2026届高三生物一轮复习课件第31讲 基因工程的基本工具

2026 第31讲 基因工程的基本工具 和基本操作程序 第八单元 生物技术与工程 选择性必修3 课标要求 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具 2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测、鉴定等步骤 目录 PART 01 重组DNA技术的基本工具 PART 02 基因工程的基本操作程序 PART 03 真题精练 PART 04 实验：DNA的粗提取与鉴定 重组DNA技术的基本工具 01 4 一、基因工程的概念 原 理 操作环境 操作水平 本 质 结 果 优 点 基因工程又叫重组DNA技术，是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。 生物体外 分子水平 基因重组 赋予生物新的遗传特性 定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍 目的基因在受体内的表达 重组DNA技术的基本工具 考点一 基因工程的理论基础 拓展延伸 二、基因工程的基本工具 1、限制性内切核酸酶(也称“限制酶”) 来源 种类 作用机理 结果 特点 主要是从原核生物中分离纯化来的 识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 分离的限制酶有数千种 ①产生黏性末端；②产生平末端 一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列，并且能在特定的 位点上切割DNA分子（专一性） ①原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA，以保证自身安全。 ②限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 重组DNA技术的基本工具 考点一 图解限制酶的选择原则 1、不破坏目的基因： 2、必须保留标记基因、启动子、终止子、复制原点： 如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ 如图乙中不选择SmaⅠ 若载体上有多个标记基因，可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，但要保留至少一个标记基因。如图可以酶切LacZ基因（lacZ 基因编码的产物β半乳糖苷酶能催化无色的Xgal生成蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，目的基因插入 lacZ基因中则菌落呈现白色，该过程称为蓝白斑筛选）。 拓展延伸 图解限制酶的选择原则 3、确保出现相同黏性末端： ②当不能使用同一种酶切割目的基因和运载体时，先确认是否可以用同尾酶替代，以获得相同黏性末端。 ①通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ； ③为避免目的基因和质粒自身环化和反向连接，最好使用不同的限制酶切割目的基因和质粒（双酶切法），如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 拓展延伸 二、基因工程的基本工具 2、DNA连接酶 （1）作用： （2）类型： 将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 连接黏性末端和平末端 缝合黏性末端和平末端（效率非常低） 来源： 大肠杆菌 作用： 来源： 作用： T4噬菌体（侵染大肠杆菌的DNA病毒） 重组DNA技术的基本工具 考点一 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 蛋白质 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子 形成与模板链互补的DNA链 基因拼接 DNA复制（体内、体外） 催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 DNA连接酶与DNA聚合酶 将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键 拓展延伸 二、基因工程的基本工具 3、运载体 （1）种类 （2）作用 （3）作为载体需具备的条件 携带外源DNA片段进入受体细胞 质粒（环状双链DNA分子）、噬菌体、动植物病毒等 ① 有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中 ② 携带外源DNA片段进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合 到受体DNA上，随受体DNA同步复制 ③ 有用于识别、筛选的标记基因，便于重组DNA的检测 ④ 对受体细胞无害 在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是天然质粒的基础上进行过人工改造的 重组DNA技术的基本工具 考点一 02 基因工程的基本操作程序 13 目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 一、目的基因的筛选与获取 1、目的基因 用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因 2、筛选目的基因的方法 ①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一 ②利用序列数据库（如GenBank）和序列比对工具（如BLAST)进行筛选 GenBank是目前国际上广泛使用的序列数据库之一，它的数据主要是各国的实验室、序列机构等发布的序列信息，利用这个数据库，我们可以便捷的检索到基因和蛋白质的序列信息。 BLAST（基本局部比对搜索工具）是一种能对两个或多个序列，包括DNA序列和蛋白质序列进行相似性比较，或将某个序列与序列数据库中的序列进行快速比对分析的工具。 考点二 基因工程的基本操作程序 （1） 通过构建基因文库来获取目的基因 ②若基因比较小、核苷酸序列已知，可通过DNA合成仪用化学方法直接合成 （3）利用PCR获取和扩增目的基因 （2） 人工合成目的基因 ①若相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因，可以它的mRNA为模板，借助逆转录酶合成双链DNA（cDNA） 一、目的基因的筛选与获取 3、获取目的基因的方法 构建基因文库 考点二 基因工程的基本操作程序 DNA模板 四种脱氧核苷酸 引物 DNA聚合酶 缓冲溶液 利用PCR获取和扩增目的基因 1.PCR：聚合酶链式反应 2.原理：DNA半保留复制、DNA的热变性 3.实质：体外DNA复制 4.条件： 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 提供DNA复制的模板 合成子链DNA的原料 一般添加Mg2+（激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶） 催化合成DNA子链；须具有耐高温特性 原料实为dNTP脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)，既可作为合成DNA子链的原料，同时可水解产生能量为合成DNA供能，因此反应体系中不需要添加ATP。 考点二 引物是短单链核酸，既可以是DNA单链，也可以为RNA单链，能与模板DNA的特定区域互补结合，一般为20-30个核苷酸，最常用20-22个核苷酸 2、引物设计需遵循“特异性、稳定性、可延伸性”三大逻辑： （1）长度适宜：太短 →特异性差，易于非目标序列结合，导致非特异性扩增； 太长 →易自身碱基互补配对折叠形成局部空间结构，如发夹结构。 引 物 1、本质 （2）GC含量合理：含量过高→复性温度高，目标序列扩增效率降低； 含量过低→复性温度过低，易导致非特异性结合。 （3）3’端严格配对：DNA聚合酶仅能从3’-OH延伸，严重错配会导致延伸终止，因此若需通过引物在目的基因特定部位添加序列，只能设计引物的5’端。 （4）确保引物与目标序列的高特异性互补，同时避免发夹结构（自身折叠）、回文序列（同种引物反向互补）、2种引物之间互补形成二聚体等现象。 