大题05 生物技术与工程（6大题型必刷练）（浙江专用）2026年高考生物终极冲刺讲练测

大题05 生物技术与工程 内容导航 【课标强化·识重点】 锚课标，明要求，明确核心考点考查侧重 【知识回顾·记核心】 梳知识，建体系，熟记高频核心必背要点 【真题训练·练手感】 刷真题，悟考法，贴合考情练就答题手感 【题型分类·攻薄弱】 分题型，破难点，靶向突破知识薄弱板块 题型01 无菌技术及分离纯化操作 题型02 发酵工程 题型03 C4 植物组织培养 题型04 植物体细胞杂交技术 题型05 单克隆抗体技术 题型06 基因工程电泳图 概念 3 发酵工程利用微生物的特定功能规模化生产对人类有用的产品 3.1 获得纯净的微生物培养物是发酵工程的基础 3.1.1 阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提 3.1.2 阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术 3.1.3 举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物 3.1.4 概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分 离和纯化的常用方法 3.1.5 概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常 用方法 3.2 发酵工程为人类提供多样的生物产品 3.2.1 举例说明日常生活中的某些食品是运用传统发酵技术生产的 3.2.2 阐明发酵工程利用现代工程技术及微生物的特定功能，工业 化生产人类所需产品 3.2.3 举例说明发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上有重要 的应用价值 概念 4 细胞工程通过细胞水平上的操作，获得有用的生物体或其产品 4.1 植物细胞工程包括组织培养和体细胞杂交等技术 4.1.1 阐明植物组织培养是在一定条件下，将离体植物器官、组织 和细胞在适宜的培养条件下诱导形成愈伤组织，并重新分化， 最终形成完整植株的过程 4.1.2 概述植物体细胞杂交是将不同植物体细胞在一定条件下融合 成杂合细胞，继而培育成新植物体的技术 4.1.3 举例说明植物细胞工程利用快速繁殖、脱毒、次生代谢产物 生产、育种等方式有效提高了生产效率 4.2 动物细胞工程包括细胞培养、核移植、细胞融合和干细胞的应用等技术 4.2.1 阐明动物细胞培养是从动物体获得相关组织，分散成单个细 胞后，在适宜的培养条件下让细胞生长和增殖的过程。动物 细胞培养是动物细胞工程的基础 4.2.2 阐明动物细胞核移植一般是将体细胞核移入一个去核的卵母 细胞中，并使重组细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体 的过程 4.2.3 阐明动物细胞融合是指通过物理、化学或生物学等手段，使 两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程 4.2.4 概述细胞融合技术是单克隆抗体制备的重要技术 4.2.5 简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值 4.3 对动物早期胚胎或配子进行显微操作和处理以获得目标个体 4.3.1 简述胚胎形成经过了受精及早期发育等过程 4.3.2 简述胚胎工程包括体外受精、胚胎移植和胚胎分割等技术 概念 5 基因工程赋予生物新的遗传特性 5.1 基因工程是一种重组DNA 技术 5.1.1 概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物 学等学科基础上发展而来的 5.1.2 阐明DNA 重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA 连接酶和载体三种基本工具 5.1.3 阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基 因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其 表达产物的检测鉴定等步骤 5.1.4 举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改 善了人类的生活品质 5.2 蛋白质工程是基因工程的延伸 5.2.1 概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质 5.2.2 举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程 一、发酵工程：分离纯化操作 1. 划线分离法 （1）不能划破培养基的原因： A. 会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的； B. 存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。 （2）第二次以及其后的划线操作时，要从上一次划线的开始末端划线。每次划线前接种环都要灼烧灭菌，再冷却。“1蘸4划5灼烧”：全程只蘸取1次液体培养基，划线4次，共5次灼烧（具体划线次数看题目）。 （3）将培养皿倒置（盖在下），放于37℃恒温培养箱中培养12—24小时 （4）相关问题： Q1：为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？ 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。 Q2：在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ 划线结束后灼烧接种环，及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。 Q3：在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 以免接种环温度太高，杀死菌种。 Q4：在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 Q5：如何判断接种操作是否符合无菌要求？ 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合目标菌种的菌落特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求。 （5）倒置的用处： A. 使培养基表面水分更好地挥发 B. 防止皿盖上的冷凝水下滴冲散菌落，杂菌污染无法形成单菌落 2. 涂布分离法——稀释涂布平板法 （六）菌种保存 操作过程：在无菌操作下，用接种环挑取单菌落，再用划线法（自斜面底部向上轻轻划直线）接种在斜面上， 37℃恒温培养箱中培养24小时后，4℃ 冰箱保存。 Q：菌种保存为何采用斜面而不是平板？ 试管开口小，不易污染；固体斜面培养基厚度大，营养丰富，不易干燥；试管体积小，不占空间 二、植物细胞工程：植物体细胞杂交技术 1. 制备原生质体需要培养液、甘露醇（或一定浓度的蔗糖）、纤维素酶和果胶酶等试剂 2. 上述试剂的无菌处理分别是：培养液→高压蒸汽灭菌；纤维素酶和果胶酶→过滤灭菌；甘露醇→高压蒸汽灭菌（有点不确定，先写着）；蔗糖→高压蒸汽灭菌 3. 融合处理后的细胞类型有A、B、AA、BB、AB等，可通过融合细胞颜色（两种细胞颜色不同）等分辨同种细胞和杂种细胞。此时不能通过观察染色体组型分辨，因为此时是原生质体状态，不能进行有丝分裂，无法对中期染色体进行显微摄影。 4. 原生质体融合一定时间后，可加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是终止原生质体融合。 过量稀释液不能换成过量无菌水，否则会使原生质体吸水胀破。也不能采用加热形式终止酶解，这样会使得原生质体死亡，无法进行后续实验 三、基因工程 （一）基因文库 借助载体建立基因文库是获取目的基因的一种常用方法。基因文库包括基因组文库和cDNA文库。把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。基因组中所有DNA序列克隆的总汇被称为基因组文库。若只想研究某些编码蛋白质的DNA序列，利用成熟的mRNA可以构建出cDNA文库。其基本方法是从特定的组织或细胞中提取并纯化全部mRNA，然后在逆转录酶等酶的催化下，以mRNA为模板合成互补的DNA，即cDNA。最后借助载体，利用与构建基因组文库相同的方法构建cDNA文库。 将DNA片段分别连接到载体上，然后通过载体分别转入不同的受体细胞，让外源DNA片段分别在各个受体细胞中大量复制（即扩增），会得到跟初始外源DNA相同的大量子代DNA，即克隆。从中找出含有目的基因的细胞，再利用一定方法将目的基因的DNA片段分离出来。该方法通过对受体菌的培养进而储存基因。 1. 构建基因组文库 基因组是指生物体所有遗传物质的总和，包括编码DNA和非编码DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA。 基因组文库是指将某生物的全部基因组DNA用限制酶切割成一定长度的DNA 片段（鸟枪法），再连接到某种载体上而形成的相同DNA集合（鸟枪法：这种方法犹如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来）。 2. 构建cDNA文库 cDNA（complementary DNA）是指互补DNA，从特定的组织或细胞中提取并纯化全部mRNA，然后在逆转录酶等酶的催化下，以mRNA为模板合成互补的DNA，即cDNA。cDNA没有内含子而只有外显子的序列，只包含该生物的部分基因 （二）将目的基因导入植物细胞的方式 1. 农杆菌转化法 根癌农杆菌中含有Ti质粒，其上有一段_T-DNA_，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到到植物染色体DNA中。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过植物组织培养技术，培养出转基因植株。主要侵染_双子叶植物。 2. 基因枪法 基因枪的作用是用压缩气体(氦或氮等)动力产生一种冷的气体冲击波进入轰击室(因此可免遭由“热”气体冲击波引起的细胞损伤)，把吸附有DNA的金属颗粒打向细胞，穿过细胞壁、细胞膜、细胞质等层层构造到达细胞核，整合到植物DNA中表达，甚至可将目的基因导入叶绿体等细胞器中。 3. 花粉管通道法 将重组DNA滴加到植物受粉后形成的花粉管通道内，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，使其进入卵细胞、合子或早期胚胎细胞中，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵或其他细胞的发育而成为带转基因的新个体。该方法直接、简便且经济。 4. 显微注射法 在显微镜下，用一根极细的玻璃针(直径1～2微米)直接将重组DNA注射到_未融合的雄性细胞核内，体外培养一段时间后再把注射过重组DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成转基因幼仔。特点：DNA损失少，无需选择标记基因，整合效率高。不足：仪器设备要求高，操作比较烦琐。 5. 制备感受态细胞 首先用CaCl2溶液处理细胞，以增大细菌细胞膜的通透性，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞_。再在低温条件下将重组DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，促进感受态细胞吸收DNA分子，最后进行短暂的热刺激处理完成转化过程。 6. 电击法 又称电穿孔法，通过短暂的电脉冲在细胞膜上形成纳米级临时性的小孔，DNA由此进入受体细胞。 1. （2026·浙江·高考真题）现代发酵工程已广泛应用于食品、医药等领域。下列叙述错误的是（　　） A．发酵原料无需灭菌处理 B．标准化工艺可控制药品质量 C．常用经选育的优良菌种 D．调控发酵条件可改善食品风味 （2024·浙江·高考真题）阅读下列材料，完成下面小题。 柿子具有较高的营养价值和药用价值。采用液体发酵法可酿制出醋香浓郁、酸味纯正的柿子醋，提高了柿子的经济价值。柿子醋的酿造工艺流程如图所示。 2. 下列关于酒精发酵和醋酸发酵的叙述，错误的是（    ） A．酒精发酵是吸能反应 B．酒精发酵在无氧条件下进行 C．醋酸发酵是放能反应 D．醋酸发酵在有氧条件下进行 3. 下列关于柿子醋酿造过程的叙述，错误的是（    ） A．加酶榨汁环节加入果胶酶，有利于提高柿子汁产量 B．酒精发酵前可对柿子汁进行杀菌，以利于酒精发酵 C．若柿子酒的酒精度过高，应稀释后再用于醋酸发酵 D．用不同品种和成熟度的柿子酿造的柿子醋风味相同 （2023·浙江·高考真题）阅读下列材料，完成下面小题。 小曲白酒清香纯正，以大米、大麦、小麦等为原料，以小曲为发酵剂酿造而成。小曲中所含的微生物主要有好氧型微生物霉菌、兼性厌氧型微生物酵母菌，还有乳酸菌、醋酸菌等细菌。酿酒的原理主要是酵母菌在无氧条件下利用葡萄糖发酵产生酒精。传统酿造工艺流程如图所示。 4. 小曲白酒的酿造过程中，酵母菌进行了有氧呼吸和无氧呼吸。关于酵母菌的呼吸作用，下列叙述正确的是（　　） A．有氧呼吸产生的[H]与O2结合，无氧呼吸产生的[H]不与O2结合 B．有氧呼吸在线粒体中进行，无氧呼吸在细胞质基质中进行 C．有氧呼吸有热能的释放，无氧呼吸没有热能的释放 D．有氧呼吸需要酶催化，无氧呼吸不需要酶催化 5. 关于小曲白酒的酿造过程，下列叙述错误的是（　　） A．糖化主要是利用霉菌将淀粉水解为葡萄糖 B．发酵液样品的蒸馏产物有无酒精，可用酸性重铬酸钾溶液检测 C．若酿造过程中酒变酸，则发酵坛密封不严 D．蒸熟并摊晾的原料加入糟醅，立即密封可高效进行酒精发酵 6. （2021·浙江·高考真题）用白萝卜制作泡菜的过程中，采用适当方法可缩短腌制时间。下列方法中错误的是（　　） A．将白萝卜切成小块 B．向容器中通入无菌空气 C．添加已经腌制过的泡菜汁 D．用沸水短时处理白萝卜块 7. （2025·浙江·高考真题）某研究小组进行微型月季的快速繁殖研究，结果如表所示。 流程 最佳措施或最适培养基 ①外植体腋芽消毒 75%乙醇浸泡30s+5%NaClO浸泡6min ②诱导出丛生苗 MS+3.0mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA ③丛生苗的扩增 MS+2.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA ④丛生苗的生根 1/2MS+0.25mg·L-1IBA+0.25mg·L-1NAA 注：丛生苗为丛状生长的幼苗，IBA（吲哚丁酸）为生长素类物质 下列叙述正确的是（    ） A．流程①的效果取决于消毒剂浓度 B．流程②不需要经过脱分化形成愈伤组织的阶段 C．与流程②相比，流程③培养基中细胞分裂素类与生长素类物质的比值更大 D．与流程③相比，提高流程④培养基的盐浓度有利于丛生苗的生根 8. （2025·浙江·高考真题）科研人员研究某种红豆杉的细胞悬浮培养和原生质体培养方式对合成紫杉醇的影响，甲组为细胞悬浮培养，乙组为原生质体的液体静置培养，丙组为琼脂糖包埋后的原生质体悬浮培养。三组的培养基相同，其中乙、丙两组另加细胞壁合成抑制剂等。结果如图所示。 下列叙述正确的是（　　） A．比较甲和丙，丙组的培养方式有利于原生质体的增殖，从而提高紫杉醇总产量 B．比较乙和丙，丙组的培养方式有利于应用到发酵罐进行紫杉醇的生产 C．丙组中琼脂糖凝胶的作用是持续为原生质体供应碳源 D．上述实验表明细胞壁完整有助于紫杉醇在细胞内的合成与积累 9. （2022·浙江·高考真题）农作物秸秆的回收利用方式很多，其中之一是将秸秆碎化后作为食用菌的栽培基质。碎化秸秆中纤维所起的作用，相当于植物组织培养中固体培养基的（    ） A．琼脂+蔗糖 B．蔗糖+激素 C．激素+无机盐 D．无机盐+琼脂 10. （2026·浙江·高考真题）为探究不同环境因素对光合作用的影响，某同学选择金鱼藻、冰块、溶液、台灯、烧杯、氧传感器、米尺等材料和用具进行实验。下列叙述错误的是（　　） A．可探究的环境因素有光照强度、温度、浓度等 B．实验中可用单位时间的释放量表示光合速率 C．将室温下的实验装置移至冰水中，光合速率持续上升 D．可通过调节台灯与烧杯之间的距离来改变光照强度 11. （2024·浙江·高考真题）某动物细胞培养过程中，细胞贴壁生长至接触抑制时，需分装培养，实验操作过程如图。 下列叙述错误的是（    ） A．①加消化液的目的是使细胞与瓶壁分离 B．②加培养液的目的是促进细胞增殖 C．③分装时需调整到合适的细胞密度 D．