（填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有______种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-______-3'和5'-______-3'。 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素______筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是______，其中纯合的突变植株是______（填序号）。 (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为______，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 【解题建模分析】 一、题型定位 情境来源 学术探究情境——利用CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑大豆基因L，通过脱落酸信号途径培育耐盐碱大豆品系 核心知识 PCR引物特异性+限制酶识别序列与黏性末端+载体构建与酶切位点分析+抗性筛选+电泳图谱解读+遗传规律 设问结构 三问递进：基础概念填空与计算→酶切位点选择与电泳图谱分析→遗传概率计算（识记→应用→综合） 能力要求 图谱信息解读+限制酶末端序列推导+电泳条带与基因型匹配+遗传分析与概率计算 二、通用解题模板 第一步：信息提取与定位 操作要点 具体做法 本题示例 读题干 ①抓研究背景与核心技术 ②理实验流程 ③审设问指向 背景技术：基因L调控大豆逆境响应、CRISPR/Cas9基因编辑、向导DNA序列； 设问：引物特异性、黏性末端种类、载体末端序列、筛选抗生素、酶切电泳鉴定、遗传概率 看附图 识图谱元件，辨酶切位点，析条带差异 图甲：载体图谱含BsaI位点及两侧序列、卡那霉素抗性基因；图乙：目标基因L部分序列，标注BamHI/EcoRI/SacI位点差异； 图丙：四株抗性植株PCR产物酶切电泳结果 划关键词 圈出题目中的核心名词 结构词：向导DNA、T-DNA、卡那霉素抗性基因； 酶切词：BsaI、BamHI、EcoRI、SacI、黏性末端； 数值条件词：“引物越短特异性越____”、“最多____种”、“5'--3'”、“纯合突变植株”、“所占比例____” 第二步：逻辑建模与推理 ①基础追问类问题的推理路径 类型 推理路径 本题示例 引物特异性判断 ① 调用PCR引物设计原理 ② 推导长度与特异性的关系 引物越短→与非靶序列互补配对概率越高→特异性越低 答案：低 黏性末端种类计算 ① 识别酶切后突出单链的碱基组成 ② 计算随机序列的组合数 BsaI酶切后产生NNNN突出单链 4个随机碱基，每个位置4种可能 组合数=4⁴=256→ 答案：256 载体末端序列推导 ① 定位图谱中BsaI酶切位点 ② 识别识别序列与切割位点的位置关系 ③ 写出切割后保留在载体上的突出单链序列 BsaI识别序列GGTCTCN↓NNNN → 切割后N链在下方，突出单链=最后4个N的互补链 左侧：5'-CAAT-3' 右侧：5'-GTTT-3' ②酶切鉴定与电泳解读类问题的推理路径（重点） 操作步骤 具体做法 本题应用 确定筛选标记 ① 定位图谱中抗性基因 ② 匹配对应抗生素 图甲：载体含卡那霉素抗性基因 → 筛选抗生素：卡那霉素 比较序列差异 ① 对比目标序列与突变序列 ② 找出酶切位点的差异所在 图乙：目标序列与突变序列对比 BamHI位点：两者均有（无法区分） EcoRI位点：两者均有（无法区分） SacI位点：目标序列无，突变序列有 选择鉴定用酶 ① 选取在目标序列与突变序列中存在差异的酶 ② 确保能通过酶切结果区分基因型 目标序列无SacI位点→PCR产物不被切→一条带 突变序列有SacI位点→PCR产物被切→两条带 选择SacI 匹配电泳结果与基因型 ① 根据条带数判断各植株的酶切结果 ② 结合纯合/杂合概念匹配基因型 图丙解读： 电泳条带从上到下，分子大小由大到小 突变序列PCR产物会被切断 ②：一条长条带→未被切断→未突变纯合子 ①和③：三条带→一条未被切断、两条切断后条带→一个突变后基因，一个未突变基因→突变杂合子 ④：两条带→没有长条带→无未突变基因→纯合突变植株 选择④ ③遗传推断类问题的推理路径 操作步骤 具体做法 本题应用 明确亲本基因型 ① 提取题干中亲本的遗传信息 ② 将文字转化为遗传学符号 题干：“体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入”→ 关于T-DNA插入为杂合状态（t/T） 题干：“基因L成功突变的纯合植株”→ 关于突变位点为纯合（m/m） 分析配子类型 ① 判断T-DNA在染色体上的遗传行为 ② 确定配子种类及比例 T-DNA插入（含抗生素抗性基因）位于一对染色体中的一条 减数分裂：1/2配子含T-DNA（抗性），1/2配子不含T-DNA（敏感） 构建遗传图解 ① 写出亲本自交的组合 ② 计算子代基因型与表型比例 雌配子：1/2 T、1/2 t 雄配子：1/2 T、1/2 t 子代：1/4 TT（抗性）+ 1/2 Tt（抗性）+ 1/4 tt（敏感） 题干要求：“突变位点纯合且对抗生素敏感” 突变位点已纯合（已知条件），只需无T-DNA插入 → 比例：1/4 三、规范作答 (1) 低 256 5'-CAAT-3' 5'-GTTT-3' (2) 卡那霉素 Sac Ⅰ ④ (3) 1/4 研考点·通技法 一、利用PCR获取和扩增目的基因 (1)含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 (2)原理：DNA半保留复制。 (3)基本条件 ①场所：在一定的缓冲液中进行，其中一般要添加Mg2＋。 ②模板：DNA母链。 ③原料：4种脱氧核苷酸。 ④酶：耐高温的DNA聚合酶。 ⑤引物：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。 (4)过程 ①变性：当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。 ②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 ③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 (5)上一轮循环的产物可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环的次数)。 (6)鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 二、PCR技术和DNA复制的比较 破类题·提能力 （2026·山东·模拟预测）AC转座子是一类可移动的DNA序列，能够在基因组中“跳跃”到新位置。AC转座子中转座酶基因表达的转座酶可识别并结合IR序列实现转座子的切离与随机插入，从而导致某些基因突变。由于AC转座子不断自主转座，使突变体植株性状难以稳定。科学家通过修改AC转座子，仅去除IR全部序列使其无法自主转移，D元件可借助AC转座子编码的转座酶实现转移，从而构建了重组载体A，用于筛选获得性状稳定的突变体植株。 (1)利用PCR修改并扩增AC转座子，使修改后的转座子无法移动并定向插入Ti质粒中，设计的一对引物的碱基序列分别为5'-______3'和5'-______3'（写出前11个碱基序列），利用PCR修改并扩增AC转座子过程需要用到______酶。 (2)将抗除草剂基因两端添加IR序列和限制酶BamHⅠ识别序列构建D元件，并将D元件插入载体中。为确定D元件连接到质粒中且插入方向正确，若仅用一对引物进行PCR检测，应选择图中的引物______。 (3)大豆植株的紫花性状为显性性状，由9号染色体上的C基因控制，T-DNA或D元件的插入会导致基因失活，由D元件插入导致的突变可因D元件的切离而发生回复突变。D元件可反复切离并随机插入染色体任何位置，且在个体发育的任何时期均可发生导致性状不稳定。利用农杆菌转化法将构建成功的重组载体A导入基因型为Cc的大豆细胞，经______过程得到1条染色体上有T-DNA插入的转基因大豆植株甲。植株甲开紫花、白花、紫白相间的花，说明植株甲______（填“部分”或“全部”）C基因被______（填“T-DNA”或“D元件”）插入。植株甲的某朵白花在生长过程中出现紫斑的原因最可能是______。 (4)利用选择培养基对植株甲的自交后代进行筛选，______的植株为性状稳定的突变体植株，用作进一步研究。 A．对卡那霉素无抗性、对除草剂无抗性 B．对潮霉素无抗性、对除草剂有抗性 C．对卡那霉素无抗性、对除草剂有抗性 D．对潮霉素无抗性、对除草剂无抗性 热点角度03 目的基因检测与鉴定方法的多维考查 析典例·建模型 （2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。    (1)与图甲中启动子结合的酶是____________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有________________（答出2个结构即可）。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物___________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_____________（填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了__________，条带2所检出的蛋白______________（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。 【解题建模分析】 一、题型定位 情境来源 学术探究情境——构建可表达J-V5融合蛋白的重组质粒，通过PCR和抗体检测鉴定重组质粒的正确性 核心知识 基因表达载体结构（启动子、终止子、标记基因、复制原点）+PCR引物设计策略+DNA链方向与转录模板链+抗体检测与蛋白表达鉴定 设问结构 三问递进：载体结构填空→PCR引物选择与链方向分析→抗体检测与蛋白鉴定（识记→推理→应用） 能力要求 图谱信息解读+引物与模板链方向逻辑推理+抗体检测结果与蛋白来源匹配 二、通用解题模板 第一步：信息提取与定位 操作要点 具体做法 本题示例 读题干 ①抓研究背景 ②理质粒结构 ③审设问指向 背景：J-V5融合蛋白重组质粒、V5编码序列表达标签短肽V5；设问：启动子结合酶、载体必备结构、PCR引物选择、a链/b链匹配、条带鉴定 看附图 识图谱元件，辨引物位置与方向，析抗体检测条带分布 图甲：质粒图谱含启动子、终止子、J基因、V5序列、引物F1/F2/R1/R2位置及方向、a链/b链标注； 图乙：抗J蛋白抗体和抗V5抗体检测条带比较 划关键词 圈出题目中的核心名词 结构词：启动子、终止子、复制原点、标记基因； 引物词：F1、F2、R1、R2、a链、b链； 条件限制词：“J基因转录模板链位于b链”、“插入方向正确”、“条带1/条带2” 第二步：逻辑建模与推理 ①载体结构类问题的推理路径 类型 推理路径 本题示例 启动子结合酶类 ① 调用教材启动子功能定义 ② 匹配对应的酶 启动子功能：启动下游基因转录 转录起始需RNA聚合酶识别并结合启动子 答案：RNA聚合酶 载体必备结构类 ① 识别图中已标注的结构 ② 回忆教材载体必要条件 ③ 排除已标注项，补充缺失项 图甲已标注：启动子、终止子、J基因、V5编码序列 载体还需：限制酶切割位点、标记基因、复制原点等 答案：限制酶切割位点、标记基因、复制原点任答2个即可 ②PCR引物选择与链方向推理类问题的路径 操作步骤 具体做法 本题应用 理解PCR鉴定目的 ① 明确PCR要验证什么 ② 确定扩增片段须包含的关键区域 目的：确定J基因已正确连接到质粒且插入方向正确 → 扩增片段须覆盖J基因与载体连接处→ 即引物一端在载体上，一端在J基因上 筛选有效引物组合 ① 分析各引物在质粒上的位置 ② 判断组合能否扩增跨连接点的片段 引物位置：F1/F2在载体上（J基因上游），R1/R2在J基因内部 F2+R1：F2在载体，R1在J基因内 → 跨连接点 ✓ F1+R2：F1在载体，R2在J基因内 → 跨连接点 ✓ F1+R1：均在载体侧，不跨连接点 ✗ F2+R2：均在载体侧，不跨连接点 ✗ 答案：F2和R1 或 F1和R2 判断引物序列与哪条链相同 ① 明确DNA双链的命名与方向 ② 理清引物延伸方向与模板链的关系 ③ 由模板链推导引物序列与哪条链一致 关键信息：转录模板链=b链；引物F1位于左侧 方向推导链： ① 启动子在左，终止子在右 → 转录方向从左到右 ② 转录模板链(b链)方向：3'→5'（与转录方向反向） ③ PCR引物延伸方向：5'→3' ④ F1为前引物，在左侧→结合的单链须方向为3'→5'（模板链方向） ⑤ 引物F1结合的模板是b链 ⑥ 引物序列与模板链互补→F1序列与a链（b链的互补链）相应部分相同 → 答案：a链 ③ 抗体检测与蛋白鉴定类问题的推理路径（重点） 操作步骤 具体做法 本题应用 理解两种抗体的检测靶标 ① 明确抗体1（抗J蛋白抗体）识别什么 ② 明确抗体2（抗V5抗体）识别什么 抗J蛋白抗体：识别J蛋白结构域 抗V5抗体：识别V5短肽标签 融合蛋白J-V5同时含J和V5，可被两种抗体同时识别 分析条带1的检测结果 ① 观察两种抗体检测的一致条带 ② 判断该条带对应的蛋白性质 条带1：抗J蛋白抗体（+）、抗V5抗体（+） → 该蛋白同时含有J结构域和V5标签 → 为J-V5融合蛋白 分析条带2的检测结果 ① 观察条带2在两种抗体检测中的差异 ② 判断条带2蛋白的来源 条带2：抗J蛋白抗体（+）、抗V5抗体（-） → 该蛋白含J结构域但不含V5标签 → 由内源J基因表达或非融合形式产生 → 不是由重组质粒上的J基因表达的 → 答案：不是 三、规范作答 (1) RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等 (2) F2和R1或F1与R2 a链 (3) J-V5融合蛋白 不是 研考点·通技法 一、目的基因的检测与鉴定 （1）检测目的基因是否导入 方法一：PCR扩增 提取转基因生物的DNA，进行操作，检测是否扩增出目的基因 方法二：DNA分子杂交技术 ①原理：碱基互补配对 ②原因：带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。 