同学们，大家好，欢迎走进今天的生物微课课堂。我们今天学习的主题是基因表达载体的构建。先来看一段视频，这是中国抗虫棉之父郭三堆院士的采访视频。中国的抗虫棉是逼出来的，中国的事应该由中国人自己来解决。这一年也要研究出我们中国的抗虫棉。那时候为了防止灭蚊虫，大量使用农药，所以那个时候人畜中毒的，环境污染的都很厉害。抗虫棉研制成功不仅仅它是一种技术上的成功，也是一种模式上的成功和精神上的成功。我们走了一条中国的从研发到产业整个过程的这么一个设计。我可以说自从有了抗虫病，基本没有因为棉花喷农药人畜中毒食物的这个食物。棉花浑身都是把面制饼是最好的纯肥的饲料。棉花里头有一个面粉，所以如果把面粉敲掉的话，它是很好的一个王室的作物。郭三堆院士，他带领团队打破国外技术垄断，让我国的抗虫棉技术走到了世界前列。我们知道培育抗虫棉首先要通过PCR获取bt抗虫蛋白基因，那获取到抗虫基因后，如何能够培育出抗虫棉呢？回顾我们前面讲过的基因工程的基本操作程序，培育转基因抗虫棉的过程分为四步，基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，这就是我们今天学习的重点内容。首先来分析为什么不能直接将BT抗虫蛋白基因导入棉花细胞，而要先构建基因表达载体呢？阅读资料思考回答。构建基因表达载体的目的是什么？一是让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。二是使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。那么构建好的基因表达载体需要具备哪些结构，并且行使什么功能呢？包含5种结构，我们来逐个学习。启动子是有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出MRNA。中子子是有特殊序列结构的。DNA片段位于基因的下游，其功能是终止转录标记。基因能够鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。复制原点是DNA复制的起始位点，目的基因能够控制表达所需要的特殊性状，我们需要选择启动子和终止子之间的限制酶切位点进行插入。在这里重点区分一个考试常考的易错点，就是启动子、终止子和起始密码子、终止密码子。启动子终止子是DNA片段管转录起始密码子，终止密码子是位于MINN上的管，翻译他们的位置不同，功能也不同。掌握结构之后，我们一起来学习基因表达载体如何构建。整个过程总结为两个字，切连。第一步，选用合适的限制酶进行切割运载体。第二步，用同种或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。第三步，利用DNA连接酶将两个片段进行连接，最终形成重组DNA分子式，至此基因表达载体构建完成。现在我们利用课前准备的一些剪纸材料，模拟基因表达载体的构建。这里提供了两种载体，两种含有目的基因的外源DNA片段，提供了可供选择的两种限制酶。这是其他同学构建的成果，但这些成果中只有第二个和最后一个是构建成功的那为什么还会有其他的一些情况出现呢？现在我们通过具体的题目来分析一下。第一问，构建基因表达载体时，能否用X8Y或hand three限制酶切割智力？为什么？答案是不能。我们可以看到智利图中X81它会破坏智利的抗生素抗性基因，handle three会破坏其动子，会导致后续的筛选和表达失败。第二问，选择合适的限制酶切割质粒和BT抗虫蛋白基因。有三个方案，那这三个方案当中哪一个是最优方案呢？同时选用eco a一和b match one是最优的方案。其实三个方案当中，前面两个它是属于单酶切，而后面一个最优方案是双酶切。在这里我们来对比一下单酶切和双酶切。单酶切会出现目的基因和质粒的自身环化，以及目的基因和智力的随意连接。水用双酶切时，目的基因和智力正向连接时对应切口的粘性末端相同，所以可以互补配对连接。反向连接时对应切口的粘性末端不同就无法连接，所以可以避免目的基因和质粒它们的自身环化以及两者之间的反向连接。好，我们再来看最后一问，上图中应选择什么限制酶对质粒和目的金进行切割形成重组载体，可以选用hand和MH one。我们可以看到含目的基因的外源DNA片段，虽然未标明转录方向，但是给出了一条链作为编码链，那么另一条链则是作为模板链。所以我们可以判断该目的金的转录方向是由左往右的。目的基因要插入启动子与终止子之间，故只能选择hand three白买去网。所以我们在使用双酶切的时候要注意方向性，做题时可以通过题目的信息去判断目的基因的转入方向，以保证正向插入。通过上述分析，我们知道了基因表达载体的构建方法，其实重点是在于限制没的选择，我们做题的时候要严格遵守限制酶的选择原则，不破坏关键结构，优先选择双酶切，保证定向插入。这里老师再补充一个知识点，如果目的金的两端没有合适的酶切位点该怎么办呢？我们可以通过引物设计，在引物的5撇端添加限制酶的识别序列，扩增后的目的基因就带上了我们所需要的酶切位点，这也是科研当中常用的一种改造方法。现在通过两道题目来巩固一下，第一题选B因为基因表达载体是重组DNA分子，而终止密码子是位于MNN上的，所以B选项是错误的。第二题答案是在引物一和引物的二的5撇端添加限制酶的识别序列。第二空为什么选择hand three MH one？我们可以看到受素基因的转入方向是从左往右，目的性转入方向要和启动子的方向保持一致，并且还要插入启动子与终止子之间，所以我们选择hand three与by much one。因为题目第一问问的是要在引物一和引物2的5撇端分别添加，所以后面一共两种限制酶。它们的书写顺序是hand three在前，by much one在后。最后我们快速回顾本节课的重点，构建基因表达载体的目的是使目的基因稳定存在，遗传给后代，并且能够正常表达。基因表达载体的结构包括启动子、目的基因、终止子、标记基因以及复制原点。基因表达载体的构建方法和过程其实重点是在于限制酶的选择，而限制酶的选择原则关键是不破坏关键结构，优先选择双酶切，保证定向插入。这是我们的课后任务，希望同学们能够按时完成。好，本节课的内容就到这里，同学们再见。