整个过程需要在无菌、无毒条件下进行 12. （2023·浙江·高考真题）在家畜优良品种培育过程中常涉及胚胎工程的相关技术。下列叙述错误的是（    ） A．经获能处理的精子才能用于体外受精 B．受精卵经体外培养可获得早期胚胎 C．胚胎分割技术提高了移植胚胎的成活率 D．胚胎移植前需对受体进行选择和处理 13. （2026·浙江·高考真题）利用转基因技术将口蹄疫病毒衣壳蛋白P1的基因导入水稻愈伤组织，获得了多个稳定表达P1的转基因水稻株系。转基因水稻的P1激活小鼠免疫反应的能力与大肠杆菌生产的P1相当，且给小鼠饲喂转基因水稻的P1也能激活免疫反应。下列叙述正确的是（　　） A．将愈伤组织进行脱分化和再分化，获得转基因水稻植株 B．不同株系转基因水稻P1蛋白的基因表达水平相同 C．转基因水稻与大肠杆菌生产的P1蛋白分子量相等 D．转基因水稻P1蛋白具备制成口服疫苗的潜力 14. （2024·浙江·高考真题）植物体在干旱、虫害或微生物侵害等胁迫过程中会产生防御物质，这类物质属于次生代谢产物。次生代谢产物在植物抗虫、抗病等方面发挥作用，也是药物、香料和色素等的重要来源。次生代谢产物X的研发流程如下： 筛选高产细胞→细胞生长和产物X合成关系的确定→发酵生产X 回答下列问题： (1)获得高产细胞时，以X含量高的植物品种的器官和组织作为_____，经脱分化形成愈伤组织，然后通过液体振荡和用一定孔径的筛网进行_____获得分散的单细胞。 (2)对分离获得的单细胞进行_____培养，并通过添加_____或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。为进一步提高目标细胞的X含量，将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，该过程模拟了_____的胁迫。 (3)在大规模培养高产细胞前，需了解植物细胞生长和产物合成的关系。培养细胞生产次生代谢产物的模型分为3种，如图所示。若X只在细胞生长停止后才能合成，则X的合成符合图_____（填“甲”“乙”“丙”），根据该图所示的关系，从培养阶段及其目标角度，提出获得大量X的方法。_____ (4)多种次生代谢产物在根部合成与积累，如人参、三叶青等药用植物，可通过_____培养替代细胞悬浮培养生产次生代谢产物。随着基因组测序和功能基因组学的发展，在全面了解生物体合成某次生代谢产物的_____和_____的基础上，可利用合成生物学的方法改造酵母菌等微生物，利用_____工程生产植物的次生代谢产物。 15. （2022·浙江·高考真题）回答下列（一）、（二）小题： （一）红曲霉合成的红曲色素是可食用的天然色素，具有防腐、降脂等功能。研究者进行了红曲色素的提取及红色素的含量测定实验，流程如下： (1)取红曲霉菌种斜面，加适量____________洗下菌苔，制成菌悬液并培养，解除休眠获得____________菌种。经液体发酵，收集红曲霉菌丝体，红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、____________，获得的上清液即为红曲色素提取液。为进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行____________处理。 (2)红曲色素包括红色素、黄色素和橙黄色素等，红色素在390nm、420nm和505nm波长处均有较大吸收峰。用光电比色法测定红曲色素提取液甲的红色素含量时，通常选用505nm波长测定的原因是____________。测定时需用____________作空白对照。 (3)生产上提取红曲色素后的残渣，经__________处理后作为饲料添加剂或有机肥，这属于废弃物的无害化和__________处理。 （二）我国在新冠疫情方面取得了显著的成效，但全球疫情形势仍然非常严峻、尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。 (4)新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用__________酶合成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的__________，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。 (5)接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的__________基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的____________。将腺病毒复制基因敲除的目的是____________。 (6)单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的____________细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和____________。 16. （2026·浙江·高考真题）农杆菌能侵染真菌，介导真菌细胞的转基因。3-磷酸甘油脱氢酶是假丝酵母中甘油合成代谢途径的关键酶，将3-磷酸甘油脱氢酶基因（Gpd）构建到表达载体上，如图1所示。通过农杆菌介导法，转化假丝酵母野生型菌株，获得转Gpd的重组菌株。野生型菌株与某重组菌株分别进行发酵实验，生产甘油的结果如图2所示。 注：ZeoR是腐草霉素抗性基因，KanR是卡那霉素抗性基因 回答下列问题： (1)表达载体导入农杆菌细胞：用溶液处理农杆菌，制备________，再用电击法将表达载体导入农杆菌细胞，经筛选获得阳性克隆。为验证阳性克隆是否为转化成功的农杆菌，从繁殖后的菌株细胞中提取质粒，经________限制酶酶切后电泳，若出现4条DNA条带，则表明转化成功。 (2)假丝酵母重组菌株的获得：在________中的酒精灯火焰旁，取野生型假丝酵母菌种，采用________方法接种在固体培养基上培养，适时挑选________再接种到液体培养基进行培养。取适量的假丝酵母与农杆菌进行共培养一段时间后，杀灭农杆菌，然后在含有________的选择培养基中筛选，最终获得重组菌株。 (3)重组菌株生产甘油能力的分析：根据图2可知，与野生型菌株相比，该重组菌株用于发酵生产甘油的2个优点是________。若某生长正常的重组菌株发酵液中甘油的含量显著低于野生型菌株，从引起变异的因素分析，可能的原因有：在培养过程中重组菌株发生了突变，或________，导致甘油合成代谢受阻。 17. （2024·浙江·高考真题）小鼠毛囊中表达F蛋白。为研究F蛋白在毛发生长中的作用，利用基因工程技术获得了F基因敲除的突变型纯合体小鼠，简称f小鼠，突变基因用f表示。f小鼠皮毛比野生型小鼠长50%，表现出毛绒绒的样子，其它表型正常。（注：野生型基因用++表示；f杂合子基因型用+f表示） 回答下列问题： (1)F基因敲除方案如图甲。在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生______，导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质因为缺失了______而丧失活性。要达到此目的，还可以对该基因的特定碱基进行______和______。 (2)从野生型、f杂合子和f小鼠组织中分别提取DNA，用限制酶HindⅢ酶切，进行琼脂糖电泳，用DNA探针检测。探针的结合位置如图甲，检测结果如图乙，则f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第______泳道和第______泳道。 (3)g小鼠是长毛隐性突变体（gg），表型与f小鼠相同。f基因和g基因位于同一条常染色体上。f杂合子小鼠与g小鼠杂交，若杂交结果是______，则g和f是非等位基因；若杂交结果是______，则g和f是等位基因。（注：不考虑交叉互换；野生型基因用++表示；g杂合子基因型用+g表示） (4)确定g和f为等位基因后，为进一步鉴定g基因，分别提取野生型（++）、g杂合子（+g）和g小鼠（gg）的mRNA，反转录为cDNA后用（2）小题同样的DNA探针和方法检测，结果如图丙。g小鼠泳道没有条带的原因是______。组织学检查发现野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，因此推测F蛋白具有的作用______。 18. （2023·浙江·高考真题）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题： (1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于______。根据这种调节方式，在培养基中添加______，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。 (2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为： ①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通过检索______获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。 ②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF膜发生______，表达载体最终进入细胞核，发生转化。 ③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为______。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了______重组细胞发育的作用。 ④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至______，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。 ⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以______为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行______处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为______，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？______。 19. （2025·浙江·高考真题）某同学欲开展小鼠的排卵、受精以及观察受精卵发育的实验，其基本过程如下。 (1)制备垂体细胞提取液：取小鼠的垂体，加入少量的培养液，剪碎，___________，经处理制成垂体细胞悬液。取垂体细胞悬液，___________，制成某一浓度的垂体细胞悬液。将垂体细胞培养一段时间后，破碎，___________，取上清液，经处理获得提取液。 (2)采集精子：将人工采集的精子置于培养液中，培养一段时间。此过程可使精子获得___________。 (3)采集卵细胞：给成年雌鼠注射垂体细胞提取液，一段时间后，采集卵子。注射垂体细胞提取液可促进雌鼠排卵的原因是 ___________。 (4)受精：将精子和卵细胞混合培养。精子入卵后，会使卵子完成减数第二次分裂，排出________，形成雌原核。 (5)观察受精卵的发育：受精卵开始卵裂，其中的细胞体积___________，细胞数量增加，但胚胎的总体积变化 ___________。结果表明这一阶段胚胎细胞的细胞周期中，显著缩短的时期是___________。 20. （2024·浙江·高考真题）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题： (1)锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物______为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内______的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含______而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会______。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。 (2)重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用______连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是______。 (3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行______培养，活化后接种至液体培养基，采用______以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。 (4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用______法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为______。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是______，依据是______。 注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。 题型01 无菌技术及分离纯化操作 1. （2021·浙江·高考真题）下列关于原生质体和细胞计数的叙述，错误的是（　　） A．测定植物原生质体的密度时，可用血细胞计数板 B．红墨水不能进入活细胞，可用于检测细胞的存活状态并计数 C．涂布分离法和划线分离法均能得到单菌落，都可用于细胞计数 D．酵母菌在液体培养基中培养一段时间后，可用比浊计测定其密度 2. ．（2024·湖南·高考真题）微生物平板划线和培养的具体操作如图所示，下列操作正确的是（　　） A．①②⑤⑥ B．③④⑥⑦ C．①②⑦⑧ D．①③④⑤ 3. （2022·浙江·高考真题）回答下列（一）、（二）小题： （一）回答与产淀粉酶的枯草杆菌育种有关的问题： (1)为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用___________制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的___________中保温一段时间，其目的是___________。 (2)为提高筛选效率，可将菌种的___________过程与菌种的产酶性能测定一起进行：将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，采用___________显色方法，根据透明圈与菌落直径比值的大小，可粗略估计出菌株是否产酶及产酶性能。 (3)为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过___________后再筛选获得，或利用转基因、___________等技术获得。 （二）回答与植物转基因和植物克隆有关的问题： (4)在用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制___________生长，二是筛选转化细胞。当选择培养基中抗生素浓度___________时，通常会出现较多假阳性植株，因此在转基因前需要对受体进行抗生素的___________检测。 (5)为提高培育转基因植株的成功率，植物转基因受体需具有较强的___________能力和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞内___________形态是否改变进行判断，也可通过观察分裂期染色体的___________，分析染色体组型是否改变进行判断。 (6)植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和___________长短等有关。同时也与受体的取材有关，其中受体为___________时全能性表达能力最高。 题型02 发酵工程 4. （2025·浙江·高考真题）猕猴桃醋生产的基本工艺流程如下，其中①②③表示发酵的三个环节，糖化是将淀粉转化为葡萄糖的过程。 下列叙述错误的是（　　） A．通过蒸煮可以杀灭猕猴桃自带的绝大多数微生物 B．麸曲中曲霉的主要作用是对糖类进行氧化分解 C．环节③需要通入无菌空气 D．