基因探针：一段带放射性标记的、与目的基因互补的短单链核苷酸序列。可以是DNA，也可以是由之转录而来的RNA，探针的长度可以包括整个基因或基因的一部分。 ③步骤：a.取出转基因生物的基因组DNA。 b.将含目的基因的DNA片段用放射性同位素（荧光分子或化学发光催化剂）等作标记,以此做探针。 c.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中。 （2）检测目的基因是否转录 方法一： RT-PCR扩增 方法二： 分子杂交技术。其与DNA分子杂交技术类似。 带将标记的基因探针，与mRNA在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。 （3）检测目的基因是否翻译 ①方法：抗原—抗体杂交技术 ②过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带 （4）个体生物学水平的鉴定：检测目的基因是否表现出相应的性状。 破类题·提能力 （2026·山东东营·二模）植物受病原菌侵害时会产生大量水杨酸(SA)并利用SA合成水杨酸甲酯(MeSA)，释放给周围植物“报信”。科学家发现拟南芥S基因缺失株系①中MeSA合成受限，B基因缺失株系无法合成MeSA，为探究S蛋白和B蛋白在MeSA合成过程中的相互作用，科学家做了如下研究，相关信息如图所示。回答下列问题。 (1)为获得S-GST融合蛋白，需要构建S-GST基因过表达载体。通过PCR特异性扩增目的基因S(只含氨基酸编码序列，810个碱基对)需先设计引物，引物的作用是___________。为利用限制双酶切法将S基因连入载体，在引物___________(填“5′”或“3′”)端上添加相应的限制酶识别序列。实验室可使用的限制酶及载体信息如图1所示，已知目的基因中无图示限制酶识别序列，且引物上只添加限制酶识别序列，翻译过程从S基因的起始密码子开始，为正确表达S-GST融合蛋白，防止密码子读取错位，可选择的限制酶组合有___________种。 (2)将构建好的载体利用农杆菌导入株系①获得转基因株系①-1，提取转基因株系染色体DNA用构建载体的限制酶双酶切获得了与目的基因相同大小的片段，___________(填“能”或“不能”)证明目的基因成功导入受体细胞，原因是___________。后经测序发现只有一个T-DNA插入到①-1基因组中，利用测序结果设计了如图2所示特异性引物，让该株系自交，可选用图中三种引物___________(用字母表示)对自交后代基因组DNA进行PCR扩增并进行凝胶电泳检测，杂合子会出现一长一短两条电泳条带。 (3)为探究S蛋白与B蛋白之间的关系，又在株系①-1的基础上获得了可同时表达B-MBP蛋白的株系①-2，用可以和GST蛋白特异性结合的“磁珠”对不同株系总蛋白进行处理，处理过程中蛋白质保持活性，洗脱“磁珠”上的蛋白质，变性后进行凝胶电泳，抗体检测后结果如图3，推测蛋白S和蛋白B___________(填“能”或“不能”)结合。后续检测发现B蛋白是MeSA合成过程中的一种关键酶，且SA处理时①-2的MeSA合成能力较①-1显著增强，综合分析植物在受到病原菌侵袭时，完成“报信”的机制是___________。 （建议用时：90分钟） 刷模拟 1.（25-26高二下·山东青岛·阶段检测）某植物的A基因是一个受低温等因素诱导表达的基因，其表达产物A蛋白是该种植物获得耐寒性不可或缺的一种防冷冻蛋白。科研小组欲利用A基因培育转基因抗冻番茄新品种。A基因上的两个限制酶切割位点及载体结构如图所示，回答下列问题： (1)研究人员用限制酶EcoRⅠ切出的末端Ⅰ为，用限制酶SmaⅠ切出的末端Ⅱ为，请依次写出这两种限制酶的识别序列，并用箭头标出切割位点______、_______。 (2)利用PCR扩增目的基因时，需加入两种引物，引物的作用是_______图中启动子的作用是______。 (3)A基因转录时以图一中α链为模板链，mRNA自身的延伸方向为5'→3'。A基因应插入图二中_____（填“启动子甲”或“启动子乙”）的下游，并且酶切位点______（填“1”或“2”）离该启动子更近些。 (4)为使甘蓝具有抗除草剂能力，科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入甘蓝植株，获得抗草甘膦转基因甘蓝。回答下列问题： a.草甘膦抗性基因一条链的两端序列如图1所示，采用PCR 技术获取和扩增草甘膦抗性基因时应选用的2种引物序列是______（标出5'端和 3'端）。若初始加入1个草甘膦抗性基因，则历经 4 次 PCR 循环需要消耗引物数量为______个。 b.图2中步骤③将农杆菌与甘蓝愈伤组织共培养后，在步骤④的培养基中添加______以便筛选出含目的基因的甘蓝植株。添加此抗生素而不选用添加另一种抗生素筛选的原因______。 c.若要检测转基因甘蓝植株是否产生抗除草剂蛋白，所用的方法是______。 2.（2026·山东泰安·模拟预测）曲酸是米曲霉的次生代谢产物，为提高米曲霉产曲酸能力，科研人员用同源重组技术将曲酸合成有关的kojR基因导入米曲霉g-1（pyrG基因缺陷）菌株中，获得高产的g-58菌株，部分过程如图甲所示，其中kanr（卡那霉素抗性基因）、pyrG（合成尿嘧啶关键基因）均为标记基因。请回答： 注：①kojR基因中a链为模板链，pyrG基因中b链为模板链 ②LB、RB为T-DNA的左右边界 ③kojR-pyrG基因的启动子和终止子的长度可忽略 (1)现欲通过PCR技术构建kojR-pyrG融合基因，需在反应体系中加入适量的Mg2+，其作用是__________。研究人员通过PCR技术用图甲中不同的引物组合来检测重组质粒是否构建成功，所得结果如图乙所示，泳道1使用的引物组合是__________，泳道2上扩增的DNA分子长度约为__________，泳道3__________（填“能”或“不能”）证明重组质粒构建成功。 (2)现有以下培养基成分：①碳源②氮源③无机盐④水⑤卡那霉素⑥尿嘧啶，筛选g-58菌株的培养基需要添加__________（填序号）。 (3)研究人员计划用甲图所示的同源重组技术敲除米曲霉g-1菌株中的LaeA基因并回补pyrG基因，来探究LaeA基因对米曲霉产曲酸的影响，请根据图甲过程及原理判断图丙中A、B基因分别为__________基因。 (4)通过研究表明，米曲霉中的LaeA基因可促进其次生代谢产物合成酶基因的转录。科研人员对摇瓶培养相同时间的g-1和g-58菌株进行相关数据检测，结果如下表。 发酵时间（d） g-1菌株（g/L） g-58菌株（g/L） 曲酸产 量（g/L） kojR基因 相对表达量 LaeA基因 相对表达量 曲酸产量（g/L） kojR基因相 对表达量 LaeA基因 相对表达量 3 6.5 1 1 9.5 100 2.2 6 10.5 1.5 1.2 25.5 130 3.7 据表分析，kojR基因能使米曲霉产曲酸增多的原因可能是：__________。 3.（2026·山东日照·二模）M蛋白与“记忆”的形成密切相关，为研究相关机理科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠，部分制作流程如图1。实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列，同时利用体内表达的外源蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（M-GFP）的表达，恢复小鼠自身被敲除的M基因功能，同时便于示踪。 (1)利用同源重组将外源基因插入染色体的特定位点，在PCR扩增片段①时，通常会在所用引物F1、R1的______（填“3′端”或“5′端”）添加同源序列。为了敲除小鼠的M基因，在构建载体1时，还应向M基因两端引入loxP位点，以图2中方式______排列才能通过同源重组达到上述目的。 (2)研究者利用______法将重组载体导入小鼠的______（填细胞）中，对代孕母鼠进行______处理，通过胚胎移植获得基因型floxM/floxM的小鼠。采用同样的方法，获得基因型Cre+/A/+的小鼠（基因型A/+指的是A基因被整合在细胞同源染色体中的一条，即可看成基因Aa）。 (3)为了快速高效繁育出含有4对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre+/A/+小鼠和M-GFP+/floxM+/小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交后最终获得基因型为______实验模型小鼠。 (4)研究发现，四环素可竞争结合A蛋白，在饲喂实验模型小鼠时，在饲料中添加四环素的目的是______。 4.（2026高三下·山东临沂·专题练习）在植物遗传转化过程中，除目的基因外，标记基因等序列也会随目的基因整合到作物基因组中，应予以剔除。科学家构建了可诱导剔除标记基因的载体，并将其导入拟南芥获得无标记基因的耐盐个体，相关过程如图所示。Cre-loxP系统由Cre酶和DNA上的特殊序列loxP组成，两个同向loxP间的DNA序列可被Cre酶识别并切除。 (1)基因工程的核心步骤是_____________。将基因1插入质粒时，切割质粒需选用的限制酶是_____________。基因1转录时的模板链是_____________（填“α链”或“β链”）。 (2)基因2插入时使用了无缝克隆技术，其流程是先对质粒进行PCR获得线性化载体，再通过PCR在目的基因两端添加与线性化载体两端相同碱基序列，然后将线性化载体与目的基因混合，在酶的作用下，从线性化载体与目的基因3'端起始切除15个核苷酸，暴露出互补的单链区域，最终促使插入片段与载体能够借助这些互补区域实现连接。 ①通过PCR对质粒进行线性化时，应选用的引物序列是_____________。（仅表示出5'→3'的10个碱基） A．5'ATCGCCTGAC3'    B．5'GACTCTAGAT3'    C．5'ATCTAGAGTC3'    D．5'TAGCGGACTG3' ②与单酶切后用DNA连接酶连接相比，这种无缝克隆技术的优点有_____________。 (3)将卡那霉素抗性基因和耐盐基因插入质粒获得重组质粒，其中基因1应是_____________基因（填“卡那霉素抗性”或“耐盐”）。重组质粒导入作物受体细胞后，应先后在分别添加_____________的培养基中筛选并培养，最后进行耐盐鉴定获得无标记基因的耐盐个体。 5.（2026·山东德州·二模）人绒毛膜促性腺激素（hCGβ）是胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，研究发现，结肠癌等多种恶性肿瘤细胞的hCGβ基因也有表达，研发抗hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图为其制备的基本方案。回答下列问题。 注：1．①、②、③和④是基因两端对应的引物 2．BsmBI的识别序列和切割位点信息（N代表任一碱基）： (1)利用大肠杆菌工程菌合成的hCGβ质量不理想，从细胞结构的角度分析原因是_____。对hCGβ基因进行PCR扩增时，所选引物是图中的_____，引物的作用是_____。 (2)限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端。载体信息如图所示，经BsmBI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-_____-3'和5'-_____-3'。 (3)阶段IV需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要添加以下哪些成分_____（a．氨苄青霉素b．无机盐c．组氨酸d．葡萄糖），可在此培养基上生长的酵母菌即为转化成功的目的菌株，“转化”是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内_____的过程。 6.（2026·山东青岛·一模）鲍迪苷D（RD）是来自甜叶菊的高品质低热量天然甜味剂，在自然界中含量很低。体外可利用生物转化法将一个葡萄糖基U—DPG转入到鲍迪苷A（RA）的特定侧链上合成RD，来源于水稻的葡萄糖基转移酶E11是体外制备RD的关键酶。研究人员通过基因工程技术制备能够表达E11的工程菌，为实现生物转化法合成RD奠定了基础，制备流程及限制酶酶切位点如图1。 限制酶 识别序列及切割位点 NsiⅠ 5' ATGCA↓T3' 3' T↑ACGTA5' ApaⅠ 5' GGGCC↓C3' 3' C↑CCGGG5' PstⅠ 5' CTGCA↓G3' 3' G↑ACGTC5' PspOMⅠ 5' GGGCC↓C3' 3' C↑CCGGG5' SalⅠ 5' G↓TCGAC3' 3' CAGCT↑G5' (1)可从______中查询基因E11的编码序列，设计特定引物。提取水稻细胞中的______，经逆转录获得总cDNA，将其作为PCR反应的模板，在制备PCR反应体系时，用微量移液器吸取不同试剂前，除需要确认或调整刻度和量程外，还需要______。 (2)为保证基因E11与pET质粒连接的准确性和效率，结合图1分析，应在基因E11转录模板链的5' 端和3' 端分别添加限制酶______的酶切序列。若基因E11转录模板链的3' 端不添加限制酶酶切序列，要实现基因E11与质粒载体的定向连接，对pET质粒应进行的操作是______。 (3)使用相关限制酶处理质粒和目的基因，连接后转化大肠杆菌，将转化后的大肠杆菌接种到含有______的培养基中培养。假设限制酶切割前后，pET质粒大小基本不变，为进一步筛选重组质粒，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取1～4号菌落中的质粒电泳，结果如图2。推测______号菌落含有重组质粒，其他菌落的条带出现的原因可能是______。 (4)将纯化得到的蛋白E11添加到含有______（填物质）的反应体系中，通过检测RD的合成速率以验证蛋白E11的酶活性。 7.（2026·山东枣庄·二模）福寿螺Mfcsg基因编码的多功能纤维素酶能够高效降解纤维素。研究人员利用无缝克隆技术构建融合基因导入毛木耳中，以提高其纤维素降解能力，相关流程如图1所示，已知潮霉素对真菌细胞有毒性。