2026届高三生物一轮复习课件第42讲《基因工程的基本工具和基本操作程序》

2026年·高考生物·一轮复习 第十单元 生物技术与工程 第42讲 基因工程 考点一 重组DNA技术的基本工具 1.基因工程的概念？ 基因工程：是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫 重组DNA技术。 1.操作环境： 2.原理： 3.操作对象： 4.操作水平： 5.结果： 体外环境 基因 分子水平 基因重组 赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品 定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍 6.意义： 考点一 重组DNA技术的基本工具 【思考】 1:不同生物的基因为什么能拼接？为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达? ①DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸）；②都遵循碱基互补配对原则；③DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构 ①基因是控制生物性状的结构与功能单位；②遗传信息的传递都遵循中心法则；③生物界几乎共用一套遗传密码 考点一 重组DNA技术的基本工具 2.重组DNA技术的基本工具有哪些？ ①限制性内切核酸酶（限制酶）；②DNA连接酶；③载体 原核生物 数千 特定核苷酸序列 磷酸二酯键 黏性末端 考点一 重组DNA技术的基本工具 粘性末端 平末端 ①黏性末端：限制酶在它识别序列的 将DNA分子的两条链 切开时，产生的是黏性末端。 中轴线两侧 分别 ②平末端：限制酶在它识别序列的 切开时，产生的是平末端 中轴线 限制酶如何选 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假阳性” （3）“双酶切”法优点：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接。 （4）“同尾酶”：来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。 用限制酶切割时需注意的事项 (1)获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是 。但是使用该法缺点是容易发生 ， 为了避免上述情况发生，可采取的措施是 。 为了产生相同的黏性末端，便于连接 分别使用两种限制酶去切割目的基因和载体 目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接 (2)获取一个目的基因需限制酶切割 次,共产生 个游离的磷酸基团。 两 (3)磷酸二酯键的形成脱去水分子（产生水），磷酸二酯键的断裂消耗水分子。 不同的限制酶处理可以产生相同的黏性末端 4 将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割质粒。如图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请思考以下问题： (1)限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割产生的黏性末端分别是_______________和______________。 (2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶？请说明理由。 用限制酶Mun Ⅰ和Spe Ⅰ切割目的基因。限制酶Mun Ⅰ和EcoR Ⅰ切割后形成的黏性末端相同，限制酶Nhe Ⅰ和Spe Ⅰ切割后形成的黏性末端相同，实验人员使用限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割质粒，应选用Mun Ⅰ和Spe Ⅰ切割目的基因。 XhoⅠ XbaⅠ XbaⅠ 考点一 重组DNA技术的基本工具 ②DNA连接酶 作用： 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来， 将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。 考点一 重组DNA技术的基本工具 ②DNA连接酶 类型： 类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 功能 缝合 和 ； 缝合__________和_______________ 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌 T4噬菌体 黏性末端 黏性末端 平末端(效率低) 磷酸二酯键 平末端 （连接平末端效率远低于T4 DNA连接酶） 项目 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 基因工程 DNA复制 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键 【核心归纳】与DNA相关的几种酶的比较 项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶 作用 部位 作用 对象 作用 结果 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 DNA水解酶 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键 DNA片段 DNA 单个的脱氧 核苷酸 DNA 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割双链DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链 考点一 重组DNA技术的基本工具 ③载体 作用： 将外源基因送入受体细胞，并在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 种类： 质粒（最常用） 动植物病毒 噬菌体 质粒——裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。 质粒 考点一 重组DNA技术的基本工具 ③载体 载体需具备的条件： （1）有一个至多个限制酶切割位点； （便于目的基因插入） （2）具有自我复制能力； （使目的基因稳定存在且数量可扩增） （3）具有特殊的标记基因； （便于将含有目的基因的受体细胞筛选出来） （4）对受体细胞无害。 （避免受体细胞受到损伤） 实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。 ①细胞内自我复制②或整合到受体DNA同步复制 【拓展】 标记基因的筛选原理 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示： 在含有抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞一定是导入目的基因的受体细胞吗？ 不一定，因为仅导入载体的和导入插入了目的基因的载体的受体细胞均能在该培养基中存活。 【拓展】 如何提高筛选的准确性 当质粒上有两个标记基因时，可将目的基因插入其中一个标记基因中，也就是重组质粒上只含一个标记基因，普通质粒上含有两个标记基因。则没有导入质粒的受体细胞不具有标记基因控制的性状，导入普通质粒的受体细胞具有两个标记基因控制的性状，导入重组质粒的受体细胞只具有一个标记基因控制的性状。这样可根据标记基因控制的性状准确筛选出含有重组质粒的受体细胞。 举例： 目的基因 lacZ 基因 氨苄青霉素抗性基因 LacZ 基因表达产生的β-半乳糖甘酶能够分解 X-gal 产生蓝色物质，从而使菌落呈蓝色；否则菌落呈白色。 请分析下列3种大肠杆菌在含 X-gal 和青霉素的固体培养基上的存活情况及菌落颜色。 无法存活 存活；白色 存活；蓝色 2．质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是(　　) A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点 B．①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b C．质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个 D．将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶 C 考点二 基因工程的基本操作程序 1.基因工程的基本操作程序包括哪几步？ ①目的基因的筛选与获取 ④目的基因的检测与鉴定 ②基因表达载体的构建（基因工程的核心） ③将目的基因导入受体细胞 考点二 基因工程的基本操作程序 2.什么是目的基因？如何筛选合适的目的基因？如何获取目的基因？ 用于改变受体细胞性状或获取预期表达产物等的基因 ①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一 ②利用序列数据库（GenBank）和序列比对工具进行筛选 ①人工合成目的基因 ②PCR获取和扩增目的基因 ③通过构建基因文库来获取目的基因 基因组文库 从细胞中提取DNA 细胞 基因组DNA 质粒 质粒酶切 DNA连接酶连接 限制酶酶切 导入细菌中 基因组文库克隆 提取 酶切的DNA片段 cDNA文库 逆转录 逆转录酶 酶切的cDNA片段 限制酶酶切 质粒 质粒酶切 连接 导入细菌中 cDNA文库克隆 提取 考点二 基因工程的基本操作程序 3.PCR（聚合酶链式反应）概念？条件？过程？ PCR概念：PCR是________________的缩写，它是一项根据_____________的原理，在_____提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对_______________________进行大量复制的技术； 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外 目的基因的核苷酸序列 ①全称： ②原理： ③操作环境： ④目的： ⑤优点： 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外（PCR扩增仪/PCR仪） 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 可以在短时间内大量扩增目的基因 考点二 基因工程的基本操作程序 3.PCR（聚合酶链式反应）概念？条件？过程？ DNA复制所需的基本条件 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成DNA子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 PCR技术与生物体内DNA复制的比较 比较项目 生物体内DNA复制 PCR技术 区别 解旋方式 场所 酶 温度条件 合成对象 解旋酶催化 细胞内(主要在细胞核内) 解旋酶、 普通的DNA聚合酶等 细胞内温和条件 DNA分子 DNA在高温作用下变性解旋 细胞外(在PCR扩增仪内) 耐高温的的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 需控制温度，在较高温度下进行 DNA片段或基因 联系 ①模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成 ②原料：均为四种脱氧核苷酸 ③酶：均需要DNA聚合酶进行催化 ④引物：均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 注：引物是一小段能与__________的一段碱基序列_________的____________。 用于PCR的引物有 种，长度通常为20~ 30个核苷酸。 DNA母链 互补配对 短单链核酸 3’ 5’ DNA母链 3’ 5’ DNA母链 3’ 5’ 引物 3’ 5’ 引物 2 图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)，都不合理，请分别说明理由。 第1组： ； 第2组： 。 引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效 引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效 引物的设计原则： 1.引物长度适宜。 2.G+C含量合理。（40％-60％） 3.引物自身/之间没有连续4个碱基互补 4.引物5`可修饰，3`不能修饰 引物 1．土壤盐渍化影响水稻生长发育。将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，过程①PCR扩增OsMYB56需要添加引物，应选用的引物组合为(　　) A．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′ B．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TAAGTTGTCT－3′ C．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－ATCATCCAAG－3′ D．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－GAACCTACTA－3′ A 2．(2021·湖北，16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　) A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间 C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度 D 考点二 基因工程的基本操作程序 3.PCR（聚合酶链式反应）概念？