①②③都需要控制温度、pH 等条件 5. （2025·浙江·高考真题）传统发酵技术为我们提供了多种食品、饮料及调味品。下列叙述错误的是（    ） A．泡菜的风味由乳酸菌的种类决定 B．用果酒发酵制作果醋的主要菌种是醋酸菌 C．家庭酿制米酒的过程既有需氧呼吸又有厌氧呼吸 D．传统发酵通常是利用多种微生物进行的混合发酵 题型03 植物组织培养 6. （2024·浙江·高考真题）山药在生长过程中易受病毒侵害导致品质和产量下降。采用组织培养技术得到脱毒苗，可恢复其原有的优质高产特性，流程如图。下列操作不可行的是（    ） 外植体→愈伤组织→丛生芽→试管苗 A．选择芽尖作为外植体可减少病毒感染 B．培养基中加入抗生素可降低杂菌的污染 C．将丛生芽切割后进行继代培养可实现快速繁殖 D．提高生长素和细胞分裂素的比值可促进愈伤组织形成丛生芽 7. （2022·浙江·高考真题）下列关于菊花组织培养的叙述，正确的是（    ） A．用自然生长的茎进行组培须用适宜浓度的乙醇和次氯酸钠的混合液消毒 B．培养瓶用专用封口膜封口可防止外界杂菌侵入并阻止瓶内外的气体交换 C．组培苗锻炼时采用蛭石作为栽培基质的原因是蛭石带菌量低且营养丰富 D．不带叶片的菊花幼茎切段可以通过器官发生的途径形成完整的菊花植株 8. （2023·河北·高考真题）植物细胞悬浮培养是将单个细胞或细胞团进行液体培养增殖的技术。下列叙述错误的 A．植物细胞悬浮培养的培养基须经无菌处理 B．经纤维素酶和果胶酶充分处理后，植物细胞团分散为单个完整的悬浮细胞 C．为使悬浮细胞正常生长，培养基须保持适当的温度、pH和渗透压 D．利用悬浮培养技术生产次生代谢物，可减少植物资源的消耗 题型04 植物体细胞杂交技术 9. （2020·山东·高考真题）两种远缘植物的细胞融合后会导致一方的染色体被排出。若其中一个细胞的染色体在融合前由于某种原因断裂，形成的染色体片段在细胞融合后可能不会被全部排出，未排出的染色体片段可以整合到另一个细胞的染色体上而留存在杂种细胞中。依据该原理，将普通小麦与耐盐性强的中间偃麦草进行体细胞杂交获得了耐盐小麦新品种，过程如下图所示。下列说法错误的是（    ） A．过程①需使用纤维素酶和果胶酶处理细胞 B．过程②的目的是使中间偃麦草的染色体断裂 C．过程③中常用灭活的病毒诱导原生质体融合 D．耐盐小麦的染色体上整合了中间偃麦草的染色体片段 10. （2023·浙江·高考真题）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题： (1)根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备__________的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的__________为外植体。 (2)植物细胞壁的主要成分为__________和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的__________失活。对处理后的原生质体在显微镜下用__________计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是__________。 (3)将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于__________。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？__________ A ．甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂 B．同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂 C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂 D．杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂 (4)愈伤组织经__________可形成胚状体或芽。胚状体能长出__________，直接发育形成再生植株。 (5)用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA序列b；M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。完善实验思路： Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的__________。 Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系，__________为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。 Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经__________后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的__________个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。 题型05 单克隆抗体技术 11. （2026·浙江·高考真题）β-淀粉样蛋白（Aβ）的异常聚集是阿尔茨海默症的致病因素之一。研究者拟利用小鼠作为实验动物，通过细胞融合技术制备抗Aβ的单克隆抗体以用于该病的研究。下列叙述错误的是（　　） A．产生抗Aβ抗体的B细胞来自于用Aβ抗原免疫的小鼠 B．杂交瘤细胞来自于小鼠B细胞与骨髓瘤细胞的融合 C．杂交瘤细胞产生的抗体即为抗Aβ的单克隆抗体 D．抗Aβ的单克隆抗体可辅助该病的特异性诊断 12. 核苷酸合成有两个途径，物质A可以阻断其中的全合成途径（如下图）。正常细胞内含有补救合成途径所必需的转化酶和激酶，制备单克隆抗体时选用的骨髓瘤细胞中缺乏转化酶。现用加入H、A、T三种物质的“HAT培养基”来筛选特定的杂交瘤细胞。关于筛选原理的叙述，正确的是 A．免疫B细胞及其互相融合细胞因全合成途径被A阻断而在HAT培养基上不能增殖 B．杂交瘤细胞因为可以进行上述两个途径所以能在HAT培养基上大量增殖 C．骨髓瘤细胞及其互相融合细胞因无法进行上述两个途径而在HAT培养基上不能增殖 D．HAT培养基上筛选出的所有杂交瘤细胞既能大量增殖又能产生高纯度的目标抗体 题型06 基因工程电泳图 （2024·浙江·高考真题）阅读下列材料，完成下面小题。 疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。 研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。 13. 下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（    ） A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用 D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段 14. 为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。 1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（    ） A．1号和6号 B．2号和4号 C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号 15. （2023·浙江·高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。 下列叙述正确的是（　　） A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 16. （2025·浙江·高考真题）玉米(2n=20)雌雄同株异花。从玉米某自交系(甲)中选育出2个雄性不育突变体(乙和丙)。已知雄性不育基因E1、E2由雄性可育基因E突变所致；如图1所示。甲×乙的F2中雄性可育285株、雄性不育94株，甲×丙的F2中雄性可育139株、雄性不育45株。利用引物P1和P2，对甲、乙、丙以及它们之间杂交的后代(丁和戊)基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经SnaBⅠ完全酶切后电泳，结果如图2所示。 回答下列问题： (1)E1基因与E基因相比，由于___________，导致编码的蛋白质中1个氨基酸发生改变。E2基因与E基因相比，由于编码区增加了插入序列，导致___________，使编码的蛋白质中氨基酸数目减少。 (2)雄性不育对雄性可育是___________性状，乙的基因型是___________。甲×丙产生的F1其雌配子有___________种，F2可育植株中纯合子占___________。若甲×戊的F1随机交配，则F2中E1的基因频率是___________。 (3)写出丁×戊获得F1的遗传图解。 (4)雄性不育突变体不能自交繁殖。为了保存雄性不育突变体，需长期保留含不育基因的杂合子。该杂合子可采用上述“PCR结合限制性内切核酸酶酶切后分析条带”进行鉴定，还可采用的方法有___________(答出2点即可)。 (5)利用引物P1、P2对甲的基因组DNA进行PCR扩增和电泳，下列叙述错误的是___________。 A．PCR反应中TaqDNA聚合酶是沿着模板链的3'端向5'端聚合核苷酸 B．图2中胶板的上端是电泳时的负极，且电泳时DNA片段由负极向正极泳动 C．若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得16条含32P标记的DNA单链 D．若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得8个含32P标记且长度为b的DNA分子 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 大题05 生物技术与工程 答案版 1. A 2. A 3. D 4. A 5. D 6. B 7. B 8. B 9. A 10. C 11. B 12. C 13. D 14. (1) 外植体 过滤 (2) 克隆 DNA合成抑制剂 微生物侵害 (3) 丙 先培养大量细胞，改变条件使细胞停止生长，大量产生X (4) 器官 代谢途径 关键酶 发酵 15. (1) 无菌水 活化 离心 破碎 (2) 其它色素对该波长光的吸收相对较少，干扰相对较小 70%乙醇溶液 (3) 灭菌 资源化 (4) 逆转录 核酸探针 (5) 抗原 载体 使腺病毒失去复制能力 (6) 脾 动物血清 16. (1) 感受态细胞/可导入外源DNA分子的农杆菌 EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ (2) 超净工作台/无菌实验室/灭菌的操作台 （平板）划线法/稀释涂布平板法 单菌落 腐草霉素 (3) 提高发酵液中甘油的含量；缩短发酵时间 T-DNA的插入导致重组菌株发生了变异 17. (1) 编码序列错位 氨基酸序列 替换 缺失 (2) 3 2 (3) 子代全为野生型 野生型：突变型=1：1 (4) 基因突变丢失了启动子，导致无法转录出 mRNA；反转录没有产物，检测不出结果 抑制毛发生长 18. (1) 负反馈调节 过量赖氨酸类似物 (2) 基因数据库 融合 核受体细胞 激活 桑椹胚或囊胚 转基因BEF DNA酶 PCR的模板 构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。 19. (1) 负反馈调节 过量赖氨酸类似物 (2) 基因数据库 融合 核受体细胞 激活 桑椹胚或囊胚 转基因BEF DNA酶 PCR的模板 构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。 20. (1) 根 解旋酶 磷酸基团 变长 (2) DNA连接酶 热变性使大肠杆菌内的DNA外溢 (3) 划线分离 振荡培养 (4) 梯度稀释 锌吸收缺陷型酵母+空载体 N 转入N基因的这组酵母菌数量多 题型01 无菌技术及分离纯化操作 1. C 2. D 3. (1) 无菌水 水浴 杀死不耐热微生物 (2) 分离 KI-I2 (3) 人工诱变 原生质体融合 (4) 农杆菌 过低 敏感性 (5) 再生 细胞核 形态特征和数量 (6) 培养时间 受精卵 题型02 发酵工程 4. B 5. A 题型03 植物组织培养 6. D 7. D 8. B 题型04 植物体细胞杂交技术 9. C 10. (1) 再生 叶 (2) 纤维素 细胞质基因和细胞核基因 血细胞计数板 降低PEG浓度，使其失去融合作用 (3) 同一个杂种融合原生质体 ABD (4) 再分化 根和芽 (5) 模板 M1、M2 凝胶电泳 1 题型05 单克隆抗体技术 11. C 12. C 题型06 基因工程电泳图 13. D 14. B 15. B 16. (1) 碱基对替换 终止密码子提前 (2) 隐性 E2E2 2/两/二 1/3 1/4 (3) (4)测交，自交，核酸分子杂交，基因测序 (5)C / 学科网（北京）股份有限公司 $ 大题05 生物技术与工程 内容导航 【课标强化·识重点】 锚课标，明要求，明确核心考点考查侧重 【知识回顾·记核心】 梳知识，建体系，熟记高频核心必背要点 【真题训练·练手感】 刷真题，悟考法，贴合考情练就答题手感 【题型分类·攻薄弱】 分题型，破难点，靶向突破知识薄弱板块 题型01 无菌技术及分离纯化操作 题型02 发酵工程 题型03 C4 植物组织培养 题型04 植物体细胞杂交技术 题型05 单克隆抗体技术 题型06 基因工程电泳图 概念 3 发酵工程利用微生物的特定功能规模化生产对人类有用的产品 3.1 获得纯净的微生物培养物是发酵工程的基础 3.1.1 阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提 3.1.2 阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术 3.1.3 举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物 3.1.4 概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分 离和纯化的常用方法 3.1.5 概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常 用方法 3.2 发酵工程为人类提供多样的生物产品 3.2.1 举例说明日常生活中的某些食品是运用传统发酵技术生产的 3.2.2 阐明发酵工程利用现代工程技术及微生物的特定功能，工业 化生产人类所需产品 3.2.3 举例说明发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上有重要 的应用价值 概念 4 细胞工程通过细胞水平上的操作，获得有用的生物体或其产品 4.1 植物细胞工程包括组织培养和体细胞杂交等技术 4.1.1 阐明植物组织培养是在一定条件下，将离体植物器官、组织 和细胞在适宜的培养条件下诱导形成愈伤组织，并重新分化， 最终形成完整植株的过程 4.1.2 概述植物体细胞杂交是将不同植物体细胞在一定条件下融合 成杂合细胞，继而培育成新植物体的技术 4.1.3 举例说明植物细胞工程利用快速繁殖、脱毒、次生代谢产物 生产、育种等方式有效提高了生产效率 4.2 动物细胞工程包括细胞培养、核移植、细胞融合和干细胞的应用等技术 4.2.1 阐明动物细胞培养是从动物体获得相关组织，分散成单个细 胞后，在适宜的培养条件下让细胞生长和增殖的过程。