拓展延伸 利用PCR获取和扩增目的基因 5. PCR反应过程 过程 说明 图解 变性 温度超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链 复性 温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 延伸 温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 考点二 第一次循环后 第二次循环后 第三次循环后 第四次循环后 预变性（94℃，5min）：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 第30次循环 n次循环后得到 个DNA分子 2n 个等长DNA分子 个不等长DNA分子 2n （2n-2n） 利用PCR获取和扩增目的基因 6. PCR扩增产物的鉴定 ——琼脂糖凝胶电泳 (1)电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷_____的电极移动，这个过程就是电泳。 (2)PCR的产物一般通过____________________来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、__________________________等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在 被检测出来。 相反 琼脂糖凝胶电泳 DNA分子的大小和构象 波长为300nm的紫外灯下 考点二 利用PCR获取和扩增目的基因 6. PCR扩增产物的鉴定——琼脂糖凝胶电泳 试剂 作用 使用场景 电泳缓冲液 维持电泳环境（导电、稳pH） 配成电泳槽溶液、浸泡凝胶 凝胶载样缓冲液 增密样品、示踪 与PCR产物混合后上样 指示剂 指示电泳进度（颜色追踪） 预混于载样缓冲液 染料 与DNA分子结合，使DNA分子的存在与位置可被观察 制胶时添加 考点二 利用PCR获取和扩增目的基因 6. PCR扩增产物的鉴定——琼脂糖凝胶电泳 配制琼脂糖溶液 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 制备凝胶 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，插入梳子形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 加样 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 电泳 接通电源，设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 观察记录 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 考点二 利用PCR获取和扩增目的基因 考点二 二、基因表达载体的构建 （基因工程的核心） 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成： 上游 RNA聚合酶 转录 目的基因 下游 标记基因 复制原点 考点二 基因工程的基本操作程序 二、基因表达载体的构建 3、基因表达载体的构建过程 4、基因表达载体的实质： 重组DNA 考点二 基因工程的基本操作程序 问题探讨： 1、使用一种限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与载体结合的重组DNA？ 载体 目的基因 自连 片段间的连接 目的基因自连 质粒自连 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 正向连接 反向连接 1 1’ 2 2’ 1 2 2’ 1’ 2 2’ 1’ 1 考点二 基因工程的基本操作程序 2、如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？ 选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割 若要使目的基因两端具有相应限制酶切位点，可通过在PCR引物的5′端分别添加上特定种类限制酶的识别序列来实现。 问题探讨： 考点二 基因工程的基本操作程序 受体细胞 导入方法 内容 植物细胞 花粉管通道法 用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中等 农杆菌转化法 农杆菌细胞内的Ti质粒上的T­DNA可携带目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上 动物细胞 显微注射技术 常用受体细胞：受精卵 原核细胞 Ca2＋处理法 用Ca＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程 三、将目的基因导入受体细胞 考点二 基因工程的基本操作程序 农杆菌转化法 一拼 一导 二拼 二导 农杆菌：①能在自然条件下侵染　　　 　　和　　 　　，而对大多数___________ 没有侵染能力。 ②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的　 　　转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 双子叶植物 裸子植物 单子叶植物 T－DNA 拓展延伸 类型 检测内容 方法 分子水 平的检测 个体水平 的鉴定 目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上 目的基因是否转录出了mRNA PCR、 分子杂交等技术 目的基因是否翻译成蛋白质 抗原-抗体杂交技术 个体是否具有相应性状 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 四、目的基因的检测与鉴定 考点二 基因工程的基本操作程序 ①样本处理：提取受体细胞中的目标核酸（DNA或mRNA），变性为单链 ②制备探针：用同位素或荧光标记已知DNA序列单链制成探针 ③杂交反应：将待测样本与探针混合，在特定条件下观察是否出现杂交带 核酸分子杂交技术 拓展延伸 03 实验：DNA的粗提取与鉴定 34 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 1、提取的基本思路： 2、实验原理： ③在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色 0 DNA溶解度 NaCl浓度 0.14mol/L 2mol/L 一、DNA提取思路与原理 ①DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精 ②DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同， 能溶于2mol/L NaCl溶液 考点三 实验：DNA的粗提取与鉴定 1、取材研磨： 称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨 破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中 二、方法步骤 2、过滤或离心取上清液： 在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。 直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。 上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？ 方法一： 方法二： 可能含有核蛋白、多糖等杂质 考点三 实验：DNA的粗提取与鉴定 3、预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA 在上清液中加入体积相等的、预冷的体积分数为95%酒精溶液，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分； 方法一 搅拌时应轻缓、并沿一个方向： 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子 酒精预冷的作用： 将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。 方法二 抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂。 考点三 实验：DNA的粗提取与鉴定 不加入丝状物 加入4mL二苯胺试剂 加入丝状物 加入4mL二苯胺试剂 实验组 对照组 水浴加热 溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关 加入2mol/L氯化钠溶液 加入2mol/L氯化钠溶液 4、DNA的鉴定 重组DNA技术的基本工具 考点一 $