猜押08 生物技术与工程（3大高频点猜押）（抢分专练）（山东专用）2026年高考生物终极冲刺讲练测

**基本信息** 聚焦生物技术与工程三大模块，通过考情分析-命题趋势-考向预测构建知识网络，结合典例提炼实验操作与综合应用方法，体现生命观念与科学思维。 **专项设计** |模块|题量/典例|方法提炼|知识逻辑| |----|----|----|----| |发酵工程|含6道选择+3道不定项，覆盖传统发酵与微生物培养|对比传统与现代发酵差异，归纳无菌技术操作细节|从菌种原理→培养流程→工程应用递进，衔接实验误差分析| |细胞工程|含8道选择+2道不定项，涉及植物/动物细胞工程|提炼细胞培养条件与融合技术关键步骤，强调全能性与增殖原理|按植物组织培养→体细胞杂交→动物细胞培养→单克隆抗体制备逻辑串联| |基因工程|含4道选择+7道综合题，聚焦工具与操作程序|总结限制酶选择技巧、PCR扩增条件，结合案例分析目的基因检测|从工具作用→操作流程→应用拓展，关联遗传定律与伦理问题|

猜押08 生物技术与工程 题型 考情分析 命题趋势 考向预测 发酵工程 2025年山东卷第15题： 无菌技术、微生物的接种方法、其他微生物的分离与计数、验证性实验与探究性实验 2025年山东卷第20题： 果酒和果醋的制作原理、果酒和果醋的制作流程及实验分析 2024年山东卷第14题： 发酵工程的应用 2024年山东卷第15题： 微生物的培养与菌种保藏、验证性实验与探究性实验 2023年山东卷第12题: 泡菜的腌制 2023年山东卷第15题: 培养基的成分及其功能、无菌技术、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 2023年山东卷第20题: 果酒和果醋的制作原理 发酵工程考点考查频繁。常考传统发酵技术，如2023年考泡菜制作、果酒和啤酒发酵原理；微生物培养技术，像2023年考平板接种、2021年考解脂菌相关实验。考查结合生活生产，注重知识理解运用。 1. 传统发酵技术：果酒、果醋、泡菜的制作原理、流程及实验误差分析仍为重点，可能结合具体生产场景设计探究性实验； 2. 微生物培养：无菌技术的操作细节、微生物分离与计数的实验步骤及数据处理，大概率以选择题或实验题形式考查； 3. 发酵工程应用：结合食品加工、环保等实际场景，考查发酵技术的具体应用及原理，注重知识的迁移运用。 细胞工程 2025年山东卷第14题： PCR扩增的原理与过程、动物细胞培养技术、克隆 2024年山东卷第20题： 植物体细胞杂交技术、植物细胞工程的实际应用 2023年山东卷第14题： 植物细胞工程的实际应用 细胞工程与胚胎工程考点均有涉及。题型涵盖选择与简答题，分值3-9分。植物组织培养、体细胞杂交，动物细胞培养、核移植，单克隆抗体制备，胚胎发育、移植与分割等是考查重点，常结合科研实例，注重知识运用与分析能力。 1. 植物细胞工程：植物组织培养的条件、流程，植物体细胞杂交的操作步骤及应用，可能结合作物育种实例考查； 2. 动物细胞工程：动物细胞培养的条件、单克隆抗体制备的流程及应用，克隆技术的原理及伦理问题，大概率以简答题形式考查； 3. 结合胚胎工程相关知识，考查细胞工程与胚胎工程的综合应用，注重科研实例的分析与解读。 基因工程 2025年山东卷第25题： PCR扩增的原理与过程、DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 2024年山东卷第13题： DNA的粗提取及鉴定 2024年山东卷第25题： 基因分离定律的实质和应用、DNA重组技术的基本工具、目的基因的检测与鉴定 2023年山东卷第25题： PCR扩增的原理与过程、DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 基因工程考点考查频繁。重点考查基因工程的基本工具，如限制酶、DNA连接酶；基本操作程序，像目的基因获取、表达载体构建等，常结合实际案例，考查学生知识运用与分析能力。题目难度系数大；其中启动子的插入位点和插入方向、报告基因的表达等都需要学生有很强的理解信息、获取信息的能力 1. 基本工具：限制酶、DNA连接酶、载体的作用及特点，可能结合具体序列考查限制酶的切割位点； 2. 基本操作程序：PCR扩增的原理、过程及条件，基因表达载体的构建，目的基因的检测与鉴定方法，为考查核心；3. 综合应用：结合遗传病治疗、作物育种等实际案例，考查基因工程的应用及伦理问题，题目难度较大，注重信息获取和综合分析能力的考查，可能结合孟德尔遗传定律综合命题。 猜押点1 发酵工程 （2026·山东德州·一模）1.泡菜和食醋既可通过传统发酵技术获得，也可利用发酵工程进行工业化生产。下列说法错误的是（ ） A. 醋酸发酵过程中醋酸菌繁殖越快发酵产物的产量越高 B. 与传统发酵相比，发酵工程更易保证产品品质的稳定性 C. 泡菜和食醋制作过程中的发酵产物会抑制杂菌的繁殖 D. 泡菜和食醋的制作分别依赖乳酸菌的无氧呼吸和醋酸菌的有氧呼吸 【答案】A 【解析】A、醋酸发酵过程中，若醋酸菌繁殖过快，会消耗大量营养物质用于菌体自身增殖，用于合成发酵产物醋酸的营养占比下降，因此发酵产物产量不会随醋酸菌繁殖速度加快而升高，并非繁殖越快产物产量越高，A错误； B、发酵工程可精准控制温度、pH、溶氧量等发酵条件，且使用纯化的优良菌种，相比传统发酵自然接种、条件难以精准调控的特点，更易保证产品品质的稳定性，B正确； C、泡菜的发酵产物为乳酸，食醋的发酵产物为醋酸，酸性环境可抑制多数杂菌的生长繁殖，C正确； D、泡菜制作依赖乳酸菌的无氧呼吸产生乳酸，醋酸菌为好氧菌，食醋制作依赖醋酸菌的有氧呼吸产生醋酸，D正确； （2026·山东日照·一模）2.与传统发酵相比，发酵工程的产品种类更加丰富，产量和质量均明显提高。下列说法正确的是（ ） A. 传统发酵无需进行消毒、灭菌，而发酵工程需要消毒、灭菌 B. 发酵条件变化会影响微生物生长繁殖，但不影响其代谢途径 C. 发酵罐内的发酵可以通过反馈控制使发酵过程处于最佳状态 D. 发酵工程可获得大量微生物菌体并从菌体中提取单细胞蛋白 【答案】C 【解析】A、传统发酵也需要对发酵器具等进行基础消毒处理，以减少杂菌污染，并非完全无需消毒、灭菌，A错误； B、发酵条件（如温度、pH、溶氧量等）不仅会影响微生物的生长繁殖，也会改变微生物的代谢途径，例如酵母菌在有氧和无氧条件下代谢途径完全不同，B错误； C、发酵罐可配套传感器实时监测发酵过程中的各项参数，通过反馈控制及时调整发酵条件，可使发酵过程始终处于最佳状态，C正确； D、单细胞蛋白本身就是发酵获得的微生物菌体，不需要从菌体中提取，D错误。 1．传统发酵技术及发酵工程 (1)传统食品的制作技术 类型 果酒 果醋 腐乳 泡菜 菌种 酵母菌 醋酸菌 毛霉 乳酸菌 原理 酵母菌无氧呼吸产生酒精 毛霉等微生物通过发酵分解蛋白质 醋酸菌有氧呼吸产生乙酸 乳酸菌无氧呼吸产生乳酸 控制条件 前期有氧，后期无氧，18~30°C 有氧，30~35°C 有氧，15-18°C 无氧，常温 提醒 ①果酒、果醋、泡菜制作过程中发酵液pH均呈下降趋势，但原因不同。 ②传统发酵过程中一般不需要严格灭菌，目标菌种的快速建立以及发酵形成的环境条件会抑制杂菌的生长繁殖。 ③传统发酵一般为混合菌种发酵，品质不一，现代工业发酵一般为单一菌种发酵，品质较高。 (2)制作果酒、果醋的装置图解读 Ⅰ.充气口：在醋酸发酵时连接充气泵进行充气。 Ⅱ.排气口：排出酒精发酵时产生的CO2。 Ⅲ.出料口：用于取样。 [深度思考]①使用该装置制作果酒时，应该关闭充气口；制作果醋时，应将充气口连接充气泵，输入氧气。 ②与排气口相连的长而弯曲的胶管作用是防止空气中微生物的污染。 (3)发酵工程的基本环节 项目 内容 配制培养基 ①配制原则：目的明确、营养协调、pH 适宜 ②营养构成：水、无机盐、碳源、氮源等 ③注意：培养基使用前要经过反复试验才能用于大规模生产 灭菌 ①目的：防止杂菌污染 ②对象：培养基和发酵设备 选育菌种 条件：环境条件稳定、温和，有利于菌种生长繁殖 途径： ①从自然界中筛选的菌种 ②通过诱变育种或基因工程育种获得的菌种 扩大培养 目的：增加菌种数量 所用培养基：通常用液体培养基 接种 条件：无菌 发酵罐内发酵 地位：中心环节 监控： ①随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程 ②及时添加必需的营养组分来延长菌体生长稳定期的时间，以得到更多发酵产物 ③严格控制温度、pH、溶解氧等发酵条件，以保证产品质量和产量 分离、提纯产物 ①若发酵产品为微生物细胞本身，可采用过滤、沉淀等方法分离、干燥 ②若产品为代谢物，可根据产物的性质采用蒸馏、萃取等方法分离、提纯获得产品 2．微生物培养、分离与计数 (1)无菌技术常用方法 (2)两种纯化微生物方法的比较 项目 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化原理 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面 将菌液进行一系列的梯度稀释，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞 主要步骤 平板划线操作 等比稀释操作和涂布平板操作 接种工具 接种环 涂布器 平板示意图 [深度思考]①为了确定培养基的灭菌是否合格，微生物实验如何设置空白对照？ 提示：随机取若干灭菌后的空白平板培养基在适宜条件下培养一段时间，观察培养基上是否有菌落生成。 ②采用固体平板培养时为什么要倒置？ 提示：既可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染，又可以避免培养基中的水分过快地挥发。 猜押点2 细胞工程 （2026·山东德州·一模）1.紫草的次生代谢物紫草宁具有抗肿瘤作用，滇紫草的次生代谢物紫草素具有抗炎作用。将色氨酸营养缺陷型紫草细胞与亮氨酸营养缺陷型滇紫草细胞融合，再用特定培养基筛选得到杂种细胞。杂种细胞在茉莉酸甲酯的调控下，能同时合成紫草宁和紫草素，且其含量提升2.5倍。下列说法正确的是（ ） A. 紫草宁与紫草素是植物生长和生存所必需的代谢产物 B. 筛选杂种细胞的特定培养基中需要添加色氨酸和亮氨酸 C. 茉莉酸甲酯可调控紫草宁和紫草素合成相关基因的表达 D. PEG是促细胞融合剂，可直接诱导紫草和滇紫草细胞的融合 【答案】C 【解析】A、紫草宁和紫草素属于次生代谢产物，并非植物生长和生存所必需的初生代谢产物，A错误； B、色氨酸营养缺陷型紫草细胞无法自主合成色氨酸，亮氨酸营养缺陷型滇紫草细胞无法自主合成亮氨酸，杂种细胞可整合两种亲本的遗传信息，能同时合成两种氨基酸，因此筛选杂种细胞的培养基不需要添加色氨酸和亮氨酸，未融合的亲本细胞、同种亲本融合的细胞均无法在该培养基存活，以此筛选出杂种细胞，B错误； C、紫草宁和紫草素的合成需要相关酶的催化，酶是基因表达的产物，茉莉酸甲酯可调控相关基因的表达，进而调节两种代谢产物的合成，C正确； D、植物细胞具有细胞壁，无法直接诱导融合，需先去除细胞壁获得原生质体后，再用PEG诱导原生质体融合，D错误。 （2026·山东潍坊·一模）2.（不定项）为培育高产青蒿素的青蒿品系，科研人员利用EMS（可使DNA中鸟嘌呤在复制时与胸腺嘧啶配对）处理青蒿愈伤组织，再通过植物组织培养获得突变植株。下列说法正确的是（ ） A. 愈伤组织形成植株的过程，需保持培养基中生长素和细胞分裂素比例恒定 B. 愈伤组织细胞高度分化，易受EMS诱导发生基因突变 C. EMS处理后DNA中嘌呤和嘧啶比例未发生变化 D. 用微型繁殖技术培养突变植株，有利于高产性状稳定遗传 【答案】CD 【解析】A、植物组织培养中，愈伤组织分化为根或芽需调节生长素和细胞分裂素的比例（高生长素促根，高细胞分裂素促芽），比例恒定无法完成分化，A错误； B、愈伤组织是未分化的薄壁细胞，分化程度低，B错误； C、EMS使鸟嘌呤（G）复制时与胸腺嘧啶（T）配对，DNA中嘌呤和嘧啶的比例依旧为1:1，C正确； D、微型繁殖（植物组织培养）属于无性繁殖，可保持亲本遗传特性，使高产突变性状稳定遗传，D正确。 （2026·山东潍坊·一模）3.研究人员将小鼠iPS细胞在体外诱导，产生了类似于内细胞团样的拟胚体。下列说法错误的是（ ） A. iPS细胞是在体外诱导产生的，功能类似于胚胎干细胞 B. iPS细胞发育为拟胚体的过程中不需要用胰蛋白酶处理 C. 通过定向诱导，拟胚体细胞可能分化成小鼠各种组织细胞 D. 将拟胚体移入发情处理的母鼠子宫内可能发育成新个体 【答案】D 【解析】A、iPS细胞是通过体外诱导体细胞重编程获得的多能干细胞，其分化潜能与胚胎干细胞相似，A正确； B、拟胚体是细胞在体外自发形成的三维聚集体，培养过程中无需胰蛋白酶消化，B正确； C、拟胚体细胞具有多能性，经定向诱导可分化成多种组织细胞（如神经细胞、心肌细胞等），C正确； D、拟胚体仅模拟早期胚胎的内细胞团结构，缺乏滋养层细胞和完整胚胎发育环境，即使移植入子宫也无法发育成新个体，D错误。 （2026·山东滨州·一模）4.母亲线粒体的有害突变会遗传给孩子，为避免这种情况，科研人员研发了“线粒体置换术”：首先取患者甲的卵母细胞核，然后将核注入乙的去核卵母细胞中，重组后的卵母细胞与甲的丈夫（丙）的精子受精，体外培养后植入甲的子宫，分娩得到胎儿丁。下列说法错误的是（ ） A. 甲、乙卵母细胞需要发育到MII期才能进行“线粒体置换术” B. 去核中的“核”指的是细胞骨架－染色体的复合物 C. 受精所需的精子需要先用载体等处理 D. 胎儿丁的遗传物质绝大部分来自于甲和丙 【答案】B 【解析】A、进行核移植相关操作时，卵母细胞需发育至减数第二次分裂（MII）期，该时期卵母细胞的细胞质具备支持细胞核全能性表达的能力，且细胞核位置靠近第一极体，便于进行去核操作，A正确； B、MII期的卵母细胞不存在核膜、核仁，其遗传物质以结合纺锤体－染色体形式存在，因此去核操作中的“核”指的是纺锤体－染色体的复合物，B错误； C、体外受精时，精子需要进行获能处理，常用方法包括Ca²⁺载体处理（化学诱导法）或培养法，使其获得受精能力，C正确； D、胎儿丁的核遗传物质来自甲的卵母细胞核和丙的精子，仅极少量的细胞质遗传物质来自乙的卵母细胞质，因此其遗传物质绝大部分来自于甲和丙，D正确。 1．植物细胞工程 (1)植物组织培养的原理及过程 [深度思考]①植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。 ②脱分化阶段不需要光，再分化阶段需要光。 ③生长素与细胞分裂素的比值高时，促进根的分化、抑制芽的形成；比值低时，促进芽的分化、抑制根的形成。 ④体内细胞未表现全能性的原因是在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性地表达。 (2)植物体细胞杂交技术 [深度思考]①原生质体融合成功的标志是再生出细胞壁。植物体细胞杂交完成的标志是培育出杂种植株。 ②植物体细胞杂交的培养基中要添加蔗糖溶液且浓度略大于原生质体内的浓度，原因是这样不仅能为原生质体提供营养，还能维持一定的渗透压，使原生质体保持正常的形态。 (3)针对两类目标(试管苗、细胞产物)的培养流程 [深度思考]①植物细胞培养技术在生产中通常要培养到愈伤组织阶段。因为此时细胞分裂能力旺盛，代谢快，有利于产物生成。 ②植物组织培养的原理是植物细胞的全能性，植物细胞培养的原理是细胞增殖。 2．动物细胞工程 (1)动物细胞培养的过程 [深度思考]①保障无菌、无毒的措施有对培养液和所有培养用具进行灭菌处理以及在无菌条件下进行操作，定期更换培养液。 ②动物细胞培养所需气体主要有O2和CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。在进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶，并将它们置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。 ③动物细胞培养过程中两次使用胰蛋白酶的作用分别是第一次：处理剪碎的组织，使其分散成单个细胞；第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来分散成单个细胞。 ④区分原代培养和传代培养的关键：是否分瓶培养。 (2)单克隆抗体的制备过程和特点 3．胚胎工程 (1)胚胎工程的操作流程 (2)归纳胚胎工程中的3个“两” ①在实际胚胎工程操作中，常以观察到两个极体或者雌、雄原核作为受精的标志 ②胚胎移植过程中两次使用激素:第一次是对供、受体进行同期发情处理，第二次用于供体的超数排卵 ③胚胎移植或分割的两个时期:桑葚胚和囊胚 (3)胚胎分割的时间和关键点 ①材料：发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚 ②实质：胚胎分割可增加动物后代的数量，其实质是动物的无性繁殖或克隆 ③成功关键点：在分割囊胚阶段的胚胎时，要注意将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。对未知性别的胚胎可以取样滋养层，做DNA分析进行性别鉴定。 猜押点3 基因工程 （2026·山东临沂·一模）1.（2026·山东临沂·一模）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法错误的是（ ） A. PCR复性温度与引物的长度以及引物中GC碱基的相对含量有关 B. 实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理 C. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 D. 