条件？过程？ 引物 DNA模板 耐高温的DNA聚合酶 4种脱氧核苷酸 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ ①变性 当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链 ②复性 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 ③延伸 当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 条件 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 缓冲溶液 （含Mg2+) 激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶 考点二 基因工程的基本操作程序 3.PCR（聚合酶链式反应）概念？条件？过程？ 第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物； 第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物； 第二轮循环的产物 第三轮的产物 完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物 PCR扩增仪 拓展应用——PCR相关计算 Their application——PCR correlation calculation 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 1 1 第一次扩增 引物A 引物B 拓展应用——PCR相关计算 Their application——PCR correlation calculation 中长链-短链DNA____个 2 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 3 3 第二次扩增 拓展应用——PCR相关计算 Their application——PCR correlation calculation 第三次扩增 中长链-短链DNA____个 4 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 7 7 短链-短链DNA______个 2 拓展应用——PCR相关计算 Their application——PCR correlation calculation 第四次扩增 中长链-短链DNA____个 6 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 15 15 短链-短链DNA______个 8 拓展应用——PCR扩增DNA规律 Their application——Rule of PCR amplification of DNA 扩增次数 第1次 第2次 第3次 第4次 第n次 DNA总数 21 22 23 24 2n 长链-中长链DNA 中长链-短链DNA 短链-短链 DNA 含引物A(或B) 的DNA 2 0 0 2 2 2 4 0 2 2 6 8 2 2(n-1) 2n-2n 1 3 7 15 2n-1 聚合酶链式反应——过程归纳 Polymerase chain reaction——The process of induction 一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次： ①子代DNA分子数为：___个 ②子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：__个 ③子代含有的目的基因数目：_____个 ④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：______个 ⑤复制过程中共需引物_______个 ⑥第n次复制需要引物___个 2n 2 2n-1 2n＋1 - 2 2n 2n-2n PCR扩增DNA规律 考点二 基因工程的基本操作程序 4.基因表达载体的构建——基因工程的核心 目的： ①使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代 ②使目的基因能够表达和发挥作用 基因表达载体的组成： 终止子 启动子 目的基因 标记基因 复制原点 基因表达载体 当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。 （1）启动子： 一段有特殊序列结构的______片段。 ①本质： ②位置： 位于基因的____，紧挨_______________。 上游 ③功能： RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 诱导型启动子： （启动子≠起始密码子） DNA 转录的起始位点 考点二 基因工程的基本操作程序 4.基因表达载体的构建——基因工程的核心 终止子 启动子 目的基因 标记基因 复制原点 基因表达载体 （2）终止子： ①本质： 一段有特殊序列结构的_______片段。 DNA ②位置： 位于基因的_____。 下游 ③功能： 使转录在所需要的地方停下来。 （3）标记基因： ①作用： 便于重组DNA分子的筛选。 （4）目的基因： ②常见类型： 抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。 如Bt基因,能控制表达所需要的特殊性状。 （5）复制原点： DNA复制的起始位点。 注意：目的基因需要插入到 与 之间。 （终止子≠终止密码子） 启动子 终止子 考点二 基因工程的基本操作程序 4.基因表达载体的构建——基因工程的核心 重组DNA分子 限制酶 目的基因 限制酶切割位点 获取目的基因 DNA连接酶 基因表达载体构建模式图 限制酶 启动子 限制酶切割位点 终止子 标记基因 复制原点 质粒 同种限制酶或能产生相同末端的限制酶 ？ 考点二 基因工程的基本操作程序 5.将目的基因植物、动物和微生物细胞的方法? 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射法 Ca2+处理法 1.花粉管通道法： 我国科学家独创 ①用____________将_______________________直接注入_____中； 微量注射器 含目的基因的DNA溶液 子房 ②在植物受粉后的一定时间内，剪去_____，将___________滴加在____________上，使目的基因借助______________进入_______； DNA溶液 花柱切面 花粉管通道 胚囊 受体细胞： 受精卵 花柱 考点二 基因工程的基本操作程序 5.