限制性内切核酸酶BsmB Ⅰ具有偏移剪切特性（切割位点在识别序列之外），利用BsmB Ⅰ可以实现多DNA片段无缝连接，其识别序列及切割位点位于接头序列两侧。 (1)为获取Mfcsg基因，可先从福寿螺胃组织细胞中得到mRNA，然后通过_______过程得到cDNA，进而制备目的基因。所构建重组质粒中的S启动子是毛木耳基因的启动子，而没有使用Mfcsg基因自身的启动子，最可能的原因是_______。 (2)作为载体，图中重组质粒除标出的结构外，还需具备的结构有_______（答出2点），经过程②构建的重组质粒中不含有BsmB Ⅰ识别序列，原因是_______。 (3)过程①的作用是_______。若Mfcsg基因两端的部分序列为5′-GCGGATGA……TTATGCTCG-3′，已知引物R2的碱基序列为5′-CGTCTCNcgagCATAA…-3′（小写字母表示接头序列），则引物F2的序列可以设计为5′-_______-3′（写出所有已知序列）。若S启动子中与R1互补的核苷酸链从左向右的序列为5′-ATGCGTGA……GGTATGCTT-3′，则引物F2的序列应设计为5′-_______-3′（写出所有已知序列）。 (4)将重组质粒的农杆菌导入毛木耳细胞，然后转移至含有_______的培养基中，能正常生长的为符合要求的受体细胞。为检测目的基因是否表达且发挥功能，可以采取的检测方法是_______。 8.（2026·山东滨州·一模）流感病毒的抗原有H和N两类，均可以分为很多亚型。某科研团队基于融合蛋白的思路，尝试制造H3、N2融合蛋白疫苗，以更好地预防H3N2病毒。 (1)获取病毒H3、N2抗原蛋白的mRNA，通过____过程得到相应的DNA，并进一步构建H3、N2融合基因。在H3蛋白基因和N2蛋白基因融合的过程中，起搭桥作用的是____（从引物1～8中选择）。 (2)从引物角度分析，两种基因能够融合的关键是____，变性后形成的杂交分子在延伸为双链等长的融合基因时，不需要添加引物的原因是____。若融合基因中上游基因的mRNA终止密码子对应的碱基序列未被切除，则融合基因翻译得到的抗原蛋白为____。 (3)将目的基因与运载体连接过程中，首先需要用____（填限制酶种类）处理载体；用____（填限制酶种类）处理目的基因所在的片段。 (4)利用大肠杆菌作受体细胞筛选获得目的菌株：首先在含卡那霉素的培养基上培养目标菌，将培养基上生长的菌落用影印法接种到含四环素的培养基上，最后选择____的菌株。 9.（2026·山东临沂·一模）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物体中提取难度大、产率低。通过在离体培养的植物细胞中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。 (1)图1中标识了质粒和基因N中限制酶的切割位点，基因N的b链为转录模板链。为将基因N正确插入质粒，引物1应添加的碱基序列是5′-______-3′，切割质粒时应选用的两种限制酶是______。质粒上的抗性基因______可用于初步筛选成功转化的植物细胞。 (2)耐高温的DNA聚合酶在PCR的______步骤中起作用。PCR扩增产物和质粒分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含N基因的重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后、质粒对应部分大小基本不变。进一步筛选转化的细胞，以1~4号细胞株中提取的DNA为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是______。初步判断实验组_____（从“1~4”中选填）的细胞中成功插入了基因N，理由是______。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有______。 a.5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b.5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c.5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d.5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' 10.（2025·山东潍坊·三模）科研人员通过CRISPR/Cas9系统敲除小鼠的PPP2R3A基因，研究该基因对小鼠心脏功能的影响。其过程为：构建含sgRNA基因和Cas9酶基因的表达载体，通过显微注射将该表达载体导入小鼠的卵细胞中，利用CRISPR/Cas9系统敲除PPP2R3A基因构建模型小鼠。图1为Cas9酶基因的DNA片段且转录方向从左到右；图2为所用质粒及质粒上有关限制酶的识别序列和酶切位点示意图，Ampr为氨苄青霉素抗性基因、Tetr为四环素抗性基因。 (1)研究表明，Cas9酶基因两侧没有限制酶切位点，在构建表达载体的过程中，可借助PCR技术在引物的______（填“5′”或“3′”）端添加限制酶切序列；引物1序列区由5′→3′的碱基序列为______，引物2序列区应含有限制酶______的识别序列。 (2)研究发现，实际操作时，只需敲除PPP2R3A基因的部分碱基序列，即可使其失去功能。科研小组用PPP2R3A基因敲除的模型小鼠（KO组）与未做处理的小鼠（WT组）进行杂交，获得子代小鼠（F1组）。三组小鼠PPP2R3A基因的电泳图谱如下图所示。 据图分析，PPP2R3A基因的长度为______；敲除掉的碱基序列长度为______；4、5、6、12、14是______组小鼠的电泳图。 (3)该科研小组检测了小鼠心脏组织中相关基因的表达情况，结果如下表所示（RGS19为参与心脏发育的蛋白信号转导调控因子）。 组别 PPP2R3A mRNA PPP2R3A蛋白 RGS19 WT组 1.31 0.24 0.87 KO组 0.76 0.14 1.21 据表分析可知，与WT组相比，KO组______。由此可以得出结论是_______。 第 1 页 共 7 页 学科网（北京）股份有限公司 $ 大题05基因工程与细胞工程类 内容导航 【命题解码·定方向】命题趋势+3年高考真题热点角度拆解 【解题建模·通技法】析典例，建模型，技法贯通破类题 【实战刷题·冲高分】精选高考大题+名校模拟题，强化实战能力，得高分 命题·趋势·定位 1.重程序闭环：命题拒绝碎片化设问，强调从“工具选用→载体构建→导入检测→功能验证”的完整逻辑链，要求考生在因果衔接与条件控制的动态推演中，展现出运用基因工程技术方法进行方案设计与过程分析的科学探究能力。 2.重原理迁移：不再停留于标准步骤复述，而要求学生将核心原理应用于反向PCR扩增未知序列、限制酶末端种类组合推演等陌生情境中，要求考生摆脱标准操作复述的思维定式，依托归纳与演绎、模型与建模等科学思维方法阐释新情境中的分子事件。 3.重证据推理：电泳条带模式、抗体杂交信号等实验数据作为实证信息普遍出现，设问指向由此逆向推断限制酶类型、基因型构成或蛋白表达来源，要求考生具备基于数据记录与分析结果、运用逻辑推理建构科学解释并作出合理判断的探究素养。 4.重因果归因：命题深入“基因操作→表达调控→表型显现”各环节的条件性，引导辨析基因存在与性状实现之间的非必然关系，要求考生能够运用演绎推理认识基因表达调控网络的层次性，以严谨的科学思维审视基因功能验证中的复杂性。 热点·角度·拆解 热点角度01 基因工程工具与操作程序的多层次精细考查 2025年山东卷 载体结构识别、限制酶组合策略、补平酶选用、电泳条带逆向推断 2024年山东卷 填空计算与识别：限制酶末端种类上限计算及特异性序列书写 2023年山东卷 填空识记：启动子功能（RNA聚合酶）、载体结构完整性 热点角度02 PCR技术与分子检测策略的综合应用与迁移创新 2025年山东卷 反向PCR的片段环化策略、电泳与测序的检测目的区分 2024年山东卷 填空判断：引物长度与特异性关系；填空推理：从电泳条带模式逆向推断限制酶类型及植株基因型 2023年山东卷 填空策略选择：PCR引物组合筛选逻辑及模板链方向判定 热点角度03 目的基因检测与鉴定方法的多维考查 2025年山东卷 表型逻辑辨析：基因存在≠功能恢复，涉及表达调控、基因沉默 2024年山东卷 个体水平鉴定：通过遗传分离比筛选特定基因型 2023年山东卷 分子水平鉴定：抗体检测融合蛋白表达产物及表达来源判定 热点角度01基因工程工具与操作程序的多层次精细考查 析典例·建模型 1.（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为_____。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和_____对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是_____。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶_____进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为_____bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为_____（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段_____，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为_____（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 (3) 通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，_____（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 【解题建模分析】 一、题型定位 情境来源 学术探究情境——利用农杆菌转化法构建T-DNA插入突变体，筛选种子休眠相关基因并鉴定突变位点 核心知识 Ti质粒结构与功能+限制酶的选择与酶切策略+DNA连接酶与DNA聚合酶的功能辨析+PCR引物设计与扩增策略+基因工程中的鉴定方法 设问结构 三问递进：载体构建与酶切方案设计→突变基因鉴定策略→基因型与表型关系判断（识记→应用→评价） 能力要求 图谱信息解读+酶切方案逻辑推理+PCR策略设计+分子生物学技术综合应用 二、通用解题模板 第一步：信息提取与定位 操作要点 具体做法 本题示例 读题干 ①抓研究背景与核心技术 ②理实验流程 ③审设问指向 背景：农杆菌转化法、T-DNA随机整合、种子休眠突变体筛选； 核心技术：Ti质粒改造、限制酶酶切、PCR扩增； 设问：复制结构、酶切方案、正向重组鉴定、限制酶选择、PCR策略、表型判断 看附图 识图谱元件，辨酶切位点，析片段长度 图甲：Ti质粒图谱，含卡那霉素抗性基因、T-DNA边界、PstI/BamHI/SpeI/SmaI/XbaI酶切位点、抗除草剂基因X、启动子/终止子位置； 图乙：T-DNA插入基因组片段，含引物P1/P2位置 划关键词 圈出题目中的核心名词 复制原点、T-DNA、启动子、终止子；酶名词：SmaI、XbaI、DNA聚合酶、DNA连接酶、限制酶；条件词：“一长一短2条带”“较短条带近似____bp”“4/6/8碱基对”“环化”“测序还是电泳” 第二步：逻辑建模与推理 ①功能-结构对应类 推理路径 本题示例 ① 识别题干描述的功能 ② 调用教材中质粒对应结构名称 题干：“Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构” → 功能：复制 DNA复制起点=复制原点 答案：复制原点 ②酶切方案设计类问题的推理路径（重点） 操作步骤 具体做法 本题应用 解读图谱信息 ①识别载体图谱中各元件位置 ②标注已知片段的长度与酶切位点分布 启动子→终止子之间为插入区域； SmaI切后为平末端； PstI、BamHI、SpeI、XbaI识别序列及位置已知；抗除草剂基因X片段约550bp 分析单酶切局限 ① 识别单一限制酶的产物特征 ② 判断可能导致的问题 仅用SmaI酶切： 产生平末端→插入片段可正向也可反向连接 问题：无法区分正反向重组子 设计双酶切方案 ① 逐一排查候选酶，排除不可用者 ② 明确排除理由 候选酶：PstI、BamHI、XbaI 排除BamHI：酶切位点在终止子内，会破坏终止子功能 排除PstI：PstI产生3'凸出黏性末端，DNA聚合酶须从5'→3'方向延伸子链，无法以3'凸出末端为模板补平 选择XbaI：不破坏关键元件，且产生的黏性末端可被DNA聚合酶补平 设计正向鉴定方案 ① 选择能区分正反向的酶切位点组合 ② 计算预期条带长度 见下方 可用位点排查： SmaI：插入片段左右两侧原本各有一个SmaI位点 SpeI：位于T-DNA上，插入片段内部无此位点 ①梳理鉴定时可用的酶切位点及其有效性 构建重组质粒时，左侧是SmaI切出的平末端与XbaI切出后补平的平末端连接。SmaI的识别序列是CCC↓GGG，XbaI的识别序列是T↓CTAGA。补平后的XbaI末端序列与SmaI末端序列不同，两者连接后形成的序列既非SmaI识别序列也非XbaI识别序列，因此左侧SmaI位点已丢失，无法再被SmaI识别切割。 