在同一电场作用下，通常DNA片段越长，在凝胶中迁移速率越慢 【答案】C 【解析】A、PCR复性过程是引物与模板DNA单链互补配对的过程，引物长度越长、GC碱基相对含量越高，引物与模板结合的稳定性越强，所需复性温度越高，因此复性温度与引物长度、GC相对含量有关，A正确； B、为避免外源DNA等杂质污染，干扰PCR扩增结果，实验使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等试剂和耗材，使用前必须进行高压灭菌处理，B正确； C、凝胶载样缓冲液中的指示剂仅用于指示电泳的迁移进程，方便判断电泳终止时机，无法指示DNA分子的具体位置，DNA的位置需要经过专门染色后用紫外灯才能观察到，C错误； D、DNA带负电，电场作用下向正极迁移，凝胶的分子筛效应会使更长的DNA片段受到的阻力更大，因此同一电场下，DNA片段越长，在凝胶中迁移速率越慢，D正确。 （2026·山东潍坊·一模）2.同源重组技术是指利用目的基因与插入位点两端的同源序列实现目的基因的定向插入。为研究马铃薯抗马铃薯早疫病菌（As）感染的能力是否与S基因表达有关，研究人员用PCR技术扩增S基因反义片段，通过同源重组技术将反义片段插入Ti质粒，并将该质粒导入抗As马铃薯植株中，过程如图1所示。反义片段转录形成的RNA可与S基因的mRNA互补结合，从而抑制S基因的表达。 （1）农杆菌转化法中的转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内______的过程。反义片段转录形成的RNA抑制了S基因表达的______过程。 （2）用限制酶切割图1中质粒会产生黏性末端，需用DNA聚合酶将产生的黏性末端补平，该过程应选用的限制酶是______。利用同源重组技术获得重组质粒，需要引物在片段末端加入与切割位点末端相同的同源序列，引物F和R所含的同源序列分别为5′-______-3′和5′-______-3′（两空只写出与扩增的S基因片段末端序列相连的3个碱基）。 （3）将反义片段转入抗As马铃薯细胞后，需在培养基中加入______（填“卡那霉素”“氨苄青霉素”或“卡那霉素和氨苄青霉素”）进行筛选。 （4）将三种植株分别接种致病菌，菌斑大小和未接种致病菌植株各个生长指标的相对值如图2所示。 据图2分析，S基因对马铃薯植株的作用是______。成功转入S基因反义片段植株与敲除S基因的植株生长指标有明显差异，推测原因是______。 【答案】（1）①. 维持稳定和表达 ②. 翻译 （2）①. BbvCⅠ ②. TGA ③. TCA （3）卡那霉素 （4） ①. 提高植株抗As感染的能力 ②. S基因反义片段转录形成的RNA降低了生长素合成相关基因的表达 【解析】 【小问1详解】 农杆菌转化法中的转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。反义片段转录形成的RNA可与S基因的mRNA互补结合，从而抑制S基因表达的翻译过程，因为翻译是基于mRNA进行的，互补结合会阻碍翻译的进行。 【小问2详解】 由图中碱基序列及其互补序列可知，质粒切割位点存在ScaⅠ、Sma Ⅰ、Xma Ⅰ和BbvCⅠ识别序列；Sma Ⅰ和Xma Ⅰ识别的序列相同，只是切割位点不同，且sma Ⅰ在质粒上还有切割位点，选择sma Ⅰ和Xma Ⅰ会破坏质粒的结构，不能选用限制酶sma Ⅰ和Xma Ⅰ；限制酶ScaⅠ切割后DNA聚合酶无法从5'端添加脱氧核苷酸，质粒上有限制酶BbvC I的识别序列，可选用BbvC I。利用同源重组技术获得重组质粒，需要引物在片段末端加入与切割位点末端相同的同源序列，因需反向插入，引物F对应质粒切割后的右切口，引物R对应质粒切割后的左切口，根据BbvC I切割位点及补平后的序列，引物F和R所含的同源序列分别为5′-TGA-3'和5′-TCA-3'。 【小问3详解】 Ti质粒中，卡那霉素抗性基因位于T-DNA区域内，随T-DNA整合入植物基因组；而氨苄青霉素抗性基因位于T-DNA外，不会转入植物细胞。因此，筛选成功转化的植株应使用卡那霉素培养基。 【小问4详解】 据图2分析，三种植株接种致病菌后，含S基因的植株（野生型）形成的菌斑小，由此可知S基因对马铃薯植株的作用是提高植株抗As感染的能力。根据未接种致病菌植株各个生长指标的相对值可知，成功转入S基因反义片段植株与敲除S基因的植株生长指标有明显差异，推测原因是S基因反义片段转录形成的RNA降低了生长素合成相关基因的表达。 1．基因工程的三种基本工具 ①限制性内切核酸酶（限制酶） 作用;识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 使用方法一般用相同限制酶切割载体和目的基因 ②DNA连接酶：E.coliDNA连接酶，T4DNA连接酶 ③载体：能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选 2．基因工程的基本操作程序 [深度思考]①目的基因主要是指编码蛋白质的基因，在已有mRNA前提下，可通过逆转录法获取目的基因。当基因较小且序列已知时，可采用化学合成法进行人工合成。 ②目的基因应插在启动子与终止子之间。 ③农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 3．限制酶的选择技巧 (1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限制酶Sma Ⅰ。 ②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙)。 (2)根据质粒的特点选择限制酶(如图) (3)根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶。图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(假设切割目的基因的限制酶为Xba Ⅰ和Sac Ⅰ)。 4．蛋白质工程 5．DNA的粗提取与鉴定 ①原理： 利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分 ②DNA性质：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；DNA能溶于2mol·L-1的NaCI溶液 ③鉴定：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色 ④步骤： 研磨一过滤(取上清液)一加人体积相等的、预冷的酒精(体积分数为95%)，静置2~3min-搅拌(或离心)一取白色丝状物(或沉淀物)-溶解鉴定DNA （2026·山东济宁·一模）1.放线菌是一种放射状生长的微生物，人们利用其变种JGs通过发酵工程大规模生产氨基寡糖类抗生素——井冈霉素，广泛应用于水稻病害防治。下列叙述正确的是（ ） A. JGs产生井冈霉素是因为它含有直接编码井冈霉素的基因 B. 可采取适当的提取、分离和纯化措施分离单细胞蛋白 C. 可用稀释涂布平板法对JGs活细胞数量准确计数 D. 利用井冈霉素防治水稻病害，属于生物防治 【答案】D 【解析】A、基因表达的产物是蛋白质，而井冈霉素是一种氨基寡糖类抗生素，化学本质不是蛋白质，所以JGs体内没有直接编码井冈霉素的基因，A错误； B、单细胞蛋白是菌体，可采用过滤、沉淀等方法将菌体从培养液中分离出来，而不是采取提取、分离和纯化等措施，B错误； C、JGs为放射状生长的微生物，稀释涂布时菌丝体难以分散成单细胞，无法形成单菌落，导致活菌计数不准确，因此不宜用稀释涂布平板法进行计数，C错误； D、井冈霉素是由放线菌发酵产生的一种抗生素，利用它防治水稻病害，属于生物防治，D正确。 （2026·山东东营·一模）2.谷氨酸棒状杆菌可用于发酵工程生产谷氨酸，发酵过程中，通常需要分次加入氨水。培养基中的碳氮比会影响菌体的繁殖和谷氨酸的合成量。下列说法错误的是（ ） A. 性状优良的菌种可从自然界中筛选，也可通过诱变育种等获得 B. 发酵需要大量菌种，菌种的扩大培养是发酵工程的中心环节 C. 加入氨水可为菌种提供氮源，也能调节发酵液的pH D. 发酵过程中要严格控制温度、pH及培养基碳氮比等条件 【答案】B 【解析】A、微生物菌种可通过自然选育（从自然界筛选）或人工诱变育种（如紫外线、化学诱变剂处理）获得优良性状，A正确； B、发酵工程的中心环节是发酵罐内的发酵过程，而非菌种的扩大培养。菌种扩大培养是为发酵过程准备足量菌种的前置步骤，B错误； C、氨水（NH3·H2O）含氮元素，可为菌体提供氮源；其碱性可中和发酵产生的酸性物质（如谷氨酸发酵产酸），维持适宜pH，C正确； D、温度、pH、碳氮比等环境条件会直接影响菌体繁殖和谷氨酸合成量，因此发酵过程中需要严格控制，D正确。 （2026·山东菏泽·一模）3.（不定项）利用发酵技术生产青霉素时，总有头孢霉素产生。研究发现青霉素和头孢霉素有一个共同的前体物质，该前体物质在不同酶的作用下分别合成青霉素和头孢霉素。下列说法错误的是（ ） A. 由于抗生素有抗菌作用，通入发酵罐的空气不需要经过灭菌 B. 通过敲除控制前体合成的酶的基因，可以使青霉菌只产生一种产物 C. 青霉菌可以同时产生大量青霉素和头孢霉素两种单细胞蛋白 D. 发酵结束时可采用适当的提取、分离和纯化措施获取青霉素 【答案】ABC 【解析】A、抗生素（如青霉素）虽能抑制或杀死细菌，但不能杀灭所有微生物。发酵过程中，杂菌污染会与青霉菌竞争营养物质、产生有害物质，影响发酵效率和产物纯度。因此，通入发酵罐的空气必须经过灭菌处理，以防止杂菌污染，A错误； B、青霉素和头孢霉素的合成均需共同前体物质，若敲除控制前体合成的酶的基因导致前体无法合成，则青霉素和头孢霉素均无法合成，B错误； C、单细胞蛋白是指通过发酵获得的大量微生物菌体 ，其本质是微生物细胞本身。而青霉素和头孢霉素是青霉菌代谢产生的抗生素，属于小分子有机化合物，并非微生物菌体，因此不属于单细胞蛋白，C错误； D、发酵结束后，发酵液中含有青霉菌菌体、未反应的底物、代谢产物等。需通过过滤去除菌体，再采用萃取、蒸馏、层析等提取、分离和纯化措施，才能获得纯净的青霉素，D正确。 （2026·山东聊城·一模）4.（不定项）传统啤酒酿造过程中，发酵在敞开式发酵池中进行，麦芽汁中接入酿酒酵母后通入大量无菌空气，之后会产生大量气体翻腾逸出，在麦芽汁表面形成25~30cm厚的泡盖（气泡层），然后停止通气，进入静止发酵阶段，一段时间后可得啤酒。下列叙述错误的是（ ） A. 传统啤酒酿造过程中所需的菌种无需选育，也不需要对菌种扩大培养 B. 泡盖的形成是由于酵母菌有氧呼吸产生大量CO2，能将麦芽汁与空气隔绝 C. 焙烤大麦芽可杀死活细胞并使淀粉酶失去活性，有利于增加麦芽汁中麦芽糖的含量 D. 静止发酵阶段相当于现代啤酒发酵工程的后发酵阶段 【答案】ACD 【解析】A、传统啤酒酿造过程中所需的菌种需选育，也需要对菌种扩大培养，A错误； B、泡盖的形成是由于向发酵池中通入无菌空气后，酵母菌有氧呼吸产生大量的CO2，形成的25～30cm厚气泡层，能将麦芽汁与空气隔绝，B正确； C、淀粉酶含量降低会降低淀粉的水解，产生的麦芽糖会减少，C错误； D、静止发酵阶段，酵母菌进行无氧发酵产生酒精和二氧化碳，这一阶段相当于现代啤酒发酵工程的主发酵阶段，D错误。 （2026·山东青岛·一模）5.（不定项）某醋厂和啤酒厂的工艺流程如图所示。酒曲含有霉菌、酵母菌、乳酸菌；醋醅含有醋酸菌；糖化即淀粉水解过程。下列相关叙述正确的有（ ） A. 糯米“蒸熟”与大米“蒸煮”的目的是利于糖化和灭菌 B. 发酵原理是利用真菌的无氧呼吸与细菌的有氧呼吸 C. 醋酸发酵过程中经常翻动发酵物，可控制发酵温度和改善通气状况 D. 啤酒酿造流程中适当增加溶解氧可缩短发酵时间 【答案】ACD 【解析】A、糯米“蒸熟”与大米“蒸煮”的目的均有利于灭菌和糖化过程，A正确； B、图中制酒用到了酒曲，酒曲含有霉菌、酵母菌、乳酸菌，霉菌属于真菌，其为需氧型，该过程霉菌产生的淀粉酶有利于将糯米中的淀粉分解，其中的乳酸菌进行的是无氧呼吸，酵母菌主要进行无氧呼吸过程完成酿酒的过程，醋酸发酵过程中主要利用了醋酸杆菌的有氧呼吸进行醋酸发酵，B错误； C、醋酸发酵过程中利用了醋酸菌的有氧呼吸，在发酵过程中经常翻动发酵物，有利于散热，可控制发酵温度和改善通气状况，C正确； D、啤酒酿造流程中利用的原理是酵母菌的无氧呼吸产生酒精的过程，若适当增加溶解氧有利于酵母菌有氧呼吸产生更多的能量满足酵母菌自身增殖的需要，因而可缩短发酵时间，D正确。 （2026·山东菏泽·一模）6.下列关于微生物培养技术及应用的叙述，正确的是（ ） A. 配制培养基时，应先调节pH，再进行灭菌处理 B. 利用以尿素为唯一氮源的选择培养基从土壤中分离的细菌都能分解尿素 C. 接种后需立即倒置培养以避免皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染 D. 稀释涂布平板法和平板划线法均可用于微生物的分离和计数 【答案】A 【解析】A、微生物纯培养的正确操作顺序应为：配制培养基→调pH→灭菌→接种→培养。若先灭菌后调pH，会破坏培养基的无菌状态（调pH需在灭菌前完成），A正确； B、有些细菌不能分解尿素，但可以利用其他细菌分解尿素产生的氨，也能在该培养基上生长，B错误； C、接种后待菌液被培养基吸收后，再将平板倒置，不是立即倒置，C错误； D、稀释涂布平板法可用于计数，而平板划线法仅用于分离纯化，无法准确计数），D错误。 （2026·山东临沂·一模）7.科研人员通过稀释涂布平板法筛选出高耐受且降解金霉素能力强的菌株，旨在解决金霉素过量使用所导致的环境污染问题。下列说法错误的是（ ） A. 以金霉素为唯一碳源制备选择培养基 B. 接种时，用涂布器蘸取菌液并均匀地涂布在培养基表面 C. 实验中需增加一个未接种的平板作为对照 D. 逐步提高培养基中金霉素的浓度有助于获得高耐受的菌株 【答案】B 【解析】A、筛选可降解金霉素的菌株时，以金霉素为唯一碳源的选择培养基可让能利用金霉素的菌株存活，其他不能利用金霉素的菌株因缺乏碳源无法生长，达到筛选目的，A正确； B、稀释涂布平板法的接种操作是先将定量菌液滴加在培养基表面，再用灼烧后冷却的涂布器将菌液均匀涂布开，并非用涂布器直接蘸取菌液，B错误； C、设置未接种的平板作为空白对照，可检验培养基是否灭菌合格、是否被杂菌污染，保证实验结果的可靠性，C正确； D、逐步提高培养基中金霉素的浓度可增大选择压力，淘汰耐受能力弱的菌株，最终筛选得到高耐受金霉素的菌株，D正确。 （2026·山东淄博·一模）8.科研人员以甲醇为原料，利用毕赤酵母工厂化生产单细胞蛋白用于饲料生产，相关流程如图所示。下列说法正确的是（ ） A. ①中提高甲醇浓度和培养温度可定向获得耐高温和高甲醇耐受性的菌株 B. ②中的种子培养基属于选择培养基 C. ④可以采用提取、分离和纯化措施从发酵液中获得单细胞蛋白 D. ⑤中获得的单细胞蛋白属于毕赤酵母的次生代谢产物 【答案】A 【解析】A、提高甲醇浓度和培养温度能起到选择作用，筛选出耐高温和高甲醇耐受性的菌株，A正确； B、②中的种子培养基（酵母提取物-胰蛋白胨-葡萄糖培养基）是通用培养基/富集培养基，目的是扩大培养筛选后的毕赤酵母，不具备选择功能，B错误； C、单细胞蛋白是微生物菌体本身，发酵结束后需要用过滤沉淀的方法获得，C错误； D、单细胞蛋白是毕赤酵母的细胞本身（菌体），属于细胞组分，并非代谢产物。次生代谢产物是微生物生长到一定阶段后产生的、对自身无明显生理功能的物质，与单细胞蛋白概念不同，D错误。 （2026·山东潍坊·一模）9.用紫外线照射野生型大肠杆菌后，筛选精氨酸营养缺陷型菌株（缺乏将鸟氨酸转化为精氨酸的酶）的流程如图。其中过程①是稀释涂布平板，过程②是将培养基甲上的菌落平移到培养基乙上，继续培养一段时间。下列说法错误的是（ ） A. 过程①中，待涂布的菌液被培养基吸收后应将培养基倒置 B. 甲、乙培养基成分的区别在于是否含有精氨酸 C. 培养基甲中菌落b即为精氨酸营养缺陷型菌株 D. 紫外线照射会提高精氨酸营养缺陷型菌株占突变型菌株的比例 【答案】D 【解析】A、为了防止冷凝水污染或冲散菌落，平板需要倒置培养；过程①中，待涂布的菌液被培养基吸收后应将培养基倒置，A正确； BC、根据题干信息可知，甲培养基含精氨酸，乙培养基不含精氨酸；菌落b在培养基甲中生长，而在乙培养基中不能生长，培养基甲中菌落b即为精氨酸营养缺陷型菌株，B正确，C正确； D、紫外线照射野生型大肠杆菌是诱发大肠杆菌发生突变，但突变具有不定向性，紫外线照射不会提高精氨酸营养缺陷型菌株占突变型菌株的比例，D错误。 故选D。 （2026·山东日照·一模）10. PHA是由嗜盐细菌合成的一种胞内聚酯。科学家从某咸水湖中寻找生产PHA菌种的大致流程如图所示。下列说法错误的是（ ） A. ②④需使用添加高浓度盐的培养基 B. 过程②中接种环每次使用前后均需灼烧灭菌 C. 应选取细菌数量与PHA含量比值小的菌株作为目标菌株 D. 若从盐碱地寻找菌种，需在②之前对土壤浸出液进行梯度稀释 【答案】B 【解析】A、目标菌株是嗜盐细菌，因此②④所使用的培养基需要高浓度盐以筛选嗜盐菌，A正确； B、该实验需要检测目的菌的数量，所以过程②中需要使用移液管和涂布器接种，接种环是在平板划线法的操作中使用的，B错误； C、目标菌株需要PHA产量高，所以应选择细菌数量与PHA含量比值小的菌株作为目标菌株，C正确； D、从土壤中找菌种时，需对②之前的盐碱地浸出液进行梯度稀释，避免菌液浓度过高无法形成单菌落，D正确。 （2026·山东聊城·一模）11.影印平板培养法是使在一系列培养基的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法。科研人员用该方法分离纯化具有链霉素抗性的大肠杆菌，过程如图所示。下列叙述正确的是（ ） A. 突变和基因重组可作为大肠杆菌进化的原材料 B. 图中只有3、7、11号培养基需要添加链霉素 C. 图中含链霉素的培养基的菌落周围会出现抑菌圈 D. 该实验可证明链霉素能诱导大肠杆菌产生耐药性 【答案】B 【解析】A、大肠杆菌属于原核生物，无染色体，不产生染色体变异，不进行有性生殖，不能产生基因重组，因此大肠杆菌可遗传变异的来源是基因突变，A错误； B、该实验的目的是分离纯化具有链霉素抗性的大肠杆菌，采用影印平板法。