动物 细胞培养是动物细胞工程的基础 4.2.2 阐明动物细胞核移植一般是将体细胞核移入一个去核的卵母 细胞中，并使重组细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体 的过程 4.2.3 阐明动物细胞融合是指通过物理、化学或生物学等手段，使 两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程 4.2.4 概述细胞融合技术是单克隆抗体制备的重要技术 4.2.5 简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值 4.3 对动物早期胚胎或配子进行显微操作和处理以获得目标个体 4.3.1 简述胚胎形成经过了受精及早期发育等过程 4.3.2 简述胚胎工程包括体外受精、胚胎移植和胚胎分割等技术 概念 5 基因工程赋予生物新的遗传特性 5.1 基因工程是一种重组DNA 技术 5.1.1 概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物 学等学科基础上发展而来的 5.1.2 阐明DNA 重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA 连接酶和载体三种基本工具 5.1.3 阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基 因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其 表达产物的检测鉴定等步骤 5.1.4 举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改 善了人类的生活品质 5.2 蛋白质工程是基因工程的延伸 5.2.1 概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质 5.2.2 举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程 一、发酵工程：分离纯化操作 1. 划线分离法 （1）不能划破培养基的原因： A. 会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的； B. 存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。 （2）第二次以及其后的划线操作时，要从上一次划线的开始末端划线。每次划线前接种环都要灼烧灭菌，再冷却。“1蘸4划5灼烧”：全程只蘸取1次液体培养基，划线4次，共5次灼烧（具体划线次数看题目）。 （3）将培养皿倒置（盖在下），放于37℃恒温培养箱中培养12—24小时 （4）相关问题： Q1：为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？ 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。 Q2：在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ 划线结束后灼烧接种环，及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。 Q3：在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 以免接种环温度太高，杀死菌种。 Q4：在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 Q5：如何判断接种操作是否符合无菌要求？ 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合目标菌种的菌落特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求。 （5）倒置的用处： A. 使培养基表面水分更好地挥发 B. 防止皿盖上的冷凝水下滴冲散菌落，杂菌污染无法形成单菌落 2. 涂布分离法——稀释涂布平板法 （六）菌种保存 操作过程：在无菌操作下，用接种环挑取单菌落，再用划线法（自斜面底部向上轻轻划直线）接种在斜面上， 37℃恒温培养箱中培养24小时后，4℃ 冰箱保存。 Q：菌种保存为何采用斜面而不是平板？ 试管开口小，不易污染；固体斜面培养基厚度大，营养丰富，不易干燥；试管体积小，不占空间 二、植物细胞工程：植物体细胞杂交技术 1. 制备原生质体需要培养液、甘露醇（或一定浓度的蔗糖）、纤维素酶和果胶酶等试剂 2. 上述试剂的无菌处理分别是：培养液→高压蒸汽灭菌；纤维素酶和果胶酶→过滤灭菌；甘露醇→高压蒸汽灭菌（有点不确定，先写着）；蔗糖→高压蒸汽灭菌 3. 融合处理后的细胞类型有A、B、AA、BB、AB等，可通过融合细胞颜色（两种细胞颜色不同）等分辨同种细胞和杂种细胞。此时不能通过观察染色体组型分辨，因为此时是原生质体状态，不能进行有丝分裂，无法对中期染色体进行显微摄影。 4. 原生质体融合一定时间后，可加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是终止原生质体融合。 过量稀释液不能换成过量无菌水，否则会使原生质体吸水胀破。也不能采用加热形式终止酶解，这样会使得原生质体死亡，无法进行后续实验 三、基因工程 （一）基因文库 借助载体建立基因文库是获取目的基因的一种常用方法。基因文库包括基因组文库和cDNA文库。把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。基因组中所有DNA序列克隆的总汇被称为基因组文库。若只想研究某些编码蛋白质的DNA序列，利用成熟的mRNA可以构建出cDNA文库。其基本方法是从特定的组织或细胞中提取并纯化全部mRNA，然后在逆转录酶等酶的催化下，以mRNA为模板合成互补的DNA，即cDNA。最后借助载体，利用与构建基因组文库相同的方法构建cDNA文库。 将DNA片段分别连接到载体上，然后通过载体分别转入不同的受体细胞，让外源DNA片段分别在各个受体细胞中大量复制（即扩增），会得到跟初始外源DNA相同的大量子代DNA，即克隆。从中找出含有目的基因的细胞，再利用一定方法将目的基因的DNA片段分离出来。该方法通过对受体菌的培养进而储存基因。 1. 构建基因组文库 基因组是指生物体所有遗传物质的总和，包括编码DNA和非编码DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA。 基因组文库是指将某生物的全部基因组DNA用限制酶切割成一定长度的DNA 片段（鸟枪法），再连接到某种载体上而形成的相同DNA集合（鸟枪法：这种方法犹如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来）。 2. 构建cDNA文库 cDNA（complementary DNA）是指互补DNA，从特定的组织或细胞中提取并纯化全部mRNA，然后在逆转录酶等酶的催化下，以mRNA为模板合成互补的DNA，即cDNA。cDNA没有内含子而只有外显子的序列，只包含该生物的部分基因 （二）将目的基因导入植物细胞的方式 1. 农杆菌转化法 根癌农杆菌中含有Ti质粒，其上有一段_T-DNA_，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到到植物染色体DNA中。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过植物组织培养技术，培养出转基因植株。主要侵染_双子叶植物。 2. 基因枪法 基因枪的作用是用压缩气体(氦或氮等)动力产生一种冷的气体冲击波进入轰击室(因此可免遭由“热”气体冲击波引起的细胞损伤)，把吸附有DNA的金属颗粒打向细胞，穿过细胞壁、细胞膜、细胞质等层层构造到达细胞核，整合到植物DNA中表达，甚至可将目的基因导入叶绿体等细胞器中。 3. 花粉管通道法 将重组DNA滴加到植物受粉后形成的花粉管通道内，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，使其进入卵细胞、合子或早期胚胎细胞中，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵或其他细胞的发育而成为带转基因的新个体。该方法直接、简便且经济。 4. 显微注射法 在显微镜下，用一根极细的玻璃针(直径1～2微米)直接将重组DNA注射到_未融合的雄性细胞核内，体外培养一段时间后再把注射过重组DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成转基因幼仔。特点：DNA损失少，无需选择标记基因，整合效率高。不足：仪器设备要求高，操作比较烦琐。 5. 制备感受态细胞 首先用CaCl2溶液处理细胞，以增大细菌细胞膜的通透性，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞_。再在低温条件下将重组DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，促进感受态细胞吸收DNA分子，最后进行短暂的热刺激处理完成转化过程。 6. 电击法 又称电穿孔法，通过短暂的电脉冲在细胞膜上形成纳米级临时性的小孔，DNA由此进入受体细胞。 1. （2026·浙江·高考真题）现代发酵工程已广泛应用于食品、医药等领域。下列叙述错误的是（　　） A．发酵原料无需灭菌处理 B．标准化工艺可控制药品质量 C．常用经选育的优良菌种 D．调控发酵条件可改善食品风味 【答案】A 【详解】A、发酵原料需彻底灭菌（如高压蒸汽灭菌），以消灭杂菌，避免干扰目标菌种代谢或产生有害物质。若原料不灭菌，杂菌繁殖会导致发酵失败，A错误； B、标准化工艺通过控制温度、pH、溶氧量等参数，确保微生物代谢稳定，使药品有效成分含量一致，B正确； C、优良菌种（如高产青霉素的青霉菌）经诱变育种或基因工程改造，可提升产物产量和纯度，是发酵工程的核心要素，C正确； D、调控发酵条件（如乳酸菌发酵的温度、时间）直接影响代谢产物种类（如有机酸、酯类），从而改善酸奶、奶酪等食品的风味和质地，D正确。 故选A。 （2024·浙江·高考真题）阅读下列材料，完成下面小题。 柿子具有较高的营养价值和药用价值。采用液体发酵法可酿制出醋香浓郁、酸味纯正的柿子醋，提高了柿子的经济价值。柿子醋的酿造工艺流程如图所示。 2. 下列关于酒精发酵和醋酸发酵的叙述，错误的是（    ） A．酒精发酵是吸能反应 B．酒精发酵在无氧条件下进行 C．醋酸发酵是放能反应 D．醋酸发酵在有氧条件下进行 3. 下列关于柿子醋酿造过程的叙述，错误的是（    ） A．加酶榨汁环节加入果胶酶，有利于提高柿子汁产量 B．酒精发酵前可对柿子汁进行杀菌，以利于酒精发酵 C．若柿子酒的酒精度过高，应稀释后再用于醋酸发酵 D．用不同品种和成熟度的柿子酿造的柿子醋风味相同 【答案】2．A 3．D 【分析】酒精发酵是利用的酵母菌的无氧呼吸，需要的是无氧条件；醋酸发酵利用的是醋酸菌的有氧呼吸，需要的是有氧条件。 2．A、酒精发酵是利用的酵母菌的无氧呼吸，属于放能反应，A错误； B、酒精发酵是利用的酵母菌的无氧呼吸，需要的是无氧条件，B正确； C、醋酸发酵利用的是醋酸菌的有氧呼吸，属于放能反应，C正确； D、醋酸发酵利用的是醋酸菌的有氧呼吸，需要的是有氧条件，D正确。 故选A。 3．A、加酶榨汁环节加入果胶酶，破坏其细胞壁，有利于提高柿子汁产量，A正确； B、酒精发酵前可以可对柿子汁进行杀菌，再接种酵母菌，以利于酒精发酵，B正确； C、若柿子酒的酒精度过高，应稀释后再用于醋酸发酵，避免浓度过高影响醋酸菌生命活动，C正确； D、用不同品种和成熟度的柿子酿造的柿子醋风味不相同，D错误。 故选D。 （2023·浙江·高考真题）阅读下列材料，完成下面小题。 小曲白酒清香纯正，以大米、大麦、小麦等为原料，以小曲为发酵剂酿造而成。小曲中所含的微生物主要有好氧型微生物霉菌、兼性厌氧型微生物酵母菌，还有乳酸菌、醋酸菌等细菌。酿酒的原理主要是酵母菌在无氧条件下利用葡萄糖发酵产生酒精。传统酿造工艺流程如图所示。 4. 小曲白酒的酿造过程中，酵母菌进行了有氧呼吸和无氧呼吸。关于酵母菌的呼吸作用，下列叙述正确的是（　　） A．有氧呼吸产生的[H]与O2结合，无氧呼吸产生的[H]不与O2结合 B．有氧呼吸在线粒体中进行，无氧呼吸在细胞质基质中进行 C．有氧呼吸有热能的释放，无氧呼吸没有热能的释放 D．有氧呼吸需要酶催化，无氧呼吸不需要酶催化 5. 关于小曲白酒的酿造过程，下列叙述错误的是（　　） A．糖化主要是利用霉菌将淀粉水解为葡萄糖 B．发酵液样品的蒸馏产物有无酒精，可用酸性重铬酸钾溶液检测 C．若酿造过程中酒变酸，则发酵坛密封不严 D．蒸熟并摊晾的原料加入糟醅，立即密封可高效进行酒精发酵 【答案】4．A 5．D 【分析】有氧呼吸的第一、二、三阶段的场所依次是细胞质基质、线粒体基质和线粒体内膜。有氧呼吸第一阶段是葡萄糖分解成丙酮酸和[H]，合成少量ATP；第二阶段是丙酮酸和水反应生成二氧化碳和[H]，合成少量ATP；第三阶段是氧气和[H]反应生成水，合成大量ATP。 4．A、有氧呼吸产生的[H]在第三阶段与O2结合生成水，无氧呼吸产生的[H]不与O2结合，A正确； B、有氧呼吸的第一阶段在细胞质基质中进行，第二和第三阶段分别在线粒体基质和线粒体内膜中进行，无氧呼吸的两个阶段都在细胞质基质中进行，B错误； C、酵母菌有氧呼吸和无氧呼吸过程中释放的能量均大多以热能散失，但无氧呼吸是不彻底的氧化分解过程，大部分能量存留在酒精，C错误； D、有氧呼吸和无氧呼吸过程都需要酶的催化，只是酶的种类不同，D错误。 故选A。 5．A、由于酿酒酵母不能直接利用淀粉发酵产生酒精（乙醇），故糖化过程主要是利用霉菌分泌的淀粉酶将淀粉分解为葡萄糖，以供发酵利用，A正确； B、发酵液样品的蒸馏产物有无酒精，可用酸性重铬酸钾溶液检测，若存在酒精，则酒精与酸性的重铬酸钾反应呈灰绿色，B正确； C、酿造过程中应在无氧条件下进行，若密封不严，会导致醋酸菌在有氧条件下发酵产生醋酸而使酒变酸，C正确； D、蒸熟并摊晾的原料需要冷却后才可加入糟醅，以免杀死菌种，且需要在有氧条件下培养一段时间，让酵母菌大量繁殖，此后再密封进行酒精发酵，D错误。 故选D。 6. （2021·浙江·高考真题）用白萝卜制作泡菜的过程中，采用适当方法可缩短腌制时间。下列方法中错误的是（　　） A．将白萝卜切成小块 B．向容器中通入无菌空气 C．添加已经腌制过的泡菜汁 D．用沸水短时处理白萝卜块 【答案】B 【分析】1、泡菜腌制过程中起作用的主要是假丝酵母和乳酸菌，在无氧条件下乳酸菌无氧呼吸产生乳酸。 2、泡菜的制作流程是：选择和处理原料、洗净泡菜坛、调味装坛、密封发酵。 【详解】A、将白萝卜切成小块可以扩大白萝卜与腌料的接触面积，缩短腌制时间，A正确； B、泡菜制作所需菌种为乳酸菌，制作过程中应保持无氧环境，向容器中通入无菌空气不利于腌制，B错误； C、泡菜汁中含有一定量的发酵菌种，所以在腌制过程中，加入一些已经腌制过泡菜汁可缩短腌制时间，C正确； D、用沸水短时处理，可抑制某些微生物的繁殖，提高泡菜品质，也可缩短腌制时间，D正确。 故选B。 7. （2025·浙江·高考真题）某研究小组进行微型月季的快速繁殖研究，结果如表所示。 流程 最佳措施或最适培养基 ①外植体腋芽消毒 75%乙醇浸泡30s+5%NaClO浸泡6min ②诱导出丛生苗 MS+3.0mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA ③丛生苗的扩增 MS+2.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA ④丛生苗的生根 1/2MS+0.25mg·L-1IBA+0.25mg·L-1NAA 注：丛生苗为丛状生长的幼苗，IBA（吲哚丁酸）为生长素类物质 下列叙述正确的是（    ） A．流程①的效果取决于消毒剂浓度 B．流程②不需要经过脱分化形成愈伤组织的阶段 C．与流程②相比，流程③培养基中细胞分裂素类与生长素类物质的比值更大 D．与流程③相比，提高流程④培养基的盐浓度有利于丛生苗的生根 【答案】B 【分析】植物组织培养过程中，激素的比例影响其分化的方向，当细胞分裂素与生长素比例相当时，产生愈伤组织，生长素浓度较高时，诱导根的形成，细胞分裂素浓度较高时，诱导芽的形成。 【详解】A、流程①中，消毒效果不仅取决于消毒剂浓度，还取决于消毒时间和消毒剂种类，A错误； B、流程②不需要经过脱分化形成愈伤组织的阶段，直接经腋芽直接分化为丛生苗，B正确； C、与流程②相比，流程③培养基中细胞分裂素类与生长素类物质的比值小，C错误； D、与流程③相比，提高流程④培养基的IBA浓度有利于丛生苗的生根，D错误。 故选B。 8. （2025·浙江·高考真题）科研人员研究某种红豆杉的细胞悬浮培养和原生质体培养方式对合成紫杉醇的影响，甲组为细胞悬浮培养，乙组为原生质体的液体静置培养，丙组为琼脂糖包埋后的原生质体悬浮培养。三组的培养基相同，其中乙、丙两组另加细胞壁合成抑制剂等。结果如图所示。 下列叙述正确的是（　　） A．比较甲和丙，丙组的培养方式有利于原生质体的增殖，从而提高紫杉醇总产量 B．比较乙和丙，丙组的培养方式有利于应用到发酵罐进行紫杉醇的生产 C．丙组中琼脂糖凝胶的作用是持续为原生质体供应碳源 D．上述实验表明细胞壁完整有助于紫杉醇在细胞内的合成与积累 【答案】B 【详解】A、题干体现的是紫杉醇含量，没有体现对细胞增殖的影响，A错误； B、丙组的胞外紫杉醇浓度比乙组高，这意味着丙组的培养方式能更多地产生可提取的紫杉醇，有利于用发酵罐进行紫杉醇的生产，B正确； C、琼脂糖的作用是为细胞提供支撑和固定，它不能为细胞提供碳源，C错误； D、甲组细胞有细胞壁，不过从紫杉醇合成量来看，甲组低于乙组和丙组，D错误。 故选B。 9. （2022·浙江·高考真题）农作物秸秆的回收利用方式很多，其中之一是将秸秆碎化后作为食用菌的栽培基质。碎化秸秆中纤维所起的作用，相当于植物组织培养中固体培养基的（    ） A．琼脂+蔗糖 B．蔗糖+激素 C．激素+无机盐 D．无机盐+琼脂 【答案】A 【分析】植物组织培养基的主要成分是无机营养物（主要由大量元素和微量元素两部分组成）、有机物（维生素、蔗糖、琼脂等）和生长调节物质（植物生长素类、细胞分裂素、赤霉素等）。培养基中的碳水化合物通常是蔗糖，作为培养基内的碳源和能源外，对维持培养基的渗透压也起重要作用。培养基中添加了琼脂，主要是作为培养基的支持物，使培养基呈固体状态，而成为固体培养基。 秸秆是食用菌栽培的主要基质,其中的纤维素和木质素在食用菌菌丝生长过程中大量降解,秸秆栽培食用菌是秸秆利用的最佳途径。 【详解】据题干的信息，“秸秆碎化后作为食用菌的栽培基质”，秸秆中的纤维素在食用菌菌丝生长过程中大量降解，提供碳源和能源，这相当于植物组织培养基中添加的蔗糖；秸秆中的纤维素是固体，可以作为培养基的支持物，使培养基呈固体状态，这相当于植物组织培养基中添加的琼脂。 故选A。 【点睛】本题主要考查植物组织培养的相关知识，意在考查考生对所学知识的识记和辨析的能力。 10. （2026·浙江·高考真题）为探究不同环境因素对光合作用的影响，某同学选择金鱼藻、冰块、溶液、台灯、烧杯、氧传感器、米尺等材料和用具进行实验。下列叙述错误的是（　　） A．可探究的环境因素有光照强度、温度、浓度等 B．实验中可用单位时间的释放量表示光合速率 C．将室温下的实验装置移至冰水中，光合速率持续上升 D．可通过调节台灯与烧杯之间的距离来改变光照强度 【答案】C 【详解】A、实验材料中台灯（调节光照强度）、冰块（调节温度）、NaHCO₃溶液（提供CO₂），可探究光照强度、温度、CO₂浓度等环境因素，A正确； B、氧传感器直接检测O₂释放量，单位时间内O₂释放量可反映净光合速率，B正确； C、冰水使温度骤降，酶活性降低，光反应和暗反应速率均下降，光合速率不会持续上升（实际下降），C错误； D、光照强度与光源距离呈反比，调节台灯与烧杯距离可改变光照强度，D正确。 故选C。 11. （2024·浙江·高考真题）某动物细胞培养过程中，细胞贴壁生长至接触抑制时，需分装培养，实验操作过程如图。 下列叙述错误的是（    ） A．①加消化液的目的是使细胞与瓶壁分离 B．②加培养液的目的是促进细胞增殖 C．③分装时需调整到合适的细胞密度 D．整个过程需要在无菌、无毒条件下进行 【答案】B 【分析】动物细胞培养条件：（1）无菌、无毒的环境：①消毒、灭菌；②添加一定量的抗生素；③定期更换培养液，以清除代谢废物。（2）营养物质：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然物质。（3）温度和PH：36.5℃±0.5℃；适宜的pH：7.2～7.4。（4）气体环境：95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO2（维持培养液的PH）。 【详解】A、①加消化液的目的是使细胞与瓶壁分离，A正确； B、②加培养液，多次加培养液先洗去残留的消化酶，然后终止消化液的消化作用，并对细胞加以稀释，B错误； C、③分装时需调整到合适的细胞密度，因为若密度过大细胞直接仍存在接触抑制，C正确； D、动物细胞培养需要无菌无毒环境，因此整个过程需要在无菌、无毒条件下进行，D正确。 故选B。 12. （2023·浙江·高考真题）在家畜优良品种培育过程中常涉及胚胎工程的相关技术。下列叙述错误的是（    ） A．经获能处理的精子才能用于体外受精 B．受精卵经体外培养可获得早期胚胎 C．胚胎分割技术提高了移植胚胎的成活率 D．胚胎移植前需对受体进行选择和处理 【答案】C 【分析】胚胎移植的基本程序主要包括：①对供、受体的选择和处理（选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体，用激素进行同期发情处理，用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理）；②配种或人工授精；③对胚胎的收集、检查、培养或保存（对胚胎进行质量检查，此时的胚胎应发育到桑葚胚或囊胚阶段）；④对胚胎进行移植；⑤移植后的检查。 【详解】A、精子需要经过获能处理才具有受精能力，A正确； B、受精卵经体外培养可获得早期胚胎，B正确； C、胚胎分割可以获得多个胚胎，分割次数越多，分割后胚胎成活的概率越小，C错误； D、胚胎移植前，需选择健康体质和正常繁殖能力的受体且进行同期发情处理，D正确。 故选C。 13. （2026·浙江·高考真题）利用转基因技术将口蹄疫病毒衣壳蛋白P1的基因导入水稻愈伤组织，获得了多个稳定表达P1的转基因水稻株系。转基因水稻的P1激活小鼠免疫反应的能力与大肠杆菌生产的P1相当，且给小鼠饲喂转基因水稻的P1也能激活免疫反应。下列叙述正确的是（　　） A．将愈伤组织进行脱分化和再分化，获得转基因水稻植株 B．不同株系转基因水稻P1蛋白的基因表达水平相同 C．转基因水稻与大肠杆菌生产的P1蛋白分子量相等 D．转基因水稻P1蛋白具备制成口服疫苗的潜力 【答案】D 【详解】A、水稻愈伤组织是已经完成脱分化的产物，要获得转基因水稻植株，只需对愈伤组织进行再分化（不需要再次脱分化）。植物组织培养的流程是：外植体→脱分化→愈伤组织→再分化→完整植株，A错误； B、转基因过程中，外源基因（P1基因）插入水稻染色体的位置是随机的（位置效应），不同株系的基因表达水平通常存在差异，B错误； C、水稻是真核生物，其细胞内的内质网和高尔基体可对表达的P1蛋白进行糖基化等修饰；而大肠杆菌是原核生物，缺乏这些细胞器，无法对蛋白质进行类似修饰。因此两者生产的P1蛋白分子量可能不同，C错误； D、题目明确指出“给小鼠饲喂转基因水稻的P1也能激活免疫反应”，说明口服P1蛋白可被小鼠免疫系统识别并引发免疫应答，具备制成口服疫苗的潜力，D正确。 故选D。 14. （2024·浙江·高考真题）植物体在干旱、虫害或微生物侵害等胁迫过程中会产生防御物质，这类物质属于次生代谢产物。次生代谢产物在植物抗虫、抗病等方面发挥作用，也是药物、香料和色素等的重要来源。次生代谢产物X的研发流程如下： 筛选高产细胞→细胞生长和产物X合成关系的确定→发酵生产X 回答下列问题： (1)获得高产细胞时，以X含量高的植物品种的器官和组织作为_____，经脱分化形成愈伤组织，然后通过液体振荡和用一定孔径的筛网进行_____获得分散的单细胞。 (2)对分离获得的单细胞进行_____培养，并通过添加_____或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。为进一步提高目标细胞的X含量，将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，该过程模拟了_____的胁迫。 (3)在大规模培养高产细胞前，需了解植物细胞生长和产物合成的关系。培养细胞生产次生代谢产物的模型分为3种，如图所示。若X只在细胞生长停止后才能合成，则X的合成符合图_____（填“甲”“乙”“丙”），根据该图所示的关系，从培养阶段及其目标角度，提出获得大量X的方法。_____ (4)多种次生代谢产物在根部合成与积累，如人参、三叶青等药用植物，可通过_____培养替代细胞悬浮培养生产次生代谢产物。随着基因组测序和功能基因组学的发展，在全面了解生物体合成某次生代谢产物的_____和_____的基础上，可利用合成生物学的方法改造酵母菌等微生物，利用_____工程生产植物的次生代谢产物。 【答案】(1) 外植体 过滤 (2) 克隆 DNA合成抑制剂 微生物侵害 (3) 丙 先培养大量细胞，改变条件使细胞停止生长，大量产生X (4) 器官 代谢途径 关键酶 发酵 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群 细胞在外源激素或某些化学物质作用下，或营养缺乏时会停止在细胞周期的特定时期 分离获得的单细胞进行克隆培养，并通过添加DNA合成抑制剂，处于S期的细胞立刻被抑制，洗去TdR后可恢复正常分裂，而处于其它时期的细胞不受过量TdR影响）或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群 X只在细胞生长停止后才能合成 观察图形 丙图细胞停止生长后，次生代谢产物才大量增加，符合X的合成特点 （2）逻辑推理与论证： 【详解】（1）植物体的器官和组织、细胞都可以作为外植体，经脱分化形成愈伤组织，将愈伤组织进行振荡培养，使其分散成小的细胞团或单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大的细胞团和残渣，离心除去小的残渣，得到单细胞悬浮液。 （2）分离获得的单细胞进行克隆培养，并通过添加DNA合成抑制剂，处于S期的细胞立刻被抑制，洗去TdR后可恢复正常分裂，而处于其它时期的细胞不受过量TdR影响）或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，模拟了微生物侵害的迫害条件。 （3）由题可知X只在细胞生长停止后才能合成，所以丙图符合。所以要获得大量X的方法，是先培养大量细胞，改变条件使细胞停止生长，大量产生X。 （4）由题知，多种次生代谢产物在根部合成与积累，所以要对根进行培养，为了方便进行次生代谢物的收集，可以通过器官培养替代细胞悬浮培养生产次生代谢产物。要大量获得次生代谢物可以通过基因工程，将相关基因转入酵母菌体内，然后通过发酵工程获得，基因工程的前提是要了解生物体合成某次生代谢产物的代谢途径和关键酶。 15. （2022·浙江·高考真题）回答下列（一）、（二）小题： （一）红曲霉合成的红曲色素是可食用的天然色素，具有防腐、降脂等功能。研究者进行了红曲色素的提取及红色素的含量测定实验，流程如下： (1)取红曲霉菌种斜面，加适量____________洗下菌苔，制成菌悬液并培养，解除休眠获得____________菌种。经液体发酵，收集红曲霉菌丝体，红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、____________，获得的上清液即为红曲色素提取液。为进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行____________处理。 (2)红曲色素包括红色素、黄色素和橙黄色素等，红色素在390nm、420nm和505nm波长处均有较大吸收峰。用光电比色法测定红曲色素提取液甲的红色素含量时，通常选用505nm波长测定的原因是____________。测定时需用____________作空白对照。 (3)生产上提取红曲色素后的残渣，经__________处理后作为饲料添加剂或有机肥，这属于废弃物的无害化和__________处理。 （二）我国在新冠疫情方面取得了显著的成效，但全球疫情形势仍然非常严峻、尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。 (4)新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用__________酶合成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的__________，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。 (5)接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的__________基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的____________。将腺病毒复制基因敲除的目的是____________。 (6)单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的____________细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和____________。 【答案】(1) 无菌水 活化 离心 破碎 (2) 其它色素对该波长光的吸收相对较少，干扰相对较小 70%乙醇溶液 (3) 灭菌 资源化 (4) 逆转录 核酸探针 (5) 抗原 载体 使腺病毒失去复制能力 (6) 脾 动物血清 【分析】1、无菌操作包括灭菌和消毒两种方式。消毒的方法有巴氏消毒法、酒精消毒、煮沸消毒法；灭菌的方法有干热灭菌、灼烧灭菌和高压蒸汽灭菌。2、微生物接种：微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，常用来统计样品活菌数目的方法是稀释涂布平板法。3、平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。 【详解】（1）防止污染，洗菌苔可加适量的无菌水，制成菌悬液并培养，解除休眠获得活化菌种。红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、离心，获得的上清液即为红曲色素提取液。为进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行破碎处理，使细胞内的红曲色素释放出来。 （2）用光电比色法测定红曲色素提取液甲的红色素含量时，通常选用505nm波长测定的原因是其它色素对该波长光的吸收相对较少，干扰相对较小。由于提取红曲色素是用的70%乙醇溶液，故测定时需用70%乙醇溶液作空白对照。 （3）生产上提取红曲色素后的残渣，经灭菌处理残渣后，作为饲料添加剂或有机肥，这属于废弃物的无害化和资源化处理。 （4）RNA做模板合成DNA，利用逆转录酶；PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的核酸探针，检测新冠病毒核酸。如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。 （5）腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的抗原基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的载体。将腺病毒复制基因敲除的目的是使腺病毒失去复制能力。 （6）单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和动物血清。 【点睛】本题考查微生物的分离与培养等相关知识，要求考生识记培养基的成分、无菌技术、微生物分离的过程，能正确理解图形和表格中隐含的知识和结论。 16. （2026·浙江·高考真题）农杆菌能侵染真菌，介导真菌细胞的转基因。3-磷酸甘油脱氢酶是假丝酵母中甘油合成代谢途径的关键酶，将3-磷酸甘油脱氢酶基因（Gpd）构建到表达载体上，如图1所示。通过农杆菌介导法，转化假丝酵母野生型菌株，获得转Gpd的重组菌株。野生型菌株与某重组菌株分别进行发酵实验，生产甘油的结果如图2所示。 注：ZeoR是腐草霉素抗性基因，KanR是卡那霉素抗性基因 回答下列问题： (1)表达载体导入农杆菌细胞：用溶液处理农杆菌，制备________，再用电击法将表达载体导入农杆菌细胞，经筛选获得阳性克隆。为验证阳性克隆是否为转化成功的农杆菌，从繁殖后的菌株细胞中提取质粒，经________限制酶酶切后电泳，若出现4条DNA条带，则表明转化成功。 (2)假丝酵母重组菌株的获得：在________中的酒精灯火焰旁，取野生型假丝酵母菌种，采用________方法接种在固体培养基上培养，适时挑选________再接种到液体培养基进行培养。取适量的假丝酵母与农杆菌进行共培养一段时间后，杀灭农杆菌，然后在含有________的选择培养基中筛选，最终获得重组菌株。 (3)重组菌株生产甘油能力的分析：根据图2可知，与野生型菌株相比，该重组菌株用于发酵生产甘油的2个优点是________。若某生长正常的重组菌株发酵液中甘油的含量显著低于野生型菌株，从引起变异的因素分析，可能的原因有：在培养过程中重组菌株发生了突变，或________，导致甘油合成代谢受阻。 【答案】(1) 感受态细胞/可导入外源DNA分子的农杆菌 EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ (2) 超净工作台/无菌实验室/灭菌的操作台 （平板）划线法/稀释涂布平板法 单菌落 腐草霉素 (3) 提高发酵液中甘油的含量；缩短发酵时间 T-DNA的插入导致重组菌株发生了变异 【分析】将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 【详解】（1）用CaCl₂溶液处理农杆菌，目的是制备感受态细胞（可导入外源DNA分子的农杆菌）。感受态细胞是指处于能吸收周围环境中DNA分子状态的细胞，这种处理会使农杆菌细胞膜通透性增加，便于外源表达载体的导入。 从图1可知，质粒上有两个Hind Ⅲ酶切位点和两个EcoR Ⅰ酶切位点。 用这两种酶同时酶切，会将质粒切成4个大小不同的片段，电泳后就会出现4条 DNA 条带，以此证明农杆菌成功导入了重组质粒。 （2）为了营造一个无菌环境，避免杂菌污染实验材料，微生物接种应在超净工作台（或无菌实验室或灭菌的操作台）的酒精灯火焰旁进行。平板划线法和稀释涂布平板法是常用的微生物接种方法，这两种方法都可以将菌种分散，最终获得单菌落。单菌落是由单个细胞繁殖而来的，能保证后续培养的菌株遗传背景一致。质粒的 T-DNA区域带有腐草霉素抗性基因（Zeoᴿ）。当农杆菌将T-DNA 整合到假丝酵母基因组后，只有成功导入该基因的重组酵母才能在含有腐草霉素的选择培养基上存活，从而筛选出重组菌株。 （3）从图2的曲线对比可以看出：重组菌株的发酵液中甘油峰值明显高于野生型菌株；重组菌株的甘油含量上升速度更快，能在更短时间内达到产量高峰。若重组菌株甘油含量显著低于野生型，除了基因突变外，还可能是T-DNA 插入导致重组菌株发生了变异，破坏了假丝酵母自身甘油合成关键基因的功能。 17. （2024·浙江·高考真题）小鼠毛囊中表达F蛋白。为研究F蛋白在毛发生长中的作用，利用基因工程技术获得了F基因敲除的突变型纯合体小鼠，简称f小鼠，突变基因用f表示。f小鼠皮毛比野生型小鼠长50%，表现出毛绒绒的样子，其它表型正常。（注：野生型基因用++表示；f杂合子基因型用+f表示） 回答下列问题： (1)F基因敲除方案如图甲。在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生______，导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质因为缺失了______而丧失活性。要达到此目的，还可以对该基因的特定碱基进行______和______。 (2)从野生型、f杂合子和f小鼠组织中分别提取DNA，用限制酶HindⅢ酶切，进行琼脂糖电泳，用DNA探针检测。探针的结合位置如图甲，检测结果如图乙，则f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第______泳道和第______泳道。 (3)g小鼠是长毛隐性突变体（gg），表型与f小鼠相同。f基因和g基因位于同一条常染色体上。f杂合子小鼠与g小鼠杂交，若杂交结果是______，则g和f是非等位基因；若杂交结果是______，则g和f是等位基因。（注：不考虑交叉互换；野生型基因用++表示；g杂合子基因型用+g表示） (4)确定g和f为等位基因后，为进一步鉴定g基因，分别提取野生型（++）、g杂合子（+g）和g小鼠（gg）的mRNA，反转录为cDNA后用（2）小题同样的DNA探针和方法检测，结果如图丙。g小鼠泳道没有条带的原因是______。组织学检查发现野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，因此推测F蛋白具有的作用______。 【答案】(1) 编码序列错位 氨基酸序列 替换 缺失 (2) 3 2 (3) 子代全为野生型 野生型：突变型=1：1 (4) 基因突变丢失了启动子，导致无法转录出 mRNA；反转录没有产物，检测不出结果 抑制毛发生长 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 mRNA提前出现终止密码子 基因突变对性状的影响 基因的编码区插入DNA片段，引起基因产生编码序列错位，导致mRNA提前出现终止密码子，合成的蛋白质中氨基酸序列变短，蛋白质结构发生改变，结构决定功能，导致合成的蛋白质丧失活性 DNA片段位置判断 PCR及电泳 野生型基因切出来能与探针结合的片段较短，f基因切出来能与探针结合的片段较长，DNA分子越长，分子质量越大，在电泳时迁移速度越慢 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）依据题意，在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生编码序列错位，从而导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质中氨基酸序列变短，蛋白质结构发生改变，结构决定功能，导致合成的蛋白质丧失活性。该基因突变是插入一个DNA片段引起的，除此之外，还可以缺失或者替换基因中的碱基，从而导致基因突变。 （2）从图中看出，野生型基因和f基因都含有2个限制酶HindⅢ的识别序列，但f基因中含有P片段，因此限制酶HindⅢ切割野生型基因和f基因后，野生型基因切出来能与探针结合的片段较短，f基因切出来能与探针结合的片段较长，DNA分子越长，分子质量越大，在电泳时迁移速度越慢，因此推测第1泳道中只有野生型基因，第2泳道中既有野生型基因，又有f基因，第3泳道中只有f基因，因此f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第3泳道和第2泳道。 （3）据题意可知，野生型基因用++表示，g小鼠是长毛隐性突变体，基因型用gg表示，f杂合子小鼠基因型用+f表示，f基因和g基因位于同一条常染色体上，如果g和f是非等位基因，f杂合子小鼠（+f/++）与g小鼠（++/gg）杂交，后代为++/+g和+f/+g，全是野生型；如果g和f是等位基因，f杂合子小鼠（+f）与g小鼠（gg）杂交，后代为+g：fg=1：1，即野生型与突变型比例为1：1。 （4）据图可知，野生型基因突变成g基因以后，启动子随着一部分DNA片段丢失，无法转录出 mRNA，也无法形成cDNA，PCR时缺少模板，反转录没有产物，导致最终无结果，因此g小鼠泳道没有条带。g小鼠表型与f小鼠相同，表现出毛绒绒的样子，野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，即没有F蛋白，表现出长毛，说明F蛋白在毛发生长中起抑制作用。 18. （2023·浙江·高考真题）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题： (1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于______。根据这种调节方式，在培养基中添加______，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。 (2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为： ①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通过检索______获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。 ②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF膜发生______，表达载体最终进入细胞核，发生转化。 ③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为______。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了______重组细胞发育的作用。 ④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至______，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。 ⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以______为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行______处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为______，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？______。 【答案】(1) 负反馈调节 过量赖氨酸类似物 (2) 基因数据库 融合 核受体细胞 激活 桑椹胚或囊胚 转基因BEF DNA酶 PCR的模板 构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。 【分析】负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。基因工程技术的基本步骤：(1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；(2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样.将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；(4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交技术.个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于负反馈调节。如果想得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体可在培养基中添加过量赖氨酸类似物。 （2）①从基因数据库获取获取目的基因编码序列，用化学合成法制备可得到目的基因。 ②表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，根据细胞膜成分，其与BEF膜发生融合。 ③去核的卵母细胞作为受体细胞，其处于减数第二次分裂中期，因为卵母细胞中含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了激活重组细胞发育的作用。 ④胚胎发育到适宜阶段可取出向受体移植。牛、羊一般要培养到桑椹胚或囊胚阶段；植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。 ⑤阳性对照：按照当前实验方案一定能得到正面预期结果的对照实验。阳性对照是已知的对测量结果有影响的因素，目的是确定实验程序无误。阴性对照和阳性对照相反，按照当前的实验方案一定不能得到正面预期结果的对照实验。排除未知变量对实验产生的不利影响。本实验以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，为了检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。应该以含有目的基因的牛耳组织细胞为阳性对照。为了除去DNA污染，可以使用DNA酶使其水解。经逆转录形成cDNA，并以此为PCR的模板进行扩增。目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。 19. （2025·浙江·高考真题）某同学欲开展小鼠的排卵、受精以及观察受精卵发育的实验，其基本过程如下。 (1)制备垂体细胞提取液：取小鼠的垂体，加入少量的培养液，剪碎，___________，经处理制成垂体细胞悬液。取垂体细胞悬液，___________，制成某一浓度的垂体细胞悬液。将垂体细胞培养一段时间后，破碎，___________，取上清液，经处理获得提取液。 (2)采集精子：将人工采集的精子置于培养液中，培养一段时间。此过程可使精子获得___________。 (3)采集卵细胞：给成年雌鼠注射垂体细胞提取液，一段时间后，采集卵子。注射垂体细胞提取液可促进雌鼠排卵的原因是 ___________。 (4)受精：将精子和卵细胞混合培养。精子入卵后，会使卵子完成减数第二次分裂，排出________，形成雌原核。 (5)观察受精卵的发育：受精卵开始卵裂，其中的细胞体积___________，细胞数量增加，但胚胎的总体积变化 ___________。结果表明这一阶段胚胎细胞的细胞周期中，显著缩短的时期是___________。 【答案】(1) 用胰蛋白酶消化 用血细胞计数板在显微镜下计数，用培养液稀释 离心 (2)受精能力 (3)提取液中含有促性腺激素 (4)第二极体 (5) 变小 不明显 间期 【分析】动物体外受精是指精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，是胚胎工程的核心技术之一，主要应用于家畜繁育、辅助生殖（如人类试管婴儿）及濒危动物保护等领域。 【详解】（1）在制备细胞悬液时，剪碎组织后通常需要用胰蛋白酶消化，以分散细胞。因为胰蛋白酶可以分解细胞间的蛋白质成分，使细胞相互分离。 要制成某一浓度的垂体细胞悬液，在取垂体细胞悬液后，用血细胞计数板在显微镜下计数，稀释。将垂体细胞培养一段时间后破碎，为了获得细胞内的物质（提取液的有效成分），需要进行离心操作，离心后细胞碎片等杂质会沉淀在底部，而上清液中含有我们需要的物质。 （2）在体外受精过程中，将人工采集的精子置于培养液中培养一段时间，此过程可使精子获得获能。精子获能后才具备与卵子受精的能力。 （3）提取液中含有促性腺激素，能作用于雌鼠的卵巢，促进卵泡发育和成熟，从而促使雌鼠排卵。 （4）卵子在体外培养至减数第二次分裂中期（MⅡ 期）时具备受精能力，此时细胞内存在一个第二极体（减数第一次分裂产生第一极体后，次级卵母细胞停滞在 MⅡ 期）。当精子成功入卵后，会激活卵子完成减数第二次分裂，最终排出第二极体，剩余的细胞核则形成雌原核。 （5）受精卵进行的早期分裂称为卵裂，其特点是：细胞持续进行有丝分裂，但分裂过程中不伴随细胞生长（或生长极短）。因此： 每次分裂后，子细胞的体积会逐渐变小（因细胞质被平均分配，且无明显物质积累）； 尽管细胞数量不断增加，但胚胎的总体积基本不变或略有缩小（不会随细胞数增多而明显增大）。 细胞周期包括分裂间期（G₁期、S期、G₂期，占时较长）和分裂期（M期，占时较短）。卵裂阶段胚胎细胞需快速增殖以增加细胞数量，核心是缩短细胞周期时长。由于S期（DNA复制期）和M期（染色体分离期）的生理过程相对固定，难以大幅缩短，因此主要通过缩短分裂间期的（尤其是 G₁期，为DNA复制作准备的时期）来实现快速分裂。 20. （2024·浙江·高考真题）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题： (1)锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物______为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内______的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含______而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会______。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。 (2)重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用______连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是______。 (3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行______培养，活化后接种至液体培养基，采用______以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。 (4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用______法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为______。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是______，依据是______。 注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。 【答案】(1) 根 解旋酶 磷酸基团 变长 (2) DNA连接酶 热变性使大肠杆菌内的DNA外溢 (3) 划线分离 振荡培养 (4) 梯度稀释 锌吸收缺陷型酵母+空载体 N 转入N基因的这组酵母菌数量多 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 锌转运蛋白基因M、N克隆 PCR技术扩增目的基因 PCR的原理是DNA分子的复制，包括变性、复性、延伸过程，变性过程类似于体内的解旋酶解旋的过程，利用高温将双链DNA解开 重组表达载体构建 基因表达载体的构建过程 利用限制性内切酶处理后的质粒和目的基因具有黏性末端或者平末端，用DNA连接酶进行连接 转基因酵母功能鉴定 目的基因的检测与鉴定 检测目的基因，需要区分出空白的受体细胞、导入目的基因的受体细胞和导入空白载体的受体细胞 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）由题意可知，锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，所以以该植物的根为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。热变性处理的目的是使DNA解螺旋，相当于生物体内解旋酶的效果。DNA分子因为含有磷酸基团而带负电荷，所以其点样孔端应靠近电泳槽负极接口。随着时间的推移，不同分子量的DNA分子速度不同，时间越长，距离差越大。 （2）内切酶处理后的质粒和目的基因，用DNA连接酶进行连接。由于PCR过程中热变性使大肠杆菌内的DNA外溢，所以可用大肠杆菌悬液当模板，利用PCR快速验证重组转化是否成功。 （3）冻存的酵母菌浓度较高，必须稀释后涂布，也可直接在固体培养基上划线接种后进行培养，进行活化，然后转至液体培养基增殖，培养过程中进行震荡，有利于增加培养液的溶氧量和使酵母菌和培养液充分接触，从而快速增殖。 （4）由题意可知，菌液稀释后OD600为0.06、0.006和0.0006，说明其进行10指数的梯度稀释。由图可知，锌吸收缺陷型酵母+空载体组不会吸收锌，为阴性对照。由图中光谱吸收值可知，转入N基因的这组酵母菌数量多，说明N转运Zn2+能力更强。 题型01 无菌技术及分离纯化操作 1. （2021·浙江·高考真题）下列关于原生质体和细胞计数的叙述，错误的是（　　） A．测定植物原生质体的密度时，可用血细胞计数板 B．红墨水不能进入活细胞，可用于检测细胞的存活状态并计数 C．涂布分离法和划线分离法均能得到单菌落，都可用于细胞计数 D．酵母菌在液体培养基中培养一段时间后，可用比浊计测定其密度 【答案】C 【分析】微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在划线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。其中稀释涂布平板法可以用来进行微生物的计数，而平板划线法不能。 【详解】A、可用血细胞计数板对原生质体进行计数，一般计数总数不少于300个细胞，A正确； B、活细胞的细胞膜具有选择透过性，红墨水中的色素分子不能透过细胞膜，当细胞死亡后，细胞膜失去选择透过性，红墨水中的色素分子能进入细胞，所以可用红墨水检测细胞的存活状态并计数，B正确； C、划线分离法不能用于细胞计数，C错误； D、酵母细胞的密度与浑浊度指标存在一定的数量关系，所以酵母菌在液体培养基中培养一段时间后，可用比浊计测定其密度，D正确。 故选C。 2. ．（2024·湖南·高考真题）微生物平板划线和培养的具体操作如图所示，下列操作正确的是（　　） A．①②⑤⑥ B．③④⑥⑦ C．①②⑦⑧ D．①③④⑤ 【答案】D 【分析】微生物平板划线和培养的过程中要保证始终没有杂菌的污染，接种环、培养基、试管等都需要进行灭菌，实验操作过程应该在酒精灯火焰旁进行。 【详解】由图可知，②中拔出棉塞后应握住棉塞上部；⑥中划线时不能将培养皿的皿盖完全拿开，应只打开一条缝隙；⑦中划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连；⑧中平板应倒置培养。 ①③④⑤正确，故选D。 3. （2022·浙江·高考真题）回答下列（一）、（二）小题： （一）回答与产淀粉酶的枯草杆菌育种有关的问题： (1)为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用___________制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的___________中保温一段时间，其目的是___________。 (2)为提高筛选效率，可将菌种的___________过程与菌种的产酶性能测定一起进行：将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，采用___________显色方法，根据透明圈与菌落直径比值的大小，可粗略估计出菌株是否产酶及产酶性能。 (3)为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过___________后再筛选获得，或利用转基因、___________等技术获得。 （二）回答与植物转基因和植物克隆有关的问题： (4)在用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制___________生长，二是筛选转化细胞。当选择培养基中抗生素浓度___________时，通常会出现较多假阳性植株，因此在转基因前需要对受体进行抗生素的___________检测。 (5)为提高培育转基因植株的成功率，植物转基因受体需具有较强的___________能力和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞内___________形态是否改变进行判断，也可通过观察分裂期染色体的___________，分析染色体组型是否改变进行判断。 (6)植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和___________长短等有关。同时也与受体的取材有关，其中受体为___________时全能性表达能力最高。 【答案】(1) 无菌水 水浴 杀死不耐热微生物 (2) 分离 KI-I2 (3) 人工诱变 原生质体融合 (4) 农杆菌 过低 敏感性 (5) 再生 细胞核 形态特征和数量 (6) 培养时间 受精卵 【分析】（一）选择培养基是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选率。 （二）农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。转化过程：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。 【详解】（1）产生淀粉酶的枯草杆菌的最适温度为50-75℃，要快速分离枯草杆菌，先将土样加入无菌水制成枯草杆菌悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的水浴中保温一段时间，杀死不耐热的微生物。 （2）将菌种的分离过程与菌种的产酶性能测定同时进行可以提高筛选效率。用稀释涂布平板法可以分离枯草杆菌，在培养基中添加淀粉作为唯一碳源，并且在培养基中添加KI-I2，能合成淀粉酶的枯草杆菌因为能利用淀粉而存活，同时淀粉由于被分解在菌落周围会出现透明圈，比较透明圈与菌落直径比值的大小，比值大的说明该菌株产酶性能较高。 （3）要获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用诱变育种，由于变异的不定向性，人工诱变后还需要再筛选才能获得高产淀粉酶的枯草杆菌。也可以利用转基因、原生质体融合等技术，从其他生物那里获得与高产淀粉酶有关的基因，进而获得相应的高产性状。 （4）野生的农杆菌没有抗性基因，用于转化植物细胞的农杆菌一般在其T—DNA中插入一种抗生素抗性基因。抗生素的作用是抑制细菌生长，农杆菌属于细菌，在其侵染植物过程中，可以用另一种抗生素抑制农杆菌的生长，从而达到在后续实验中消除转化植物细胞中农杆菌的作用。具有T-DNA中抗性基因的细胞能在含有相应抗生素的培养基上存活。当培养基中抗生素浓度过低时，很多没有抗性的细胞也存活下来，因此出现假阳性，故在转基因前要对受体进行抗生素的敏感性检测。 （5）转基因植株要经过植物组织培育，要提高培育转基因植株的成功率，应该选再生能力和遗传稳定性较强的受体，这种受体全能性较高，能保持生物的性状。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞核形态是否改变进行判断，也可以直接在光学显微镜下观察分裂期染色体的形态特征和数量，分析染色体组型是否改变。 （6）植物转基因受体全能性表达程度高低除了与受体基因型、培养环境、继代次数有关外，还与培养时间长短和受体的取材有关，受精卵是没分化的细胞，分裂和分化能力都很强，故受体为受精卵时全能性表达能力最高。 题型02 发酵工程 4. （2025·浙江·高考真题）猕猴桃醋生产的基本工艺流程如下，其中①②③表示发酵的三个环节，糖化是将淀粉转化为葡萄糖的过程。 下列叙述错误的是（　　） A．通过蒸煮可以杀灭猕猴桃自带的绝大多数微生物 B．麸曲中曲霉的主要作用是对糖类进行氧化分解 C．环节③需要通入无菌空气 D．①②③都需要控制温度、pH 等条件 【答案】B 【详解】A、蒸煮过程中高温可以破坏微生物的细胞结构等，从而杀灭猕猴桃自带的绝大多数微生物，A正确； B、麸曲中的曲霉主要作用是将淀粉等多糖分解为葡萄糖等单糖，而不是对糖类进行氧化分解，B错误； C、环节③是醋酸发酵，醋酸菌是好氧菌，所以需要通入无菌空气，C正确； D、①糖化过程、②酒精发酵、③醋酸发酵都需要适宜的温度和pH等条件来保证微生物的正常生长和代谢，D正确。 故选B。 5. （2025·浙江·高考真题）传统发酵技术为我们提供了多种食品、饮料及调味品。下列叙述错误的是（    ） A．泡菜的风味由乳酸菌的种类决定 B．用果酒发酵制作果醋的主要菌种是醋酸菌 C．家庭酿制米酒的过程既有需氧呼吸又有厌氧呼吸 D．传统发酵通常是利用多种微生物进行的混合发酵 【答案】A 【分析】参与果酒制作的微生物是酵母菌，其新陈代谢类型为异养兼性厌氧型。参与果醋制作的微生物是醋酸菌，其新陈代谢类型是异养需氧型。果醋制作的原理：当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的葡萄糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。 【详解】A、泡菜的风味由原料、发酵菌种类、发酵环境等因素共同决定的，A错误； B、用果酒发酵制作果醋的主要菌种是醋酸菌，醋酸菌是好氧型微生物，B正确； C、家庭酿制米酒主要用的是酵母菌，在酿制米酒的过程中，首先让酵母菌在有氧的环境进行增殖，然后在无氧的环境中进行发酵，C正确； D、传统发酵食品所用的是自然菌种，没有进行严格的灭菌，以混合菌种的固体发酵及半固体发酵为主，D正确。 故选A。 题型03 植物组织培养 6. （2024·浙江·高考真题）山药在生长过程中易受病毒侵害导致品质和产量下降。采用组织培养技术得到脱毒苗，可恢复其原有的优质高产特性，流程如图。下列操作不可行的是（    ） 外植体→愈伤组织→丛生芽→试管苗 A．选择芽尖作为外植体可减少病毒感染 B．培养基中加入抗生素可降低杂菌的污染 C．将丛生芽切割后进行继代培养可实现快速繁殖 D．提高生长素和细胞分裂素的比值可促进愈伤组织形成丛生芽 【答案】D 【分析】植物组织培养技术：1、过程：离体的植物组织，器官或细胞(外植体)→愈伤组织→胚状体→植株(新植体)。2、原理：植物细胞的全能性。3、条件：①细胞离体和适宜的外界条件(如适宜温度、适时的光照、pH和无菌环境等) ；②一定的营养(无机、有机成分)和植物激素(生长素和细胞分裂素)。 【详解】A、芽尖等分生组织分裂旺盛，且含病毒少，取材时常选用其作为外植体，A正确； B、培养基中有大量的营养物质容易被细菌污染，加入抗生素可降低杂菌的污染，B正确； C、将丛生芽切割后转移到新的培养基上继续进行扩大培养称为继代培养，其又可分为第二代培养、第三代培养等。大多数植物每隔4~6周进行一次继代培养，每进行一次继代培养，培养物一般能增殖3~4倍。正因为培养物可以不断继代培养，所以离体繁殖速度比常规方法通常要快数万倍，可实现快速繁殖，C正确； D、提高生长素和细胞分裂素的比值可促进愈伤组织形成根而不是芽，D错误。 故选D。 7. （2022·浙江·高考真题）下列关于菊花组织培养的叙述，正确的是（    ） A．用自然生长的茎进行组培须用适宜浓度的乙醇和次氯酸钠的混合液消毒 B．培养瓶用专用封口膜封口可防止外界杂菌侵入并阻止瓶内外的气体交换 C．组培苗锻炼时采用蛭石作为栽培基质的原因是蛭石带菌量低且营养丰富 D．不带叶片的菊花幼茎切段可以通过器官发生的途径形成完整的菊花植株 【答案】D 【分析】植物组织培养技术：1、过程：离体的植物组织，器官或细胞（外植体）→愈伤组织→胚状体→植株（新植体）．2、原理：植物细胞的全能性．3、条件：①细胞离体和适宜的外界条件（如适宜温度、适时的光照、pH和无菌环境等）；②一定的营养（无机、有机成分）和植物激素（生长素和细胞分裂素）。 【详解】A、 自然生长茎段的消毒属于外植体消毒，先用70%酒精，再用无菌水清洗，再用5%次氯酸钠消毒处理，最后再用无菌水清洗，A错误； B、培养瓶用专用封口膜封口的目的是防止杂菌污染，并不影响气体交换，B错误； C、组培苗锻炼时采用蛭石作为栽培基质的原因是蛭石比较松软，持水性也较好，有利于幼苗的生根和叶片的生长，C错误； D、不带叶片的菊花茎的切段可通过植物组织培养分化出芽和根这种器官发生的途径形成完整的菊花植株，D正确。 故选D。 8. （2023·河北·高考真题）植物细胞悬浮培养是将单个细胞或细胞团进行液体培养增殖的技术。下列叙述错误的 A．植物细胞悬浮培养的培养基须经无菌处理 B．经纤维素酶和果胶酶充分处理后，植物细胞团分散为单个完整的悬浮细胞 C．为使悬浮细胞正常生长，培养基须保持适当的温度、pH和渗透压 D．利用悬浮培养技术生产次生代谢物，可减少植物资源的消耗 【详解】A、为了避免杂菌污染，植物细胞悬浮培养的培养基须经无菌处理，A正确； B、纤维素酶和果胶酶处理植物细胞获得的是原生质体，不能获得单个完整的悬浮细胞，B错误； C、细胞的正常生长需要适宜的条件，因此，为使悬浮细胞正常生长，培养基须保持适当的温度、pH和渗透压，C正确； D、利用悬浮培养技术生产次生代谢物，可减少植物资源的消耗，同样也不受季节和天气得限制，D正确。 故选B。 题型04 植物体细胞杂交技术 9. （2020·山东·高考真题）两种远缘植物的细胞融合后会导致一方的染色体被排出。若其中一个细胞的染色体在融合前由于某种原因断裂，形成的染色体片段在细胞融合后可能不会被全部排出，未排出的染色体片段可以整合到另一个细胞的染色体上而留存在杂种细胞中。依据该原理，将普通小麦与耐盐性强的中间偃麦草进行体细胞杂交获得了耐盐小麦新品种，过程如下图所示。下列说法错误的是（    ） A．过程①需使用纤维素酶和果胶酶处理细胞 B．过程②的目的是使中间偃麦草的染色体断裂 C．过程③中常用灭活的病毒诱导原生质体融合 D．耐盐小麦的染色体上整合了中间偃麦草的染色体片段 【答案】C 【分析】从图中看出①是去掉植物细胞壁，②是用紫外线诱导染色体变异，③融合形成杂种细胞。 【详解】A、过程1是获得植物细胞的原生质体，需要用纤维素酶和果胶酶将细胞壁分解，A正确； B、根据题干信息“将其中一个细胞的染色体在融合前断裂，形成的染色体片段在细胞融合后可能不会被全部排出，未排出的染色体片段可以整合到另一个细胞的染色体上而留存在杂种细胞中，将普通小麦与耐盐性强的中间偃麦草进行体细胞杂交获得了耐盐小麦新品种，”故过程②通过紫外线照射是使中间偃麦草的染色体断裂，B正确； C、灭活的病毒诱导是动物细胞融合特有的方法，诱导植物原生质体融合常用物理法、化学法，C错误； D、实验最终将不抗盐的普通小麦和抗盐的偃麦草整合形成耐盐小麦，说明耐盐小麦染色体上整合了中间偃麦草的染色体片段，D正确。 故选C。 10. （2023·浙江·高考真题）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题： (1)根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备__________的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的__________为外植体。 (2)植物细胞壁的主要成分为__________和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的__________失活。对处理后的原生质体在显微镜下用__________计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是__________。 (3)将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于__________。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？__________ A ．甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂 B．同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂 C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂 D．杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂 (4)愈伤组织经__________可形成胚状体或芽。胚状体能长出__________，直接发育形成再生植株。 (5)用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA序列b；M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。完善实验思路： Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的__________。 Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系，__________为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。 Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经__________后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的__________个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。 【答案】(1) 再生 叶 (2) 纤维素 细胞质基因和细胞核基因 血细胞计数板 降低PEG浓度，使其失去融合作用 (3) 同一个杂种融合原生质体 ABD (4) 再分化 根和芽 (5) 模板 M1、M2 凝胶电泳 1 【分析】1、植物组织培养过程：离体的植物组织经过脱分化形成愈伤组织，经过再分化愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。 2、植物体细胞杂交可以克服植物有性杂交不亲和性、打破物种之间的生殖隔离，操作过程包括:原生质体制备、原生质体融合、杂种细胞筛选、杂种细胞培养、杂种植株再生以及杂种植株鉴定等步骤。 【详解】（1）在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备再生的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的叶为外植体。 （2）植物细胞壁的主要成分为纤维素和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应，在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的细胞质基因和细胞核基因失活，融合后具有甲植物的细胞核基因和乙植物的细胞质基因。对处理后的原生质体在显微镜下用血细胞计数板计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是降低PEG浓度,使其失去融合作用。 （3）将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于同一个杂种融合的原生质体。未融合的原生质体因为细胞质或细胞核的失活，无法正常生长、分裂；同种融合的原生质体也因为甲原生质体细胞质或乙原生质体细胞核失活而不能生长、分裂；只有杂种细胞才具备有活性的细胞质和细胞核，可以生长、分裂，因此这些愈伤组织只能来自于杂种细胞。故选ABD。 （4）愈伤组织经再分化可形成胚状体或芽。胚状体能长出根和芽，直接发育形成再生植株。 （5）Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的模板。 Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系，M1、M2为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。 Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经凝胶电泳后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的1个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。 题型05 单克隆抗体技术 11. （2026·浙江·高考真题）β-淀粉样蛋白（Aβ）的异常聚集是阿尔茨海默症的致病因素之一。研究者拟利用小鼠作为实验动物，通过细胞融合技术制备抗Aβ的单克隆抗体以用于该病的研究。下列叙述错误的是（　　） A．产生抗Aβ抗体的B细胞来自于用Aβ抗原免疫的小鼠 B．杂交瘤细胞来自于小鼠B细胞与骨髓瘤细胞的融合 C．杂交瘤细胞产生的抗体即为抗Aβ的单克隆抗体 D．抗Aβ的单克隆抗体可辅助该病的特异性诊断 【答案】C 【详解】A、制备单克隆抗体时，需用特定抗原（Aβ）免疫小鼠，刺激其B淋巴细胞分化为浆细胞并产生相应抗体，故产生抗Aβ抗体的B细胞确实来源于Aβ抗原免疫的小鼠，A正确； B、杂交瘤细胞由免疫后小鼠的B淋巴细胞（能产生特定抗体）与骨髓瘤细胞（具有无限增殖能力）通过细胞融合技术形成，B正确； C、杂交瘤细胞是多种融合细胞的混合物，其中仅部分细胞能产生抗Aβ抗体。需经特异性抗体检测和克隆化培养筛选后，才能获得稳定分泌抗Aβ单克隆抗体的杂交瘤细胞系，故未筛选前的杂交瘤细胞产生的抗体不一定是目标单克隆抗体，C错误； D、单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高的特点，抗Aβ的单克隆抗体可特异性结合Aβ蛋白，用于阿尔茨海默症的病理检测或辅助诊断，D正确。 故选C。 12. 核苷酸合成有两个途径，物质A可以阻断其中的全合成途径（如下图）。正常细胞内含有补救合成途径所必需的转化酶和激酶，制备单克隆抗体时选用的骨髓瘤细胞中缺乏转化酶。现用加入H、A、T三种物质的“HAT培养基”来筛选特定的杂交瘤细胞。关于筛选原理的叙述，正确的是 A．免疫B细胞及其互相融合细胞因全合成途径被A阻断而在HAT培养基上不能增殖 B．杂交瘤细胞因为可以进行上述两个途径所以能在HAT培养基上大量增殖 C．骨髓瘤细胞及其互相融合细胞因无法进行上述两个途径而在HAT培养基上不能增殖 D．HAT培养基上筛选出的所有杂交瘤细胞既能大量增殖又能产生高纯度的目标抗体 【答案】C 【分析】据题图分析可知，核苷酸合成有两个途径，物质A可以阻断其中的全合成途径。在加入H、A、T三种物质的HAT培养基中，已免疫的B淋巴细胞内含有补救合成途径所必需的转化酶和激酶，能进行补救合成途径，但无法大量增殖；制备单克隆抗体时选用的骨髓瘤细胞中缺乏转化酶，无法进行补救合成途径，又因全合成途径被物质A阻断，因此在HAT培养基上不能增殖；只有融合成功的杂交瘤细胞既能大量增殖，又可以通过补救合成途径合成核苷酸，因此被筛选出来。 【详解】A、免疫的B细胞是高度分化的细胞，本身不具备增殖能力，A错误； B、杂交瘤细胞因为可以进行补救合成，所以能在HAT培养基上大量增殖，B错误； C、骨髓瘤细胞及其相互融合细胞在HAT培养基上，全合成途径被物质A阻断，又因缺乏转化酶，补救合成途径无法进行，因此不能增殖，C正确； D、HAT培养基上只能筛选出杂交瘤细胞，并不能选出产生高纯度的目标抗体的杂交瘤细胞，D错误。 故选C。 题型06 基因工程电泳图 （2024·浙江·高考真题）阅读下列材料，完成下面小题。 疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。 研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。 13. 下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（    ） A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用 D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段 14. 为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。 1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（    ） A．1号和6号 B．2号和4号 C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号 【答案】13．D 14．B 【分析】引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。 13．A、根据图乙结果显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段,说明能够用于特异性扩增目的片段，A正确； B、根据图乙信息可知，F1-R2引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段，B正确； C、根据图乙信息可知，F1-R1能扩增目的1条带，F2-R1无法扩增目的条带，所以F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用，C正确； D、根据图乙显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段，F1-R2引物扩增条带为三条，说明R2引物无法特异性的扩增目的条带，D错误。 故选D。 14．根据题干信息可知，疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知，在具有氯喹抗性的基因组没有ApoⅠ酶切位点，而敏感性基因组中具有该酶切位点，因此对6份血样处理后进行PCR，产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳出现两条带则为敏感型，只有一条带的为抗性，所以1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是2号和4号，B正确，ACD错误。 故选B。 15. （2023·浙江·高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。 下列叙述正确的是（　　） A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 【答案】B 【分析】PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 【详解】A、分析图中可知，启动子在左侧，GFP基因整合于Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GEP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误； B、因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确； C、整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误； D、用引物1和引物3进行PCR扩增，杂合子和Gata3—GFP基因纯合子都能扩增出相应片段，因此无法区分杂合子和纯合子，D错误。 故选B。 16. （2025·浙江·高考真题）玉米(2n=20)雌雄同株异花。从玉米某自交系(甲)中选育出2个雄性不育突变体(乙和丙)。已知雄性不育基因E1、E2由雄性可育基因E突变所致；如图1所示。甲×乙的F2中雄性可育285株、雄性不育94株，甲×丙的F2中雄性可育139株、雄性不育45株。利用引物P1和P2，对甲、乙、丙以及它们之间杂交的后代(丁和戊)基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经SnaBⅠ完全酶切后电泳，结果如图2所示。 回答下列问题： (1)E1基因与E基因相比，由于___________，导致编码的蛋白质中1个氨基酸发生改变。E2基因与E基因相比，由于编码区增加了插入序列，导致___________，使编码的蛋白质中氨基酸数目减少。 (2)雄性不育对雄性可育是___________性状，乙的基因型是___________。甲×丙产生的F1其雌配子有___________种，F2可育植株中纯合子占___________。若甲×戊的F1随机交配，则F2中E1的基因频率是___________。 (3)写出丁×戊获得F1的遗传图解。 (4)雄性不育突变体不能自交繁殖。为了保存雄性不育突变体，需长期保留含不育基因的杂合子。该杂合子可采用上述“PCR结合限制性内切核酸酶酶切后分析条带”进行鉴定，还可采用的方法有___________(答出2点即可)。 (5)利用引物P1、P2对甲的基因组DNA进行PCR扩增和电泳，下列叙述错误的是___________。 A．PCR反应中TaqDNA聚合酶是沿着模板链的3'端向5'端聚合核苷酸 B．图2中胶板的上端是电泳时的负极，且电泳时DNA片段由负极向正极泳动 C．若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得16条含32P标记的DNA单链 D．若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得8个含32P标记且长度为b的DNA分子 【答案】(1) 碱基对替换 终止密码子提前 (2) 隐性 E2E2 2/两/二 1/3 1/4 (3) (4)测交，自交，核酸分子杂交，基因测序 (5)C 【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，过程包括：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】（1）由图1可知，E1基因与E基因相比，由于碱基对替换，导致编码的蛋白质中1个氨基酸发生改变。由图1可知，E2基因与E基因相比，编码区增加了插入序列，结果编码的蛋白质中氨基酸数目减少，说明翻译提前终止，故反推出编码区增加了插入序列，导致mRNA上终止密码子提前。 （2）由题意可知，甲×乙的F2中雄性可育285株、雄性不育94株，即F2中雄性可育：雄性不育=285：94≈3：1，可知雄性不育为隐性性状，雄性可育为显性性状。甲基因型为EE，故图2中b片段对应E基因，E2基因长度大于E1，故a片段为E2，E1内部存在限制酶SnaBⅠ的识别序列，可被切割为c和d，据此可知乙的基因型为E2E2，丙的基因型为E1E1。甲×丙产生的F1的基因型为EE1，故其可产生2种类型的雌配子，分别是E、E1，F1自交，F2中的基因型及比例为EE：EE1：E1E1=1：2：1，其中EE、EE1雄性可育，因此F2可育植株中纯合子占1/3。由图2可知戊的基因型为E1E2，甲×戊的F1的基因型及比例为EE1：EE2=1：1，F1均可育，随机交配，基因频率不变，因此F2中E1的基因频率与F1中的相同，为1/2×1/2=1/4。 （3）由图2可知戊的基因型为E1E2，雄性不育，可作母本，产生两种类型的雌配子，分别是E1：E2=1：1；丁基因型为EE1，雄性可育，可作父本，产生两种类型雄配子，分别是E：E1=1：1，雌雄配子随机结合，F1的基因型为EE1：EE2：E1E1：E1E2=1：1：1：1，其中EE1和EE2为雄性可育，E1E1和E2E2为雄性不可育，因此丁×戊获得F1的遗传图解为： （4）鉴定基因有无常用的方法有PCR技术、核酸分子杂交、基因测序等，同时也可采用自交和杂交的方法进行鉴定，如含不育基因的杂合子EE1或EE2，测交后代雄性可育：雄性不育=1：1；自交后代雄性可育：雄性不育=3：1。 （5）A、PCR反应中的引物能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，故TaqDNA聚合酶是沿着模板链的3'端向5'端聚合核苷酸，A正确； B、DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，因此若图2中胶板的上端是电泳时的负极，电泳时DNA片段由负极向正极泳动，B正确； CD、在PCR扩增中，1对引物中的每个引物P1和P2分别结合互补的链后进行延伸。每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得24=16个双链DNA分子，其中的15个双链DNA分子都有1条链结合P1引物。若用32P标记引物P1，可获得15条含32P标记的DNA单链，其中第1次扩增时，与P2引物结合的链最终形成的双链DNA分子没有被32P标记。同时获得长度为b，即目的基因片段长度的双链DNA分子为24-2×4=8个。C错误，D正确。 故选C。 / 学科网（北京）股份有限公司 $