将目的基因植物、动物和微生物细胞的方法 农杆菌转化法的过程： T-DNA 目的基因 构建表达载体 含目的基因的重组Ti质粒 转入农杆菌 含重组Ti质粒的农杆菌 导入植物细胞 表现出新性状的植物 植物细胞 将目的基因插入染色体DNA中 植物组织培养 考点二 基因工程的基本操作程序 5.将目的基因植物、动物和微生物细胞的方法 __________插入Ti质粒的________中形成重组Ti质粒 重组Ti质粒转入__________ 转化植物细胞 目的基因插入植物细胞中的________________上 目的基因在植物细胞中稳定存在并__________ 表达 目的基因 T-DNA 农杆菌 染色体DNA 考点二 基因工程的基本操作程序 5.将目的基因植物、动物和微生物细胞的方法 两次拼接： 第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上； 第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。 两次导入： 第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌； 第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。 提醒：农杆菌转化法中的两次拼接、两次导入 考点二 基因工程的基本操作程序 5.将目的基因植物、动物和微生物细胞的方法 显微注射法 受精卵 注射器 固定吸管 显微注射仪 将含有目的基因的 表达裁体提纯 →显微注射入动物的受精卵 →受精卵发育 →获得具有新性状的动物 受体细胞： 受精卵 考点二 基因工程的基本操作程序 5.将目的基因植物、动物和微生物细胞的方法 ①.原核生物的作为受体细胞的优点 ①繁殖快 ②单细胞 ③遗传物质少 ②.导入方法： Ca2+处理法 大肠杆菌 能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 Ca2+ 混合 表达载体 吸收DNA，完成转化 使大肠杆菌处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态 用CaCl2处理大肠杆菌，增加细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入宿主细胞。 缓冲液 溶于 考点二 基因工程的基本操作程序 5.将目的基因受体细胞 受体细胞 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 受体细胞 转化过程 以农杆菌转化法为例： 将目的基因插入Ti质粒的T­DNA上 ↓ 转入农杆菌中 ↓ 导入植物细胞 ↓ 整合到受体细胞的DNA上 提纯含目的基 因的表达载体 ↓ 显微注射 ↓ 受精卵发育 ↓ 具有新性 状的个体 Ca2＋处理细胞 ↓ 细胞处于一种能吸收周围环境DNA分子的状态 ↓ 基因表达载体导入 农杆菌转化法、花粉管通道法 体细胞 显微注射技术 受精卵 Ca2+处理法 原核细胞 考点二 基因工程的基本操作程序 6.目的基因的检测与鉴定 请同学们阅读教材82页，思考目的基因的检测需要检测什么？检测的方法分别是？ ①目的基因是否导入受体细胞 ②目的基因是否转录形成mRNA ③目的基因是否翻译成蛋白质 ④个体水平检测 PCR等技术、核酸分子杂交技术 PCR等技术、核酸分子杂交技术 抗原-抗体杂交技术 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 考点二 基因工程的基本操作程序 6.目的基因的检测与鉴定 1.分子水平的检测 ①检测目的基因是否导入受体细胞 方法1：PCR扩增 转基因生物 提取DNA DNA作为模板 是否扩增出目的基因 PCR操作 电泳操作 非转基因棉花 转基因抗虫棉 阴性对照 Marker 考点二 基因工程的基本操作程序 6.目的基因的检测与鉴定 方法2： 核酸分子杂交技术 碱基互补配对 原理： 酶切 转膜 标记的DNA/RNA探针 DNA分子杂交（Southern-blot)流程图 原因：带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。 考点二 基因工程的基本操作程序 6.目的基因的检测与鉴定 提取RNA 转膜 标记的DNA/RNA探针 RNA ②检测目的基因是否转录 方法1： PCR扩增 转基因生物 提取RNA RNA作为模板 PCR操作 电泳 逆转录 cDNA 方法2： 核酸分子杂交技术 RNA分子杂交(Northern Blot)流程图 考点二 基因工程的基本操作程序 6.目的基因的检测与鉴定 ③检测目的基因是否翻译 方法：抗原— 抗体杂交技术 苏云金芽孢杆菌 提取 Bt抗虫蛋白 注射小鼠体内 抗体 标记抗体 提取蛋白 电泳分离 抗原 抗体 杂交 转基因生物 放射性检测 （杂交带） 过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带 考点二 基因工程的基本操作程序 6.目的基因的检测与鉴定 2.个体水平的检测 检测目的基因是否表现出相应的性状 方法：抗虫鉴定、抗病鉴定等 棉铃虫 棉铃虫（死亡） 考点二 基因工程的基本操作程序 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）接种实验 未染病 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 类型 检测内容 方法 分子水平的检测 个体生物学水平的鉴定 目的基因是否转录出了mRNA PCR等技术、核酸分子杂交技术 目的基因是否翻译成蛋白质 抗原-抗体杂交技术 个体是否具有相应性状 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 目的基因是否导入受体细胞 基因工程的基本操作程序 The basic operating procedures of genetic engineering 目的基因的筛选和获取-前提 利用PCR获取和扩增 化学方法人工合成 构建基因表达载体-核心 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞-关键 花粉管通道法(植物)、农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、Ca2+处理法(微生物); 目的基因的检测与鉴定-保证 分子检测：是否插入、转录、翻译 个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。 易错辨析 A．限制性内切核酸酶可以从某些原核生物中提取 B．限制性内切核酸酶也可以识别和剪切RNA C．不同限制性内切核酸酶可能切割出相同的黏性末端 D．DNA连接酶连接的是两条链碱基对之间的氢键 E．E.coli DNA连接酶只能将有互补黏性末端的两个DNA 片段连接起来 A．基因工程中所用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等 B．基因工程中用的载体大多数为天然质粒 C．质粒是常用的载体，有2个游离的磷酸基团 D．基因工程中的载体必须具有自我复制能力 E．基因工程中的载体具有一个至多个限制酶切割位点，以便目的基因的插入 F．载体质粒中必须有抗生素抗性基因，便于重组DNA分子的筛选 √ × √ × × √ × × √ √ A．基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建 √ × 易错辨析 B．构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中能稳定存在且遗传给下一代 C．一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、起始密码子和终止密码子等结构 D．基因表达载体的构建至少需要两种工具酶 E．基因表达载体的构建过程中会发生碱基互补配对 F．诱导物与诱导型启动子结合可激活或抑制目的基因表达 G．基因表达载体中启动子具有DNA聚合酶的结合部位，启动复制过程 A．农杆菌转化法是利用土壤农杆菌侵染植物细胞，然后将重组Ti质粒整合到受体植物细胞的染色体DNA上 B．将重组Ti质粒导入土壤农杆菌中时，可以用钙离子处理细菌 C．应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T－DNA片段内 D．将目的基因导入动物细胞常用体细胞作受体细胞，采用显微注射技术进行操作 E．可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译 F．某抗虫基因转基因是否成功，最简便的方法是观察该植物有没有抗虫性状 √ × √ √ √ × × √ √ × × √ 考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 1.DNA提取和鉴定的原理分别是? DNA提取原理： DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。 DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精 初步分离 DNA 和蛋白质 DNA 在不同浓度的 NaCl 溶液中溶解度不同，能溶于 2 mol/L 的 NaCl 溶液 溶解 DNA DNA鉴定原理： 在一定温度下，DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 2.材料选择和试剂作用？ 注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含 DNA。 （1）选材： DNA 含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。 （2）试剂： ① 研磨液 ② 体积分数为 95% 的酒精 ③ 2 mol/L 的 NaCl 溶液 ④ 二苯胺试剂 ⑤ 蒸馏水 → 提取、溶解 DNA 研磨液成分 作用 SDS 使蛋白质变性 EDTA 抑制DNA酶 Tris-HCl缓冲液 稳定DNA → 析出 DNA → 溶解 DNA → 鉴定DNA（要现配现） 考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 3.实验步骤 称取 30g 洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入 10mL 研磨液，充分研磨。 研磨洋葱 取材、研磨 研磨目的： 注意：研磨时间不宜太长，防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量； 有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶; 破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中。 考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 3.实验步骤 取材、研磨 过滤或离心 方法一：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。 方法二：直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心 5min，再取上清液放入烧杯中。 思考：①上清液中除 DNA 之外，可能含有哪些杂质？ ②低温放置几分钟有什么作用？ 不能用滤纸，防止DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。 可能含有核蛋白、多糖等杂质 抑制核酸水解酶的活性，进而抑制 DNA 降解； 抑制 DNA 分子运动，使 DNA 易形成沉淀析出； 低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂。 考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 3.实验步骤 方法一：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分； 用冷却的酒精析出DNA 取材、研磨 过滤或离心 分离 思考：①搅拌时应轻缓、并沿一个方向？ ②酒精预冷的作用？ 方法二：将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子 低温可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； 低温抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出； 低温有利于增加DNA的柔韧性，减少断裂。 考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 3.实验步骤 取材、研磨 过滤或离心 分离 鉴定 取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。 鉴定 DNA 鉴定结果 对照组 实验组 溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关。 思考讨论： 1. 如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？ 将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液。 2. 有时会在 DNA 滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？ 利用蛋白酶分解杂质蛋白，但不分解 DNA，有利于 DNA 与蛋白质分开。 3. 有时还会反复利用不同浓度的 NaCl 溶液来溶解、析出 DNA，试猜想该操作的目的？ 进一步纯化 DNA--用高盐浓度的溶液溶解 DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使 DNA 析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出 DNA，就能够除去与 DNA 溶解度不同的多种杂质。 DNA 的粗提取与鉴定 考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 1.实验原理 PCR利用了_________________和________________的原理。 DNA的热变性原理 DNA半保留复制 2.材料用具 ②微量离心管 ③微量移液器 ④一次性吸液枪头 ——自动控温，实现DNA的扩增 ——实际上是进行PCR反应的场所 PCR仪 微量离心管 推动杆 调节旋钮 卸枪头按钮 体积刻度 吸液杆 枪头 （注意：加不同样品时，需要更换枪头） ①PCR仪 ⑤PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （1pg～1μg） 5～10μL 总体积 50μL 注意：酶和缓冲液要在冰块上缓慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和缓冲液一般分装成小份，避免反复融化导致 。 活性降低甚至失活 考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 3 方法步骤 1.加样： 用微量移液器按照PCR反应体系配方，在微量离心管中依次加入各组分。 2.离心： 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。 ——提高反应速率 考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 3.反应：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min — — 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，10min 使DNA充分变性，双链打开，以利于引物更好地和模板结合。 问题1：预变性的目的是什么？ 问题2：为什么最后1次变性和延伸时间都延长了？ Taq 酶活性会随着循环次数增加而下降。在每一轮循环中，部分片段可能没有完全延伸完，Taq 酶就脱落了。最后1次变性、延伸时间延长，让这些DNA打开，重新充分延伸。 3 方法步骤 考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 问题1：PCR的产物是什么？ 问题2：如何鉴定PCR的产物？ DNA片段 琼脂糖凝胶电泳 利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 （1）电泳：DNA分子具有_______________，在一定的 ________下，这些基团可以带上正电荷或负 电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷________的电极移动，这个过程就是电泳。 可解离的基团 pH 相反 1 实验原理 一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带 ，在电场中DNA便向 泳动。 负电荷 正极 磷酸电离形成的磷酸基团带负电 样品点样孔应靠近 极。 负 考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 （2）鉴定方法：PCR的产物一般通过 来鉴定。 琼脂糖来源于红藻的多糖，其主要成分为多聚半乳糖，琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶。 琼脂糖凝胶具有网络结构（孔径），孔径大小与琼脂糖凝胶浓度有关，浓度越高，孔径越 ，能够通过的核酸分子越 。 琼脂糖凝胶电泳 在凝胶中DNA分子的迁移速率与_____________、_________________和______等有关 凝胶的浓度 DNA分子的大小 构象 小 小 考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 核酸染色剂 常用的核酸染色剂有EB（溴化乙锭）、GoldView等，EB能插入DNA分子中的碱基对之间，导致EB与DNA结合。嵌入核酸碱基间的EB能吸收300nm波长的紫外光，发出可见荧光。其荧光强度与DNA分子的含量成正比。 考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 标准参照物（Marker） DNA Marker是 的片段，在实验时和样本DNA同时进行凝胶电泳，通过对比两者的迁移速率，可以大致估计 。 样本DNA的大小 已知的DNA分子大小 考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 琼脂糖凝胶电泳装置 2 实验器材 考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 制备凝胶 观察鉴定 进行电泳 电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 ①熔化： ②倒模: ③凝固: 3 方法步骤 考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 制备凝胶 观察鉴定 进行电泳 将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（marker）。 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待 前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 ①加液 ②加样 ③电泳 指示剂 ①有颜色，使样品呈现颜色，便于加样。 ②分子量较小，指示样品迁移的速率及方向。 考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 制备凝胶 观察鉴定 进行电泳 取出凝胶置于 下观察和照相。 紫外灯 一条条带（目的基因片段） 1.本实验进行电泳鉴定的结果应该是几条条带？ 2.如图所示，该片段大小约为 。 750bp 0次 12次 12次 30次 30次 根据条带的 及 来评价扩增的结果 3.判断成功扩增出DNA片段的依据是什么？ 分布 粗细程度 估计DNA的大小 估计DNA的数量 思考·讨论 4.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？ 未出现扩增条带可能的原因有： ①引物出现质量问题； ②变性时温度 ，变性时间 ，模板DNA链未打开。 ③Taq酶失活； ④Mg2+浓度过 。 出现非特异性扩增带可能的原因有： ①引物特异性不强或容易聚合成二聚体 ②复性时的温度过低，引物随机连接到非目的基因片段 ③DNA聚合酶的浓度过高，即使引物与模板的结合并不完全匹配，酶仍可能催化延伸反应，生成非特异性扩增产物。 ④Mg2+浓度过高 ⑤模板DNA出现污染 低 低 短 注意： 1. 