为了对比有链霉素和无链霉素时大肠杆菌的生长情况，应该是1、2、5、6、9、10号培养基不添加链霉素，3、7、11号培养基添加链霉素，B正确； C、链霉素作为抗生素，对大肠杆菌有抑制作用。在含链霉素的培养基上，对链霉素敏感的大肠杆菌不能生长，而具有抗性的大肠杆菌能生长，具有抗性的大肠杆菌并没有抑制其他菌生长的作用，所以菌落周围不会出现抑菌圈，C错误； D、该实验中，大肠杆菌的抗药性是在接触链霉素之前就已经存在的（通过基因突变产生），链霉素只是对具有抗药性的大肠杆菌进行了选择，并不能诱导大肠杆菌产生抗药性，D错误。 （2026·山东德州·一模）12.（不定项）尿素在高温下易分解，也能被脲酶分解，分解产物能使酚红指示剂变红。为从土壤中筛选出尿素分解菌，实验人员配制不含氮源的培养基(添加酚红指示剂)，向其中加入过滤除菌的尿素后用HCl调至橙黄色，然后倒平板。将1g土壤样品溶于99mL无菌水后再稀释104倍，取菌液0.1mL涂布于上述平板并培养，统计平均菌落数为120个。下列说法正确的是（ ） A. 制备培养基时，应先对培养基灭菌再加入尿素 B. 涂布接种时，用涂布器蘸取0.1mL菌液并均匀地涂布在平板上 C. 红色圈与菌落直径比值大的菌落中的菌株分解尿素能力强 D. 1g土壤样品中尿素分解菌的数目约为1.2×109个 【答案】ACD 【解析】A、尿素高温下易分解，无法通过高压蒸汽灭菌，因此制备培养基时应先对不含尿素的基础培养基进行灭菌，再加入过滤除菌的尿素，A正确； B、涂布接种的正确操作是先将0.1mL菌液滴加在平板表面，再使用灼烧后冷却的涂布器将菌液均匀涂布，不能用涂布器直接蘸取菌液，B错误； C、尿素分解菌产生的脲酶分解尿素产生氨，可使酚红指示剂变红，红色圈与菌落直径的比值越大，说明单位体积菌落分解尿素的能力越强，对应菌株分解尿素的能力越强，C正确； D、1g土壤样品中尿素分解菌的数目约为120÷0.1×106=1.2×109个，D正确。 （2026·山东济宁·一模）13.（不定项）ε-聚赖氨酸（ε-PL）是一种天然食品防腐剂。科研人员从土壤中分离分泌ε-PL的微生物，部分实验操作如图所示，Ⅰ~Ⅴ表示过程，①~③表示菌落，ε-PL使亚甲基蓝褪色，形成透明圈。下列叙述错误的是（ ） A. 实验中需对土样、培养基和培养皿等进行灭菌处理 B. Ⅰ过程接种后的培养皿不能立即进行倒置培养 C. 发酵产物ε-PL需从微生物体内分离提纯 D. 应挑取乙培养基上①菌落，涂布接种到丙培养基上 【答案】ACD 【解析】A、实验中需对培养基和培养皿等进行灭菌处理，土样不能灭菌处理，会将微生物杀死，A错误； B、Ⅰ过程接种后的培养皿不能立即进行倒置培养，待菌液被培养基吸收，B正确； C、发酵产物ε-PL会分泌到细胞外，从培养基中分离提纯，C错误； D、由于ε-PL可使亚甲基蓝褪色，形成透明圈，故应选择透明圈最大（分泌ε-PL的能力越强，分泌ε-聚赖氨酸（ε-PL）量更多）的菌落①进行接种、培养，据丙图菌落形态可知，接种的方法是平板划线法，用的是接种环，D错误。 （2026·山东东营·一模）14.（不定项）营养缺陷型菌株是指野生型菌株失去了合成某种物质的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子后才能生长。夹心平板培养法可用于营养缺陷型菌株的检出，其原理如图1所示，先在培养皿上倒一层基本培养基，凝固后再接种一层待检菌液，其上再浇一薄层基本培养基，凝固后培养出菌落，再倒一层X培养基继续培养，最终培养结果如图2所示。下列说法错误的是（ ） A. X培养基中含有水、氮源、碳源、无机盐和特殊的营养因子等 B. 菌落A为检出的营养缺陷型菌株，菌落B为野生型菌株 C. 在培养细菌时一般需将培养基调至中性或弱酸性 D. 该实验无需设置未接种的夹层平板作为对照 【答案】BCD 【解析】A、X培养基是用来筛选营养缺陷型菌株的，它需要包含水、氮源、碳源、无机盐，还需要补充该营养缺陷型菌株无法合成的特殊营养因子，这样只有该营养缺陷型菌株能在其上生长，A正确； B、野生型菌株可以在基本培养基上生长，营养缺陷型菌株不能在基本培养基上生长，必须补充所缺乏的营养因子才能生长。先在培养皿上倒一层基本培养基，凝固后再接种一层待检菌液，其上再浇一薄层基本培养基，凝固后培养出菌落，这些菌落为野生型，再倒一层X培养基继续培养，这时候营养缺陷型菌株才开始生长，野生型继续生长，最终野生型菌落生长时间长，菌落大即为A，营养缺陷型为B菌落小，B错误； C、不同微生物对培养基的pH要求不同，培养细菌时一般需将培养基调至中性或弱碱性，C错误； D、为排除培养基本身是否被杂菌污染等无关因素对实验结果的影响，该实验需设置未接种的夹层平板作对照，D错误。 （2026·山东东营·一模）15.研究者欲利用原生质体融合技术将两种药用植物细胞融合，以实现有效成分的工厂化生产。下列说法正确的是（ ） A. 操作前需用乙醇和次氯酸钠溶液等对外植体进行消毒 B. 应将植物细胞置于无菌水中去除细胞壁 C. 杂种细胞形成愈伤组织的过程体现了植物细胞的全能性 D. 愈伤组织产生的次生代谢产物是植物生命活动所必需的 【答案】A 【解析】A、原生质体融合前需进行外植体消毒，乙醇和次氯酸钠是植物组织培养中常用的消毒剂，可灭除表面微生物，A正确； B、去除植物细胞壁需使用纤维素酶和果胶酶处理，无菌水会导致细胞吸水涨破，应在等渗溶液中去除细胞壁，B错误； C、杂种细胞经脱分化形成愈伤组织，该过程未形成完整植株（或各种细胞），仅体现细胞分化能力，未完全体现全能性，C错误； D、次生代谢产物（如药用成分）非植物生命活动必需，D错误。 （2026·山东日照·一模）16.研究人员利用细胞工程技术生产紫杉醇的大致流程如图所示。下列说法错误的是（ ） A. 过程①脱分化得到的愈伤组织具有较高的分裂分化能力 B. 过程②振荡培养有利于细胞充分接触培养液并增加其溶氧量 C. 过程③中过滤的目的是除去细胞团获得较纯净的单细胞悬浮液 D. 过程⑤主要是利用促进细胞生长的营养条件提高单细胞中紫杉醇含量 【答案】D 【解析】A、过程①是脱分化，外植体经脱分化形成愈伤组织。愈伤组织是高度液泡化、无特定形态的薄壁细胞团，分裂分化能力很强，可再分化形成胚状体或丛芽，A正确； B、过程②将愈伤组织制成细胞悬浮液，振荡培养的作用： 使细胞与培养液充分接触，保证营养供应； 增加培养液中的溶氧量，满足细胞呼吸需求，B正确； C、过程③通过无菌网筛过滤、离心，目的是除去较大的细胞团，获得分散度更高、较纯净的单细胞悬浮液，C正确； D、过程⑤是工厂化生产紫杉醇，主要是通过增加产紫杉醇细胞的数量来大量生产，而不是提高单细胞中紫杉醇含量，D错误。 （2026·山东临沂·一模）17.（不定项）植物甲抗旱、抗病性强，植物乙分蘖能力强、结实性好。科研人员通过植物体细胞杂交技术培育出兼有甲、乙优良性状的植物丙，过程如图所示。下列说法错误的是（ ） A. 过程①中酶处理的时间有差异，原因可能是两种亲本的细胞壁结构有差异 B. 过程②是该技术的关键环节，融合的细胞均具有两种细胞的遗传物质 C. 过程④的培养基中不需要添加生长素和细胞分裂素 D. 可通过分析丙的染色体来鉴定是否为杂种植株 【答案】BC 【解析】A、过程①中植物甲、乙的酶解时间不同（甲 1.5 小时，乙 2 小时），原因可能是两种植物的细胞壁成分、结构存在差异，导致纤维素酶和果胶酶的降解效率不同，A正确； B、过程②是原生质体融合，是植物体细胞杂交技术的关键环节，但融合的细胞并非都具有两种细胞的遗传物质： 存在甲 - 甲、乙 - 乙同种细胞融合的情况，这类融合细胞只含有一种亲本的遗传物质； 只有甲 - 乙的异种融合细胞才具有两种细胞的遗传物质，B错误； C、过程④是杂种细胞脱分化形成愈伤组织，该过程的培养基中必须添加生长素和细胞分裂素，以调控细胞脱分化，C错误； D、杂种植株丙的染色体是植物甲、乙染色体的总和，可通过分析染色体的形态、数目来鉴定是否为杂种植株，D正确。 （2026·山东德州·一模）18.中国克隆牛“康康”的培育流程如下：将良种肉牛的体细胞直接注入去核卵母细胞中，经诱导融合形成重构胚；对重构胚人工激活与体外培养后，筛选合格胚胎移植至代孕母牛子宫内，使其完成胚胎发育。下列说法错误的是（ ） A. “康康”的细胞质基因来源于受体细胞和供体细胞 B. 利用梯度离心法可不穿透透明带去除纺锤体—染色体复合物 C. 可用电刺激或Ca2+载体激活重构胚，使其完成发育进程 D. 将重构胚培养至囊胚期，取内细胞团细胞进行DNA分析后方可移植 【答案】D 【解析】A、培育过程中将完整的供体体细胞注入去核卵母细胞，供体体细胞携带的少量细胞质、去核卵母细胞的细胞质共同参与重构胚组成，因此“康康”的细胞质基因来源于供体细胞和受体卵母细胞，A正确； B、卵母细胞去核的方法包括显微操作法、梯度离心法、紫外光短时间照射法等，其中梯度离心法无需穿透透明带即可去除纺锤体—染色体复合物，B正确； C、重构胚形成后需经过人工激活才能启动发育进程，电刺激、Ca2+载体处理、乙醇处理等均是常用的激活方法，C正确； D、囊胚的内细胞团将来发育为胎儿的各种组织，若取内细胞团细胞进行DNA分析会破坏胚胎结构，影响后续发育，应取将来发育为胎膜和胎盘的滋养层细胞进行检测，D错误。 （2026·山东济宁·一模）19. PER.C6细胞系是通过转染人5型腺病毒E1基因而永生化的人胚胎视网膜上皮细胞系，可以在大型生物反应器中悬浮生长至高密度，适于制备流感疫苗。下列叙述正确的是（ ） A. 通常在培养液中通入5%的CO2以刺激细胞呼吸 B. E1基因改变了人胚胎视网膜上皮细胞的生长特性 C. PER.C6细胞为流感病毒的增殖提供模板、原料条件 D. PER.C6细胞需定期用胰蛋白酶处理后才能继续增殖 【答案】B 【解析】A、动物细胞培养时通入5%的CO2的作用是维持培养液的pH稳定，并非刺激细胞呼吸，A错误； B、由题干可知，转染E1基因后的人胚胎视网膜上皮细胞发生永生化，获得了可高密度悬浮生长的特性，说明E1基因改变了该细胞的生长特性，B正确； C、流感病毒增殖的模板是病毒自身的遗传物质，PER.C6细胞仅为其增殖提供原料、能量、酶等条件，不提供模板，C错误； D、PER.C6细胞可悬浮生长，不存在贴壁生长的接触抑制现象，不需要定期用胰蛋白酶处理，D错误。 （2026·山东淄博·一模）20.科研人员将患镰状细胞贫血小鼠的成纤维细胞经原代培养和传代培养后，通过体外诱导，获得多能干细胞（iPS细胞），并对iPS细胞进行基因编辑修复突变位点后用于治疗小鼠的镰状细胞贫血。下列说法错误的是（ ） A. 出现接触抑制的原代培养的成纤维细胞，更适合用于诱导iPS细胞 B. 传代培养小鼠成纤维细胞时应定期更换培养液，以清除代谢废物并补充营养物质 C. 可借助病毒将关键转录因子基因导入小鼠成纤维细胞来诱导形成iPS细胞 D. 只需将基因编辑后的iPS细胞直接注射进小鼠骨髓即可治疗镰状细胞贫血 【答案】D 【解析】A、出现接触抑制的原代培养的成纤维细胞，保留正常的二倍体核型，遗传物质未发生改变，更适合用于诱导形成iPS细胞，A正确； B、传代培养过程中细胞代谢会消耗营养、产生有害代谢废物，定期更换培养液可清除代谢废物并补充营养，避免代谢产物积累损伤细胞，B正确； C、诱导成纤维细胞形成iPS细胞需要将关键转录因子基因导入受体细胞，病毒可作为基因工程的载体，将目的基因导入动物细胞，因此可借助病毒完成该过程，C正确； D、iPS细胞为多能干细胞，直接注射进骨髓会出现不受控的分化，甚至可能引发肿瘤，还需要先将基因编辑后的iPS细胞诱导分化为正常造血干细胞，再移植入骨髓才能起到治疗作用，并非直接注射即可，D错误。 （2026·山东临沂·一模）21.如图是制备抗白细胞介素-6（IL-6）单克隆抗体的示意图。下列说法错误的是（ ） A. 步骤①给小鼠注射IL-6后，应从脾中分离筛选B淋巴细胞 B. 步骤②在脾组织中加入胰蛋白酶，制成细胞悬液 C. 步骤③加入灭活病毒或PEG诱导细胞融合，体现了细胞膜的流动性 D. 步骤④⑤分别经过克隆化培养和抗体检测筛选出了杂交瘤细胞 【答案】D 【解析】A、步骤①给小鼠注射IL-6后，应从小鼠的脾中获取B淋巴细胞，A正确； B、步骤②需要在组织中加入胰蛋白酶或胶原蛋白酶，使其成为单细胞，进而制成悬液，B正确； C、步骤③是诱导细胞融合过程，该过程可加入灭活病毒或PEG诱导，细胞融合的过程体现了细胞膜的流动性，C正确； D、步骤④是在选择培养基上筛选得到的杂交瘤细胞，该过程得到的杂交瘤细胞不一定能产生所需抗体，步骤⑤经过克隆化培养和抗体检测筛选出了分泌所需抗体的杂交瘤细胞，D错误。 故选D。 （2026·山东东营·一模）22.我国科研人员在猪体内培育出了“人源肾脏”，相关过程如图所示。下列说法错误的是（ ） A. 推测敲除的SALL1基因是猪肾脏发育的关键基因 B. 选用人源干细胞作为肾脏供体细胞是因为其具有很强的分裂分化能力 C. 可以在猪胚胎发育至桑葚胚时注射人源干细胞 D. 所获得的嵌合胚胎中所有细胞的基因型均相同 【答案】D 【解析】A、根据SALL1缺陷的早期胚胎发育成肾脏缺陷胚胎可知，这个基因是猪肾脏发育的关键基因，A正确； B、人源干细胞具有很强的分裂和分化能力，能够发育形成肾脏组织，因此被选用为肾脏供体细胞，B正确； C、早期胚胎（如桑葚胚、囊胚阶段）的细胞还未高度分化，此时注射人源干细胞，干细胞能更好地参与胚胎发育并形成肾脏，C正确； D、嵌合胚胎中包含猪的细胞和注入的人源干细胞发育形成的细胞，猪细胞和人源干细胞的基因型不同，所以嵌合胚胎中并非所有细胞的基因型均相同，D错误。 （2026·山东青岛·一模）23.猴的克隆胚胎在发育过程中往往出现基因的异常甲基化修饰以及胎盘发育异常，导致克隆成功率较低。我国科学家采用一定的技术手段对克隆胚胎进行处理，如图所示，提高了克隆成功率，并在2024年获得了首个活到成年的克隆猴。下列分析错误的是（ ） A. 成纤维细胞应注入去除纺锤体-染色体复合物的食蟹猴MII期卵母细胞 B. Kdm4d的mRNA和酶TSA均通过修饰DNA来影响基因表达 C. 囊胚b的形成是有性生殖，囊胚a的形成是无性繁殖 D. 该技术在克隆具有特定疾病的模型动物以及辅助生殖等领域有广阔前景 【答案】B 【解析】A、在体细胞核移植（克隆）过程中，供体细胞（如成纤维细胞）的核需要注入去除了纺锤体-染色体复合物的MII期卵母细胞中，以确保供体细胞的基因组能够替代卵母细胞的基因组，A正确； B、Kdm4d是一种组蛋白去甲基化酶，TSA（曲古抑菌素A）是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂。它们通过修饰蛋白质来影响基因表达，促进克隆胚胎的正常发育和分化，B错误； C、囊胚b是通过受精作用获得，属于有性生殖，囊胚a是通过细胞核移植技术获得，属于无性生殖，C正确； D、通过克隆技术可以创建特定疾病的动物模型，用于研究疾病机制和药物开发，此外，该技术还可能用于辅助生殖，帮助解决不孕不育等问题，D正确。 （2026·山东菏泽·一模）24.某科研团队利用动物细胞工程技术构建肝脏类器官，用于药物毒性检测，其流程：诱导小鼠多能干细胞（iPS细胞）分化为多种类型肝细胞→三维培养构建出具有生理功能的肝脏类器官→置于不同浓度的待测药物中，检测细胞活力、肝细胞内相关酶（如谷丙转氨酶）活性等指标。下列相关叙述正确的是（ ） A. iPS细胞分裂能力强，进行体外贴壁培养时，不会发生接触抑制现象 B. 三维培养获得肝脏类器官所使用的气体环境通常为95%氧气和5%CO2 C. 应增设“肝脏类器官+不含待测药物的培养液”组，排除无关变量干扰 D. 若培养液中谷丙转氨酶活性显著升高，则说明该药物对肝脏毒性较弱 【答案】C 【解析】A、iPS 细胞（诱导多能干细胞）虽然分裂能力强，但本质上还是动物细胞。 动物细胞在体外贴壁培养时，当细胞相互接触，就会停止分裂增殖，这就是接触抑制。 因此，iPS 细胞也会发生接触抑制，A错误； B、动物细胞培养的标准气体环境是95% 空气（提供 O₂） + 5% CO₂（维持培养液 pH）。 肝脏类器官的培养同样遵循这一条件，B错误； C、这个实验的目的是检测药物的肝毒性，需要设置对照组来排除基础条件对实验结果的影响。 “肝脏类器官 + 不含待测药物的培养液” 是典型的空白对照组，可排除培养液本身、培养环境等无关变量的干扰，C正确； D、谷丙转氨酶主要存在于肝细胞内，当肝细胞受损时，它会释放到培养液中，导致活性升高。 因此，谷丙转氨酶活性显著升高，恰恰说明肝细胞受损严重，药物对肝脏毒性较强，D错误。 故选C。 （2026·山东青岛·一模）25.抗体结构分为可变区（V区）和恒定区（C区，是抗体分子中相对较为保守的区域，在不同物种间的差异较大），与抗原特异性结合的区域为CDR区，位于V区中。单克隆抗体在疾病诊断和病原体鉴定中发挥重要作用，但鼠源的单抗容易在人体内引发人抗鼠抗体反应（HAMA），从而削弱其治疗的有效性。科学家对鼠源杂交抗体进行改造，生产出效果更好的鼠—人嵌合抗体，主要流程如图所示。下列叙述正确的是（ ） A. 鼠—人嵌合抗体至少含有4个游离氨基，其抗体特异性由肽链的C区决定 B. 鼠源单抗易引发人体免疫排斥反应可能与其可变区有关 C. 为提高嵌合基因与载体的连接效率，扩增时应在两条引物的5'端添加同种限制酶酶切位点 D. 鼠—人嵌合抗体的研制过程属于蛋白质工程，图中转染细胞的方法可能是显微注射法 【答案】D 【解析】A、由图可知，鼠—人嵌合抗体含有4条肽链，因此至少含有4个游离氨基，抗体与抗原特异性结合的区域为CDR区，位于V区中，因此，抗体特异性由肽链的V区决定，A错误； B、恒定区是抗体分子中相对较为保守的区域，在不同物种间的差异较大，鼠源单抗易引发人体免疫排斥反应可能与其恒定区有关，B错误； C、子链延伸只能从5′端向3′端，为避免自身环化和反向链接，应使用两种不同的限制酶进行酶切，因此应在两条引物的5′端添加不同的限制酶酶切位点，C错误； D、鼠—人嵌合抗体是对鼠源抗体改造，即对蛋白质改造，属于蛋白质工程；将基因表达载体导入动物细胞常用显微注射法，D正确。 （2026·山东日照·一模）27.为解决杂交瘤细胞在传代培养中出现来自B淋巴细胞染色体丢失的问题，研究人员在单抗制备过程中用EBV（一种病毒颗粒）感染小鼠B淋巴细胞，使之成为染色体核型稳定的细胞，操作过程如图所示。