2024届高三生物二轮复习练习聚焦“PCR”

聚焦“PCR技术”1 姓名 班级 【高考真题填空】 1.(2020新高考Ⅰ)通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出 Wx基因的cDNA，原因是__________________________________________________。 2.(2022全国乙卷) 为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的__________________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是___________。 3.(2022·广东) 研究者针对每个需要扩增的酶基因设计一对 ，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。 4.(2022山东)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增基因。用于扩增基因的引物需满足的条件是 。 5.(2021全国)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答问题： (1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是 （用数字序号）。 (2)操作③中使用的酶是_____________________，PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、 三步，其中复性的结果是 。 (3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与____________特异性结合。 (4)PCR（多聚酶链式反应）技术是指____________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。 6.（2023.6浙江改编）2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：①构建乳腺专一表达载体。②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。③将转基因的BEF作为核供体细胞进行核移植。④重组细胞的体外培养及胚胎移植。⑤检测：DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以 为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行 处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为 ，利用特定引物扩增目的基因片段。 7.（2023.1浙江改编）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合（在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体的细胞质和乙原生质体的细胞核失活）、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA序列b；M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。完善实验思路： ①提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的 ； ②将DNA提取物加入PCR反应体系， 为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。 ③得到的2个PCR扩增产物经 后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的 个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。 8.（2019全国Ⅰ）在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是 。目前在PCR反应中使用Taq DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是 。 9. (2022山东)为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______（填“ 3′端”或“ 5′端”），原因是 。 【选择+简答】 1. (2021湖北)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是（ ） A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间 C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度 2.(2021江苏)热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除𝑇𝑎𝑞DNA聚合酶以外的各成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增，下列叙述正确的有（ ）多选 A. 𝑇𝑎𝑞酶最适催化温度范围为50∼60℃ B.与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物 C.两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸 D.PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了𝑇𝑎𝑞酶的特异性 3.(2017·江苏)设计引物是 PCR 技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（见图），请分别说明理由。 (1)第1组： 。 (2)第2组： 。 4. (2020北京)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白HMA3基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的𝐻𝑀𝐴3基因，同时避免内源𝐻𝑀𝐴3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是( ) A.①+③ B.①+② C.③+② D.③+④ 5.反转录PCR又称逆转录PCR(RT-PCR)，是以mRNA为模板进行的特殊PCR，过程如图。下列相关叙述错误的是(　　) A．图示过程需要控制温度，否则可能得不到产物 B．RT-PCR技术中，不需已知mRNA的全部序列 C．过程③中子链沿着模板链的5′→3′方向延伸 D．RT-PCR技术可应用于是否被RNA病毒感染的检测 6.下列操作过程的叙述中错误的是(　　) A．PCR 实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌 B．PCR 所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后，应缓慢融化 C．PCR 所用的缓冲液和酶应分装成小份，并常温储存 D．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换 7.下图为质粒pUC18，为生产出满足需求的质粒载体，利用定点诱变技术，通过设计具有诱变位点的引物P1和引物P2进行PCR，来实现目标载体的单碱基突变，目的是使质粒pUC18不能被限制酶Eam1105Ⅰ识别，但依然具有氨苄青霉素抗性。下列相关叙述，错误的是(　　) A．诱变位点位于限制酶Eam1105Ⅰ识别序列中 B．PCR反应体系由P1、P2两种引物、脱氧核苷酸、TaqDNA聚合酶及含Mg2＋的缓冲液组成 C．诱变成功的质粒依然具有氨苄青霉素抗性，利用了密码子具有简并性的原理 D．诱变成功的质粒pUC18经过EcoRⅠ、Eam1105Ⅰ双酶切后进行电泳，只能产生1条条带 8.(2023.6·浙江)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列叙述正确的是(　 　) A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D.若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 9.不对称PCR技术是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法，如图所示。不对称PCR中加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物，两者的比例通常为1/50～1/100。PCR反应的最初若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，在限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。下列相关说法正确的是(　 　) A. 两种引物与模板链结合时，需将温度控制在72 ℃左右 B．PCR扩增时，在DNA解旋酶的作用下双链DNA解聚为单链 C．PCR扩增时，子链分别沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3′端延伸 D．通过不对称PCR技术最后大量获得的ssDNA的碱基序列与图中甲链的相同 10.目的基因表达检测过程中需要大量探针,若仅扩增探针这段单链，需要利用不对称PCR,即采用不等量的一对引物，经若干次循环后,低浓度的引物被耗尽,以后的探针循环只产生高浓度引物的延伸产物，结果产生大量的单链 DNA。这两种引物分别引物1引物2，为限制性引物与非限制性引物，其最佳比例一般为1:50~1:100。据此分析，上图中的引物 应该为非限制性引物。假设反应体系中原来有1个模板DNA分子，最初25个循环扩增产生双链 DNA，后15个循环均只扩增一条链，则需要非限制性引物 个。 11.免疫PCR是一种微量抗原检测系统，利用该技术可检测牛乳中微量抗生素。大致检测步骤是，将抗体1固定在微板上，冲洗后加入待检的牛乳，再加入DNA标记的抗体2，PCR扩增及产物检测。下列叙述错误的是(　　) A．图中的抗体1和抗体2均需要与抗生素特异性结合 B．第三次冲洗的目的是除去游离的抗体2以避免出现假阳性 C．在PCR扩增过程中，子链的合成均是从5′端向3′端延伸的 D．可用牛乳蛋白基因的DNA片段作为标记DNA与抗体2相连 12.下列关于DNA片段的扩增及电泳鉴定的叙述，错误的是(　 　) A．琼脂糖凝胶电泳是对PCR扩增产物进行鉴定的一种方法 B．DNA分子在凝胶中的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小等有关 C．电泳结束后，可通过电子显微镜观察到凝胶中的DNA分子条带 D．该实验使用到的器具和试剂等在使用前必须进行高压灭菌处理 13.新型冠状病毒是一种单链RNA病毒，新型冠状病毒的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。 （1）首先，从样本中提取病毒RNA，经 催化生成cDNA。然后以cDNA为模板，以 为原料，进行实时荧光PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。 （2）通过实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针（一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合）。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针对TaqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到（如图甲）。 ①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因退火，通过形成 而特异性结合。退火的温度一般在 ℃范围。具体反应温度常与引物长度、碱基组成等有关。通常，引物中 含量越低，所需的退火温度越低。 ②在PCR循环的 阶段，由于TaqDNA聚合酶催化子链的合成并水解探针，检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈 关系。 （3）实时荧光PCR检测新型冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙所示。 ①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，可能的原因是 （答一点）。 ②Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就 。 ③某新型冠状病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct＞40或无Ct值判定为阴性。图乙所示新型冠状病毒核酸检测结果应判定为 。 （4）阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染。可能产生假阴性的因素有 （多选）。 a.取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光 b.样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解 c.病毒发生变异 14.“实时荧光定量RT-PCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在l～2h内即可得到检测结果。TaqMan探针是实时荧光定量RT-PCR技术中一种常用探针（如图1），其一端连接荧光基团（R），另一端连接淬灭剂（Q）。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步（如图2）。请据图回答： 图1 (1)结合图1和图2分析，“荧光RT-PCR技术”所用的试剂盒中通常都应含 酶、 酶、TaqMan探针、引物、dNTP、Mg2+、缓冲剂系等。这种分子层面的荧光RT-PCR检测具有特异性和灵敏性都很高的特点，主要与试剂盒中的 、 有关。 (2)根据Taq Man探针功能分析，探针中碱基序列的设计应主要依据 ， 探针的 （填“5’”或“3’”）端连接R。新冠病毒是冠状病毒大家庭中的新的一员，其碱基序列 与引起SARS的冠状病毒碱基序列有79.5%的相似性，与流感病毒碱基相似度也较高，因此在设计Taq Man探针时应筛选出nCoV-2019特有序列，以避免 （填“假阴性”或“假阳性”）的出现。 (3)根据图1和图2，Taq酶的除了能催化DNA子链的延伸，还能 。 (4)若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为定值a，则反应体系中某时刻荧光信号强度（Rn）主要与 、 有关。 聚焦“PCR技术”2 姓名 班级 1.【情境素材】重叠延伸PCR技术是一项重要的基因定点突变技术，其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理见图。 （1）若拟突变位点的碱基对为A—T，则需要让其突变为 才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为 (假设引物为单链DNA)。 （2）在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生______种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，其原因是什么？ 。 （3）利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问题是什么？________________________________________________________________________。 2.融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法，其过程如图所示。 （1）第一阶段中PCR至少进行 次循环，才能获得含引物2且双链等长的DNA，第二阶段中两DNA能成功"搭桥"连接的原因是 。 （2）若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计 种引物，其中能够起着"搭桥"作用的引物有 种。第二阶段融合扩增时 （填“需要”、“不需要”）再次添加引物。 3.(1)实现基因的定点诱变时,需要根据目的基因序列设计两常规引物和根据突变碱基序列所处位置设计两个突变引物，图中属于突变引物的是 ，通过PCR1能得到大量产物AB,该过程需要加入引物 ，至少要经过 次复制可以得到产物AB。 (2)用同样的方法通过PCR2可以得到大量产物CD，然后取产物AB的上链和产物CD的下链再次进行扩增,即可得到突变产物AD，该过程是否需要加入引物？并说明原因： 。 4.大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变需进行两轮PCR反应即可获得，过程如图所示。下列叙述不正确的是（ ） A.第一轮PCR过程中复性所用的温度与第二轮PCR复性的温度不一样 B. PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状,该定点诱变产物需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译 C.第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链 D.将某功能蛋白的第17位Cys(UGU)改造成Ser(UCU)，属于蛋白质工程 5.为减少引物与模板之间的非特异性配对，人们对普通PCR技术进行改良，发明了巢式PCR，原理是利用两套引物进行两轮PCR扩增。首先利用第一对引物（外引物）对目的基因所在的DNA进行第一轮扩增，第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，利用第二对引物（内引物或巢式引物）结合在第一轮扩增产物内部，经过15～30次循环，获得第二轮扩增片段（即目的基因），最终第二轮扩增片段短于第一轮，基本过程如图所示。下列叙述错误的是（ ） A．两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段 B．使用外引物至少经过3次循环，才能得到图示的第一轮扩增产物 C．若第一轮扩增产生错误片段，则其进入第二轮扩增的概率极低 D．普通PCR与巢式PCR相比，特异性更强，错误率更高 7.反向PCR可用于扩增未知序列，其原理如下图所示。下图链状DNA分子内侧是已知序列，外侧为未知序列。下列说法错误的是（ ） A.PCR的原理是DNA半保留复制 B.图3中环状DNA进行PCR的过程中，沿引物A延伸子链的方向是逆时针 C.PCR产物含有EcoR Ⅰ的酶切位点 D.PCR产物最终还是环状DNA分子，包含已知序列的完整序列 8.如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出图中片段F已知序列两侧的未知序列，具体流程如图（以EoRI酶切为例），请据图回答下列问题： （1）步骤I用的EcoR I是一种 酶，它通过识别 （填“双链DNA”或“RNA”）分子的特定的核苷酸序列，并且在特定位点进行切割。 （2）步骤Ⅱ连接，用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′一羟基与5′—磷酸基团间形成 键；PCR循环中，升温到90℃以上是为了获得DNA单链，复性后延伸，延伸时TaqDNA聚合酶的作用是催化 。 （3）若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ扩增，选用的PCR引物必须是 （从引物①②③④中选择，填编号）。 已知序列 DNA序列（虚线处省略了部分核酸序列） PCR引物 ①5′- AACTATGCGCTCATGA-3′ ②5′- GCAATGCGTAGCCTCT-3′ ③5′- AGAGGCTACGCATTGC-3′ ④5′- TCATGAGCGCATAGTT-3′ 9.油菜是我国重要的油料作物，黄籽油菜比黑籽油菜的含油量更高，色素积累更少，但我国主栽的甘蓝型油菜缺乏天然的黄籽种质资源。研究表明，TT8基因作为一个重要的基因参与了黄籽性状的形成。科研人员首次利用CRISPR/Cas9技术对甘蓝型油菜中的BnaTT8基因进行定点突变改造(如图1)，PCR扩增BnaTT8基因，构建基因表达载体(如图2)，再将重组质粒通过农杆菌转化法导入受体甘蓝型油菜甲9707(J9707)中，创建甘蓝型油菜黄籽突变体，CRISPR/Cas9介导的BnaTT8基因突变可以显著提高种子的含油量和蛋白质含量，使得用甘蓝型油菜种子生产的菜籽油的营养价值更高。请回答下列问题。 (1)图1中向导RNA与BnaTT8基因按照________________原则特异性结合，Cas9蛋白切割BnaTT8基因使a链和互补链中的_____________断裂，通过随机增添、删除或替换部分碱基对，获得所需目的基因。 (2)PCR扩增目的基因的原理是_______________________，需要根据所需的BnaTT8基因设计引物，引物在DNA复制中的作用是___________________________________________________________。为保证BnaTT8基因正确插入质粒中，需要在引物的________(填“3′端”或“5′端”)添加限制酶的识别序列。 (3)图2字母A～E表示不同限制酶的切割位点，构建基因表达载体时，将BnaTT8基因插入________(填字母)处，目的是_______________________________________________________________________。 重组质粒导入受体细胞后，可在个体水平上通过___________________________________________来鉴定BnaTT8基因是否表达。 (4)基于CRISPR/Cas9系统强大的精确编辑植物基因组的能力，CRISPR/Cas9基因编辑技术已经成为农业中的一个强有力的工具，科研人员在CRISPR/Cas9的基础上进行改造，开发出了可以精准实现多种碱基替换和大片段插入和删除的基因编辑工具。请写出CRISPR/Cas9及其改造的产品在科学研究中的应用：__________________________________________________________________________(答出一点即可)。 PCR 1 填空： 1. 引物能与WX基因的cDNA特异性结合 2. 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 3. 特异性核苷酸序列 复性 4. 引物 5. 两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补配对 6. (1) ④②③① (2) 耐高温的DNA聚合酶 延伸 (3) 病原菌DNA (4) 在生物体外大量快速扩增DNA片段的技术 6. 转基因的BEF（含目的基因的BEF） DNA（水解）酶 模板（扩增模板） 7. 模板 M1、M2 电泳 1 8. 加热至90～95℃ TaqDNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活 9. 5′ DNA合成新链的延伸方向是5′→3′，不会影响目的基因的正常复制 选择+简答 1D 2BC 3.(1)引物Ⅰ与引物Ⅱ局部互补配对而失效 (2)引物Ⅰ′自身折叠后互补配对而失效 4B 5C 6C 7B 8B 9D 10. 1 229—1（或16×225 - 1） 11D 12C 13.逆转录酶 4种脱氧核糖核苷三磷酸 氢键 50-65℃ CG 延伸 正相关/正比例 引物浓度下降、酶活性下降、原料浓度下降 越小 阳性 abc 14.(1) 逆转录、Taq TaqMan探针 引物 (2) 新冠病毒RNA内部的一段序列 5’ 假阳性 (3) 催化TaqMan探针水解 扩增次数 样品初始量 PCR 2 1.（1）C—G或T—A　G或A （2）3　 引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用。 （3）M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段。 2. (1)2 碱基互补配对 (2) 8 6 不需要 3.(1) bc ab 3 (2) 不需要，可以分别以AB上链和CD下链为引物进行延伸 4C 5D 6. 7D 8.限制性核酸内切（或限制） 双链DNA 磷酸二酯键 脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键 ②④ 9.(1)碱基互补配对　磷酸二酯键　 (2)DNA半保留复制　使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸　5′端　 (3)C　保证BnaTT8基因可以在J9707的细胞中表达　测定(纯合)突变体成熟种子的含油量和蛋白质含量　 (4)对基因进行定点突变，抑制有害基因或致病基因的表达；利用基因编辑技术对作物的淀粉含量、香味、营养价值和贮藏品质等品质性状进行改良或精确地去除生产上无用或不理想的性状(答出一点且合理即可) 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$