可用的有效位点：插入片段右侧的SmaI位点、T-DNA上的SpeI位点 结论：用SmaI+SpeI双酶切 ②定位正向重组时有效酶切位点的空间关系，计算短片段长度 双酶切（SmaI+SpeI）产生两个片段： 【正向重组】 左边界…启动子—[左侧SmaI丢失]—[基因X 550bp]—SmaI—SpeI—终止子…右边界 └── 短片段 ──┘ ≈ 550bp 从SpeI到SmaI 双酶切(SmaI+SpeI) → 长带 + 短带(≈550bp) ③插入位点鉴定策略类问题的推理路径 操作步骤 具体做法 本题应用 理解实验目的 ① 明确要验证的科学问题 ② 识别已知与未知信息 目的：证明两个突变体的T-DNA插入同一基因 已知：小麦基因组序列已知、T-DNA序列已知 未知：T-DNA两侧的基因组序列未知 选择限制酶策略 ① “PCR难以扩增大片段”的限制 ② 选择酶切频率更高的酶 PCR限制：片段太长无法有效扩增→ 需产生较短片段 识别序列越短，切割频率越高，片段越小 识别序列4bp > 6bp > 8bp（频率）→ 选择：4bp 设计未知序列扩增策略 ① 识别引物设计的基础要求 ② 推导获取未知序列的策略 引物P1/P2位于已知T-DNA序列上，方向向外 若直接扩增：无反向引物结合位点，无法扩增 策略：将酶切片段环化（自连）→ 环化后P1/P2成为向内的引物对，可扩增中间的未知序列 选择鉴定方法 ① 区分“电泳”与“测序比对”的功能差异 ② 匹配实验目的选择方法 目的：判断未知序列是否属于同一基因 电泳：仅知片段长度，长度相同≠序列相同 测序+序列比对：精确判断碱基序列是否一致 → 选择：测序和序列比对 ④基因型与表型关系判断类问题的推理路径 操作步骤 具体做法 本题应用 （1）识别实验操作 ① 明确转基因操作的内容 ② 区分“检测到基因”与“检测到蛋白/功能” 操作：将野生型基因的表达载体转入突变植株 检测结果：检测到野生型基因（DNA水平） （2）构建因果链条 ① 梳理从基因到表型的完整路径 ② 识别可能的断裂环节 基因→转录→mRNA→翻译→蛋白质→功能→表型 → 检测到基因仅证明DNA存在 → 表达受多种因素影响（启动子强度、mRNA稳定性、蛋白折叠等） （3）给出严谨判断 ① 明确“不能确定”及其理由 ② 区分“可能”与“必然” 基因存在≠基因表达≠功能恢复 → 结论：不能确定表型为野生型 三、规范作答 (1) 复制原点 XbaI DNA聚合酶 SmaI和SpeI 550bp (2) 4 环化 测序和序列比对 (3) 不能 研考点·通技法 一、基因工程的工具 (1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)——“分子手术刀” 切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶。 （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。（真核生物也有） （2）功能：能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 ①限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。 ②在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在C和G之间。 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。 (2)DNA连接酶——“分子缝合针” (3)载体——“分子运输车” （1）作用：将目的基因转入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 （2）种类：质粒、噬菌体和动植物病毒等。 （3）最常用的载体——质粒 （其基因属于细胞质基因） 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。（不是细胞器） （4）载体需具备的条件： ①有一个至多个限制酶切割切点。（作用：供外源DNA片段（基因）插入其中） ②能在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。（作用：使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制） ③有特殊的标记基因。（作用：便于重组DNA分子的筛选） ④对受体细胞无害。（真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。） （5）重组质粒的形成：获取目的基因和切割载体时，通常使用同种限制酶,目的是为了产生相同的黏性末端，便于连接。 缺点：易发生目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接，为了避免上述情况发生，可分别使用两种限制酶去切割目的基因和载体。 （6）选择限制酶切割位点的基本原则： ①切割目的基因时：能切下目的基因且不破坏目的基因。 ②切割质粒时：至少保留一个完整的标记基因，便于筛选。 二、基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 三、基因表达载体的组成 四、基因表达载体的构建过程 (1)首先用一定的限制酶切割载体。 (2)然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。 (3)再利用DNA连接酶将含目的基因的DNA片段拼接到载体的切口处(如图所示)。 破类题·提能力 （2026·山东青岛·二模）图1为一段DNA，需要利用反向PCR的原理扩增已知序列及两侧序列。由于DNA过长，需要使用限制酶进行切割。 (1)限制酶会使DNA中的________水解，从而使DNA链断开。切割时，左侧限制酶I切割之后形成的末端类型为________，因此右侧限制酶切割后，需要使用________酶进行处理，然后用________酶将切割后的DNA片段连接成环。 (2)连接成环后，需要根据已知序列设计一对引物（两引物不重叠）。请写出9个核苷酸的左侧引物5′________3′。利用这对引物进行PCR，将得到的产物继续连接成环，然后用一种限制酶将其切开，即可得到含“需扩增序列（方向一致且完整）”的DNA片段，若达到此目的，最初切割右侧时所用的限制酶应为________，选用该酶的原因是________。 (3)得到大量PCR产物之后，研究人员进一步对已知序列两侧的部分使用双脱氧链末端终止法进行测序。双脱氧链末端终止法通过使用链终止剂——类似于正常dNTP的2′，3′-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），将延伸的DNA链特异性地终止，其反应体系也包括单链模板、引物、4种dNTP和Taq酶。共分四组，每组按一定比例加入一种（ddNTP），它能随机渗入合成的DNA链，一旦渗入合成即终止，于是各种不同大小片段的末端核苷酸必定为该种核苷酸。使用左侧引物的测序结果如图2（只显示部分结果）。要得到上述条带，一般需要对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，产物迁移速率和________有关。请根据显示的结果写出已知序列左侧对应的A链序列5′________3′。 【答案】(1) 磷酸二酯键 平末端 DNA聚合酶 DNA连接酶 (2) 5'-ATGACGGAT-3' V 使用V切割后补平与另一端连接后该酶的识别位点会被保留 (3) 凝胶浓度、产物分子大小和构象 GCTAAATGCA 【知识点】目的基因的检测与鉴定、基因表达载体的构建、DNA重组技术的基本工具、PCR扩增的原理与过程 【分析】基因工程核心操作程序为四步：获取目的基因；构建基因表达载体；将基因表达载体导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）限制酶的核心功能是切割DNA双链，其作用对象是连接相邻脱氧核苷酸的磷酸二酯键，这是基因工程中“分子剪刀”的关键作用机制。左侧限制酶Ⅰ的识别序列为“5'-CCCGGG-3'”，切割位点在两条链的对称位置，切割后产生完全齐平的末端，符合平末端的定义。 右侧限制酶切割后需与左侧平末端匹配以形成环状DNA。右侧若选用限制酶Ⅳ ，识别5'-CTTAA↓G-3'，切割后产生5'突出的黏性末端。为与左侧平末端兼容，需使用DNA聚合酶进行末端修饰。 DNA连接酶需修复磷酸二酯键以连接片段。由于左侧为平末端，E·coli DNA连接酶仅能连接黏性末端，而T4DNA连接酶可同时连接黏性末端和平末端，因此是该步骤的唯一选择。 （2）引物需与已知序列的互补链结合，且延伸方向为5’→3’。已知B链（3’端）序列为“3'-TAGGCAGTACGGTCCGAG-5'”，其互补的A链（5’端）序列为“5'-ATCCGTCATGCCAGGCTC-3'”。左侧引物需匹配A链的5’端区域，引物序列 “5'-ATGACGGAT-3'”。利用这对引物进行PCR，将得到的产物继续连接成环，然后用一种限制酶将其切开，可得到含“需扩增序列（方向一致且完整）”的DNA片段，若达到此目的，最初切割右侧时所用的限制酶应为V，选用该酶的原因是使用V切割后补平与另一端连接后该酶的识别位点会被保留，可再次被V识别切割。 （3）琼脂糖凝胶电泳的分离原理是：DNA片段带负电，在电场中向正极迁移，产物迁移速率和凝胶浓度、产物分子大小和构象有关。双脱氧测序中，条带从下到上对应DNA片段从短到长（即从5’端到3’端的碱基顺序）。左侧引物结合于已知序列外侧，测序结果需反向推导：从点样孔下方第一条带开始（最短片段，对应5’端第一个碱基），根据四组ddNTP的条带分布，依次读取碱基为“TGCATTTAGC”，最终得到A链5’端序列“GCTAAATGCA”。 热点角度02 PCR技术与分子检测策略的综合应用与迁移创新 析典例·建模型 （2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越______（填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有______种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-______-3'和5'-______-3'。 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素______筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是______，其中纯合的突变植株是______（填序号）。 (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为______，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 【解题建模分析】 一、题型定位 情境来源 学术探究情境——利用CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑大豆基因L，通过脱落酸信号途径培育耐盐碱大豆品系 核心知识 PCR引物特异性+限制酶识别序列与黏性末端+载体构建与酶切位点分析+抗性筛选+电泳图谱解读+遗传规律 设问结构 三问递进：基础概念填空与计算→酶切位点选择与电泳图谱分析→遗传概率计算（识记→应用→综合） 能力要求 图谱信息解读+限制酶末端序列推导+电泳条带与基因型匹配+遗传分析与概率计算 二、通用解题模板 第一步：信息提取与定位 操作要点 具体做法 本题示例 读题干 ①抓研究背景与核心技术 ②理实验流程 ③审设问指向 背景技术：基因L调控大豆逆境响应、CRISPR/Cas9基因编辑、向导DNA序列； 设问：引物特异性、黏性末端种类、载体末端序列、筛选抗生素、酶切电泳鉴定、遗传概率 看附图 识图谱元件，辨酶切位点，析条带差异 图甲：载体图谱含BsaI位点及两侧序列、卡那霉素抗性基因；图乙：目标基因L部分序列，标注BamHI/EcoRI/SacI位点差异； 图丙：四株抗性植株PCR产物酶切电泳结果 划关键词 圈出题目中的核心名词 结构词：向导DNA、T-DNA、卡那霉素抗性基因； 酶切词：BsaI、BamHI、EcoRI、SacI、黏性末端； 数值条件词：“引物越短特异性越____”、“最多____种”、“5'--3'”、“纯合突变植株”、“所占比例____” 第二步：逻辑建模与推理 ①基础追问类问题的推理路径 类型 推理路径 本题示例 引物特异性判断 ① 调用PCR引物设计原理 ② 推导长度与特异性的关系 引物越短→与非靶序列互补配对概率越高→特异性越低 答案：低 黏性末端种类计算 ① 识别酶切后突出单链的碱基组成 ② 计算随机序列的组合数 BsaI酶切后产生NNNN突出单链 4个随机碱基，每个位置4种可能 组合数=4⁴=256→ 答案：256 载体末端序列推导 ① 定位图谱中BsaI酶切位点 ② 识别识别序列与切割位点的位置关系 ③ 写出切割后保留在载体上的突出单链序列 BsaI识别序列GGTCTCN↓NNNN → 切割后N链在下方，突出单链=最后4个N的互补链 左侧：5'-CAAT-3' 右侧：5'-GTTT-3' ②酶切鉴定与电泳解读类问题的推理路径（重点） 操作步骤 具体做法 本题应用 确定筛选标记 ① 定位图谱中抗性基因 ② 匹配对应抗生素 图甲：载体含卡那霉素抗性基因 → 筛选抗生素：卡那霉素 比较序列差异 ① 对比目标序列与突变序列 ② 找出酶切位点的差异所在 图乙：目标序列与突变序列对比 BamHI位点：两者均有（无法区分） EcoRI位点：两者均有（无法区分） SacI位点：目标序列无，突变序列有 选择鉴定用酶 ① 选取在目标序列与突变序列中存在差异的酶 ② 确保能通过酶切结果区分基因型 目标序列无SacI位点→PCR产物不被切→一条带 突变序列有SacI位点→PCR产物被切→两条带 选择SacI 匹配电泳结果与基因型 ① 根据条带数判断各植株的酶切结果 ② 结合纯合/杂合概念匹配基因型 图丙解读： 电泳条带从上到下，分子大小由大到小 突变序列PCR产物会被切断 ②：一条长条带→未被切断→未突变纯合子 ①和③：三条带→一条未被切断、两条切断后条带→一个突变后基因，一个未突变基因→突变杂合子 ④：两条带→没有长条带→无未突变基因→纯合突变植株 选择④ ③遗传推断类问题的推理路径 操作步骤 具体做法 本题应用 明确亲本基因型 ① 提取题干中亲本的遗传信息 ② 将文字转化为遗传学符号 题干：“体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入”→ 关于T-DNA插入为杂合状态（t/T） 题干：“基因L成功突变的纯合植株”→ 关于突变位点为纯合（m/m） 分析配子类型 ① 判断T-DNA在染色体上的遗传行为 ② 确定配子种类及比例 T-DNA插入（含抗生素抗性基因）位于一对染色体中的一条 减数分裂：1/2配子含T-DNA（抗性），1/2配子不含T-DNA（敏感） 构建遗传图解 ① 写出亲本自交的组合 ② 计算子代基因型与表型比例 雌配子：1/2 T、1/2 t 雄配子：1/2 T、1/2 t 子代：1/4 TT（抗性）+ 1/2 Tt（抗性）+ 1/4 tt（敏感） 题干要求：“突变位点纯合且对抗生素敏感” 突变位点已纯合（已知条件），只需无T-DNA插入 → 比例：1/4 三、规范作答 (1) 低 256 5'-CAAT-3' 5'-GTTT-3' (2) 卡那霉素 Sac Ⅰ ④ (3) 1/4 研考点·通技法 一、利用PCR获取和扩增目的基因 (1)含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 (2)原理：DNA半保留复制。 (3)基本条件 ①场所：在一定的缓冲液中进行，其中一般要添加Mg2＋。 ②模板：DNA母链。 ③原料：4种脱氧核苷酸。 ④酶：耐高温的DNA聚合酶。 ⑤引物：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。 (4)过程 ①变性：当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。 ②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 ③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 (5)上一轮循环的产物可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环的次数)。 (6)鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 二、PCR技术和DNA复制的比较 破类题·提能力 （2026·山东·模拟预测）AC转座子是一类可移动的DNA序列，能够在基因组中“跳跃”到新位置。AC转座子中转座酶基因表达的转座酶可识别并结合IR序列实现转座子的切离与随机插入，从而导致某些基因突变。由于AC转座子不断自主转座，使突变体植株性状难以稳定。科学家通过修改AC转座子，仅去除IR全部序列使其无法自主转移，D元件可借助AC转座子编码的转座酶实现转移，从而构建了重组载体A，用于筛选获得性状稳定的突变体植株。 (1)利用PCR修改并扩增AC转座子，使修改后的转座子无法移动并定向插入Ti质粒中，设计的一对引物的碱基序列分别为5'-______3'和5'-______3'（写出前11个碱基序列），利用PCR修改并扩增AC转座子过程需要用到______酶。 (2)将抗除草剂基因两端添加IR序列和限制酶BamHⅠ识别序列构建D元件，并将D元件插入载体中。为确定D元件连接到质粒中且插入方向正确，若仅用一对引物进行PCR检测，应选择图中的引物______。 (3)大豆植株的紫花性状为显性性状，由9号染色体上的C基因控制，T-DNA或D元件的插入会导致基因失活，由D元件插入导致的突变可因D元件的切离而发生回复突变。D元件可反复切离并随机插入染色体任何位置，且在个体发育的任何时期均可发生导致性状不稳定。利用农杆菌转化法将构建成功的重组载体A导入基因型为Cc的大豆细胞，经______过程得到1条染色体上有T-DNA插入的转基因大豆植株甲。植株甲开紫花、白花、紫白相间的花，说明植株甲______（填“部分”或“全部”）C基因被______（填“T-DNA”或“D元件”）插入。植株甲的某朵白花在生长过程中出现紫斑的原因最可能是______。 (4)利用选择培养基对植株甲的自交后代进行筛选，______的植株为性状稳定的突变体植株，用作进一步研究。 A．对卡那霉素无抗性、对除草剂无抗性 B．对潮霉素无抗性、对除草剂有抗性 C．对卡那霉素无抗性、对除草剂有抗性 D．对潮霉素无抗性、对除草剂无抗性 【答案】(1) GAATTCTAGGG GCTAGCTAGGG Taq DNA聚合酶 (2)F1和R2或F2和R1 (3) 植物组织培养 部分 D元件 白花细胞中，D元件从C基因中切离，使C基因恢复功能，表达出紫色性状，从而在白花中出现紫斑 (4)A 【分析】PCR的本质是在体外模拟细胞内的DNA复制过程，依赖以下关键要素： 模板DNA、引物、 Taq DNA聚合酶、 dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、 缓冲液。 【详解】（1）为使AC转座子定向插入Ti质粒，需要在其两端引入与质粒上相同的酶切位点，EcoRI和NheI酶切位点位于启动子下游，且Ti质粒其余区域不存在此酶切位点。上游引物：需包含EcoRI位点（GAATTC），前11个碱基为：5'-GAATTCTAGGG-3'，下游引物：需包含NheI位点（GCTAGC），前11个碱基为：5'-GCTAGCTAGGG-3'。PCR扩增需要Taq DNA聚合酶（热稳定DNA聚合酶）来催化DNA合成。 （2）为确定D元件连接到质粒中且插入方向正确，应选择引物F1和R2或F2和R1。 若D元件正向插入，这两对引物可扩增出片段，若反向插入或未插入，则无扩增产物。 （3）导入重组载体A的大豆细胞，经植物组织培养（脱分化形成愈伤组织，再分化形成幼苗）得到转基因大豆植株甲。 若全部C基因被插入则全为白花，部分插入则表现为紫白相间，而 T-DNA 插入导致的突变是稳定的，而D元件插入导致的突变可因D元件的切离而发生回复突变，导致性状不稳定，因此植株甲开紫花、白花、紫白相间的花，说明部分C基因被D元件插入。白花细胞中，D元件从C基因中切离，使C基因恢复功能，表达出紫色性状，从而在白花中出现紫斑。 （4）性状稳定的突变体应满足： 不含可移动的 D 元件，保留 T-DNA，因此对除草剂无抗性，对潮霉素有抗性，对卡那霉素无抗性，因卡那霉素抗性基因在 T-DNA 外，A正确，BCD错误。 故选A。 热点角度03 目的基因检测与鉴定方法的多维考查 析典例·建模型 （2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。    (1)与图甲中启动子结合的酶是____________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有________________（答出2个结构即可）。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物___________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_____________（填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了__________，条带2所检出的蛋白______________（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。 【解题建模分析】 一、题型定位 情境来源 学术探究情境——构建可表达J-V5融合蛋白的重组质粒，通过PCR和抗体检测鉴定重组质粒的正确性 核心知识 基因表达载体结构（启动子、终止子、标记基因、复制原点）+PCR引物设计策略+DNA链方向与转录模板链+抗体检测与蛋白表达鉴定 设问结构 三问递进：载体结构填空→PCR引物选择与链方向分析→抗体检测与蛋白鉴定（识记→推理→应用） 能力要求 图谱信息解读+引物与模板链方向逻辑推理+抗体检测结果与蛋白来源匹配 二、通用解题模板 第一步：信息提取与定位 操作要点 具体做法 本题示例 读题干 ①抓研究背景 ②理质粒结构 ③审设问指向 背景：J-V5融合蛋白重组质粒、V5编码序列表达标签短肽V5；设问：启动子结合酶、载体必备结构、PCR引物选择、a链/b链匹配、条带鉴定 看附图 识图谱元件，辨引物位置与方向，析抗体检测条带分布 图甲：质粒图谱含启动子、终止子、J基因、V5序列、引物F1/F2/R1/R2位置及方向、a链/b链标注； 图乙：抗J蛋白抗体和抗V5抗体检测条带比较 划关键词 圈出题目中的核心名词 结构词：启动子、终止子、复制原点、标记基因； 引物词：F1、F2、R1、R2、a链、b链； 条件限制词：“J基因转录模板链位于b链”、“插入方向正确”、“条带1/条带2” 第二步：逻辑建模与推理 ①载体结构类问题的推理路径 类型 推理路径 本题示例 启动子结合酶类 ① 调用教材启动子功能定义 ② 匹配对应的酶 启动子功能：启动下游基因转录 转录起始需RNA聚合酶识别并结合启动子 答案：RNA聚合酶 载体必备结构类 ① 识别图中已标注的结构 ② 回忆教材载体必要条件 ③ 排除已标注项，补充缺失项 图甲已标注：启动子、终止子、J基因、V5编码序列 载体还需：限制酶切割位点、标记基因、复制原点等 答案：限制酶切割位点、标记基因、复制原点任答2个即可 ②PCR引物选择与链方向推理类问题的路径 操作步骤 具体做法 本题应用 理解PCR鉴定目的 ① 明确PCR要验证什么 ② 确定扩增片段须包含的关键区域 目的：确定J基因已正确连接到质粒且插入方向正确 → 扩增片段须覆盖J基因与载体连接处→ 即引物一端在载体上，一端在J基因上 筛选有效引物组合 ① 分析各引物在质粒上的位置 ② 判断组合能否扩增跨连接点的片段 引物位置：F1/F2在载体上（J基因上游），R1/R2在J基因内部 F2+R1：F2在载体，R1在J基因内 → 跨连接点 ✓ F1+R2：F1在载体，R2在J基因内 → 跨连接点 ✓ F1+R1：均在载体侧，不跨连接点 ✗ F2+R2：均在载体侧，不跨连接点 ✗ 答案：F2和R1 或 F1和R2 判断引物序列与哪条链相同 ① 明确DNA双链的命名与方向 ② 理清引物延伸方向与模板链的关系 ③ 由模板链推导引物序列与哪条链一致 关键信息：转录模板链=b链；引物F1位于左侧 方向推导链： ① 启动子在左，终止子在右 → 转录方向从左到右 ② 转录模板链(b链)方向：3'→5'（与转录方向反向） ③ PCR引物延伸方向：5'→3' ④ F1为前引物，在左侧→结合的单链须方向为3'→5'（模板链方向） ⑤ 引物F1结合的模板是b链 ⑥ 引物序列与模板链互补→F1序列与a链（b链的互补链）相应部分相同 → 答案：a链 ③ 抗体检测与蛋白鉴定类问题的推理路径（重点） 操作步骤 具体做法 本题应用 理解两种抗体的检测靶标 ① 明确抗体1（抗J蛋白抗体）识别什么 ② 明确抗体2（抗V5抗体）识别什么 抗J蛋白抗体：识别J蛋白结构域 抗V5抗体：识别V5短肽标签 融合蛋白J-V5同时含J和V5，可被两种抗体同时识别 分析条带1的检测结果 ① 观察两种抗体检测的一致条带 ② 判断该条带对应的蛋白性质 条带1：抗J蛋白抗体（+）、抗V5抗体（+） → 该蛋白同时含有J结构域和V5标签 → 为J-V5融合蛋白 分析条带2的检测结果 ① 观察条带2在两种抗体检测中的差异 ② 判断条带2蛋白的来源 条带2：抗J蛋白抗体（+）、抗V5抗体（-） → 该蛋白含J结构域但不含V5标签 → 由内源J基因表达或非融合形式产生 → 不是由重组质粒上的J基因表达的 → 答案：不是 三、规范作答 (1) RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等 (2) F2和R1或F1与R2 a链 (3) J-V5融合蛋白 不是 研考点·通技法 一、目的基因的检测与鉴定 （1）检测目的基因是否导入 方法一：PCR扩增 提取转基因生物的DNA，进行操作，检测是否扩增出目的基因 方法二：DNA分子杂交技术 ①原理：碱基互补配对 ②原因：带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。 基因探针：一段带放射性标记的、与目的基因互补的短单链核苷酸序列。可以是DNA，也可以是由之转录而来的RNA，探针的长度可以包括整个基因或基因的一部分。 ③步骤：a.取出转基因生物的基因组DNA。 b.将含目的基因的DNA片段用放射性同位素（荧光分子或化学发光催化剂）等作标记,以此做探针。 c.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中。 （2）检测目的基因是否转录 方法一： RT-PCR扩增 方法二： 分子杂交技术。其与DNA分子杂交技术类似。 带将标记的基因探针，与mRNA在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。 （3）检测目的基因是否翻译 ①方法：抗原—抗体杂交技术 ②过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带 （4）个体生物学水平的鉴定：检测目的基因是否表现出相应的性状。 破类题·提能力 （2026·山东东营·二模）植物受病原菌侵害时会产生大量水杨酸(SA)并利用SA合成水杨酸甲酯(MeSA)，释放给周围植物“报信”。科学家发现拟南芥S基因缺失株系①中MeSA合成受限，B基因缺失株系无法合成MeSA，为探究S蛋白和B蛋白在MeSA合成过程中的相互作用，科学家做了如下研究，相关信息如图所示。回答下列问题。 (1)为获得S-GST融合蛋白，需要构建S-GST基因过表达载体。通过PCR特异性扩增目的基因S(只含氨基酸编码序列，810个碱基对)需先设计引物，引物的作用是___________。为利用限制双酶切法将S基因连入载体，在引物___________(填“5′”或“3′”)端上添加相应的限制酶识别序列。实验室可使用的限制酶及载体信息如图1所示，已知目的基因中无图示限制酶识别序列，且引物上只添加限制酶识别序列，翻译过程从S基因的起始密码子开始，为正确表达S-GST融合蛋白，防止密码子读取错位，可选择的限制酶组合有___________种。 (2)将构建好的载体利用农杆菌导入株系①获得转基因株系①-1，提取转基因株系染色体DNA用构建载体的限制酶双酶切获得了与目的基因相同大小的片段，___________(填“能”或“不能”)证明目的基因成功导入受体细胞，原因是___________。后经测序发现只有一个T-DNA插入到①-1基因组中，利用测序结果设计了如图2所示特异性引物，让该株系自交，可选用图中三种引物___________(用字母表示)对自交后代基因组DNA进行PCR扩增并进行凝胶电泳检测，杂合子会出现一长一短两条电泳条带。 (3)为探究S蛋白与B蛋白之间的关系，又在株系①-1的基础上获得了可同时表达B-MBP蛋白的株系①-2，用可以和GST蛋白特异性结合的“磁珠”对不同株系总蛋白进行处理，处理过程中蛋白质保持活性，洗脱“磁珠”上的蛋白质，变性后进行凝胶电泳，抗体检测后结果如图3，推测蛋白S和蛋白B___________(填“能”或“不能”)结合。后续检测发现B蛋白是MeSA合成过程中的一种关键酶，且SA处理时①-2的MeSA合成能力较①-1显著增强，综合分析植物在受到病原菌侵袭时，完成“报信”的机制是___________。 【答案】(1) 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 5′ 3 (2) 不能 限制酶切割植物基因组DNA时也可能出现与目的基因相同大小的DNA片段 acd或bcd (3) 能 病原菌侵染导致植物SA的大量合成，SA促进S蛋白和B酶结合，结合后B酶活性增强，大量合成MeSA，完成“报信” 【详解】（1）PCR技术中，引物的作用是与模板DNA特异性结合，为DNA聚合酶提供延伸起点，使DNA聚合酶从引物3'端开始连接脱氧核苷酸，合成子链。 限制酶识别序列需要添加在引物的5'端，若添加在3'端会影响引物与模板结合以及DNA子链延伸。 S基因共810个碱基对（为3的倍数），要保证融合蛋白读码框正确不错位，需要两个酶切位点之间被切除的碱基数为3的倍数，图中限制酶识别区存在CCCGGG序列，可被SmaⅠ或XmaⅠ识别并切割，另一种限制酶可选取其他三种限制酶的一种，可选择的限制酶组合有三种。 （2）限制酶切割植物基因组DNA时可能会在多个位置出现同样的识别序列，这样在切割的时候可能出现与目的基因相同大小的DNA片段，有的片段有目的基因，有的片段没有，所以不能根据与目的基因相同大小的片段来确定基因是否成功导入受体细胞。 纯合子（两条染色体都插入了 T-DNA）：只能扩增出引物a和c（或a和d）之间的片段，只有一条带。 未插入的野生型：只能扩增出引物c和d之间的片段（但因片段过长无法扩增），因此无条带。提取的染色体 DNA 用构建载体的限制酶双酶切，获得与目的基因相同大小的片段，只能说明该片段含有目的基因的酶切位点和大小，但无法区分该片段是来自插入到染色体上的重组载体，还是未整合到染色体上的游离载体 / 残留质粒。只有通过 PCR、测序或 Southern 杂交等方法，证明目的基因已稳定整合到受体细胞的染色体 DNA 上，才能证明成功导入。原株系为S基因缺失，本身不存在完整S基因，实验提取的是染色体DNA，酶切得到了与目的基因大小一致的片段，可证明目的基因成功整合到受体细胞染色体。两条链都插入T-DNA为纯合子，但无法扩增，对于杂合子，可以选择acd或bcd三种引物，会得到不同的片段，这个片段因为不长，所以可以完成扩增，并且长短不一样，从而杂合子会出现一长一短两条电泳条带。 （3）据图分析，SA处理后①-2比①-1抗GST和抗MBP显著提高，说明①-2的MeSA合成能力显著增强，因此报信机制为：病原菌侵染导致植物SA的大量合成，SA促进S蛋白和B酶结合，结合后B酶活性增强，大量合成MeSA，完成“报信”。 （建议用时：90分钟） 刷模拟 1.（25-26高二下·山东青岛·阶段检测）某植物的A基因是一个受低温等因素诱导表达的基因，其表达产物A蛋白是该种植物获得耐寒性不可或缺的一种防冷冻蛋白。科研小组欲利用A基因培育转基因抗冻番茄新品种。A基因上的两个限制酶切割位点及载体结构如图所示，回答下列问题： (1)研究人员用限制酶EcoRⅠ切出的末端Ⅰ为，用限制酶SmaⅠ切出的末端Ⅱ为，请依次写出这两种限制酶的识别序列，并用箭头标出切割位点______、_______。 (2)利用PCR扩增目的基因时，需加入两种引物，引物的作用是_______图中启动子的作用是______。 (3)A基因转录时以图一中α链为模板链，mRNA自身的延伸方向为5'→3'。A基因应插入图二中_____（填“启动子甲”或“启动子乙”）的下游，并且酶切位点______（填“1”或“2”）离该启动子更近些。 (4)为使甘蓝具有抗除草剂能力，科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入甘蓝植株，获得抗草甘膦转基因甘蓝。回答下列问题： a.草甘膦抗性基因一条链的两端序列如图1所示，采用PCR 技术获取和扩增草甘膦抗性基因时应选用的2种引物序列是______（标出5'端和 3'端）。若初始加入1个草甘膦抗性基因，则历经 4 次 PCR 循环需要消耗引物数量为______个。 b.图2中步骤③将农杆菌与甘蓝愈伤组织共培养后，在步骤④的培养基中添加______以便筛选出含目的基因的甘蓝植株。添加此抗生素而不选用添加另一种抗生素筛选的原因______。 c.若要检测转基因甘蓝植株是否产生抗除草剂蛋白，所用的方法是______。 【答案】(1) (2) 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 RNA 聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录 (3) 启动子乙 2 (4) 5′-CTTGGATGAT-3'和5'-TCTGTTGAAT-3' 30 潮霉素 由图可知潮霉素抗性基因在T-DNA片段中，卡那霉素抗性基因不在T-DNA片段中，所以潮霉素抗性基因可随T-DNA转移到被侵染的细胞，并且随其整合到该细胞的染色体DNA上，从而使含目的基因的甘蓝植株有抗潮霉素的抗性，所以能在含潮霉素的培养基上筛选含目的基因的甘蓝植株 抗原-抗体杂交 【知识点】PCR扩增的原理与过程、DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【详解】（1）由题干可知，限制酶EcoRⅠ切出的末端Ⅰ为 ，可推知该酶的切割位点位于碱基G和碱基A之间，与之对应形成的另一黏性末端为； 两末端重新连接成，即为限制酶EcoRⅠ的识别序列；限制酶SmaⅠ切出的末端Ⅱ为平末端，可推知该酶在识别序列的中心轴线两侧进行切割，因此其识别序列为。 （2）进行PCR时所用引物是根据一段已知目的基因的碱基序列设计的，它可以使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。图中启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录。 （3）图二中启动子乙是受低温等因素诱导表达的启动子，因此A基因应插入启动子乙下游。由于A基因转录时以图一中α链为模板链（其左侧是5'端，右侧是3'端），且mRNA自身的延伸方向为5'→3'，因此可判断A基因转录时从基因A的右侧（即酶切位点2）开始转录的，因此右侧即酶切位点2应该离启动子较近。 （4）a.图所示碱基序列磷酸端为5'端，羟基端为3'端，在进行PCR操作时，引物应分别与基因两条链的3'端结合，根据图中两端序列可推知选用的2种引物序列是5'-CTGGATGAT-3'和5'-TCTGTTAAT-3'，若初始加入1个草甘膦抗性基因，则历经4次PCR循环可形成16个DNA分子，其中原有2条母链的没有引物，其余子链都有引物，故需要消耗引物数量为15×2=30个。 b.图2中步骤③将农杆菌与甘蓝愈伤组织共培养后，在步骤④的培养基中添加潮霉素以便筛选出含目的基因的甘蓝植株。由图可知潮霉素抗性基因在T-DNA片段中，卡那霉素抗性基因不在T-DNA片段中，所以潮霉素抗性基因可随T-DNA转移到被侵染的细胞，并且随其整合到该细胞的染色体DNA上，从而使含目的基因的甘蓝植株有抗潮霉素的抗性，所以能在含潮霉素的培养基上筛选含目的基因的甘蓝植株。 c.对草甘膦抗性基因进行改造，最终得到相应的蛋白质，该过程需用到蛋白质工程。检测转基因甘蓝植株是否产生抗除草剂蛋白，可以用抗原-抗体杂交的方法。 2.（2026·山东泰安·模拟预测）曲酸是米曲霉的次生代谢产物，为提高米曲霉产曲酸能力，科研人员用同源重组技术将曲酸合成有关的kojR基因导入米曲霉g-1（pyrG基因缺陷）菌株中，获得高产的g-58菌株，部分过程如图甲所示，其中kanr（卡那霉素抗性基因）、pyrG（合成尿嘧啶关键基因）均为标记基因。请回答： 注：①kojR基因中a链为模板链，pyrG基因中b链为模板链 ②LB、RB为T-DNA的左右边界 ③kojR-pyrG基因的启动子和终止子的长度可忽略 (1)现欲通过PCR技术构建kojR-pyrG融合基因，需在反应体系中加入适量的Mg2+，其作用是__________。研究人员通过PCR技术用图甲中不同的引物组合来检测重组质粒是否构建成功，所得结果如图乙所示，泳道1使用的引物组合是__________，泳道2上扩增的DNA分子长度约为__________，泳道3__________（填“能”或“不能”）证明重组质粒构建成功。 (2)现有以下培养基成分：①碳源②氮源③无机盐④水⑤卡那霉素⑥尿嘧啶，筛选g-58菌株的培养基需要添加__________（填序号）。 (3)研究人员计划用甲图所示的同源重组技术敲除米曲霉g-1菌株中的LaeA基因并回补pyrG基因，来探究LaeA基因对米曲霉产曲酸的影响，请根据图甲过程及原理判断图丙中A、B基因分别为__________基因。 (4)通过研究表明，米曲霉中的LaeA基因可促进其次生代谢产物合成酶基因的转录。科研人员对摇瓶培养相同时间的g-1和g-58菌株进行相关数据检测，结果如下表。 发酵时间（d） g-1菌株（g/L） g-58菌株（g/L） 曲酸产 量（g/L） kojR基因 相对表达量 LaeA基因 相对表达量 曲酸产量（g/L） kojR基因相 对表达量 LaeA基因 相对表达量 3 6.5 1 1 9.5 100 2.2 6 10.5 1.5 1.2 25.5 130 3.7 据表分析，kojR基因能使米曲霉产曲酸增多的原因可能是：__________。 【答案】(1) 激活Taq DNA聚合酶（或激活耐高温的DNA聚合酶或激活Taq酶） 引物1和引物2 4700bp 不能 (2)①②③④ (3)pyrG基因和LaeA基因 (4)kojR基因可促进LaeA基因表达，促进次生代谢产物合成酶的合成/增加次生代谢产物的合成，有利于曲酸的产生 【知识点】微生物的培养与应用综合、基因表达载体的构建 【分析】1、基因工程的基本操作程序主要包括四个基本步骤：提取目的基因、目的基因与载体连接、将与目的基因连接的载体导入受体细胞、目的基因的表达与检测。 2、基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用同源DNA片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的，由此可见，基因敲除可定向改变生物体的某一基因。基因敲除既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 【详解】（1）PCR体系中Mg²+的作用是激活Taq DNA聚合酶，维持酶的催化活性。根据引物位置和产物大小：引物1和引物2可扩增出500bp的kojR基因，对应泳道1的条带；重组质粒总长度为载体3750bp加上融合基因（500+750）bp再去掉T-DNA中限制酶中间片段（300），即4700bp，对应泳道2的条带大小；泳道3扩增出了预期大小（1250bp）的片段，泳道 3 的条带只能说明 “扩增出了约 1500 bp 的片段”，但无法验证这个片段的序列是否是我们想要的 kojR-pyrG 融合基因，因此不能证明重组质粒构建成功。 （2）原始菌株g-1为pyrG基因缺陷（不能合成尿嘧啶），且无卡那霉素抗性；g-58成功导入了pyrG和卡那霉素抗性基因。培养基基本成分需要碳源、氮源、无机盐、水；筛选时不需要添加尿嘧啶（否则缺陷型g-1也能存活，无法筛选），无需添加卡那霉素（抗细菌，为真菌无作用），因此需要添加的成分为①②③④。 （3）实验目的是敲除g-1的LaeA基因、回补pyrG基因，同源重组时，重组质粒上的A片段会替换g-1基因组上的B片段，因此A是需要回补的pyrG基因，B是被敲除的LaeA基因。 （4）结合题意和表格数据分析：kojR本身是和曲酸合成相关的基因，kojR基因可促进LaeA基因表达，促进次生代谢产物合成酶的合成/增加次生代谢产物的合成，有利于曲酸的产生。 3.（2026·山东日照·二模）M蛋白与“记忆”的形成密切相关，为研究相关机理科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠，部分制作流程如图1。实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列，同时利用体内表达的外源蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（M-GFP）的表达，恢复小鼠自身被敲除的M基因功能，同时便于示踪。 (1)利用同源重组将外源基因插入染色体的特定位点，在PCR扩增片段①时，通常会在所用引物F1、R1的______（填“3′端”或“5′端”）添加同源序列。为了敲除小鼠的M基因，在构建载体1时，还应向M基因两端引入loxP位点，以图2中方式______排列才能通过同源重组达到上述目的。 (2)研究者利用______法将重组载体导入小鼠的______（填细胞）中，对代孕母鼠进行______处理，通过胚胎移植获得基因型floxM/floxM的小鼠。采用同样的方法，获得基因型Cre+/A/+的小鼠（基因型A/+指的是A基因被整合在细胞同源染色体中的一条，即可看成基因Aa）。 (3)为了快速高效繁育出含有4对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre+/A/+小鼠和M-GFP+/floxM+/小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交后最终获得基因型为______实验模型小鼠。 (4)研究发现，四环素可竞争结合A蛋白，在饲喂实验模型小鼠时，在饲料中添加四环素的目的是______。 【答案】(1) 5' 端 ②（同向排列） (2) 显微注射 受精卵 同期发情（或同期发情处理） (3)Cre+/A/+ M-GFP+/floxM/floxM (4)竞争性结合 A 蛋白，抑制诱导型 T 启动子的激活，从而抑制 M-GFP（M 基因）的表达，实现 M 基因表达的可控调控 【知识点】基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、胚胎移植技术 【详解】（1）在 PCR 扩增片段①时，需在引物5' 端添加同源序列。DNA 聚合酶只能从引物的 3' 端延伸 DNA 链，因此引物的 5' 端可以添加不影响延伸的同源序列，用于后续的同源重组。题目要求"敲除小鼠的M基因"，即需要切除M基因。因此需要loxP位点 同向排列，对应方式②（从图上看，方式②是同向排列的）。 （2）动物基因工程中，将外源重组载体导入动物细胞最常用、最有效的方法是显微注射法，受体细胞通常选择受精卵（因为受精卵的全能性高，能发育为完整个体）。胚胎移植时，需要对供体和受体母鼠进行同期发情处理，使它们的生理状态（子宫内膜环境）保持一致，这样移入的胚胎才能在受体子宫内正常着床和发育。 （3）获得同时含 4 个基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，即基因型为 Cre+/A/+ M-GFP+/floxM/floxM（可简化理解为：Cre+A+ M-GFP+ floxM/floxM）。 （4）题干说明 “四环素可竞争结合 A 蛋白”，而 A 蛋白是诱导型 T 启动子的激活因子，只有 A 蛋白与 T 启动子结合，才能启动 M-GFP 的表达。 因此，在饲料中添加四环素的目的是： 竞争性结合 A 蛋白，阻止 A 蛋白与诱导型 T 启动子结合，从而抑制 M-GFP 基因的表达，实现 M 基因表达的可控调控（或 “关闭 M 基因的表达，构建条件性敲除模型”）。 4.（2026高三下·山东临沂·专题练习）在植物遗传转化过程中，除目的基因外，标记基因等序列也会随目的基因整合到作物基因组中，应予以剔除。科学家构建了可诱导剔除标记基因的载体，并将其导入拟南芥获得无标记基因的耐盐个体，相关过程如图所示。Cre-loxP系统由Cre酶和DNA上的特殊序列loxP组成，两个同向loxP间的DNA序列可被Cre酶识别并切除。 (1)基因工程的核心步骤是_____________。将基因1插入质粒时，切割质粒需选用的限制酶是_____________。基因1转录时的模板链是_____________（填“α链”或“β链”）。 (2)基因2插入时使用了无缝克隆技术，其流程是先对质粒进行PCR获得线性化载体，再通过PCR在目的基因两端添加与线性化载体两端相同碱基序列，然后将线性化载体与目的基因混合，在酶的作用下，从线性化载体与目的基因3'端起始切除15个核苷酸，暴露出互补的单链区域，最终促使插入片段与载体能够借助这些互补区域实现连接。 ①通过PCR对质粒进行线性化时，应选用的引物序列是_____________。（仅表示出5'→3'的10个碱基） A．5'ATCGCCTGAC3'    B．5'GACTCTAGAT3'    C．5'ATCTAGAGTC3'    D．5'TAGCGGACTG3' ②与单酶切后用DNA连接酶连接相比，这种无缝克隆技术的优点有_____________。 (3)将卡那霉素抗性基因和耐盐基因插入质粒获得重组质粒，其中基因1应是_____________基因（填“卡那霉素抗性”或“耐盐”）。重组质粒导入作物受体细胞后，应先后在分别添加_____________的培养基中筛选并培养，最后进行耐盐鉴定获得无标记基因的耐盐个体。 【答案】(1) 基因表达载体的构建 EcoRI和SalI β链 (2) AC 可在任何位点插入目的基因，避免载体和目的基因自身环化及目的基因的反向连接 (3) 卡那霉素抗性 卡那霉素和地塞米松 【知识点】遗传信息的转录、PCR扩增的原理与过程、DNA重组技术的基本工具、目的基因的检测与鉴定 【详解】（1）基因工程的核心步骤是构建基因表达载体。结合目的基因可知，需要用限制酶Mfe I和Sal I进行酶切，为了获得相同的黏性末端，理论上质粒也需要使用限制酶Mfe I和Sal I进行酶切，但限制酶Mfe I会破坏质粒上的Cre酶基因，结合限制酶识别序列，EcoR I和Mfe I酶切形成的黏性末端是相同的，因此切割质粒需选用的限制酶是EcoR I和Sal I。结合质粒上启动子和终止子的位置，以及目的基因插入的位置，基因1转录时的模板链是β链。 （2）①结合图示质粒切口的放大部分，由于模板链的碱基序列为3'TAGCGGACTG5'和3'TAGATCTCAG5'，引物应该与复制起始端互补配对，因此通过PCR对质粒进行线性化时，应选用的引物序列是5'ATCGCCTGAC3'和5'ATCTAGAGTC3'，故选AC。②限制酶具有专一性，需要在特定的位点切割形成黏性末端，且单酶切目的基因、质粒两端的黏性末端相同，会导致载体和目的基因自身环化及目的基因的反向连接，因此与单酶切后用DNA连接酶连接相比，这种无缝克隆技术的优点有可在任何位点插入目的基因，避免载体和目的基因自身环化及目的基因的反向连接。 （3）由于两个同向loxP间的DNA序列可被Cre酶识别并切除，所以为了构建可诱导剔除卡那霉素抗性基因的载体，结合图示质粒和基因进行分析，其中基因1应是卡那霉素抗性基因。重组质粒上地塞米松诱导型启动子可启动Cre酶基因的表达，同时两个同向loxP间含有卡那霉素抗性基因，因此重组质粒导入作物受体细胞后，应先后在分别添加卡那霉素和地塞米松的培养基中筛选并培养，以检测导入重组质粒后，进行卡那霉素抗性基因的剔除，最后进行耐盐鉴定获得无标记基因的耐盐个体。 5.（2026·山东德州·二模）人绒毛膜促性腺激素（hCGβ）是胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，研究发现，结肠癌等多种恶性肿瘤细胞的hCGβ基因也有表达，研发抗hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图为其制备的基本方案。回答下列问题。 注：1．①、②、③和④是基因两端对应的引物 2．BsmBI的识别序列和切割位点信息（N代表任一碱基）： (1)利用大肠杆菌工程菌合成的hCGβ质量不理想，从细胞结构的角度分析原因是_____。对hCGβ基因进行PCR扩增时，所选引物是图中的_____，引物的作用是_____。 (2)限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端。载体信息如图所示，经BsmBI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-_____-3'和5'-_____-3'。 (3)阶段IV需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要添加以下哪些成分_____（a．氨苄青霉素b．无机盐c．组氨酸d．葡萄糖），可在此培养基上生长的酵母菌即为转化成功的目的菌株，“转化”是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内_____的过程。 【答案】(1) 大肠杆菌细胞内没有内质网、高尔基体等细胞器，无法对蛋白质进一步加工 ②、③ 使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 (2) CGTG CGAG (3) a、c 维持稳定和表达 【知识点】培养基的成分及其功能、PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【详解】（1）人绒毛膜促性腺激素（hCGβ）是糖蛋白，大肠杆菌是原核生物，从细胞结构角度，原核细胞没有内质网、高尔基体，无法对核糖体合成的多肽链进行糖基化修饰，因此合成的hCGβ质量不理想。PCR扩增目的基因时，子链沿5′→3′方向延伸，引物需结合在目的基因两条链的两端，因此选择引物②和③；引物的作用是与模板链特异性结合，为DNA聚合酶提供延伸起点，使DNA聚合酶从引物3′端开始合成DNA。 （2）根据BsmB I的识别切割规律，该酶切割后会产生5′端突出的4个核苷酸的黏性末端；结合题中给出的载体酶切区序列，酶切后载体保留的两个黏性末端如下图，左边载体上保留的黏性末端序列应为5'-CGAG-3'和右边载体上保留的黏性末端序列应为5'-CGTG-3'。 （3）受体酵母菌是组氨酸缺陷型，只有成功导入携带组氨酸合成基因的重组质粒的酵母菌才能存活，因此筛选培养基不能添加组氨酸，才能筛选出成功转化的菌株；氨苄青霉素是筛选大肠杆菌（原核生物）时使用的选择试剂，酵母菌筛选不需要添加，因此不需要添加的成分是a（氨苄青霉素）和c（组氨酸）。基因工程中，转化的定义是：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 6.（2026·山东青岛·一模）鲍迪苷D（RD）是来自甜叶菊的高品质低热量天然甜味剂，在自然界中含量很低。体外可利用生物转化法将一个葡萄糖基U—DPG转入到鲍迪苷A（RA）的特定侧链上合成RD，来源于水稻的葡萄糖基转移酶E11是体外制备RD的关键酶。研究人员通过基因工程技术制备能够表达E11的工程菌，为实现生物转化法合成RD奠定了基础，制备流程及限制酶酶切位点如图1。 限制酶 识别序列及切割位点 NsiⅠ 5' ATGCA↓T3' 3' T↑ACGTA5' ApaⅠ 5' GGGCC↓C3' 3' C↑CCGGG5' PstⅠ 5' CTGCA↓G3' 3' G↑ACGTC5' PspOMⅠ 5' GGGCC↓C3' 3' C↑CCGGG5' SalⅠ 5' G↓TCGAC3' 3' CAGCT↑G5' (1)可从______中查询基因E11的编码序列，设计特定引物。提取水稻细胞中的______，经逆转录获得总cDNA，将其作为PCR反应的模板，在制备PCR反应体系时，用微量移液器吸取不同试剂前，除需要确认或调整刻度和量程外，还需要______。 (2)为保证基因E11与pET质粒连接的准确性和效率，结合图1分析，应在基因E11转录模板链的5' 端和3' 端分别添加限制酶______的酶切序列。若基因E11转录模板链的3' 端不添加限制酶酶切序列，要实现基因E11与质粒载体的定向连接，对pET质粒应进行的操作是______。 (3)使用相关限制酶处理质粒和目的基因，连接后转化大肠杆菌，将转化后的大肠杆菌接种到含有______的培养基中培养。假设限制酶切割前后，pET质粒大小基本不变，为进一步筛选重组质粒，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取1～4号菌落中的质粒电泳，结果如图2。推测______号菌落含有重组质粒，其他菌落的条带出现的原因可能是______。 (4)将纯化得到的蛋白E11添加到含有______（填物质）的反应体系中，通过检测RD的合成速率以验证蛋白E11的酶活性。 【答案】(1) 序列数据库 （总）RNA 更换微量移液器的枪头 (2) NsiⅠ，SalⅠ 选择SalⅠ和PstⅠ对质粒进行完全酶切，利用DNA聚合酶将SalⅠ产生的黏性末端补平 (3) 四环素 1 2号、3号导入的重组载体是两个pET质粒环化形成，4号导入的是空白pET质粒 (4)U-DPG和RA 【知识点】目的基因的检测与鉴定、基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【详解】（1）基因的编码序列属于公开的核酸序列信息，可从序列数据库中查询获取，以此为依据设计扩增基因E11的特定PCR引物。逆转录法获取cDNA的原理是以RNA（主要是mRNA） 为模板，在逆转录酶的作用下合成互补的DNA链，因此需要先提取水稻细胞中的总RNA，再经逆转录获得总cDNA，作为PCR扩增基因E11的模板。微量移液器的枪头为一次性使用耗材，吸取不同试剂前更换枪头，可避免不同试剂之间的交叉污染，保证PCR反应体系的纯度和实验结果的准确性。 （2）质粒的转录方向为从启动子到终止子，目的基因E11需与质粒转录方向一致，才能正常表达；质粒上可用于插入目的基因的酶切位点需位于启动子和终止子之间，且不破坏氯霉素/四环素抗性基因、复制原点等关键元件，可选位点为PstⅠ、SalⅠ。由限制酶识别序列可知：NsiⅠ的切割位点为5'ATGCA↓T3'，PstⅠ的切割位点为 5'CTGCA↓G3'，二者切割后可产生互补的黏性末端（均含-TGCA-序列），能实现连接；SalⅠ的酶切位点唯一且位于启动子/终止子之间，可与NsiⅠ 配合实现定向酶切。基因E11转录模板链的5'端对应编码链的3'端，需添加NsiⅠ 酶切序列（与质粒PstⅠ 互补），3'端添加SalⅠ 酶切序列，使目的基因与酶切后的质粒定向连接，避免反向连接。若基因E113'端不添加酶切序列，需通过改造质粒实现定向连接，避免目的基因随机连接或质粒自连：先用SalⅠ和PstⅠ对质粒完全酶切，产生两个不同的末端（SalⅠ黏性末端、PstⅠ黏性末端）； 用DNA聚合酶将SalⅠ切割产生的黏性末端补平，使质粒形成一个平末端（SalⅠ处）+ 一个黏性末端（PstⅠ处）； 目的基因仅5'端有与PstⅠ互补的黏性末端，3'端为天然平末端，只能与质粒的黏性末端、平末端分别配对，从而实现定向连接。 （3）质粒上含氯霉素抗性基因和四环素抗性基因，目的基因插入位点位于氯霉素抗性基因内部：当目的基因与质粒连接形成重组质粒时，氯霉素抗性基因被破坏，失去抗性；而四环素抗性基因保持完整，仍具有抗性。因此需将转化后的大肠杆菌接种到含四环素的培养基中培养，筛选出成功导入质粒（空白质粒或重组质粒）的大肠杆菌。结合电泳结果和质粒/目的基因长度分析： 空白pET质粒长度为5369bp（约 5000bp），重组质粒为质粒+基因E11，总长度为5369+1369=6738bp（约6000bp）； M1为链状DNA分子 Marker（6000bp、5000bp、3000bp、1500bp），M2为环状DNA分子Marker；环状DNA分子电泳迁移速率快于同长度的链状DNA分子；1号菌落的质粒条带位置对应M2的 6000bp左右，与重组质粒（约6738bp）的电泳位置相符，因此1号菌落含有重组质粒。2号、3号：条带位置比1号更靠近点样孔（分子量更大），原因是两个空白pET质粒经酶切后自身环化形成二聚体质粒，分子量远大于重组质粒，电泳迁移速率更慢； 4号：条带位置对应M2的5000bp左右，与空白pET质粒（5369bp）的电泳位置相符，说明导入的是未插入目的基因的空白pET质粒。 （4）题干明确：体外可利用生物转化法将一个葡萄糖基U—DPG转入到鲍迪苷A（RA）的特定侧链上合成 RD，葡萄糖基转移酶E11是该过程的关键酶。酶的活性验证需在底物存在的条件下进行，因此反应体系中需加入该酶的两种底物（U—DPG和RA），通过检测产物RD的合成速率，即可验证蛋白E11的葡萄糖基转移酶活性。 7.（2026·山东枣庄·二模）福寿螺Mfcsg基因编码的多功能纤维素酶能够高效降解纤维素。研究人员利用无缝克隆技术构建融合基因导入毛木耳中，以提高其纤维素降解能力，相关流程如图1所示，已知潮霉素对真菌细胞有毒性。限制性内切核酸酶BsmB Ⅰ具有偏移剪切特性（切割位点在识别序列之外），利用BsmB Ⅰ可以实现多DNA片段无缝连接，其识别序列及切割位点位于接头序列两侧。 (1)为获取Mfcsg基因，可先从福寿螺胃组织细胞中得到mRNA，然后通过_______过程得到cDNA，进而制备目的基因。所构建重组质粒中的S启动子是毛木耳基因的启动子，而没有使用Mfcsg基因自身的启动子，最可能的原因是_______。 (2)作为载体，图中重组质粒除标出的结构外，还需具备的结构有_______（答出2点），经过程②构建的重组质粒中不含有BsmB Ⅰ识别序列，原因是_______。 (3)过程①的作用是_______。若Mfcsg基因两端的部分序列为5′-GCGGATGA……TTATGCTCG-3′，已知引物R2的碱基序列为5′-CGTCTCNcgagCATAA…-3′（小写字母表示接头序列），则引物F2的序列可以设计为5′-_______-3′（写出所有已知序列）。若S启动子中与R1互补的核苷酸链从左向右的序列为5′-ATGCGTGA……GGTATGCTT-3′，则引物F2的序列应设计为5′-_______-3′（写出所有已知序列）。 (4)将重组质粒的农杆菌导入毛木耳细胞，然后转移至含有_______的培养基中，能正常生长的为符合要求的受体细胞。为检测目的基因是否表达且发挥功能，可以采取的检测方法是_______。 【答案】(1) 逆转录 Mfcsg基因自身的启动子在真菌中不能发挥作用（或者作用效率低） (2) 终止子、复制原点 识别序列在②过程中被剪切掉 (3) 各DNA片段添加BsmB Ⅰ识别序列和接头序列 CGTCTCNgcggATGA CGTCTCNgcttGCGGATGA (4) 潮霉素 使用等量的转基因毛木耳和非转基因毛木耳降解纤维素，比较降解效率 【知识点】目的基因的检测与鉴定、基因表达载体的构建、DNA重组技术的基本工具、PCR扩增的原理与过程 【详解】（1）以mRNA为模板合成cDNA的过程为逆转录；所构建重组质粒中的S启动子是毛木耳基因的启动子，而没有使用Mfcsg基因自身的启动子，最可能的原因是Mfcsg基因自身的启动子在真菌中不能发挥作用(或者作用效率低) （2）作为载体的重组质粒，除已标出结构外，还需具备终止子、复制原点等结构。经过程②构建的重组质粒中不含有BsmB Ⅰ识别序列，原因是BsmB Ⅰ识别序列在过程②构建的重组质粒时被剪切掉了。 （3）过程①是PCR扩增，作用是获取并扩增 S 启动子、Mfcsg 基因、Hpt 基因等目的片段，同时为各DNA片段添加BsmB Ⅰ识别序列和接头序列，以便后续无缝连接。若Mfcsg基因两端的部分序列为5′-GCGGATGA……TTATGCTCG-3′，已知引物R2的碱基序列为5′-CGTCTCNcgagCATAA…-3′，则引物F2的序列可以设计为5′-CGTCTCNgcggATGA-3‘。若S启动子中与R1互补的核苷酸链从左向右的序列为5′-ATGCGTGA……GGTATGCTT-3′，则引物F2的序列应设计为5′-CGTCTCNgcttGCGGATGA-3′。 （4）因为Hpt基因表示潮霉素抗性基因，潮霉素对真菌细胞有毒性，所以将重组质粒的农杆菌导入毛木耳细胞后，转移至含有潮霉素的培养基中，能正常生长的是符合要求的受体细胞。为检测目的基因是否表达且发挥功能，可以采取的检测方法是使用等量的转基因毛木耳和非转基因毛木耳降解纤维素，比较降解效率。 8.（2026·山东滨州·一模）流感病毒的抗原有H和N两类，均可以分为很多亚型。某科研团队基于融合蛋白的思路，尝试制造H3、N2融合蛋白疫苗，以更好地预防H3N2病毒。 (1)获取病毒H3、N2抗原蛋白的mRNA，通过____过程得到相应的DNA，并进一步构建H3、N2融合基因。在H3蛋白基因和N2蛋白基因融合的过程中，起搭桥作用的是____（从引物1～8中选择）。 (2)从引物角度分析，两种基因能够融合的关键是____，变性后形成的杂交分子在延伸为双链等长的融合基因时，不需要添加引物的原因是____。若融合基因中上游基因的mRNA终止密码子对应的碱基序列未被切除，则融合基因翻译得到的抗原蛋白为____。 (3)将目的基因与运载体连接过程中，首先需要用____（填限制酶种类）处理载体；用____（填限制酶种类）处理目的基因所在的片段。 (4)利用大肠杆菌作受体细胞筛选获得目的菌株：首先在含卡那霉素的培养基上培养目标菌，将培养基上生长的菌落用影印法接种到含四环素的培养基上，最后选择____的菌株。 【答案】(1) 逆转录 引物1和引物3 (2) 起搭桥作用的两个引物的5'端存在部分可以碱基互补配对的序列 可沿着杂交分子互补区域的3'端继续延伸 H3 (3) BamHⅠ和XmaⅠ Sau3AI和XmaⅠ (4)能在含卡那霉素培养基上生长但不能在含四环素培养基上生长 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链。 【详解】（1）以mRNA为模板合成DNA的过程为逆转录，所以获取病毒H3、N2抗原蛋白的mRNA，通过逆转录过程得到相应的DNA。DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的，据图可知扩增N2基因用的引物为引物1和引物6，扩增H3基因用的引物为引物3和引物8，所以起搭桥作用的是引物1和引物3。 （2）两种基因能够融合的关键是引物1和引物3的5'端部分碱基互补配对，这样才能在搭桥、变性后杂交过程中使两个基因连接起来。变性后形成的杂交分子在延伸为双链等长的融合基因时，两条链互为引物和模板链，且两条母链均存在3'端，使DNA聚合酶能从母链的3'端开始连接脱氧核苷酸，即可沿着杂交分子互补区域的3'端继续延伸，据图可知H3基因位于融合基因的上游，所以若融合基因中上游基因的mRNA终止密码子对应的碱基序列未被切除，则融合基因翻译得到的抗原蛋白为H3。 （3）根据限制酶识别序列及产生的黏性末端，BsaⅠ切割产生的黏性末端不固定所以不能使用，而运载体上在启动子和终止子之间还有BamHⅠ和XmaⅠ，且Sau3AI会切割卡那霉素抗性基因，所以用BamHⅠ和XmaⅠ处理运载体；因为Sau3AI产生的黏性末端和BamHⅠ产生的黏性末端相同，为同尾酶，所以为了防止载体自身环化以及保证目的基因和载体正确连接，用Sau3AI和XmaⅠ处理目的基因所在的片段。 （4）重组质粒中卡那霉素抗性基因未被破坏，四环素抗性基因被破坏，所以在含卡那霉素的培养基上能生长，在含四环素的培养基上不能生长的菌株为含有重组质粒的目的菌株。 9.（2026·山东临沂·一模）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物体中提取难度大、产率低。通过在离体培养的植物细胞中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。 (1)图1中标识了质粒和基因N中限制酶的切割位点，基因N的b链为转录模板链。为将基因N正确插入质粒，引物1应添加的碱基序列是5′-______-3′，切割质粒时应选用的两种限制酶是______。质粒上的抗性基因______可用于初步筛选成功转化的植物细胞。 (2)耐高温的DNA聚合酶在PCR的______步骤中起作用。PCR扩增产物和质粒分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含N基因的重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后、质粒对应部分大小基本不变。进一步筛选转化的细胞，以1~4号细胞株中提取的DNA为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是______。初步判断实验组_____（从“1~4”中选填）的细胞中成功插入了基因N，理由是______。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有______。 a.5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b.5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c.5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d.5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' 【答案】(1) AGATCT BamHI、EcoRI 2 (2) 延伸 检验PCR反应中是否有外源DNA污染 1 目的基因N大小约为2.3kb，实验组1的电泳结果与其大小接近 (3)GCC 【知识点】目的基因的检测与鉴定、基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【分析】PCR技术的原理与操作：包括PCR扩增的原料组成（模板、引物、dNTP、酶、缓冲液），及PCR三个步骤（变性、复性、延伸）中DNA聚合酶的作用阶段。 【详解】（1）基因N的b链为转录模板链，质粒上启动子与终止子之间有 BamHI 、EcoRI 和XbaI的识别序列，其中BamHI和XbaI会破坏目的基因，观察表格中限制酶识别序列及切割位点可知BglI和BamHI为同尾酶，，故选择BamHI 和 EcoRI 切割质粒，选择BglI和 EcoRI 切割目的基因，根据模板链为链，为基因N正确插入质粒，所以需要在引物1应添加BglI的碱基序列是5′-AGATCT-3′。T-DNA区域内的抗性基因 2 会随 T-DNA 整合到植物细胞染色体中，可通过添加对应抗生素初步筛选成功转化的植物细胞。 （2）PCR 的延伸步骤中，耐高温的DNA聚合酶以DNA为模板，从引物 3' 端开始合成子链，该步骤需要耐高温DNA聚合酶催化。设置空白对照组（用无菌水代替模板DNA），目的是排除试剂、操作等引入的外源DNA污染，确保实验结果可靠。重组质粒大小约9.5kb，原质粒为7.2kb，因此基因N大小约为 9.5−7.2=2.3 kb。实验组1的电泳条带大小约2000bp（接近 2.3kb），与目的基因N的大小相符，说明成功插入了基因N。 （3）密码子位于mRNA上，与DNA模板链互补，与引物（DNA链）反向互补。a引物的诱变序列为GCA（DNA链），对应mRNA密码子GCA。 根据引物a的GCA为第240位密码子对应序列，可知a引物第244位密码子开始对应的序列（TGG/CTG/TTT……），观察其与c引物上最前面一位密码子对应序列之后的完全一致，可知c引物最前面的GCC即是第243位密码子，也就是丙氨酸诱变序列，即丙氨酸的另一个密码子为GCC。 10.（2025·山东潍坊·三模）科研人员通过CRISPR/Cas9系统敲除小鼠的PPP2R3A基因，研究该基因对小鼠心脏功能的影响。其过程为：构建含sgRNA基因和Cas9酶基因的表达载体，通过显微注射将该表达载体导入小鼠的卵细胞中，利用CRISPR/Cas9系统敲除PPP2R3A基因构建模型小鼠。图1为Cas9酶基因的DNA片段且转录方向从左到右；图2为所用质粒及质粒上有关限制酶的识别序列和酶切位点示意图，Ampr为氨苄青霉素抗性基因、Tetr为四环素抗性基因。 (1)研究表明，Cas9酶基因两侧没有限制酶切位点，在构建表达载体的过程中，可借助PCR技术在引物的______（填“5′”或“3′”）端添加限制酶切序列；引物1序列区由5′→3′的碱基序列为______，引物2序列区应含有限制酶______的识别序列。 (2)研究发现，实际操作时，只需敲除PPP2R3A基因的部分碱基序列，即可使其失去功能。科研小组用PPP2R3A基因敲除的模型小鼠（KO组）与未做处理的小鼠（WT组）进行杂交，获得子代小鼠（F1组）。三组小鼠PPP2R3A基因的电泳图谱如下图所示。 据图分析，PPP2R3A基因的长度为______；敲除掉的碱基序列长度为______；4、5、6、12、14是______组小鼠的电泳图。 (3)该科研小组检测了小鼠心脏组织中相关基因的表达情况，结果如下表所示（RGS19为参与心脏发育的蛋白信号转导调控因子）。 组别 PPP2R3A mRNA PPP2R3A蛋白 RGS19 WT组 1.31 0.24 0.87 KO组 0.76 0.14 1.21 据表分析可知，与WT组相比，KO组______。由此可以得出结论是_______。 【答案】(1) 5′ AGATCTGCATCCTCCAGG BamHⅠ (2) 507bp 113bp F1组 (3) KO组心脏组织中PPP2R3A的mRNA和蛋白表达量明显下降，参与心脏发育的蛋白信号转导调控因子RGS19表达量明显升高 PPP2R3A在体内可能通过抑制RGS19蛋白的合成（与RGS19蛋白互作）来影响心脏的功能 【知识点】基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用、基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【分析】基因工程技术的基本步骤包括目的基因的筛选和获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）子链延伸的方向是5′→“3′，引物为单个的脱氧核苷酸提供3′端。研究表明，Cas9酶基因两侧没有限制酶切位点，在构建表达载体的过程中，可借助PCR技术在引物的5′端端添加限制酶切序列； 结合图1和图2可知，需要把目的基因插入到启动子和终止子之间，且不能破坏目的基因和复制原点，HindIII、PstI会破坏目的基因，SmaI会破坏复制原点，因此选择限制酶Bgl II和BamHI，引物I的5'端需要添加Bgl II的识别序列，引物结合到模板的3'端，与模板碱基互补配对，因此引物1序列区由5′→3′的碱基序列为AGATCTGCATCCTCCAGG；引物2序列区应含有限制酶BamHⅠ的识别序列，可以保证目的基因插入载体中，且插入到Tetr，保证只有一个标记基因Ampr进行筛选。 （2）图中WT组有一个条带，长度为507bp，据此可知PPP2R3A基因的长度为507bp；研究发现，实际操作时，只需敲除PPP2R3A基因的部分碱基序列，即可使其失去功能，KO组PPP2R3A基因碱基序列长度小于507bp，敲除掉的碱基序列长度为507-394=113bp；4、5、6、12、14基因碱基序列长度是394bp，为F1组小鼠的电泳图。 （3）据表分析可知，与WT组相比，KO组心脏组织中PPP2R3A的mRNA和蛋白表达量明显下降，参与心脏发育的蛋白信号转导调控因子RGS19表达量明显升高；由此可以得出结论是PPP2R3A在体内可能通过抑制RGS19蛋白的合成（与RGS19蛋白互作）来影响心脏的功能。 第 1 页 共 7 页 学科网（北京）股份有限公司 $