EBV转化细胞能在HAT培养基中存活，但对药物Oua敏感。骨髓瘤细胞在HAT培养基中不能存活，但对Oua不敏感。下列说法错误的是（ ） A. 杂交瘤细胞染色体丢失可能会导致自身抗体的产生能力下降 B. 图中筛选过程可淘汰未融合的骨髓瘤细胞及EBV转化细胞 C. 图中筛选出的杂交瘤细胞能够产生特异性单抗和抗EBV抗体 D. 图中筛选出的杂交瘤细胞可直接扩大培养用于工厂化生产单抗 【答案】CD 【解析】A、抗体是由浆细胞分泌的，杂交瘤细胞若丢失来自B淋巴细胞的染色体，可能会导致抗体产生能力下降，A正确； B、据题意“EBV转化细胞能够在HAT培养基中存活，但对Oua敏感；骨髓瘤细胞在HAT培养基中不能存活，但对Oua不敏感”可知，Oua筛选去除的是未与骨髓瘤细胞融合的EBV转化细胞和自身融合的EBV转化细胞，B正确； C、图中筛选出的杂交瘤细胞只能够产生一种特异性单抗，C错误； D、图示获得的杂交瘤细胞还要进行克隆培养和抗体检测，检测呈现阳性的杂交瘤细胞才能用于生产单克隆抗体，D错误。 （2026·山东滨州·一模）28.流感病毒的抗原有H和N两类，均可以分为很多亚型。某科研团队基于融合蛋白的思路，尝试制造H3、N2融合蛋白疫苗，以更好地预防H3N2病毒。 （1）获取病毒H3、N2抗原蛋白的mRNA，通过____过程得到相应的DNA，并进一步构建H3、N2融合基因。在H3蛋白基因和N2蛋白基因融合的过程中，起搭桥作用的是____（从引物1～8中选择）。 （2）从引物角度分析，两种基因能够融合的关键是____，变性后形成的杂交分子在延伸为双链等长的融合基因时，不需要添加引物的原因是____。若融合基因中上游基因的mRNA终止密码子对应的碱基序列未被切除，则融合基因翻译得到的抗原蛋白为____。 （3）将目的基因与运载体连接过程中，首先需要用____（填限制酶种类）处理载体；用____（填限制酶种类）处理目的基因所在的片段。 （4）利用大肠杆菌作受体细胞筛选获得目的菌株：首先在含卡那霉素的培养基上培养目标菌，将培养基上生长的菌落用影印法接种到含四环素的培养基上，最后选择____的菌株。 【答案】（1）①. 逆转录 ②. 引物1和引物3 （2）①. 起搭桥作用的两个引物的5'端存在部分可以碱基互补配对的序列 ②. 可沿着杂交分子互补区域的3'端继续延伸 ③. H3 （3）①. BamHⅠ和XmaⅠ ②. Sau3AI和XmaⅠ （4）能在含卡那霉素培养基上生长但不能在含四环素培养基上生长 【解析】 【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链。 【小问1详解】 以mRNA为模板合成DNA的过程为逆转录，所以获取病毒H3、N2抗原蛋白的mRNA，通过逆转录过程得到相应的DNA。DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的，据图可知扩增N2基因用的引物为引物1和引物6，扩增H3基因用的引物为引物3和引物8，所以起搭桥作用的是引物1和引物3。 【小问2详解】 两种基因能够融合的关键是引物1和引物3的5'端部分碱基互补配对，这样才能在搭桥、变性后杂交过程中使两个基因连接起来。变性后形成的杂交分子在延伸为双链等长的融合基因时，两条链互为引物和模板链，且两条母链均存在3'端，使DNA聚合酶能从母链的3'端开始连接脱氧核苷酸，即可沿着杂交分子互补区域的3'端继续延伸，据图可知H3基因位于融合基因的上游，所以若融合基因中上游基因的mRNA终止密码子对应的碱基序列未被切除，则融合基因翻译得到的抗原蛋白为H3。 【小问3详解】 根据限制酶识别序列及产生的黏性末端，BsaⅠ切割产生的黏性末端不固定所以不能使用，而运载体上在启动子和终止子之间还有BamHⅠ和XmaⅠ，且Sau3AI会切割卡那霉素抗性基因，所以用BamHⅠ和XmaⅠ处理运载体；因为Sau3AI产生的黏性末端和BamHⅠ产生的黏性末端相同，为同尾酶，所以为了防止载体自身环化以及保证目的基因和载体正确连接，用Sau3AI和XmaⅠ处理目的基因所在的片段。 【小问4详解】 重组质粒中卡那霉素抗性基因未被破坏，四环素抗性基因被破坏，所以在含卡那霉素的培养基上能生长，在含四环素的培养基上不能生长的菌株为含有重组质粒的目的菌株。 （2026·山东淄博·一模）29.人源干扰素IFNα-2b是一种具有抗病毒活性的真核蛋白，可通过大肠杆菌BL21（DE3）表达体系大规模生产。BL21（DE3）的质粒上有T7RNA聚合酶基因和lacI基因。T7RNA聚合酶具有极高的启动子特异性和转录效率，其表达受lacI基因编码的lac阻遏蛋白的调控，当培养基中无诱导物IPTG时，lac阻遏蛋白结合到T7RNA聚合酶基因的启动子上抑制其表达。 （1）BL21（DE3）去除了蛋白酶编码基因，目的是_______。T7RNA聚合酶基因的启动子属于______型启动子。 （2）构建重组载体时，选用了两种启动子PBAD（被大肠杆菌自身RNA聚合酶识别）和PT7（仅被T7RNA聚合酶识别），重组载体的部分结构如图1。构建基因表达载体的目的是_______。为实现目的基因在特定时期表达，图1的4个基因的启动子中为PBAD的是______（填序号）。为筛选出含重组质粒的大肠杆菌并使其大量表达IFNa-2b，培养基中需要加入_____。 （3）编码同一氨基酸的不同密码子，在不同生物体中的使用频率并不相同，即存在密码子偏好性。如果使用大肠杆菌表达一种真核蛋白，可能因密码子偏好性不同，导致目标蛋白翻译过程受阻。IFNa-2b基因的mRNA中存在一种大肠杆菌中不常见的密码子AGG，导致IFNa-2b产量极低。可利用同源重组（图2）向大肠杆菌基因组中导入密码子AGG对应的______基因提高IFNα-2b产量。图2中的同源区段可不发生交换，也可发生单交换或双交换。对大肠杆菌进行改造后，利用高温处理使质粒丢失，在培养基中加入四环素，能够生长的是发生______（填“单交换”或“双交换”）的大肠杆菌。利用引物1和引物2进行PCR扩增（引物大小忽略不计），如果插入了目的基因，PCR产物大小为______bp。 【答案】（1）①. 防止/抑制IFN Nα-2b/人源干扰素/目的蛋白/外源蛋白的降解 ②. 诱导型 （2）①. 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时能够在受体细胞内表达和发挥作用 ②. ①②④ ③. 卡那霉素和 IPTG （3）①. tRNA（或“转运RNA”） ②. 单交换 ③. 1100或5000 【解析】 【小问1详解】 防止蛋白酶降解外源基因表达的人源干扰素 IFNα-2b，提高目标蛋白的产量和稳定性。因为其表达受 lacI 基因编码的 lac 阻遏蛋白调控，需 IPTG 诱导才能解除抑制。 【小问2详解】 构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时能够在受体细胞内表达和发挥作用。启动子③是控制IFNα-2b（目的蛋白）的表达，需要在合适时机稳定表达，应该被T7RNA聚合酶识别（受IPTG调控）。 而T7RNA聚合酶基因和lac基因是调控元件，需要大肠杆菌自身RNA聚合酶来基础表达，维持菌株的调控体系，通过大肠杆菌BL21（DE3）表达体系大规模生产IFNα-2b，也需要大肠杆菌自身RNA聚合酶来基础表达，所以它们的启动子①②④是 PBAD。用于筛选导入了重组质粒（携带卡那霉素抗性基因）的大肠杆菌，不含重组质粒的大肠杆菌无法在含卡那霉素的培养基存活。 IPTG作为诱导物，解除lac阻遏蛋白对T7RNA聚合酶基因启动子的抑制，让T7RNA聚合酶表达，进而启动目的基因IFNα-2b的转录和翻译，实现大量表达。 【小问3详解】 tRNA（或识别密码子 AGG 的 tRNA），通过补充对应 tRNA 来克服密码子偏好性，提高翻译效率。单交换会使完整四环素抗性基因（Tet^r）保留，高温处理后仍含四环素抗性基因；双交换会丢失四环素抗性基因，只有成功插入目的基因的菌株（四环素敏感）才能在含四环素的培养基中存活（未插入的菌株因四环素抗性基因完整而被四环素杀死）。若发生了双交换，M1 和 M2 片段各 500 bp，目的基因 100 bp，总长度 = 500 + 100 + 500 = 1100 bp。若发生了单交换，PCR产物大小为4000+500+500=5000。 （2026·山东日照·一模）30.除草剂氟草啶（FCD）能抑制植物细胞中原卟啉原IX氧化酶的活性以达到除草效果，科研人员利用基因编辑技术使水稻2号染色体上的PPO1基因（编码原卟啉原IX氧化酶）与CP12基因结构改变（如图1），从而赋予水稻对FCD的耐受性，并利用PCR技术结合电泳对转基因水稻进行鉴定，结果如图2所示。 （1）据图1分析，利用PCR技术鉴定基因编辑是否成功时，应选择的引物组合为________。若基因编辑成功，PCR扩增产物的电泳结果应为图2中的________号泳道。若电泳结果中5号泳道内出现两条电泳条带，原因可能是________（填序号）。 ①样品被污染 ②复性过程温度过低 ③预变性时间较短 ④延伸过程中引物3'端被封闭 ⑤引物特异性不强 ⑥图1中的两个切割位点之间被切割后原位连接 （2）基因编辑成功后，PPO1的转录模板链是________（填“A”或“B”）链，基因编辑前后，CP12的转录模板链________（填“是”或“否”）改变。 （3）综合上述信息，分析上述基因编辑成功的水稻对FCD耐受性增强的原因是________。 【答案】（1）①. F1和R2（或F2和R1） ②. 3 ③. ①②③④⑤ （2） ①. A ②. 否 （3）强启动子提高了PPO1基因的转录水平，使原卟啉原IX氧化酶的表达量增加 【解析】 【小问1详解】 结合图示可知，与原来的染色体相比发生了倒位，若使用F1F2或R1R2则无法进行PCR扩增，若使用F1R1或F2R2，则无论是否基因编辑成功都可以扩增出产物，因此利用PCR技术鉴定基因编辑是否成功时，应选择的引物组合为F1和R2（或F2和R1）。根据扩增引物可知，PCR扩增产物的碱基对数量为300+911=1211，应为图2中的3号条带。若电泳结果中5号泳道内出现两条电泳条带，原因可能是①样品被污染，扩增出非目的基因；②复性过程温度过低、③预变性时间较短都导致引物与非目的基因结合扩增出非目的基因序列； ④延伸过程中引物3'端被封闭，扩增出的DNA片段偏短；⑤引物特异性不强，扩增出非目的基因；⑥图1中的两个切割位点之间被切割后原位连接，则PCR扩增没有对应的产物，故选①②③④⑤。 【小问2详解】 基因转录时，是以DNA的一条链为模板，转录的方向是启动子到终止子，沿模板的3'端到5'端。根据图中信息，基因编辑成功的PPO1基因转录的模板是A链。根据图示可知，基因编辑前后，CP12的转录模板链没有发生改变，均为B链。 【小问3详解】 综合上述信息，分析上述基因编辑成功的水稻对FCD耐受性增强的原因是强启动子提高了PPO1基因的转录水平，使原卟啉原IX氧化酶的表达量增加。 （2026·山东菏泽·一模）31.科研人员开发了一种可将靶DNA中特定位点碱基对C-G变为T-A的单碱基编辑工具（简称CBE系统）。该系统由dCas9蛋白、胞苷脱氨酶和sgRNA三部分构成，其中“dCas9蛋白+胞苷脱氨酶”在sgRNA的引导下，使靶DNA特定位点的一个碱基C脱氨反应变成U，最终实现C→T的改变。编辑过程如图1，该过程中DNA链不断裂。图1中①②代表相应过程。 （1）CBE系统与靶DNA的识别与结合过程发生了________键的断裂和形成；①过程形成的一个含A-U的DNA分子经②过程n轮（n>2）复制后，可形成________个目标DNA． （2）上述CBE系统的构建用到了图2中的质粒、目的基因和限制酶等。构建CBE系统的部分过程如下： I．重组质粒的构建：根据pHSE401质粒上限制酶识别位点，利用PCR扩增目的基因时，需要在引物的________端添加限制酶识别序列，通过合适的限制酶组合以达到目的基因与质粒正确连接，避免出现自身环化现象。 Ⅱ．重组质粒的筛选：将重组质粒导入对卡那霉素和四环素敏感的大肠杆菌中，将该大肠杆菌在含有卡那霉素的培养基中涂布培养，获得单菌落A、B、C、D和E，然后将菌落原位转移到含四环素的培养基中，发现A、C菌落不能存活，则导入重组质粒的菌落是________。据此推测步骤Ⅰ中的限制酶组合可以为________（填序号）。 ①XbaⅠ和NheⅠ②XbaⅠ和HindⅢ③XbaⅠ和EcoRⅠ ④SmaⅠ和NheⅠ⑤HindⅢ和EcoRⅠ⑥EcoRⅠ和NheⅠ （3）草莓中MYB10基因影响品质，若将该基因编码的多肽链中一个特定的组氨酸定点突变为酪氨酸，则可以改良品质。已知MYB10基因转录的非模板链中相关的部分碱基序列为5＇-GGACATGGG-3＇，据此设计sgRNA的序列是5＇________3＇。（组氨酸的密码子：CAU、CAC，酪氨酸的密码子：UAU、UAC） （4）CBE系统有时误对非目标序列进行编辑而造成“脱靶”，发现sgRNA的序列越短，脱靶率越高。分析脱靶最可能的原因：________。 【答案】（1）①. 氢 ②. 2n-1-1 （2）①. 5' ②. A 、C ③. ②③⑤ （3）GGACAUGGG （4）非目标序列也可能含有与sgRNA配对的碱基序列，造成sgRNA选错对象与之结合而脱靶 【解析】 【小问1详解】 CBE系统与靶DNA的识别和结合过程中，首先基因组DNA双链先解开，其中的一条链与sgRNA结合，发生了氢键的断裂和形成。第一次复制得到G-C、A-U，第二次复制得到G-C、C-G、A-U、A-T，仅有1个目标DNA，第三次复制得到G-C、C-G、G-C、C-G、A-T、A-T、A-U、A-T，以此类推，经n轮复制后，G-C占一半，另一半中有一个是A -U，因此经脱氨作用形成的一个如图所示的DNA分子需要经过2次复制后才可形成碱基编辑的DNA，所以经过n轮（n>2）复制可形成（2n－1-1）个碱基编辑的DNA。 【小问2详解】 子链延伸的方向是5'→3'，根据pHSE401质粒上限制酶识别位点，利用PCR扩增目的基因时，需要在引物的5'端添加限制酶识别序列，通过合适的限制酶组合以达到目的基因与质粒正确连接，避免出现自身环化现象。导入重组质粒的菌落是 A、C（在卡那霉素培养基存活，在四环素培养基不能存活，说明四环素抗性基因被破坏，目的基因插入其中）。① Xba I 和 Nhe I：两种酶切后产生的黏性末端相同，会导致质粒自身环化或目的基因反向连接，不符合要求。 ② Xba I 和 Hind III：破坏四环素抗性基因，符合条件。 ③ Xba I 和 EcoR I：破坏四环素抗性基因，符合条件。 ④ Sma I 和 Nhe I：Sma I破坏卡那霉素抗性基因，不符合筛选条件。 ⑤ Hind III 和 EcoR I：破坏四环素抗性基因，符合条件。 ⑥ EcoR I 和 Nhe I：未破坏四环素抗性基因，不符合条件。 因此可选 ②③⑤。 【小问3详解】 MYB10基因转录的非模板链为5'-GGACATGGG-3'，则模板链为3'-CCTGTACCC-5'，转录的mRNA序列为5'-GGACAUGGG-3'。 组氨酸密码子为CAU、CAC，对应DNA模板链为GTA、GTG。要将组氨酸突变为酪氨酸（UAU、UAC），需将DNA中的C-G变为T-A，因此sgRNA的序列是5'-GGACAUGGG-3'。 【小问4详解】 sgRNA序列越短，与靶DNA的特异性结合能力越弱， 非目标序列也可能含有与sgRNA配对的碱基序列，造成sgRNA选错对象与之结合而脱靶。 （2026·山东东营·一模）32.小麦因M基因存在易被布氏白粉菌感染而患白粉病，导致严重减产。科研人员利用农杆菌转化法，将gRNA基因和Cas9蛋白基因导入到小麦中，对M基因进行敲除，使其无法表达。gRNA-Cas9复合体可对DNA的特定序列识别并剪切。复合体首先会定位目标DNA序列3'端的PAM序列，然后gRNA上的靶向序列与目标DNA的另一条链互补配对，接着Cas9会切割目标DNA某位点，实现基因敲除。相关过程如图1所示。 （1）gRNA中的识别序列与目标DNA的相应序列特异性结合遵循__________原则，Cas9蛋白作用的化学键是__________。 （2）为了不破坏其他正常基因，需要设计gRNA精准识别的靶向序列。科研人员对小麦M基因测序，部分结果如图2所示。若在后续利用限制酶AvaⅡ进行辅助检测，则gRNA上的靶向序列应设计为5'-__________-3'（写出12个碱基）。 （3）利用图3中的载体1与载体2构建携带gRNA基因和Cas9蛋白基因的最终表达载体，应选择使用的限制酶有__________，最终表达载体还应具备的基本元件有__________（写出两点）。表达载体导入农杆菌后，利用含__________的培养基筛选出阳性菌落。 （4）对转化成功的小麦植株M基因相关序列进行PCR扩增，用限制酶AvaⅡ酶完全酶切并电泳检测，若检测结果出现1个条带，则该植株为M基因__________（填“敲除”或“未敲除”）的植株。后续还需对小麦进行白粉病抗性鉴定，请简述实验思路：__________。 【答案】（1）①. 碱基互补配对 ②. 磷酸二酯键 （2）AGAUUGGGUCCU （3）①. SpeI和NheI ②. 复制原点、终止子 ③. 潮霉素 （4）①. 敲除 ②. 用布氏白粉菌感染基因改造的小麦和没有经过基因改造的小麦，如果基因改造的小麦产量高，没有改造的小麦产量低，则说明改造成功 【解析】 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的筛选和获取从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选，是基因工程的核心步骤。（3）将目的基因导入受体细胞将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【小问1详解】 gRNA中的识别序列与目标DNA的相应序列特异性结合遵循碱基互补配对原则。 gRNA能够识别DNA特定序列，引导Cas9蛋白通过催化磷酸二酯键的断裂发挥作用，二者的作用类似基因工程中的限制酶。 【小问2详解】 观察图2，目标DNA序列为5′-AGATGCATATCCCGGAGATTGGGTCCTGCGTGACGG-3′，其3′端（即该序列的右侧）的PAM序列是“AGATTG”；复合体首先会定位目标DNA序列3'端的PAM序列，然后gRNA上的靶向序列与目标DNA的另一条链（3′端-5′端）互补配对，接着Cas9会切割目标DNA某位点，实现基因敲除；可见gRNA靶向序列的应该与目标DNA序列（5′端-3′端）序列基本一致，但需要将DNA序列上的T换成U，又在后续利用限制酶AvaⅡ进行辅助检测，则gRNA上的靶向序列应设计为5'-AGAUUGGGUCCU-3'（写出12个碱基）。 【小问3详解】 通过限制酶SpeⅠ和NheⅠ将载体1启动子a和gRNA基因剪切，该片段两端的黏性末端相同，因此再用SpeⅠ将载体2切开，通过DNA连接酶将该片段连接到载体2即可成为最终载体。基因表达载体除了图中所示的目的基因、启动子、标记基因外，还应具有复制原点、终止子等元件。由于载体中含有潮霉素抗性基因，所以可用含潮霉素的培养基筛选出阳性菌落。 【小问4详解】 AvaⅡ酶切位点存在于M基因中，若M基因未被敲除，AvaⅡ酶切后会产生两个条带；若M基因被敲除，M基因序列改变，AvaⅡ酶切位点消失，酶切后会出现1个条带，所以检测结果出现1个条带时，该植株为M基因敲除的植株。 白粉病抗性鉴定可通过将白粉病菌接种到小麦植株上，观察植株是否感染白粉病来判断。具体思路为：用布氏白粉菌感染基因改造的小麦和没有经过基因改造的小麦，如果基因改造的小麦产量高，没有改造的小麦产量低，则说明改造成功。 （2026·山东青岛·一模）33.磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程如图所示，请回答下列问题。 （1）PCR1经过________轮循环可初步获得图中A片段，PCR2扩增GFP基因时需依据________设计引物R2，据图分析扩增目的片段时所用的引物F1和R2可对应下表中的________（填序号）。 ① 5´-TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3´ ② 5´-AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC-3´ ③ 5´-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA-3´ ④ 5´-GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA-3´ 据以上表格提示PCR1和PCR2通常________（“能”或者“不能”）在同一反应体系中进行。 （2）无缝克隆时，T5核酸外切酶沿________（填“5´→3´或“3´→5´”）的方向水解DNA，其目的是形成________。过程②两个片段复性后存在“缺口”的原因是________，过程③所需的酶有________。 （3）与传统的酶切再连法相比无缝克隆技术构建重组质粒的优点有________。 A. 不受限制酶切位点的限制 B. 不会引入多余碱基，不会出现移码突变 C. 操作相对简单，成功率高 D. 不需要使用PCR技术扩增目的基因 （4）利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有________的MS培养基上进行筛选和鉴定，将筛选得到的种子种植可得到转基因拟南芥，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中________，了解PA的分布和含量。 【答案】（1）①. 2 ②. GFP基因的一端和PABD基因一端的核苷酸序列 ③. ①、④ ④. 不能 （2）①. 5'→3' ②. 黏性末端 ③. 过程①形成的黏性末端大于互补配对的区段（同源序列） ④. DNA聚合酶和DNA连接酶 （3）ABC （4）①. 草胺膦 ②. 绿色荧光点的分布 【解析】 【小问1详解】 PCR第1轮：得到长短不一的链；PCR第2轮：首次出现长度正好等于A片段的 DNA。由重组DNA图可知，GFP基因和PABD基因进行连接，PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，而设计引物F1仅需根据PABD基因一端的核苷酸序列，因此引物F1的碱基序列比引物R2的碱基序列短，因此扩增目的片段的引物F1对应于下表中的①。PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列引物R2，即引物R2的一部分能与引物F1进行碱基互补配对，综上所述，R2对应于下表中的④。PCR1和PCR2不能在同一反应体系中进行，因为PCR1与PCR2的引物F1和R2之间存在互补序列，若在同一体系中扩增，引物会相互配对形成其他产物，干扰正常PCR反应，无法获得正确的目的片段。 【小问2详解】 据图可知，T5核酸外切酶沿5'→3'的方向水解DNA（单链），暴露出3' 端非互补序列，即黏性末端。过程②在退火的过程中，两个片段的黏性末端可根据互补序列进行配对结合，但由于过程①形成的黏性末端大于互补配对的区段（同源序列），因此在过程②退火后存在“缺口”。过程③缺口处DNA链的补齐，可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA聚合酶（DNA聚合酶将游离的单个脱氧核苷酸加到子链3′末端）和DNA连接酶（将两个DNA片段进行连接）。 【小问3详解】 传统的酶切再连法需要用特定的限制酶将目的基因和质粒先进行切割，再用DNA连接酶对目的基因和质粒进行连接，在该过程会形成多个小片段，操作复杂，而无缝克隆技术构建重组质粒是不受限制酶切位点的限制，不会引入多余碱基，不会出现移码突变，操作时间短，成功率高，ABC正确，D错误。 【小问4详解】 由图可知，bar（草胺膦抗性基因）为标记基因，位于T-DNA上，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有草胺膦的MS培养基上进行筛选和鉴定。由题意“将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量”可知，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色荧光点的分布，了解PA的动态变化。 （2026·山东临沂·一模）34.香树脂醇具有抗炎等功效，从植物体中提取难度大、产率低。通过在离体培养的植物细胞中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。 （1）图1中标识了质粒和基因N中限制酶的切割位点，基因N的b链为转录模板链。为将基因N正确插入质粒，引物1应添加的碱基序列是5′-______-3′，切割质粒时应选用的两种限制酶是______。质粒上的抗性基因______可用于初步筛选成功转化的植物细胞。 （2）耐高温的DNA聚合酶在PCR的______步骤中起作用。PCR扩增产物和质粒分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含N基因的重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后、质粒对应部分大小基本不变。进一步筛选转化的细胞，以1~4号细胞株中提取的DNA为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是______。初步判断实验组_____（从“1~4”中选填）的细胞中成功插入了基因N，理由是______。 （3）为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有______。 a.5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b.5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c.5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d.5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' 【答案】（1）①. AGATCT ②. BamHI、EcoRI ③. 2 （2）①. 延伸 ②. 检验PCR反应中是否有外源DNA污染 ③. 1 ④. 目的基因N大小约为2.3kb，实验组1的电泳结果与其大小接近 （3）GCC 【解析】 【分析】PCR技术的原理与操作：包括PCR扩增的原料组成（模板、引物、dNTP、酶、缓冲液），及PCR三个步骤（变性、复性、延伸）中DNA聚合酶的作用阶段。 【小问1详解】 基因N的b链为转录模板链，质粒上启动子与终止子之间有 BamHI 、EcoRI 和XbaI的识别序列，其中BamHI和XbaI会破坏目的基因，观察表格中限制酶识别序列及切割位点可知BglI和BamHI为同尾酶，，故选择BamHI 和 EcoRI 切割质粒，选择BglI和 EcoRI 切割目的基因，根据模板链为链，为基因N正确插入质粒，所以需要在引物1应添加BglI的碱基序列是5′-AGATCT-3′。T-DNA区域内的抗性基因 2 会随 T-DNA 整合到植物细胞染色体中，可通过添加对应抗生素初步筛选成功转化的植物细胞。 【小问2详解】 PCR 的延伸步骤中，耐高温的DNA聚合酶以DNA为模板，从引物 3' 端开始合成子链，该步骤需要耐高温DNA聚合酶催化。设置空白对照组（用无菌水代替模板DNA），目的是排除试剂、操作等引入的外源DNA污染，确保实验结果可靠。重组质粒大小约9.5kb，原质粒为7.2kb，因此基因N大小约为 9.5−7.2=2.3 kb。实验组1的电泳条带大小约2000bp（接近 2.3kb），与目的基因N的大小相符，说明成功插入了基因N。 【小问3详解】 密码子位于mRNA上，与DNA模板链互补，与引物（DNA链）反向互补。a引物的诱变序列为GCA（DNA链），对应mRNA密码子GCA。 根据引物a的GCA为第240位密码子对应序列，可知a引物第244位密码子开始对应的序列（TGG/CTG/TTT……），观察其与c引物上最前面一位密码子对应序列之后的完全一致，可知c引物最前面的GCC即是第243位密码子，也就是丙氨酸诱变序列，即丙氨酸的另一个密码子为GCC。 （2026·山东聊城·一模）35.弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）最具代表性的特异性抗原是CD20，超过95%的DLBCL病例强表达CD20.抗原蛋白CD19在正常B细胞和DLBCL细胞表面都可稳定、高密度表达，也是B细胞受信号通路的重要组成部分。双靶点嵌合抗原受体T细胞（CAR—T）疗法是未来治疗DLBCL的发展方向，科学家将患者T细胞改造成同时表达CD19抗原受体和CD20抗原受体（对应基因简称为CAR基因）的CAR—T细胞。其基本流程如图1、2所示： （1）从患者体内获取的T细胞主要有辅助性T细胞（Th）和细胞毒性T细胞（Tc），由Th细胞改造完成的CAR—T细胞受到抗原刺激后，可分泌______，促进正常B细胞的增殖分化；由Tc细胞改造完成的CAR—T细胞裂解DLBCL细胞需要受到_______的双信号刺激才能进行。 （2）CD19CAR—T细胞长期激活可能导致正常B细胞耗竭，影响体液免疫功能。为降低该风险，结合题目信息，从图2和图3中选择部分或全部元件，设计新的基因表达载体，在答题卡相应位置画出元件排列顺序示意图（一个基因单独或多个基因拼接共用一个启动子为一个元件），并辅以必要的文字说明_______。 （3）图4为利用无缝克隆（In—Fusion）技术构建含CAR基因的重组质粒流程图，其中In—Fusion酶可以将任何具有相同15~20bp末端序列的线性DNA分子进行无缝连接，实现高效稳定的同源重组。 ①图中过程Ⅰ是利用PCR技术将质粒线性化，为了保证扩增后的产物是图中所示的线性质粒，应该选择引物_______。CAR基因序列可以由生物科技公司合成，扩增CAR基因时，引物F和R序列要依据_______的末端序列设计。 ②为了筛选、鉴定构建成功的重组质粒，科研人员进行了如下操作：将重组质粒导入大肠杆菌，菌液涂布到含_______的培养基中，培养适宜时间后，挑取菌落并加入_______等进行菌落PCR，并通过电泳鉴定PCR产物。 ③与传统构建重组质粒的方法相比，In—Fusion技术的优点有_______。（答出两点即可） 【答案】（1）①. 细胞因子 ②. 抗原（或靶细胞 DLBCL 细胞）的接触和辅助性 T 细胞（Th）表面的特定分子 （2）元件排列顺序：。 文字说明： 利用pEF1α启动子持续表达nTA基因，nTA基因表达产物在没有四环素类抗生素时，无法激活pTRE启动子。 当正常B细胞出现耗竭风险时，向患者体内注入四环素类抗生素，nTA基因表达产物结合四环素类抗生素后，激活pTRE启动子，启动vp3基因表达，vp3基因表达产物诱导CAR—T细胞凋亡，从而减少CAR—T细胞数量，降低正常B细胞耗竭的风险。 （3）①. 引物2和引物3 ②. Pc 和 Ter ③. 氨苄青霉素 ④. PCR 缓冲液、Taq 酶、dNTP、特异性引物 ⑤. 对比传统构建重组质粒，In一Fusion 技术的优势有不受限制酶酶切位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏等。 【解析】 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【小问1详解】 如白细胞介素 - 4、白细胞介素 - 6 等）：辅助性 T 细胞（Th）受抗原刺激后，会分泌细胞因子，这些细胞因子可以促进 B 细胞的增殖分化，形成浆细胞和记忆细胞。细胞毒性 T 细胞（Tc）的活化需要双信号刺激，第一信号来自其与靶细胞（DLBCL 细胞）的接触，第二信号来自辅助性 T 细胞（Th）提供的共刺激信号。 【小问2详解】 为了降低 CD19CAR-T 细胞长期激活导致正常 B 细胞耗竭的风险，我们可以设计一个可诱导的 “自杀开关” 系统，在需要时清除过度激活的 CAR-T 细胞。降低CD19CAR—T细胞长期激活导致正常B细胞耗竭的风险，元件排列顺序：pEF1α启动子 → nTA基因 → vp3基因 → pTRE启动子 → CAR基因。如图： 文字说明： 利用pEF1α启动子持续表达nTA基因，nTA基因表达产物在没有四环素类抗生素时，无法激活pTRE启动子。 当正常B细胞出现耗竭风险时，向患者体内注入四环素类抗生素，nTA基因表达产物结合四环素类抗生素后，激活pTRE启动子，启动vp3基因表达，vp3基因表达产物诱导CAR—T细胞凋亡，从而减少CAR—T细胞数量，降低正常B细胞耗竭的风险。 【小问3详解】 ①引物选择与设计：应选择引物2和 3（或根据图中线性化位点选择能扩增出完整线性化质粒的引物对）。PCR 扩增时，引物需要与模板链的 3' 端互补，从而保证扩增产物是图中所示的线性化质粒。扩增 CAR 基因时，引物 F 和 R 序列要依据线性化质粒的末端序列设计，即Pc 和 Ter的末端序列。这样才能保证扩增出的 CAR 基因两端与线性化质粒的末端序列相同，以便 In-Fusion 酶进行无缝连接。 ②筛选与鉴定： 菌液应涂布到含氨苄青霉素 的培养基中。因为重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因（Ampr），只有成功导入质粒的大肠杆菌才能在该培养基上生长。 挑取菌落并加入 PCR 缓冲液、Taq 酶、dNTP、特异性引物 等进行菌落 PCR，通过电泳鉴定 PCR 产物的大小，判断 CAR 基因是否成功插入。 ③ In—Fusion 技术的优点：不受限制酶酶切位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏；无需酶切 和连接，简化实验流程等。 （2026·山东济宁·一模）36.科学家通过基因工程改造大肠杆菌，实现规模化生产人胰岛素；利用蛋白质工程优化胰岛素结构，通过将胰岛素B链的第28位氨基酸-脯氨酸（密码子为CCU）替换为天冬氨酸（密码子为GAU），有效抑制了胰岛素的聚合，研发出速效胰岛素类似物产品。图1是运用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构，图2是利用大引物PCR技术引入特定位点突变的流程。回答下列问题。 （1）图1中质粒作为载体时未标出的必需结构是____。为保证目的基因与载体正向连接，扩增目的基因时，上游引物的5’端应添加限制酶____的识别序列，下游引物5’端的15个碱基序列为5’-____-3’。 （2）β-半乳糖苷酶可以将无色X-gal分解产生蓝色物质。筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，培养基中需添加____，从____色菌落中选择。 （3）图2中，为了得到可表达出速效胰岛素类似物的改良基因，进行第一次PCR时，上游引物对应突变位点的碱基序列是5’-____-3’。利用所获得的大引物、模板和其他引物等进行第二次PCR时，至少要进行____次循环，才能获得完成定点突变、双链等长的改良基因。 【答案】（1）①. 终止子 ②. XhoI ③. CAATTGGTAGTCGAA （2）①. 氨苄青霉素和X-gal ②. 白 （3）①. GAT ②. 2 【解析】 【分析】一个基因表达载体的组成，除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：①不能破坏目的基因；②不能破坏所有的抗性基因（至少保留一个）；③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自身环化和质粒的自身环化。 