为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行 处理。 2. 该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在 储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上 。 3. 在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须 。 4. 在进行操作时，一定要戴好 。 5. PCR扩增不能随意加大试剂用量。 高压灭菌 -20℃ 更换 一次性手套 4．(2024·黑吉辽，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是(　　) A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 A 专题突破10　综合PCR的基因工程问题 一.利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式——正向连接和反向连接 5．(2019·江苏，33节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是______。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是________________。 乙、丙 目的基因反向连接 二.利用PCR技术引导基因定点突变及融合基因的重组构建——重叠延伸PCR 6．水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。 (1)由以上事例可知，要对蛋白质的结构进行改造，需要通过________________来完成。 (2)若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为______________才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为______________(假设引物为单链DNA)。 改造基因（或基因定点突变） T-A或C-G A或G (4)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问题是？ (3)在第一阶段获得2种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生____种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为？ 3 引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时会结合而失去作用。 M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段 三、利用PCR技术扩增未知基因序列——反向PCR 7．(2020·江苏，33节选)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)： (1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种_______酶，它通过识别特定的________________切割特定位点。 (2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成____________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得_________；Taq DNA聚合酶的作用是催化____________________________________。 限制 核苷酸序列 磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸 (3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。 ②④ 四、利用PCR技术快速检测病原体——荧光定量PCR 8．猴痘是由猴痘病毒(一种RNA病毒)感染所致的一种病毒性人畜共患病，临床上表现为发热、皮疹、淋巴结肿大等。猴痘病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。 (1)首先，从样本中提取病毒RNA，经________酶作用生成cDNA；然后以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。 (2)通过实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部分序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图1)。 ①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因复性时，通过________________原则而特异性结合。 ②在PCR循环的延伸阶段，TaqDNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈__________(填“正相关”或“负相关”)。 逆转录 碱基互补配对 正相关 (3)通过实时荧光PCR检测猴痘病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图2所示。 ①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因可能有？ ②Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就____________。 ③某新猴痘病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2所示猴痘病毒核酸检测结果应判定为____________。 (4)阴性结果也不能排除猴痘病毒感染，可能产生假阴性的因素有____________(多选)。 a．取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值 b．样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解 c．病毒发生变异 正相关 越小 阳性 abc Lavf60.16.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Lavf60.16.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Lavf60.16.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Lavf58.20.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $