1.2.2 微生物的选择培养和计数课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

温故知新 纯培养物：由单一个体繁殖所获得的 微生物群体 问题：如何从自然界中，分离出需要的特定微生物？ 1.2微生物的培养技术及应用 高压蒸汽灭菌 液体培养基 二 微生物的选择培养与计数 第一章传统发酵技术的应用 1. 阐明微生物选择培养的原理。 2. 进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。 传统工艺酿酒利用的是自然界中的野生菌种，涉及的微生物种类繁多，其中酵母菌是决定酒产量和质量的主要菌种。为满足酒产量需求，缩短发酵周期，现代工业酿酒一般采用人工选育的纯培养的酵母菌进行酒精发酵。 思考：如何从多种微生物中分离出优良的酵母菌，进而 完善纯培养呢？ 学生任务一：根据以上资料，讨论完成以下问题。 Q1.寻找耐高温的DNA聚合酶的思路是什么样的？ Q2.为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？ 因为水生栖热菌能在70-80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。 美国黄石公园 耐高温的酶 耐高温生物体 高温环境（热泉、火山口） 寻找 寻找 资料一：PCR技术是体外扩增DNA片段的聚合酶链式反应，需要DNA模板、引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。 资料二：1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。 探究活动一：分离特定种类的微生物 Q3.这对在实验室中选择培养特定的微生物有什么启示？ 可人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。 根据微生物对生存环境的要求，到相应环境中去寻找。 启示： 耐寒微生物 石油分解菌 被石油污染的土壤 冰川冻土层 实验室筛选微生物原理： 人为提供__________________的条件（包括_____、_____和_____等），同时_______________________ 有利于目的菌生长 抑制或阻止其他微生物的生长 营养 温度 pH 培养基中加氨苄青霉素 具有氨苄青霉素抗性的菌落 没有氨苄青霉素抗性的细菌 培养基应有菌落 没有氨苄青霉素抗性的细菌被淘汰 Q4.怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌? 选择培养基: 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 选择培养基的作用原理： (1)在培养基中加入某种化学物质,如 加入青霉素→分离出酵母菌和霉菌, 加入高浓度的食盐→得到金黄色葡萄球菌。 (2)改变培养基中的营养成分,如 缺乏氮源时→分离出固氮微生物, 以石油作为唯一碳源时→分离出能消除石油污染的微生物。 (3)改变微生物的培养条件,如将培养基放在高温环境中培养→得到耐高温的微生物。 (4)通过某些特殊环境分离微生物,如在高盐环境中可分离耐盐菌。 【例2】含氨苄西林的LB培养基在基因工程中有很重要的应用。该培养基能杀死一切不抗氨苄西林的细菌,只有对氨苄西林具有抗性的细菌才能正常生长繁殖。由其作用可知该培养基是一种 (　　) A.固体培养基　　 B.合成培养基 C.天然培养基　　 D.选择培养基 【例1】在培养基中加入尿素(唯一氮源),以分离出能分解尿素的细菌,这种加入尿素的培养基在功能上属于 (　　) A.选择培养基　B.固体培养基 C.液体培养基　 D.半固体培养基 A D 课堂练习： 尿素的立体结构 资料二：尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。 这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源。 Q1.你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？ 设计一种选择培养基,用尿素作为唯一氮源,可以将分解尿素的细菌分离出来。 学生任务二：根据以上资料，讨论完成以下问题。 资料三： Q2.该培养基能否将分解尿素的细菌分离出来，为什么？ Q3.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 培养基一 KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素CO(NH2)2 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000ml 培养基二（牛肉膏蛋白胨培养基） 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g 蒸馏水 定容到1000ml Q4.怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？ 碳源、氮源、无机盐、水 培养基一的碳源为_______，氮源为_______；培养基二的碳源和氮源为_______ ； 牛肉膏 蛋白胨 葡萄糖 尿素 能。尿素是培养基中的唯一氮源,只有能够利用尿素的微生物才能够生长。 需要设置接种等量的相同菌液的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照,当牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数明显多于该培养基上的菌落数时,即可说明该培养基具有选择作用。 资料四：通常1g土壤中有几亿到几百亿个土壤微生物，其中，细菌的数量最多，能分解尿素的细菌是其中的一部分。 资料五：土壤溶液接种到选择培养基上的结果 学生任务三：根据以上资料，讨论完成以下问题。 Q1.可否直接制备土壤溶液，接种到选择培养基上进行培养？ Q2.平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？ 稀释涂布平板法接种培养 平板划线法接种培养 Q3.稀释涂布平板法法能否达到对细菌进行计数的目的？ 不能。 探究活动二：微生物的数量测定 一般只有最后一次划线的末端才会形成只由一个细菌形成的菌落，而其他一些菌落往往由两个细菌或多个细菌繁殖而成。 土壤中细菌数量多，需要对土壤溶液稀释再接种。 不能。 稀释涂布平板法实验操作 稀释涂布平板法： 和 。 梯度稀释 涂布平板 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。 基本操作： 1.梯度稀释： 1ml 102 1ml 103 1ml 104 1ml 105 1ml 106 1ml 107 90ml无菌水 101 土壤10g 分别取1ml上清液，加入盛有9ml无菌水的试管中，制成不同稀释倍数的菌液。 6支试管，分别加入9ml无菌水 13 灼 ⑤将涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽后，涂布器冷却后，再进行涂布。 涂 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 滴 ③取0.1ml菌液，滴加到培养基表面 ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中 浸 2.涂布平板： 聚集的微生物 单个细胞 菌液梯度稀释 单个菌落 涂布平板 生长繁殖 学生任务四：阅读教材P18，讨论完成以下问题。 Q2.稀释涂布平板法统计的细菌的个数与它的实际个数相同吗？为什么？ Q1.与平板划线法相比,为什么稀释涂布平板法可以用于细菌的计数? 当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个单菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌且接种的菌种体积固定。 Q4.还有哪些方法可以用于细菌计数？统计的细菌个数与它的实际个数相同吗？为什么？ Q3.有哪些操作可以使计数更加准确？ 统计的菌落往往比活菌的实际数目低 因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落 ①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。 ②设计实验时，各稀释度菌液需要涂布至少三个平板作为重复组。 15 显微镜直接计数： 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。 每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数 统计结果一般是活菌数和死菌数的总和,导致统计结果偏大。 （可补充使用“染色排除法”） Q4.还有哪些方法可以用于细菌计数？统计的细菌个数与它的实际个数相同吗？为什么？ 讲完第1点后讲课本P22中间楷体字内容引出2、3、4、内容 实例分析1： 甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？ （80+90+100）/3 0.1 × 105 =9 ×107个 计算公式： 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。 两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1.甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2.乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？ 甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。 实例分析2： 9.某同学利用稀释涂布平板法进行土壤微生物的数量测定,该同学首先将得到的1 mL土壤样液稀释100倍,然后取0.1 mL稀释液均匀地涂布在培养基表面,重复3个平板,在适宜条件下培养一段时间后,3个平板上的菌落数分别为71、73和75。下列叙述错误的是 (　　)A.可得出该土壤样液中活菌数大约为7.3×107个/LB.此方法统计的菌落数往往比实际的活菌数目低C.一般选择菌落数在30~300的平板进行计数D.显微镜直接计数法统计的都是稀释液中活菌数 D 1.实验目的： 三、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 （1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 （2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 2.实验原理： 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000ml KH2PO4和Na2HPO4的作用是： ①提供无机盐； ②调节pH。 三、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 3.操作步骤： 土壤取样 配制培养基 样品的稀释与涂布平板 微生物的培养与观察 土壤取样 取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤 取样过程：铲去表土（一般3cm左右） 注意事项：铁铲和取样袋在使用前都要灭菌；事毕洗手。 配制培养基 选择培养基：以尿素为唯一氮源 完全培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基） —作为对照，来判断选择培养基是否具有选择作用 选择培养基 （平行重复） 牛肉膏蛋白胨培养基(作为对照) 测定土壤中细菌的数量，一般选用104、105、106，各梯度分别涂布3个平板和1个不涂布作空白对照 3.操作步骤： 土壤取样 配制培养基 样品的稀释与涂布平板 微生物的培养与观察 图中的1、2、3平板是选择培养基，4平板为牛肉膏蛋白胨培养基，以判断选择培养基是否具有筛选作用；另外，还要有两个空白对照，即不接种的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。 ①培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。 *细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d ②观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取数目稳定时的记录作为结果。 *防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目 ③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。 3.操作步骤： 土壤取样 配制培养基 样品的稀释与涂布平板 微生物的培养与观察 稀释104倍 稀释105倍 稀释106倍 空白对照 CO(NH2)2+H2O 脲酶 CO2+2NH3 pH升高，酚红指示剂变红 补充拓展： 脲酶阴性 脲酶阳性 土壤中分解尿素的细菌的鉴定 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。 7.在做分离分解尿素的细菌实验时,甲同学从对应1×106倍稀释的培养基上筛选出大约120个菌落,而其他同学只选择出大约20个菌落。下列有关叙述错误的是 (　　)A.可以将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照,以证明培养基是否受到污染B.让其他同学用与甲同学一样的土壤进行实验,如果结果与甲同学一致,则可以证明甲同学无误C.甲同学出现这种结果的原因可能是土样不同,也可能是操作过程出了问题D.A、B选项的实验思路都遵循了实验的对照原则和平行重复原则 D 方法 纯化原理 接种工具 单菌落的获得 用途 接种效果图 相同点 通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散 将菌液进行一系列的等比稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落 接种环 涂布器 从最后划线的区域挑取 稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落 分离纯化菌种，获得单菌落 ①分离纯化菌种，获得单菌落 ②用于计数 ①都能分离纯化菌种②都是在固体培养基上进行的 平板划线法 稀释涂布平板法 总结：列表区别 课堂小结 课堂小结 微生物的数量测定 选择培养基的作用 微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法 微 生 物 的 选 择 培 养 和 计 数 选择培养基 微生物的选择培养 科学实例 筛选原则 选择培养基的概念及举例 稀释涂布平板法的操作过程 间接计数法 — 稀释涂布平板法 直接计数 —计数板计数法 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 培养基的制备 实验设计 （1）土壤取样 （2）样品的稀释 （3）稀释涂布平板法接种 （4）微生物的培养与观察 结果分析评价 练习与应用 一、概念检测 1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。 （1）这种培养基是一种选择培养基。（ ） （2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（ ） （3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ） √ √ √ 一、概念检测 2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是（ ） A. 菌落中的细菌数目是固定的 B. 平板上的一个菌落就是一个细菌 C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同 D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌 D 练习与应用 二、拓展应用 1.反刍（chú）动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。 反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。 练习与应用 二、拓展应用 2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。 （1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。 提示：可以参考本节“探究·实践”中的设计思路进行设计。 练习与应用 二、拓展应用 2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。 练习与应用 （2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？ 提示：纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。 二、拓展应用 2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。 练习与应用 （3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。 提示：这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。 $