【小问1详解】 载体需具备启动子、终止子、标记基因、复制原点和限制酶切割位点等，图1质粒未标出的必需结构是终止子。为保证目的基因与载体正向连接且不破坏目的基因和标记基因，限制酶Sal I会破坏两个标记基因，NheⅠ会破坏目的基因，所以选择MunⅠ和XhoⅠ进行双酶切，因此为保证目的基因与载体正向连接，扩增目的基因时，上游引物的5'端应添加限制酶XhoⅠ的识别序列，下游引物的5'端应添加限制酶MunⅠ的识别序列，所以下游引物5'端的15个碱基序列为5'-CAATTGGTAGTCGAA-3'。 【小问2详解】 已知β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。而结合题图，目的基因的插入破坏了lacZ基因的结构，使其不能正常表达，无法产生β-半乳糖苷酶，底物X-gal不会被分解，则菌落呈现白色。故应将转化后的大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上，筛选出的白色的菌落即为含有重组质粒的大肠杆菌菌落。 【小问3详解】 根据碱基互补配对原则，B链的第28位氨基酸—脯氨酸(密码子为CCU)替换为天冬氨酸 (密码子为GAU)，则需要将转录模板链相应位置GGA改为CTA，那么与之结合的相应引物的序列应由CCT改为GAT。利用大引物②链作为下游引物和常规上游引物共同进行PCR时，根据PCR过程和DNA分子半保留复制特点可知，第一轮得到两个DNA分子，其中一个DNA分子一条链含大引物②（含突变位点）另一条链为模板链（不含突变位点），两条链不等长；另一个DNA分子和模板DNA一样（无突变位点）。第二次循环中，以含有大引物②的DNA单链为模板，以常规引物复制得到的DNA分子即为完成定点突变、双链等长的改良基因。 （2026·山东德州·一模）37.S蛋白能够特异性识别癌细胞表面抗原，L蛋白是一种可被低氧环境激活的菌体裂解酶，科研人员将S蛋白基因和L蛋白基因连接为S-L融合基因，利用腺病毒AAV构建基因表达载体，再利用AAV和大肠杆菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，将S-L融合基因导入大肠杆菌基因组中，构建出能够精准递送抗癌药物的工程菌。 图1：S-L融合基因的构建过程 图2：同源重组替换基因的过程 （1）已知S蛋白基因转录时以b链为模板，L基因转录时以a链为模板。在构建S-L融合基因时，最好使用限制酶___________分别切割S蛋白基因和L蛋白基因，再用___________酶连接。将S-L融合基因连接至AAV载体时，需利用限制酶___________对S-L融合基因进行切割。 （2）AAV作为载体应具备的条件有___________(答出两点)。 （3）将基因表达载体导入大肠杆菌后，获得甲、乙两种大肠杆菌，分别提取其DNA，加入引物1、2、3扩增并电泳，结果如图3所示。其中成功导入S-L融合基因的大肠杆菌为___________(填“甲”或“乙”)；条带③为用引物___________扩增的产物。 （4）已知癌细胞周围为低氧环境。把抗癌药物注入含S-L融合基因的工程菌中，该工程菌可实现抗癌药物的精准递送，分析其机理是___________。 【答案】（1）①. XbaⅠ、SpeⅠ ②. DNA连接 ③. PstⅠ、BglⅡ （2）有多个限制酶酶切位点、基因能够在受体细胞内自我复制或整合到受体细胞DNA中，随着宿主细胞DNA复制而复制、有标记基因、对宿主细胞无害 （3） ①. 乙 ②. 引物1和引物2 （4）工程菌中表达的S蛋白可特异性结合癌细胞抗原，将工程菌引至癌细胞，癌细胞周围的低氧环境激活L蛋白导致工程菌破裂，抗癌药物释放 【解析】 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【小问1详解】 构建S-L融合基因需保证两个基因转录方向一致（S基因以b链为模板、L基因以a链为模板），XbaⅠ和 SpeⅠ切割后可使S、L基因产生互补黏性末端，实现定向连接，避免反向连接导致基因表达异常。限制酶切割基因后产生的DNA片段，需通过DNA连接酶恢复脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，才能将S、L基因连接为S-L融合基因。这两种限制酶的酶切位点位于S-L融合基因的两端，切割后可使融合基因产生特异性末端，能定向插入AAV载体的对应酶切位点，同时保证融合基因的完整，避免自身环化或载体自连。 【小问2详解】 基因工程载体需满足目的基因的装载、传递、稳定遗传和筛选等核心需求，必备条件为：有多个限制酶酶切位点，便于根据目的基因选择合适酶切位点，插入目的基因且不破坏载体自身结构；能在受体细胞内自我复制（或整合到受体细胞DNA 中，随宿主细胞DNA同步复制），保证目的基因在受体细胞中稳定遗传并扩增； 有标记基因（如抗性基因），便于通过选择培养基筛选出成功导入目的基因的受体细胞； 对宿主细胞无害，不影响受体细胞的正常生命活动，确保受体细胞能正常增殖、表达目的基因。 【小问3详解】 未导入S-L融合基因的大肠杆菌（甲），其基因组中无该融合基因，仅能扩增出少量短片段，电泳条带少；而成功导入融合基因的大肠杆菌（乙），引物可结合融合基因及大肠杆菌基因组的同源区段，扩增出不同长度的DNA片段，因此电泳出现①②③三条条带，条带数量多于甲。PCR扩增产物的长度由引物结合的模板位置决定，引物1和引物2分别结合在S-L融合基因的两端，扩增的DNA片段长度最长；电泳中DNA片段越长，迁移速率越慢，因此最长的扩增产物对应条带③（条带①②为引物1和引物3、引物2和引物3组合扩增的短片段，迁移速率更快）。 【小问4详解】 该过程依托S蛋白和L蛋白的特异性功能，实现抗癌药物的靶向定位和定向释放，两步完成精准递送： 靶向定位：工程菌中S-L融合基因表达出S蛋白，S蛋白能特异性识别并结合癌细胞表面的抗原，使携带抗癌药物的工程菌被精准引导至癌细胞周围，避免药物作用于正常细胞； 定向释放：癌细胞周围为低氧环境，可激活工程菌表达的L蛋白（菌体裂解酶），L蛋白发挥裂解作用使工程菌的菌体破裂，内部装载的抗癌药物随即释放，精准作用于癌细胞，实现药物的靶向递送。 / 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 猜押08 生物技术与工程 题型 考情分析 命题趋势 考向预测 发酵工程 2025年山东卷第15题： 无菌技术、微生物的接种方法、其他微生物的分离与计数、验证性实验与探究性实验 2025年山东卷第20题： 果酒和果醋的制作原理、果酒和果醋的制作流程及实验分析 2024年山东卷第14题： 发酵工程的应用 2024年山东卷第15题： 微生物的培养与菌种保藏、验证性实验与探究性实验 2023年山东卷第12题: 泡菜的腌制 2023年山东卷第15题: 培养基的成分及其功能、无菌技术、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 2023年山东卷第20题: 果酒和果醋的制作原理 发酵工程考点考查频繁。常考传统发酵技术，如2023年考泡菜制作、果酒和啤酒发酵原理；微生物培养技术，像2023年考平板接种、2021年考解脂菌相关实验。考查结合生活生产，注重知识理解运用。 1. 传统发酵技术：果酒、果醋、泡菜的制作原理、流程及实验误差分析仍为重点，可能结合具体生产场景设计探究性实验； 2. 微生物培养：无菌技术的操作细节、微生物分离与计数的实验步骤及数据处理，大概率以选择题或实验题形式考查； 3. 发酵工程应用：结合食品加工、环保等实际场景，考查发酵技术的具体应用及原理，注重知识的迁移运用。 细胞工程 2025年山东卷第14题： PCR扩增的原理与过程、动物细胞培养技术、克隆 2024年山东卷第20题： 植物体细胞杂交技术、植物细胞工程的实际应用 2023年山东卷第14题： 植物细胞工程的实际应用 细胞工程与胚胎工程考点均有涉及。题型涵盖选择与简答题，分值3-9分。植物组织培养、体细胞杂交，动物细胞培养、核移植，单克隆抗体制备，胚胎发育、移植与分割等是考查重点，常结合科研实例，注重知识运用与分析能力。 1. 植物细胞工程：植物组织培养的条件、流程，植物体细胞杂交的操作步骤及应用，可能结合作物育种实例考查； 2. 动物细胞工程：动物细胞培养的条件、单克隆抗体制备的流程及应用，克隆技术的原理及伦理问题，大概率以简答题形式考查； 3. 结合胚胎工程相关知识，考查细胞工程与胚胎工程的综合应用，注重科研实例的分析与解读。 基因工程 2025年山东卷第25题： PCR扩增的原理与过程、DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 2024年山东卷第13题： DNA的粗提取及鉴定 2024年山东卷第25题： 基因分离定律的实质和应用、DNA重组技术的基本工具、目的基因的检测与鉴定 2023年山东卷第25题： PCR扩增的原理与过程、DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 基因工程考点考查频繁。重点考查基因工程的基本工具，如限制酶、DNA连接酶；基本操作程序，像目的基因获取、表达载体构建等，常结合实际案例，考查学生知识运用与分析能力。题目难度系数大；其中启动子的插入位点和插入方向、报告基因的表达等都需要学生有很强的理解信息、获取信息的能力 1. 基本工具：限制酶、DNA连接酶、载体的作用及特点，可能结合具体序列考查限制酶的切割位点； 2. 基本操作程序：PCR扩增的原理、过程及条件，基因表达载体的构建，目的基因的检测与鉴定方法，为考查核心；3. 综合应用：结合遗传病治疗、作物育种等实际案例，考查基因工程的应用及伦理问题，题目难度较大，注重信息获取和综合分析能力的考查，可能结合孟德尔遗传定律综合命题。 猜押点1 发酵工程 （2026·山东德州·一模）1.泡菜和食醋既可通过传统发酵技术获得，也可利用发酵工程进行工业化生产。下列说法错误的是（ ） A. 醋酸发酵过程中醋酸菌繁殖越快发酵产物的产量越高 B. 与传统发酵相比，发酵工程更易保证产品品质的稳定性 C. 泡菜和食醋制作过程中的发酵产物会抑制杂菌的繁殖 D. 泡菜和食醋的制作分别依赖乳酸菌的无氧呼吸和醋酸菌的有氧呼吸 （2026·山东日照·一模）2.与传统发酵相比，发酵工程的产品种类更加丰富，产量和质量均明显提高。下列说法正确的是（ ） A. 传统发酵无需进行消毒、灭菌，而发酵工程需要消毒、灭菌 B. 发酵条件变化会影响微生物生长繁殖，但不影响其代谢途径 C. 发酵罐内的发酵可以通过反馈控制使发酵过程处于最佳状态 D. 发酵工程可获得大量微生物菌体并从菌体中提取单细胞蛋白 1．传统发酵技术及发酵工程 (1)传统食品的制作技术 类型 果酒 果醋 腐乳 泡菜 菌种 酵母菌 醋酸菌 毛霉 乳酸菌 原理 酵母菌无氧呼吸产生酒精 毛霉等微生物通过发酵分解蛋白质 醋酸菌有氧呼吸产生乙酸 乳酸菌无氧呼吸产生乳酸 控制条件 前期有氧，后期无氧，18~30°C 有氧，30~35°C 有氧，15-18°C 无氧，常温 提醒 ①果酒、果醋、泡菜制作过程中发酵液pH均呈下降趋势，但原因不同。 ②传统发酵过程中一般不需要严格灭菌，目标菌种的快速建立以及发酵形成的环境条件会抑制杂菌的生长繁殖。 ③传统发酵一般为混合菌种发酵，品质不一，现代工业发酵一般为单一菌种发酵，品质较高。 (2)制作果酒、果醋的装置图解读 Ⅰ.充气口：在醋酸发酵时连接充气泵进行充气。 Ⅱ.排气口：排出酒精发酵时产生的CO2。 Ⅲ.出料口：用于取样。 [深度思考]①使用该装置制作果酒时，应该关闭充气口；制作果醋时，应将充气口连接充气泵，输入氧气。 ②与排气口相连的长而弯曲的胶管作用是防止空气中微生物的污染。 (3)发酵工程的基本环节 项目 内容 配制培养基 ①配制原则：目的明确、营养协调、pH 适宜 ②营养构成：水、无机盐、碳源、氮源等 ③注意：培养基使用前要经过反复试验才能用于大规模生产 灭菌 ①目的：防止杂菌污染 ②对象：培养基和发酵设备 选育菌种 条件：环境条件稳定、温和，有利于菌种生长繁殖 途径： ①从自然界中筛选的菌种 ②通过诱变育种或基因工程育种获得的菌种 扩大培养 目的：增加菌种数量 所用培养基：通常用液体培养基 接种 条件：无菌 发酵罐内发酵 地位：中心环节 监控： ①随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程 ②及时添加必需的营养组分来延长菌体生长稳定期的时间，以得到更多发酵产物 ③严格控制温度、pH、溶解氧等发酵条件，以保证产品质量和产量 分离、提纯产物 ①若发酵产品为微生物细胞本身，可采用过滤、沉淀等方法分离、干燥 ②若产品为代谢物，可根据产物的性质采用蒸馏、萃取等方法分离、提纯获得产品 2．微生物培养、分离与计数 (1)无菌技术常用方法 (2)两种纯化微生物方法的比较 项目 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化原理 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面 将菌液进行一系列的梯度稀释，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞 主要步骤 平板划线操作 等比稀释操作和涂布平板操作 接种工具 接种环 涂布器 平板示意图 [深度思考]①为了确定培养基的灭菌是否合格，微生物实验如何设置空白对照？ 提示：随机取若干灭菌后的空白平板培养基在适宜条件下培养一段时间，观察培养基上是否有菌落生成。 ②采用固体平板培养时为什么要倒置？ 提示：既可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染，又可以避免培养基中的水分过快地挥发。 猜押点2 细胞工程 （2026·山东德州·一模）1.紫草的次生代谢物紫草宁具有抗肿瘤作用，滇紫草的次生代谢物紫草素具有抗炎作用。将色氨酸营养缺陷型紫草细胞与亮氨酸营养缺陷型滇紫草细胞融合，再用特定培养基筛选得到杂种细胞。杂种细胞在茉莉酸甲酯的调控下，能同时合成紫草宁和紫草素，且其含量提升2.5倍。下列说法正确的是（ ） A. 紫草宁与紫草素是植物生长和生存所必需的代谢产物 B. 筛选杂种细胞的特定培养基中需要添加色氨酸和亮氨酸 C. 茉莉酸甲酯可调控紫草宁和紫草素合成相关基因的表达 D. PEG是促细胞融合剂，可直接诱导紫草和滇紫草细胞的融合 （2026·山东潍坊·一模）2.（不定项）为培育高产青蒿素的青蒿品系，科研人员利用EMS（可使DNA中鸟嘌呤在复制时与胸腺嘧啶配对）处理青蒿愈伤组织，再通过植物组织培养获得突变植株。下列说法正确的是（ ） A. 愈伤组织形成植株的过程，需保持培养基中生长素和细胞分裂素比例恒定 B. 愈伤组织细胞高度分化，易受EMS诱导发生基因突变 C. EMS处理后DNA中嘌呤和嘧啶比例未发生变化 D. 用微型繁殖技术培养突变植株，有利于高产性状稳定遗传 （2026·山东潍坊·一模）3.研究人员将小鼠iPS细胞在体外诱导，产生了类似于内细胞团样的拟胚体。下列说法错误的是（ ） A. iPS细胞是在体外诱导产生的，功能类似于胚胎干细胞 B. iPS细胞发育为拟胚体的过程中不需要用胰蛋白酶处理 C. 通过定向诱导，拟胚体细胞可能分化成小鼠各种组织细胞 D. 将拟胚体移入发情处理的母鼠子宫内可能发育成新个体 （2026·山东滨州·一模）4.母亲线粒体的有害突变会遗传给孩子，为避免这种情况，科研人员研发了“线粒体置换术”：首先取患者甲的卵母细胞核，然后将核注入乙的去核卵母细胞中，重组后的卵母细胞与甲的丈夫（丙）的精子受精，体外培养后植入甲的子宫，分娩得到胎儿丁。下列说法错误的是（ ） A. 甲、乙卵母细胞需要发育到MII期才能进行“线粒体置换术” B. 去核中的“核”指的是细胞骨架－染色体的复合物 C. 受精所需的精子需要先用载体等处理 D. 胎儿丁的遗传物质绝大部分来自于甲和丙 1．植物细胞工程 (1)植物组织培养的原理及过程 [深度思考]①植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。 ②脱分化阶段不需要光，再分化阶段需要光。 ③生长素与细胞分裂素的比值高时，促进根的分化、抑制芽的形成；比值低时，促进芽的分化、抑制根的形成。 ④体内细胞未表现全能性的原因是在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性地表达。 (2)植物体细胞杂交技术 [深度思考]①原生质体融合成功的标志是再生出细胞壁。植物体细胞杂交完成的标志是培育出杂种植株。 ②植物体细胞杂交的培养基中要添加蔗糖溶液且浓度略大于原生质体内的浓度，原因是这样不仅能为原生质体提供营养，还能维持一定的渗透压，使原生质体保持正常的形态。 (3)针对两类目标(试管苗、细胞产物)的培养流程 [深度思考]①植物细胞培养技术在生产中通常要培养到愈伤组织阶段。因为此时细胞分裂能力旺盛，代谢快，有利于产物生成。 ②植物组织培养的原理是植物细胞的全能性，植物细胞培养的原理是细胞增殖。 2．动物细胞工程 (1)动物细胞培养的过程 [深度思考]①保障无菌、无毒的措施有对培养液和所有培养用具进行灭菌处理以及在无菌条件下进行操作，定期更换培养液。 ②动物细胞培养所需气体主要有O2和CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。在进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶，并将它们置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。 ③动物细胞培养过程中两次使用胰蛋白酶的作用分别是第一次：处理剪碎的组织，使其分散成单个细胞；第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来分散成单个细胞。 ④区分原代培养和传代培养的关键：是否分瓶培养。 (2)单克隆抗体的制备过程和特点 3．胚胎工程 (1)胚胎工程的操作流程 (2)归纳胚胎工程中的3个“两” ①在实际胚胎工程操作中，常以观察到两个极体或者雌、雄原核作为受精的标志 ②胚胎移植过程中两次使用激素:第一次是对供、受体进行同期发情处理，第二次用于供体的超数排卵 ③胚胎移植或分割的两个时期:桑葚胚和囊胚 (3)胚胎分割的时间和关键点 ①材料：发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚 ②实质：胚胎分割可增加动物后代的数量，其实质是动物的无性繁殖或克隆 ③成功关键点：在分割囊胚阶段的胚胎时，要注意将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。对未知性别的胚胎可以取样滋养层，做DNA分析进行性别鉴定。 猜押点3 基因工程 （2026·山东临沂·一模）1.（2026·山东临沂·一模）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法错误的是（ ） A. PCR复性温度与引物的长度以及引物中GC碱基的相对含量有关 B. 实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理 C. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 D. 在同一电场作用下，通常DNA片段越长，在凝胶中迁移速率越慢 （2026·山东潍坊·一模）2.同源重组技术是指利用目的基因与插入位点两端的同源序列实现目的基因的定向插入。为研究马铃薯抗马铃薯早疫病菌（As）感染的能力是否与S基因表达有关，研究人员用PCR技术扩增S基因反义片段，通过同源重组技术将反义片段插入Ti质粒，并将该质粒导入抗As马铃薯植株中，过程如图1所示。反义片段转录形成的RNA可与S基因的mRNA互补结合，从而抑制S基因的表达。 （1）农杆菌转化法中的转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内______的过程。反义片段转录形成的RNA抑制了S基因表达的______过程。 （2）用限制酶切割图1中质粒会产生黏性末端，需用DNA聚合酶将产生的黏性末端补平，该过程应选用的限制酶是______。利用同源重组技术获得重组质粒，需要引物在片段末端加入与切割位点末端相同的同源序列，引物F和R所含的同源序列分别为5′-______-3′和5′-______-3′（两空只写出与扩增的S基因片段末端序列相连的3个碱基）。 （3）将反义片段转入抗As马铃薯细胞后，需在培养基中加入______（填“卡那霉素”“氨苄青霉素”或“卡那霉素和氨苄青霉素”）进行筛选。 （4）将三种植株分别接种致病菌，菌斑大小和未接种致病菌植株各个生长指标的相对值如图2所示。 据图2分析，S基因对马铃薯植株的作用是______。成功转入S基因反义片段植株与敲除S基因的植株生长指标有明显差异，推测原因是______。 1．基因工程的三种基本工具 ①限制性内切核酸酶（限制酶） 作用;识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 使用方法一般用相同限制酶切割载体和目的基因 ②DNA连接酶：E.coliDNA连接酶，T4DNA连接酶 ③载体：能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选 2．基因工程的基本操作程序 [深度思考]①目的基因主要是指编码蛋白质的基因，在已有mRNA前提下，可通过逆转录法获取目的基因。当基因较小且序列已知时，可采用化学合成法进行人工合成。 ②目的基因应插在启动子与终止子之间。 ③农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 3．限制酶的选择技巧 (1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限制酶Sma Ⅰ。 ②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙)。 (2)根据质粒的特点选择限制酶(如图) (3)根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶。图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(假设切割目的基因的限制酶为Xba Ⅰ和Sac Ⅰ)。 4．蛋白质工程 5．DNA的粗提取与鉴定 ①原理： 利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分 ②DNA性质：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；DNA能溶于2mol·L-1的NaCI溶液 ③鉴定：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色 ④步骤： 研磨一过滤(取上清液)一加人体积相等的、预冷的酒精(体积分数为95%)，静置2~3min-搅拌(或离心)一取白色丝状物(或沉淀物)-溶解鉴定DNA （2026·山东济宁·一模）1.放线菌是一种放射状生长的微生物，人们利用其变种JGs通过发酵工程大规模生产氨基寡糖类抗生素——井冈霉素，广泛应用于水稻病害防治。下列叙述正确的是（ ） A. JGs产生井冈霉素是因为它含有直接编码井冈霉素的基因 B. 可采取适当的提取、分离和纯化措施分离单细胞蛋白 C. 可用稀释涂布平板法对JGs活细胞数量准确计数 D. 利用井冈霉素防治水稻病害，属于生物防治 （2026·山东东营·一模）2.谷氨酸棒状杆菌可用于发酵工程生产谷氨酸，发酵过程中，通常需要分次加入氨水。培养基中的碳氮比会影响菌体的繁殖和谷氨酸的合成量。下列说法错误的是（ ） A. 性状优良的菌种可从自然界中筛选，也可通过诱变育种等获得 B. 发酵需要大量菌种，菌种的扩大培养是发酵工程的中心环节 C. 加入氨水可为菌种提供氮源，也能调节发酵液的pH D. 发酵过程中要严格控制温度、pH及培养基碳氮比等条件 （2026·山东菏泽·一模）3.（不定项）利用发酵技术生产青霉素时，总有头孢霉素产生。研究发现青霉素和头孢霉素有一个共同的前体物质，该前体物质在不同酶的作用下分别合成青霉素和头孢霉素。下列说法错误的是（ ） A. 由于抗生素有抗菌作用，通入发酵罐的空气不需要经过灭菌 B. 通过敲除控制前体合成的酶的基因，可以使青霉菌只产生一种产物 C. 青霉菌可以同时产生大量青霉素和头孢霉素两种单细胞蛋白 D. 发酵结束时可采用适当的提取、分离和纯化措施获取青霉素 （2026·山东聊城·一模）4.（不定项）传统啤酒酿造过程中，发酵在敞开式发酵池中进行，麦芽汁中接入酿酒酵母后通入大量无菌空气，之后会产生大量气体翻腾逸出，在麦芽汁表面形成25~30cm厚的泡盖（气泡层），然后停止通气，进入静止发酵阶段，一段时间后可得啤酒。下列叙述错误的是（ ） A. 传统啤酒酿造过程中所需的菌种无需选育，也不需要对菌种扩大培养 B. 泡盖的形成是由于酵母菌有氧呼吸产生大量CO2，能将麦芽汁与空气隔绝 C. 焙烤大麦芽可杀死活细胞并使淀粉酶失去活性，有利于增加麦芽汁中麦芽糖的含量 D. 静止发酵阶段相当于现代啤酒发酵工程的后发酵阶段 （2026·山东青岛·一模）5.（不定项）某醋厂和啤酒厂的工艺流程如图所示。酒曲含有霉菌、酵母菌、乳酸菌；醋醅含有醋酸菌；糖化即淀粉水解过程。下列相关叙述正确的有（ ） A. 糯米“蒸熟”与大米“蒸煮”的目的是利于糖化和灭菌 B. 发酵原理是利用真菌的无氧呼吸与细菌的有氧呼吸 C. 醋酸发酵过程中经常翻动发酵物，可控制发酵温度和改善通气状况 D. 啤酒酿造流程中适当增加溶解氧可缩短发酵时间 （2026·山东菏泽·一模）6.下列关于微生物培养技术及应用的叙述，正确的是（ ） A. 配制培养基时，应先调节pH，再进行灭菌处理 B. 利用以尿素为唯一氮源的选择培养基从土壤中分离的细菌都能分解尿素 C. 接种后需立即倒置培养以避免皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染 D. 稀释涂布平板法和平板划线法均可用于微生物的分离和计数 （2026·山东临沂·一模）7.科研人员通过稀释涂布平板法筛选出高耐受且降解金霉素能力强的菌株，旨在解决金霉素过量使用所导致的环境污染问题。下列说法错误的是（ ） A. 以金霉素为唯一碳源制备选择培养基 B. 接种时，用涂布器蘸取菌液并均匀地涂布在培养基表面 C. 实验中需增加一个未接种的平板作为对照 D. 逐步提高培养基中金霉素的浓度有助于获得高耐受的菌株 （2026·山东淄博·一模）8.科研人员以甲醇为原料，利用毕赤酵母工厂化生产单细胞蛋白用于饲料生产，相关流程如图所示。下列说法正确的是（ ） A. ①中提高甲醇浓度和培养温度可定向获得耐高温和高甲醇耐受性的菌株 B. ②中的种子培养基属于选择培养基 C. ④可以采用提取、分离和纯化措施从发酵液中获得单细胞蛋白 D. ⑤中获得的单细胞蛋白属于毕赤酵母的次生代谢产物 （2026·山东潍坊·一模）9.用紫外线照射野生型大肠杆菌后，筛选精氨酸营养缺陷型菌株（缺乏将鸟氨酸转化为精氨酸的酶）的流程如图。其中过程①是稀释涂布平板，过程②是将培养基甲上的菌落平移到培养基乙上，继续培养一段时间。下列说法错误的是（ ） A. 过程①中，待涂布的菌液被培养基吸收后应将培养基倒置 B. 甲、乙培养基成分的区别在于是否含有精氨酸 C. 培养基甲中菌落b即为精氨酸营养缺陷型菌株 D. 紫外线照射会提高精氨酸营养缺陷型菌株占突变型菌株的比例 （2026·山东日照·一模）10. PHA是由嗜盐细菌合成的一种胞内聚酯。科学家从某咸水湖中寻找生产PHA菌种的大致流程如图所示。下列说法错误的是（ ） A. ②④需使用添加高浓度盐的培养基 B. 过程②中接种环每次使用前后均需灼烧灭菌 C. 应选取细菌数量与PHA含量比值小的菌株作为目标菌株 D. 若从盐碱地寻找菌种，需在②之前对土壤浸出液进行梯度稀释 （2026·山东聊城·一模）11.影印平板培养法是使在一系列培养基的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法。科研人员用该方法分离纯化具有链霉素抗性的大肠杆菌，过程如图所示。下列叙述正确的是（ ） A. 突变和基因重组可作为大肠杆菌进化的原材料 B. 图中只有3、7、11号培养基需要添加链霉素 C. 图中含链霉素的培养基的菌落周围会出现抑菌圈 D. 该实验可证明链霉素能诱导大肠杆菌产生耐药性 （2026·山东德州·一模）12.（不定项）尿素在高温下易分解，也能被脲酶分解，分解产物能使酚红指示剂变红。为从土壤中筛选出尿素分解菌，实验人员配制不含氮源的培养基(添加酚红指示剂)，向其中加入过滤除菌的尿素后用HCl调至橙黄色，然后倒平板。将1g土壤样品溶于99mL无菌水后再稀释104倍，取菌液0.1mL涂布于上述平板并培养，统计平均菌落数为120个。下列说法正确的是（ ） A. 制备培养基时，应先对培养基灭菌再加入尿素 B. 涂布接种时，用涂布器蘸取0.1mL菌液并均匀地涂布在平板上 C. 红色圈与菌落直径比值大的菌落中的菌株分解尿素能力强 D. 1g土壤样品中尿素分解菌的数目约为1.2×109个 （2026·山东济宁·一模）13.（不定项）ε-聚赖氨酸（ε-PL）是一种天然食品防腐剂。科研人员从土壤中分离分泌ε-PL的微生物，部分实验操作如图所示，Ⅰ~Ⅴ表示过程，①~③表示菌落，ε-PL使亚甲基蓝褪色，形成透明圈。下列叙述错误的是（ ） A. 实验中需对土样、培养基和培养皿等进行灭菌处理 B. Ⅰ过程接种后的培养皿不能立即进行倒置培养 C. 发酵产物ε-PL需从微生物体内分离提纯 D. 应挑取乙培养基上①菌落，涂布接种到丙培养基上 （2026·山东东营·一模）14.（不定项）营养缺陷型菌株是指野生型菌株失去了合成某种物质的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子后才能生长。夹心平板培养法可用于营养缺陷型菌株的检出，其原理如图1所示，先在培养皿上倒一层基本培养基，凝固后再接种一层待检菌液，其上再浇一薄层基本培养基，凝固后培养出菌落，再倒一层X培养基继续培养，最终培养结果如图2所示。下列说法错误的是（ ） A. X培养基中含有水、氮源、碳源、无机盐和特殊的营养因子等 B. 菌落A为检出的营养缺陷型菌株，菌落B为野生型菌株 C. 在培养细菌时一般需将培养基调至中性或弱酸性 D. 该实验无需设置未接种的夹层平板作为对照 （2026·山东东营·一模）15.研究者欲利用原生质体融合技术将两种药用植物细胞融合，以实现有效成分的工厂化生产。下列说法正确的是（ ） A. 操作前需用乙醇和次氯酸钠溶液等对外植体进行消毒 B. 应将植物细胞置于无菌水中去除细胞壁 C. 杂种细胞形成愈伤组织的过程体现了植物细胞的全能性 D. 愈伤组织产生的次生代谢产物是植物生命活动所必需的 （2026·山东日照·一模）16.研究人员利用细胞工程技术生产紫杉醇的大致流程如图所示。下列说法错误的是（ ） A. 过程①脱分化得到的愈伤组织具有较高的分裂分化能力 B. 过程②振荡培养有利于细胞充分接触培养液并增加其溶氧量 C. 过程③中过滤的目的是除去细胞团获得较纯净的单细胞悬浮液 D. 过程⑤主要是利用促进细胞生长的营养条件提高单细胞中紫杉醇含量 （2026·山东临沂·一模）17.（不定项）植物甲抗旱、抗病性强，植物乙分蘖能力强、结实性好。科研人员通过植物体细胞杂交技术培育出兼有甲、乙优良性状的植物丙，过程如图所示。下列说法错误的是（ ） A. 过程①中酶处理的时间有差异，原因可能是两种亲本的细胞壁结构有差异 B. 过程②是该技术的关键环节，融合的细胞均具有两种细胞的遗传物质 C. 过程④的培养基中不需要添加生长素和细胞分裂素 D. 可通过分析丙的染色体来鉴定是否为杂种植株 （2026·山东德州·一模）18.中国克隆牛“康康”的培育流程如下：将良种肉牛的体细胞直接注入去核卵母细胞中，经诱导融合形成重构胚；对重构胚人工激活与体外培养后，筛选合格胚胎移植至代孕母牛子宫内，使其完成胚胎发育。下列说法错误的是（ ） A. “康康”的细胞质基因来源于受体细胞和供体细胞 B. 利用梯度离心法可不穿透透明带去除纺锤体—染色体复合物 C. 可用电刺激或Ca2+载体激活重构胚，使其完成发育进程 D. 将重构胚培养至囊胚期，取内细胞团细胞进行DNA分析后方可移植 （2026·山东济宁·一模）19. PER.C6细胞系是通过转染人5型腺病毒E1基因而永生化的人胚胎视网膜上皮细胞系，可以在大型生物反应器中悬浮生长至高密度，适于制备流感疫苗。下列叙述正确的是（ ） A. 通常在培养液中通入5%的CO2以刺激细胞呼吸 B. E1基因改变了人胚胎视网膜上皮细胞的生长特性 C. PER.C6细胞为流感病毒的增殖提供模板、原料条件 D. PER.C6细胞需定期用胰蛋白酶处理后才能继续增殖 （2026·山东淄博·一模）20.科研人员将患镰状细胞贫血小鼠的成纤维细胞经原代培养和传代培养后，通过体外诱导，获得多能干细胞（iPS细胞），并对iPS细胞进行基因编辑修复突变位点后用于治疗小鼠的镰状细胞贫血。下列说法错误的是（ ） A. 出现接触抑制的原代培养的成纤维细胞，更适合用于诱导iPS细胞 B. 传代培养小鼠成纤维细胞时应定期更换培养液，以清除代谢废物并补充营养物质 C. 可借助病毒将关键转录因子基因导入小鼠成纤维细胞来诱导形成iPS细胞 D. 只需将基因编辑后的iPS细胞直接注射进小鼠骨髓即可治疗镰状细胞贫血 （2026·山东临沂·一模）21.如图是制备抗白细胞介素-6（IL-6）单克隆抗体的示意图。下列说法错误的是（ ） A. 步骤①给小鼠注射IL-6后，应从脾中分离筛选B淋巴细胞 B. 步骤②在脾组织中加入胰蛋白酶，制成细胞悬液 C. 步骤③加入灭活病毒或PEG诱导细胞融合，体现了细胞膜的流动性 D. 步骤④⑤分别经过克隆化培养和抗体检测筛选出了杂交瘤细胞 （2026·山东东营·一模）22.我国科研人员在猪体内培育出了“人源肾脏”，相关过程如图所示。下列说法错误的是（ ） A. 推测敲除的SALL1基因是猪肾脏发育的关键基因 B. 选用人源干细胞作为肾脏供体细胞是因为其具有很强的分裂分化能力 C. 可以在猪胚胎发育至桑葚胚时注射人源干细胞 D. 所获得的嵌合胚胎中所有细胞的基因型均相同 （2026·山东青岛·一模）23.猴的克隆胚胎在发育过程中往往出现基因的异常甲基化修饰以及胎盘发育异常，导致克隆成功率较低。我国科学家采用一定的技术手段对克隆胚胎进行处理，如图所示，提高了克隆成功率，并在2024年获得了首个活到成年的克隆猴。下列分析错误的是（ ） A. 成纤维细胞应注入去除纺锤体-染色体复合物的食蟹猴MII期卵母细胞 B. Kdm4d的mRNA和酶TSA均通过修饰DNA来影响基因表达 C. 囊胚b的形成是有性生殖，囊胚a的形成是无性繁殖 D. 该技术在克隆具有特定疾病的模型动物以及辅助生殖等领域有广阔前景 （2026·山东菏泽·一模）24.某科研团队利用动物细胞工程技术构建肝脏类器官，用于药物毒性检测，其流程：诱导小鼠多能干细胞（iPS细胞）分化为多种类型肝细胞→三维培养构建出具有生理功能的肝脏类器官→置于不同浓度的待测药物中，检测细胞活力、肝细胞内相关酶（如谷丙转氨酶）活性等指标。下列相关叙述正确的是（ ） A. iPS细胞分裂能力强，进行体外贴壁培养时，不会发生接触抑制现象 B. 三维培养获得肝脏类器官所使用的气体环境通常为95%氧气和5%CO2 C. 应增设“肝脏类器官+不含待测药物的培养液”组，排除无关变量干扰 D. 若培养液中谷丙转氨酶活性显著升高，则说明该药物对肝脏毒性较弱 （2026·山东青岛·一模）25.抗体结构分为可变区（V区）和恒定区（C区，是抗体分子中相对较为保守的区域，在不同物种间的差异较大），与抗原特异性结合的区域为CDR区，位于V区中。单克隆抗体在疾病诊断和病原体鉴定中发挥重要作用，但鼠源的单抗容易在人体内引发人抗鼠抗体反应（HAMA），从而削弱其治疗的有效性。科学家对鼠源杂交抗体进行改造，生产出效果更好的鼠—人嵌合抗体，主要流程如图所示。下列叙述正确的是（ ） A. 鼠—人嵌合抗体至少含有4个游离氨基，其抗体特异性由肽链的C区决定 B. 鼠源单抗易引发人体免疫排斥反应可能与其可变区有关 C. 为提高嵌合基因与载体的连接效率，扩增时应在两条引物的5'端添加同种限制酶酶切位点 D. 鼠—人嵌合抗体的研制过程属于蛋白质工程，图中转染细胞的方法可能是显微注射法 （2026·山东日照·一模）27.为解决杂交瘤细胞在传代培养中出现来自B淋巴细胞染色体丢失的问题，研究人员在单抗制备过程中用EBV（一种病毒颗粒）感染小鼠B淋巴细胞，使之成为染色体核型稳定的细胞，操作过程如图所示。EBV转化细胞能在HAT培养基中存活，但对药物Oua敏感。骨髓瘤细胞在HAT培养基中不能存活，但对Oua不敏感。下列说法错误的是（ ） A. 杂交瘤细胞染色体丢失可能会导致自身抗体的产生能力下降 B. 图中筛选过程可淘汰未融合的骨髓瘤细胞及EBV转化细胞 C. 图中筛选出的杂交瘤细胞能够产生特异性单抗和抗EBV抗体 D. 图中筛选出的杂交瘤细胞可直接扩大培养用于工厂化生产单抗 （2026·山东滨州·一模）28.流感病毒的抗原有H和N两类，均可以分为很多亚型。某科研团队基于融合蛋白的思路，尝试制造H3、N2融合蛋白疫苗，以更好地预防H3N2病毒。 （1）获取病毒H3、N2抗原蛋白的mRNA，通过____过程得到相应的DNA，并进一步构建H3、N2融合基因。在H3蛋白基因和N2蛋白基因融合的过程中，起搭桥作用的是____（从引物1～8中选择）。 （2）从引物角度分析，两种基因能够融合的关键是____，变性后形成的杂交分子在延伸为双链等长的融合基因时，不需要添加引物的原因是____。若融合基因中上游基因的mRNA终止密码子对应的碱基序列未被切除，则融合基因翻译得到的抗原蛋白为____。 （3）将目的基因与运载体连接过程中，首先需要用____（填限制酶种类）处理载体；用____（填限制酶种类）处理目的基因所在的片段。 （4）利用大肠杆菌作受体细胞筛选获得目的菌株：首先在含卡那霉素的培养基上培养目标菌，将培养基上生长的菌落用影印法接种到含四环素的培养基上，最后选择____的菌株。 （2026·山东淄博·一模）29.人源干扰素IFNα-2b是一种具有抗病毒活性的真核蛋白，可通过大肠杆菌BL21（DE3）表达体系大规模生产。BL21（DE3）的质粒上有T7RNA聚合酶基因和lacI基因。T7RNA聚合酶具有极高的启动子特异性和转录效率，其表达受lacI基因编码的lac阻遏蛋白的调控，当培养基中无诱导物IPTG时，lac阻遏蛋白结合到T7RNA聚合酶基因的启动子上抑制其表达。 （1）BL21（DE3）去除了蛋白酶编码基因，目的是_______。T7RNA聚合酶基因的启动子属于______型启动子。 （2）构建重组载体时，选用了两种启动子PBAD（被大肠杆菌自身RNA聚合酶识别）和PT7（仅被T7RNA聚合酶识别），重组载体的部分结构如图1。构建基因表达载体的目的是_______。为实现目的基因在特定时期表达，图1的4个基因的启动子中为PBAD的是______（填序号）。为筛选出含重组质粒的大肠杆菌并使其大量表达IFNa-2b，培养基中需要加入_____。 （3）编码同一氨基酸的不同密码子，在不同生物体中的使用频率并不相同，即存在密码子偏好性。如果使用大肠杆菌表达一种真核蛋白，可能因密码子偏好性不同，导致目标蛋白翻译过程受阻。IFNa-2b基因的mRNA中存在一种大肠杆菌中不常见的密码子AGG，导致IFNa-2b产量极低。可利用同源重组（图2）向大肠杆菌基因组中导入密码子AGG对应的______基因提高IFNα-2b产量。图2中的同源区段可不发生交换，也可发生单交换或双交换。对大肠杆菌进行改造后，利用高温处理使质粒丢失，在培养基中加入四环素，能够生长的是发生______（填“单交换”或“双交换”）的大肠杆菌。利用引物1和引物2进行PCR扩增（引物大小忽略不计），如果插入了目的基因，PCR产物大小为______bp。 （2026·山东日照·一模）30.除草剂氟草啶（FCD）能抑制植物细胞中原卟啉原IX氧化酶的活性以达到除草效果，科研人员利用基因编辑技术使水稻2号染色体上的PPO1基因（编码原卟啉原IX氧化酶）与CP12基因结构改变（如图1），从而赋予水稻对FCD的耐受性，并利用PCR技术结合电泳对转基因水稻进行鉴定，结果如图2所示。 （1）据图1分析，利用PCR技术鉴定基因编辑是否成功时，应选择的引物组合为________。若基因编辑成功，PCR扩增产物的电泳结果应为图2中的________号泳道。若电泳结果中5号泳道内出现两条电泳条带，原因可能是________（填序号）。 ①样品被污染 ②复性过程温度过低 ③预变性时间较短 ④延伸过程中引物3'端被封闭 ⑤引物特异性不强 ⑥图1中的两个切割位点之间被切割后原位连接 （2）基因编辑成功后，PPO1的转录模板链是________（填“A”或“B”）链，基因编辑前后，CP12的转录模板链________（填“是”或“否”）改变。 （3）综合上述信息，分析上述基因编辑成功的水稻对FCD耐受性增强的原因是________。 （2026·山东菏泽·一模）31.科研人员开发了一种可将靶DNA中特定位点碱基对C-G变为T-A的单碱基编辑工具（简称CBE系统）。该系统由dCas9蛋白、胞苷脱氨酶和sgRNA三部分构成，其中“dCas9蛋白+胞苷脱氨酶”在sgRNA的引导下，使靶DNA特定位点的一个碱基C脱氨反应变成U，最终实现C→T的改变。编辑过程如图1，该过程中DNA链不断裂。图1中①②代表相应过程。 （1）CBE系统与靶DNA的识别与结合过程发生了________键的断裂和形成；①过程形成的一个含A-U的DNA分子经②过程n轮（n>2）复制后，可形成________个目标DNA． （2）上述CBE系统的构建用到了图2中的质粒、目的基因和限制酶等。构建CBE系统的部分过程如下： I．重组质粒的构建：根据pHSE401质粒上限制酶识别位点，利用PCR扩增目的基因时，需要在引物的________端添加限制酶识别序列，通过合适的限制酶组合以达到目的基因与质粒正确连接，避免出现自身环化现象。 Ⅱ．重组质粒的筛选：将重组质粒导入对卡那霉素和四环素敏感的大肠杆菌中，将该大肠杆菌在含有卡那霉素的培养基中涂布培养，获得单菌落A、B、C、D和E，然后将菌落原位转移到含四环素的培养基中，发现A、C菌落不能存活，则导入重组质粒的菌落是________。据此推测步骤Ⅰ中的限制酶组合可以为________（填序号）。 ①XbaⅠ和NheⅠ②XbaⅠ和HindⅢ③XbaⅠ和EcoRⅠ ④SmaⅠ和NheⅠ⑤HindⅢ和EcoRⅠ⑥EcoRⅠ和NheⅠ （3）草莓中MYB10基因影响品质，若将该基因编码的多肽链中一个特定的组氨酸定点突变为酪氨酸，则可以改良品质。已知MYB10基因转录的非模板链中相关的部分碱基序列为5＇-GGACATGGG-3＇，据此设计sgRNA的序列是5＇________3＇。（组氨酸的密码子：CAU、CAC，酪氨酸的密码子：UAU、UAC） （4）CBE系统有时误对非目标序列进行编辑而造成“脱靶”，发现sgRNA的序列越短，脱靶率越高。分析脱靶最可能的原因：________。 （2026·山东东营·一模）32.小麦因M基因存在易被布氏白粉菌感染而患白粉病，导致严重减产。科研人员利用农杆菌转化法，将gRNA基因和Cas9蛋白基因导入到小麦中，对M基因进行敲除，使其无法表达。gRNA-Cas9复合体可对DNA的特定序列识别并剪切。复合体首先会定位目标DNA序列3'端的PAM序列，然后gRNA上的靶向序列与目标DNA的另一条链互补配对，接着Cas9会切割目标DNA某位点，实现基因敲除。相关过程如图1所示。 （1）gRNA中的识别序列与目标DNA的相应序列特异性结合遵循__________原则，Cas9蛋白作用的化学键是__________。 （2）为了不破坏其他正常基因，需要设计gRNA精准识别的靶向序列。科研人员对小麦M基因测序，部分结果如图2所示。若在后续利用限制酶AvaⅡ进行辅助检测，则gRNA上的靶向序列应设计为5'-__________-3'（写出12个碱基）。 （3）利用图3中的载体1与载体2构建携带gRNA基因和Cas9蛋白基因的最终表达载体，应选择使用的限制酶有__________，最终表达载体还应具备的基本元件有__________（写出两点）。表达载体导入农杆菌后，利用含__________的培养基筛选出阳性菌落。 （4）对转化成功的小麦植株M基因相关序列进行PCR扩增，用限制酶AvaⅡ酶完全酶切并电泳检测，若检测结果出现1个条带，则该植株为M基因__________（填“敲除”或“未敲除”）的植株。后续还需对小麦进行白粉病抗性鉴定，请简述实验思路：__________。 （2026·山东青岛·一模）33.磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程如图所示，请回答下列问题。 （1）PCR1经过________轮循环可初步获得图中A片段，PCR2扩增GFP基因时需依据________设计引物R2，据图分析扩增目的片段时所用的引物F1和R2可对应下表中的________（填序号）。 ① 5´-TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3´ ② 5´-AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC-3´ ③ 5´-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA-3´ ④ 5´-GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA-3´ 据以上表格提示PCR1和PCR2通常________（“能”或者“不能”）在同一反应体系中进行。 （2）无缝克隆时，T5核酸外切酶沿________（填“5´→3´或“3´→5´”）的方向水解DNA，其目的是形成________。过程②两个片段复性后存在“缺口”的原因是________，过程③所需的酶有________。 （3）与传统的酶切再连法相比无缝克隆技术构建重组质粒的优点有________。 A. 不受限制酶切位点的限制 B. 不会引入多余碱基，不会出现移码突变 C. 操作相对简单，成功率高 D. 不需要使用PCR技术扩增目的基因 （4）利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有________的MS培养基上进行筛选和鉴定，将筛选得到的种子种植可得到转基因拟南芥，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中________，了解PA的分布和含量。 （2026·山东临沂·一模）34.香树脂醇具有抗炎等功效，从植物体中提取难度大、产率低。通过在离体培养的植物细胞中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。 （1）图1中标识了质粒和基因N中限制酶的切割位点，基因N的b链为转录模板链。为将基因N正确插入质粒，引物1应添加的碱基序列是5′-______-3′，切割质粒时应选用的两种限制酶是______。质粒上的抗性基因______可用于初步筛选成功转化的植物细胞。 （2）耐高温的DNA聚合酶在PCR的______步骤中起作用。PCR扩增产物和质粒分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含N基因的重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后、质粒对应部分大小基本不变。进一步筛选转化的细胞，以1~4号细胞株中提取的DNA为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是______。初步判断实验组_____（从“1~4”中选填）的细胞中成功插入了基因N，理由是______。 （3）为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有______。 a.5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b.5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c.5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d.5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' （2026·山东聊城·一模）35.弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）最具代表性的特异性抗原是CD20，超过95%的DLBCL病例强表达CD20.抗原蛋白CD19在正常B细胞和DLBCL细胞表面都可稳定、高密度表达，也是B细胞受信号通路的重要组成部分。双靶点嵌合抗原受体T细胞（CAR—T）疗法是未来治疗DLBCL的发展方向，科学家将患者T细胞改造成同时表达CD19抗原受体和CD20抗原受体（对应基因简称为CAR基因）的CAR—T细胞。其基本流程如图1、2所示： （1）从患者体内获取的T细胞主要有辅助性T细胞（Th）和细胞毒性T细胞（Tc），由Th细胞改造完成的CAR—T细胞受到抗原刺激后，可分泌______，促进正常B细胞的增殖分化；由Tc细胞改造完成的CAR—T细胞裂解DLBCL细胞需要受到_______的双信号刺激才能进行。 （2）CD19CAR—T细胞长期激活可能导致正常B细胞耗竭，影响体液免疫功能。为降低该风险，结合题目信息，从图2和图3中选择部分或全部元件，设计新的基因表达载体，在答题卡相应位置画出元件排列顺序示意图（一个基因单独或多个基因拼接共用一个启动子为一个元件），并辅以必要的文字说明_______。 （3）图4为利用无缝克隆（In—Fusion）技术构建含CAR基因的重组质粒流程图，其中In—Fusion酶可以将任何具有相同15~20bp末端序列的线性DNA分子进行无缝连接，实现高效稳定的同源重组。 ①图中过程Ⅰ是利用PCR技术将质粒线性化，为了保证扩增后的产物是图中所示的线性质粒，应该选择引物_______。CAR基因序列可以由生物科技公司合成，扩增CAR基因时，引物F和R序列要依据_______的末端序列设计。 ②为了筛选、鉴定构建成功的重组质粒，科研人员进行了如下操作：将重组质粒导入大肠杆菌，菌液涂布到含_______的培养基中，培养适宜时间后，挑取菌落并加入_______等进行菌落PCR，并通过电泳鉴定PCR产物。 ③与传统构建重组质粒的方法相比，In—Fusion技术的优点有_______。（答出两点即可） （2026·山东济宁·一模）36.科学家通过基因工程改造大肠杆菌，实现规模化生产人胰岛素；利用蛋白质工程优化胰岛素结构，通过将胰岛素B链的第28位氨基酸-脯氨酸（密码子为CCU）替换为天冬氨酸（密码子为GAU），有效抑制了胰岛素的聚合，研发出速效胰岛素类似物产品。图1是运用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构，图2是利用大引物PCR技术引入特定位点突变的流程。回答下列问题。 （1）图1中质粒作为载体时未标出的必需结构是____。为保证目的基因与载体正向连接，扩增目的基因时，上游引物的5’端应添加限制酶____的识别序列，下游引物5’端的15个碱基序列为5’-____-3’。 （2）β-半乳糖苷酶可以将无色X-gal分解产生蓝色物质。筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，培养基中需添加____，从____色菌落中选择。 （3）图2中，为了得到可表达出速效胰岛素类似物的改良基因，进行第一次PCR时，上游引物对应突变位点的碱基序列是5’-____-3’。利用所获得的大引物、模板和其他引物等进行第二次PCR时，至少要进行____次循环，才能获得完成定点突变、双链等长的改良基因。 （2026·山东德州·一模）37.S蛋白能够特异性识别癌细胞表面抗原，L蛋白是一种可被低氧环境激活的菌体裂解酶，科研人员将S蛋白基因和L蛋白基因连接为S-L融合基因，利用腺病毒AAV构建基因表达载体，再利用AAV和大肠杆菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，将S-L融合基因导入大肠杆菌基因组中，构建出能够精准递送抗癌药物的工程菌。 图1：S-L融合基因的构建过程 图2：同源重组替换基因的过程 （1）已知S蛋白基因转录时以b链为模板，L基因转录时以a链为模板。在构建S-L融合基因时，最好使用限制酶___________分别切割S蛋白基因和L蛋白基因，再用___________酶连接。将S-L融合基因连接至AAV载体时，需利用限制酶___________对S-L融合基因进行切割。 （2）AAV作为载体应具备的条件有___________(答出两点)。 （3）将基因表达载体导入大肠杆菌后，获得甲、乙两种大肠杆菌，分别提取其DNA，加入引物1、2、3扩增并电泳，结果如图3所示。其中成功导入S-L融合基因的大肠杆菌为___________(填“甲”或“乙”)；条带③为用引物___________扩增的产物。 （4）已知癌细胞周围为低氧环境。把抗癌药物注入含S-L融合基因的工程菌中，该工程菌可实现抗癌药物的精准递送，分析其机理是___________。 / 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $