2027届高三大一轮复习（人教版 ）重难点05 PCR技术的循环过程、引物设计及选择、八大应用类型专攻（重难点讲义）

该高中生物学高考复习讲义聚焦PCR技术核心考点，涵盖原理、循环过程、电泳鉴定、引物设计及八大应用类型，按基础原理到技术应用的逻辑层次系统梳理，通过考点精讲、方法指导、真题剖析等环节，帮助学生构建完整知识网络，突破高考重点难点。 讲义以科学思维培养为核心，结合典例分析引物设计原则、电泳结果判断等关键技能，针对重叠延伸PCR、实时荧光定量PCR等高考高频应用设置专题突破，配合分层练习与真题演练，高效提升学生实验分析与解决问题能力，为教师精准把控复习节奏提供有力支撑。

　 重难点05 PCR技术的循环过程、电泳鉴定及应用专题突破 （PCR的原理、过程及电泳鉴定、引物设计和选择、PCR八大类型） 一、PCR技术的原理、过程及电泳鉴定 1.PCR技术的原理:DNA热变性、DNA半保留复制。 2.PCR的循环过程 （1）PCR过程： 过程 说明 图解 变性 温度超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链 复性 温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 延伸 温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 （2）PCR扩增过程中的循环图示： 【提醒】若一个目的基因在PCR中经过n轮循环，得到2n个DNA分子，含引物的DNA分子2n个，含其中一种引物的DNA分子数(2n－1)个，同时含两种引物的DNA分子(2n－2)个，共需要消耗(2n＋1－2)个引物。含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子2n个，含等长脱氧核苷酸链的DNA分子 (2n－2n)个。 3.电泳鉴定 （1）分离原理：在凝胶中DNA分子越大迁移速率越慢，而DNA分子越小迁移速率越快。 （2）结果分析：同一条带的DNA分子片段相同，条带粗细代表DNA分子片段的数量，距离起点的远近代表DNA分子片段的大小。 【典例1】(2024·新课标卷)某种二倍体植物的P1和P2植株杂交得F1，F1自交得F2。对个体的DNA进行PCR检测，产物的电泳结果如图所示，其中①～⑧为部分F2个体，上部2条带是一对等位基因的扩增产物，下部2条带是另一对等位基因的扩增产物，这2对等位基因位于非同源染色体上。下列叙述错误的是： A．①②个体均为杂合子，F2中③所占的比例大于⑤ B．还有一种F2个体的PCR产物电泳结果有3条带 C．③和⑦杂交子代的PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同 D．①自交子代的PCR产物电泳结果与④电泳结果相同的占1/2 【典例2】临床上对人的血清白蛋白(HSA)需求量很大，科研人员利用基因工程技术改造水稻，并从转基因水稻中获取HSA。部分流程及相关限制酶的识别序列和切割位点如图，HSA基因的b链为模板链。回答下列问题： (1)PCR扩增HSA基因时，一次循环包括变性、________三步，其中消耗引物的一步是________。与水稻细胞内的相关酶相比，该技术用到的酶具有的特点是________。 (2)HSA基因两端没有限制酶BclⅠ、BamHⅠ和Hind Ⅲ的酶切位点，据图分析，在利于提高HSA基因与Ti质粒之间的重组率的前提下，在PCR扩增HSA基因前，需要在设计的引物1的5′端添加的碱基序列是5′－______________－3′，引物2的5′端添加的碱基序列是5′－______________－3′。 (3)图中②过程，需要用________处理农杆菌，以提高重组表达载体进入农杆菌的效率。 (4)经③过程处理的水稻愈伤组织细胞中，正常情况下HSA基因会插入____________。为了检测HSA基因是否转化成功，应选择标记基因________的特性进行筛选。 二、引物的设计依据、原则及选择技巧 1.引物的设计依据：PCR扩增目的基因时，设计引物的依据是目的基因两端的部分核苷酸序列，引物与目的基因模板链的3′端的部分序列互补配对。 2.引物的设计原则和实例分析 （1）设计原则 ①引物长度要适宜：通常为20～30个核苷酸；引物长度越短，产物特异性越低。 ②引物GC含量要适宜：一般为45%～55%。 ③复性温度要适宜：复性温度过高会抑制引物与模板的碱基配对，复性温度过低会增大引物与DNA模板链发生错配的概率。复性温度越低，产物特异性越低。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关。引物的长度相同时，GC含量越高，需要设定的复性温度越高。 ④引物自身及引物之间不应有连续的多个碱基互补。 （2）实例分析：某同学设计两组引物(只标注部分碱基序列)都不合理。请解释原因： 提示：第1组引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效；第2组引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。 3.引物的选择技巧 （1）一看方向：引物与模板链之间反向配对，模板链是3’→5’，引物延伸是5’→3’。 （2）二看区间：PCR扩增的是两个引物之间的DNA片段，因此应选择目的基因两端正确方向配对的两个引物。 【典例1】(2026·江西上饶一模)RDX是一种有毒化学物质，能够深入土壤和饮用水中，对生态环境和人类健康构成严重威胁。科研人员从细菌中获得RDX降解酶基因XplA和XpIB，并利用农杆菌转化法将这两个基因插入柳枝稷草染色体中，使柳枝稷草获得降解土壤中RDX的能力。XplA和XpIB基因结构如图1所示，基因表达载体的部分结构如图2所示。下列有关叙述错误的是（　　） A. 为确保XpIB基因定向插入到载体中，PCR扩增时，在引物1、2的两端需分别加入XmaI、BclI的识别序列 B. 若通过PCR检测所获转基因柳枝稷草中是否插入XplA和XpIB基因，需选用的引物为引物1、引物2 C. 由于电泳只能区分DNA序列的长度，不能确认是否为目的基因，所以对符合预期的产物片段，需进行基因测序 D. 将XplA和XplB基因成功转入柳枝稷草细胞并获得的转基因植株中，并不是所有个体都具有降解RDX的能力 【典例2】重叠延伸PCR技术是一种通过核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，经过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法，过程如图。下列叙述错误的是(　　) A．引物中G、C的含量越高，复性温度越高；当设置温度过低时可能导致非特异性条带增多 B．第一阶段中引物2和引物3容易发生碱基互补配对，因此两者应置于不同反应系统中 C．加入引物1、2的反应系统和加入引物3、4的反应系统中各进行1次PCR，共产生4种DNA分子 D．引物1、2组成的反应系统中，经第一阶段要形成图中同时含有引物1、2的双链DNA分子，至少要经过2次复制 三、PCR技术的八大应用类型 (一)PCR技术鉴定目的基因是否反向连接 实例分析：为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。如图所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是乙和丙。若用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是目的基因反向连接。　 (二)重叠延伸PCR技术引导基因定点突变 1.原理：PCR定点突变是基于聚合酶链式反应（PCR）技术发展而来的一种DNA修饰技术。基本原理是在PCR反应中加入具有错误碱基的引物，通过DNA聚合酶的作用，在特定位置引入所需的突变。 2.步骤： （1）设计具有错误碱基的引物 在PCR定点突变中，关键步骤是设计具有错误碱基的引物。这些引物在与模板DNA序列互补的同时，在特定位置引入一个或多个错误的碱基。根据需要，可以设计多种引物，以在相同或不同位置引入多个突变。 （2）退火和延伸步骤 在标准的PCR反应中，退火和延伸是关键步骤。当加热将双链DNA解旋后，引物与模板DNA序列互补结合，形成单链DNA-引物复合物。随后，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸合成新的DNA链。在此过程中，错误的碱基被掺入到新合成的DNA链中。 （3）变性、退火与延伸循环 PCR反应通过变性、退火和延伸的循环进行，使新的DNA链得以不断合成和扩增。最终，通过多轮循环，突变DNA序列的拷贝数不断增加，从而实现定点突变的克隆和扩增。 3.过程图示： 4.大引物PCR技术 大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。 【典例1】重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示(凸起处代表突变位点)。下列说法正确的是(　　) A.过程①需要把两对引物同时加入一个扩增体系以提高扩增效率 B.过程①至少需要3轮PCR才能得到图中所示PCR产物 C.过程②的产物都可以完成延伸过程 D.若过程④得到16个突变基因则需要消耗15个通用引物RP2 【典例2】 (2026·湖南长沙一中联考)基因定点突变的目的是通过定向改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作为第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列叙述错误的是(　　) A.第一轮PCR过程中复性所用的温度应低于第二轮PCR复性的温度 B.PCR扩增的定点诱变产物需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译 C.第一轮PCR的产物的两条DNA链作为第二轮PCR所用的引物 D.将某蛋白质的第21位组氨酸(CAC)改造成酪氨酸(UAC)，属于蛋白质工程 (三)重叠延伸PCR技术构造融合基因 1.过程：融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法，其过程如图所示。 2.实例：如图是中间载体1和中间载体2(利用融合PCR技术构建成)构建成叶绿体定点整合表达载体示意图(限制酶酶切位点标注于载体外侧)，叶绿体定点整合表达载体通过与叶绿体基因的同源重组，将目的基因整合于叶绿体DNA上的特定位点上。 【典例1】丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）引起的一种传染病。为研制针对HCV的多肽疫苗，某研究小组构建LTB-R9-Bp融合基因的过程如图，进而构建出融合基因表达载体，其中LTB是一种免疫增强剂基因，R9-Bp是HCV两个相连的包膜蛋白基因。下列说法正确的是（    ） A．PCR反应体系中需加入待扩增的模板、引物、原料、耐高温的DNA水解酶 B．若要大量扩增LTB-R9-Bp融合基因，可选择引物P2和引物P3继续进行PCR C．融合基因表达载体的组成元件有融合基因、标记基因、启动子和终止密码子等 D．若利用转基因植物生产该疫苗，需用到基因工程、植物组织培养和抗原抗体杂交技术 【典例2】（2026•湖北模拟）细菌中的M蛋白在酶X的作用下被ATP磷酸化，磷酸化的M蛋白积累会抑制细菌的生长，酶Y则可使其发生去磷酸化。研究人员用X基因（编码酶X）、Y基因（编码酶Y）和GFP基因（编码绿色荧光蛋白）构建3种融合基因（GFP基因均位于融合基因的上游），并将3种融合基因分别导入不含X和Y基因的大肠杆菌中，以研究酶Y的功能。回答下列问题。 （1）将融合基因a和质粒构建的基因表达载体导入大肠杆菌后，接种在含卡那霉素的培养基上，从长出的菌落中提取DNA，选用引物组合 　 　 进行PCR，以检测融合基因a是否正确插入。若实验操作规范但未获得扩增产物，其原因可能是 　 　 。 （2）构建融合基因b时，应将GFP基因中编码 　 　 的序列删除，使得受体细胞合成GFP﹣酶X融合蛋白。为检测导入融合基因b的工程菌内融合基因b是否完整表达以及酶X的活性，首先从具有 　 　 特征的菌落中提取蛋白质进行电泳，在泳道中添加的物质还应包括 　 　 ，后续实验用特异性识别磷酸化的M蛋白的抗体检测，通过是否出现阳性结果来判断酶X的活性。 （3）将以上3种融合基因分别转化的工程菌与未转化的大肠杆菌通过 　 　 法接种到同一平板的①～④区域。一段时间后，菌落生长状况如图2所示，推测导入融合基因a的工程菌被接种在图中的 　 　 区域。为从中筛选出高活性酶Y的突变菌株，基 本思路是 　 。 (四)反向PCR技术扩增未知基因序列 1.条件：当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。 2思路：先从未知序列的两侧把DNA 切成片段，然后通过DNA连接酶将DNA片段环化；再利用已知序列的两端设计引物，只不过引物相对于已知序列是反向配置的，所以子链反向延伸(如图)。 反向PCR可用于检测目的基因在受体细胞基因组上的插入位点等未知DNA片段。 【典例1】如图所示，在一段未知序列的突变体DNA片段中，插入了已知序列的T－DNA，要想对T－DNA两侧的未知序列进行测序，下列做法正确的是(　　) A．用引物①和引物④直接进行PCR扩增之后再测序 B．用引物②和引物③直接进行PCR扩增之后再测序 C．用DNA连接酶连接成环状后，再用引物①④PCR扩增后测序 D．用DNA连接酶连接成环状后，再用引物②③PCR扩增后测序 【典例2】(2025·山东卷)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T－DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为____________________。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaⅠ和__________对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是__________。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶__________进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为__________bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是T－DNA插入小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T－DNA的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为______(填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶，且T－DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段__________，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为____________________(填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，________(填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。 (五)“双脱氧法”基因测序 1.原理：(1)双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3′-OH，因此每当DNA链加入分子ddNTP时，延伸便终止。 (2)每一次DNA测序是由4个独立的PCR反应组成的，4个PCR反应体系均加入模板、引物、dNTP、DNA聚合酶，唯一不同的是4个反应体系分别加入不同的含有标记的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。 (3)PCR反应后，在反应体系中就形成了大量起始点相同、终止点不同的DNA片段，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带，依据电泳条带读取DNA双链的碱基序列。 (4)双脱氧法原理示意图： 2.实例：通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。 上述PCR反应体系中只加入一种引物，对照个体PCR子链的测序结果为5′­CTACCCGTGAT­3′，该序列与对照个体双链DNA分子中模板链的互补链的序列相同，患者为5′­CTACCTGTGAT­3′，对比可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T。 【典例1】ddNTP(双脱氧核苷三磷酸)缺少3′羟基，无法形成新的磷酸二酯键，能使DNA链的延伸终止，因此常被用于DNA测序。某实验室欲利用PCR技术对某DNA进行测序，已知参与反应的物质有被测序的DNA、dNTP(脱氧核苷三磷酸)、引物、相关酶等，且不同ddNTP参与反应的结果如表所示，其中“■”代表引物。下列叙述正确的是(　　) ddNTP类型 子链类型 ddATP ■—GATTCGAGCTGddATP ■—GATTCGddATP ■—GddATP ddCTP ■—GATTCGAGddCTP ■—GATTddCTP ddGTP ■—GATTCGAGCTddGTP ■—GATTCGAddGTP ■—GATTCddGTP ■—ddGTP ddTTP ■—GATTCGAGCddTTP ■—GATddTTP ■—GAddTTP A.题中相关酶包括解旋酶、DNA聚合酶等 B．若不考虑引物，则被测的DNA的序列应为5′－CTAAGCTCGACT－3′ C．引物的碱基序列与模板链的3′端的一段碱基序列相同 D．dNTP可为DNA复制提供原料和能量 【典例2】(2024·湖南卷)（不定项）最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（　　） A. 上述PCR反应体系中只加入一种引物 B. 电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C. 5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列 D. 患者该段序列中某位点的碱基C突变为G (六)实时荧光定量PCR技术(qRT－PCR) 1.获取cDNA。从样本中提取RNA（有多种RNA），通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA。 2.PCR扩增cDNA。在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。 3.荧光检测。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小(如图)。 【典例】实时荧光定量PCR简称qPCR，灵敏度高、特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将标有荧光素的Taqman探针与待测样本DNA混合后，在变性、复性、延伸的热循环中，与待测样本DNA配对结合的Taqman探针被Taq酶切断，在特定光激发下发出荧光(如图所示)，随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值。 (1)做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1对引物和______种Taqman探针。 (2)设初始目的基因有m个，扩增n次，需消耗探针____________个。 (3)Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就________。 （七）巢式PCR技术 1.原理：巢式PCR是指先后用外引物和内引物扩增目的基因的方法，其原理为先以比目的基因大的DNA片段为模板，用外引物(F1、R1)进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物(F2、R2)扩增目的基因。 2.过程图示： （注：第二轮PCR使用内引物以第一轮PCR产物为模板进行再次扩增，第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定；如果两套引物一起加入反应体系中，外引物长度应大于内引物长度，复性温度需高于内引物，使外引物先进行反应。） （八）不对称PCR技术 1.原理：不对称PCR是一种通过控制引物浓度比例选择性扩增单链DNA的技术，其核心原理是使用限制性引物与非限制性引物按1：50的比例进行PCR扩增，初期生成双链DNA，当限制性引物耗尽后转为单链扩增，该方法可用于制备DNA探针。 2.过程图示： （注：制备的单链DNA探针与目标DNA的α链相同。） 【典例1】DNA分子杂交时，常需要大量的单链DNA探针。不对称PCR是一种常见的单链DNA探针制备方法，其原理是反应体系中加入一对数量不相等的引物。假设在PCR反应的早期10个循环中，扩增产物是双链DNA，当较少的限制性引物耗尽后，数量较多的非限制性引物将引导合成大量目标DNA单链。下列叙述正确的是(　　) A．若a链为所需的DNA分子探针，则非限制性引物应选用引物Ⅲ B．进行最初10个循环的目的是为了将限制性引物消耗完，以保证获得大量的单链DNA探针 C．设计较长的限制性引物与较短的非限制性引物，以便于后阶段通过提高温度来控制产物生成量 D．如果体系中原模板DNA的数量为m，共进行25次循环，则最终获得的单链探针数为15×210m 【典例2】(2026·四川成都七中诊断)不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法，如图所示。不对称PCR中加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物，两者的比例通常为1∶100，PCR反应最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。下列相关说法错误的是(　　) A.用不对称PCR方法扩增目的基因时，不需要知道基因的全部序列 B.进行最初若干次循环的目的是增加模板DNA的量 C.最后大量获得的ssDNA与图中乙链的碱基序列一致 D.因为双链DNA和单链DNA的分子量大小不同，可通过电泳方法将其分离 1 学科网（北京）股份有限公司 $ 　 重难点05 PCR技术的循环过程、电泳鉴定及应用专题突破 （PCR的原理、过程及电泳鉴定、引物设计和选择、PCR八大类型） 一、PCR技术的原理、过程及电泳鉴定 1.PCR技术的原理:DNA热变性、DNA半保留复制。 2.PCR的循环过程 （1）PCR过程： 过程 说明 图解 变性 温度超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链 复性 温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 延伸 温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 （2）PCR扩增过程中的循环图示： 【提醒】若一个目的基因在PCR中经过n轮循环，得到2n个DNA分子，含引物的DNA分子2n个，含其中一种引物的DNA分子数(2n－1)个，同时含两种引物的DNA分子(2n－2)个，共需要消耗(2n＋1－2)个引物。含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子2n个，含等长脱氧核苷酸链的DNA分子 (2n－2n)个。 3.电泳鉴定 （1）分离原理：在凝胶中DNA分子越大迁移速率越慢，而DNA分子越小迁移速率越快。 （2）结果分析：同一条带的DNA分子片段相同，条带粗细代表DNA分子片段的数量，距离起点的远近代表DNA分子片段的大小。 【典例1】(2024·新课标卷)某种二倍体植物的P1和P2植株杂交得F1，F1自交得F2。对个体的DNA进行PCR检测，产物的电泳结果如图所示，其中①～⑧为部分F2个体，上部2条带是一对等位基因的扩增产物，下部2条带是另一对等位基因的扩增产物，这2对等位基因位于非同源染色体上。下列叙述错误的是： A．①②个体均为杂合子，F2中③所占的比例大于⑤ B．还有一种F2个体的PCR产物电泳结果有3条带 C．③和⑦杂交子代的PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同 D．①自交子代的PCR产物电泳结果与④电泳结果相同的占1/2 【答案】D 【解析】由题可知，这2对等位基因位于非同源染色体上，假设A/a为上部两条带的等位基因，B/b为下部两条带的等位基因，由电泳图可知P1为AAbb，P2为aaBB，F1为AaBb，F2中①AaBB②Aabb都为杂合子，③AABb占F2的比例为，⑤AABB占F2的比例为，A正确；电泳图中的F2的基因型依次为：AaBB、Aabb、AABb、aaBB、AABB、AAbb、aabb、AaBb，未出现的基因型为aaBb，其个体PCR产物电泳结果有3条带，B正确；③AABb和⑦aabb杂交后代为Aabb、 AaBb，其PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同，C正确；①AaBB自交子代为，AABB（）、AaBB（）、aaBB（），其PCR产物电泳结果与④aaBB电泳结果相同的占，D错误。 【典例2】临床上对人的血清白蛋白(HSA)需求量很大，科研人员利用基因工程技术改造水稻，并从转基因水稻中获取HSA。部分流程及相关限制酶的识别序列和切割位点如图，HSA基因的b链为模板链。回答下列问题： (1)PCR扩增HSA基因时，一次循环包括变性、________三步，其中消耗引物的一步是________。与水稻细胞内的相关酶相比，该技术用到的酶具有的特点是________。 (2)HSA基因两端没有限制酶BclⅠ、BamHⅠ和Hind Ⅲ的酶切位点，据图分析，在利于提高HSA基因与Ti质粒之间的重组率的前提下，在PCR扩增HSA基因前，需要在设计的引物1的5′端添加的碱基序列是5′－______________－3′，引物2的5′端添加的碱基序列是5′－______________－3′。 (3)图中②过程，需要用________处理农杆菌，以提高重组表达载体进入农杆菌的效率。 (4)经③过程处理的水稻愈伤组织细胞中，正常情况下HSA基因会插入____________。为了检测HSA基因是否转化成功，应选择标记基因________的特性进行筛选。 答案：(1)复性、延伸　复性　耐高温　(2)GGATCC　AAGCTT　(3)钙离子　(4)染色体DNA中　1 【解析】(2)HSA基因两端没有限制酶BclⅠ、BamHⅠ和Hind Ⅲ的酶切位点，要使目的基因插入启动子和终止子之间且方向正确，需使用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种酶，在PCR扩增HSA基因前，需在设计的引物1的5′端添加BamHⅠ识别序列5′－GGATCC－3′，引物2的5′端添加Hind Ⅲ识别序列5′－AAGCTT－3′。(3)图中②过程将重组的质粒即目的基因导入农杆菌，需要用钙离子(CaCl2溶液)处理农杆菌，以提高重组表达载体进入农杆菌的效率。 (4)经③过程处理的水稻愈伤组织细胞中，HSA基因应插入水稻愈伤组织细胞的染色体DNA中，为了检测HSA基因是否转化成功，应选择标记基因1的特性进行筛选，因为标记基因1随T－DNA整合到水稻愈伤组织细胞的染色体的DNA中。 二、引物的设计依据、原则及选择技巧 1.引物的设计依据：PCR扩增目的基因时，设计引物的依据是目的基因两端的部分核苷酸序列，引物与目的基因模板链的3′端的部分序列互补配对。 2.引物的设计原则和实例分析 （1）设计原则 ①引物长度要适宜：通常为20～30个核苷酸；引物长度越短，产物特异性越低。 ②引物GC含量要适宜：一般为45%～55%。 ③复性温度要适宜：复性温度过高会抑制引物与模板的碱基配对，复性温度过低会增大引物与DNA模板链发生错配的概率。复性温度越低，产物特异性越低。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关。引物的长度相同时，GC含量越高，需要设定的复性温度越高。 ④引物自身及引物之间不应有连续的多个碱基互补。 （2）实例分析：某同学设计两组引物(只标注部分碱基序列)都不合理。请解释原因： 提示：第1组引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效；第2组引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。 3.引物的选择技巧 （1）一看方向：引物与模板链之间反向配对，模板链是3’→5’，引物延伸是5’→3’。 （2）二看区间：PCR扩增的是两个引物之间的DNA片段，因此应选择目的基因两端正确方向配对的两个引物。 【典例1】(2026·江西上饶一模)RDX是一种有毒化学物质，能够深入土壤和饮用水中，对生态环境和人类健康构成严重威胁。科研人员从细菌中获得RDX降解酶基因XplA和XpIB，并利用农杆菌转化法将这两个基因插入柳枝稷草染色体中，使柳枝稷草获得降解土壤中RDX的能力。XplA和XpIB基因结构如图1所示，基因表达载体的部分结构如图2所示。下列有关叙述错误的是（　　） A. 为确保XpIB基因定向插入到载体中，PCR扩增时，在引物1、2的两端需分别加入XmaI、BclI的识别序列 B. 若通过PCR检测所获转基因柳枝稷草中是否插入XplA和XpIB基因，需选用的引物为引物1、引物2 C. 由于电泳只能区分DNA序列的长度，不能确认是否为目的基因，所以对符合预期的产物片段，需进行基因测序 D. 将XplA和XplB基因成功转入柳枝稷草细胞并获得的转基因植株中，并不是所有个体都具有降解RDX的能力 【答案】B 【解析】为确保XplB基因定向插入载体，需要在引物1、2的两端分别加入XmaⅠ、BclⅠ的识别序列，这样PCR扩增后的片段两端就带有这两种酶的酶切位点，能与载体的对应酶切位点定向连接，A正确；若通过PCR检测转基因柳枝稷草中是否插入XplA和XplB基因，需要分别针对两个基因设计引物，检测XplA基因需要引物3、引物4；检测XplB基因需要引物1、引物2。 仅用引物1、引物2只能检测XplB基因，无法检测XplA基因，B错误； 由于电泳只能区分DNA片段的长度，不能确认片段的碱基序列是否为目的基因，因此对符合预期的产物需要进行基因测序来验证，C正确；将XplA和XplB基因成功转入柳枝稷草细胞并获得转基因植株后，由于基因表达受多种因素影响，不是所有个体都能正常表达这两个基因，因此不是所有个体都具备降解RDX的能力，D正确。 【典例2】重叠延伸PCR技术是一种通过核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，经过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法，过程如图。下列叙述错误的是(　　) A．引物中G、C的含量越高，复性温度越高；当设置温度过低时可能导致非特异性条带增多 B．第一阶段中引物2和引物3容易发生碱基互补配对，因此两者应置于不同反应系统中 C．加入引物1、2的反应系统和加入引物3、4的反应系统中各进行1次PCR，共产生4种DNA分子 D．引物1、2组成的反应系统中，经第一阶段要形成图中同时含有引物1、2的双链DNA分子，至少要经过2次复制 【答案】C 【解析】G与C之间形成三个氢键，引物中G、C的含量越高，与模板链形成的氢键越多，复性温度设置得越高；当设置温度过低，会造成引物与模板链的结合位点增加，导致非特异性条带增多，A正确；由图可知，引物2和引物3分别与目的基因两条链的相对应位置结合，因此二者之间存在碱基互补配对片段，为防止扩增时引物2与引物3之间进行配对，需将其置于不同反应系统中，B正确；引物1和2位于一个反应系统中，引物3和4位于另一个反应系统中，这两个反应系统各进行1次PCR，引物1扩增的DNA分子与引物4扩增的DNA分子相同，因此只能产生3种双链DNA分子，即引物1(或4)扩增的双链DNA分子，引物2扩增的双链DNA分子，引物3扩增的双链DNA分子，C错误；引物2与目的基因的相应模板链结合，可形成一个含引物2的双链不等长的DNA分子，该DNA分子中引物2所在的那条链再与引物1结合即可扩增获得同时含有引物1和引物2的双链等长的DNA分子，因此至少需要经过2次复制，D正确。 三、PCR技术的八大应用类型 (一)PCR技术鉴定目的基因是否反向连接 实例分析：为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。如图所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是乙和丙。若用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是目的基因反向连接。　 (二)重叠延伸PCR技术引导基因定点突变 1.原理：PCR定点突变是基于聚合酶链式反应（PCR）技术发展而来的一种DNA修饰技术。基本原理是在PCR反应中加入具有错误碱基的引物，通过DNA聚合酶的作用，在特定位置引入所需的突变。 2.步骤： （1）设计具有错误碱基的引物 在PCR定点突变中，关键步骤是设计具有错误碱基的引物。这些引物在与模板DNA序列互补的同时，在特定位置引入一个或多个错误的碱基。根据需要，可以设计多种引物，以在相同或不同位置引入多个突变。 （2）退火和延伸步骤 在标准的PCR反应中，退火和延伸是关键步骤。当加热将双链DNA解旋后，引物与模板DNA序列互补结合，形成单链DNA-引物复合物。随后，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸合成新的DNA链。在此过程中，错误的碱基被掺入到新合成的DNA链中。 （3）变性、退火与延伸循环 PCR反应通过变性、退火和延伸的循环进行，使新的DNA链得以不断合成和扩增。最终，通过多轮循环，突变DNA序列的拷贝数不断增加，从而实现定点突变的克隆和扩增。 3.过程图示： 4.大引物PCR技术 大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。 【典例1】重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示(凸起处代表突变位点)。下列说法正确的是(　　) A.过程①需要把两对引物同时加入一个扩增体系以提高扩增效率 B.过程①至少需要3轮PCR才能得到图中所示PCR产物 C.过程②的产物都可以完成延伸过程 D.若过程④得到16个突变基因则需要消耗15个通用引物RP2 【答案】D 【解析】两种突变引物能互补配对，因此过程①必须分两个反应系统进行，A错误；过程①至少需要2轮PCR才能得到图中所示PCR产物，B错误；过程②获得的产物不都可以完成延伸过程，因为子链只能从引物的3′端开始延伸，C错误；若过程④得到16个突变基因，则产生16个突变基因共需要消耗16×2－2＝30(个)通用引物，而需要通用引物RP2的数量为30÷2＝15(个)，D正确。 【拓展】两个引物均从内部扩增，在某一引物引入突变位点 若两个引物均从内部扩增，其中一个引物引入突变位点，则至少第3次扩增后才可获得双链等长的突变DNA片段，n轮扩增后可获得2n－2n个突变DNA。 【典例2】 (2026·湖南长沙一中联考)基因定点突变的目的是通过定向改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作为第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列叙述错误的是(　　) A.第一轮PCR过程中复性所用的温度应低于第二轮PCR复性的温度 B.PCR扩增的定点诱变产物需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译 C.第一轮PCR的产物的两条DNA链作为第二轮PCR所用的引物 D.将某蛋白质的第21位组氨酸(CAC)改造成酪氨酸(UAC)，属于蛋白质工程 【答案】C 【解析】为了使两轮PCR反应在同一支试管中进行， 引物设计时应考虑不同的复性温度，第一轮PCR过程中复性所用的温度应低于第二轮PCR复性的温度，A正确；若要使目的基因可以表达出蛋白质，则产物需具备启动子和终止子，诱导基因转录和翻译，B正确；除了第一轮产物作为第二轮PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，C错误。 (三)重叠延伸PCR技术构造融合基因 1.过程：融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法，其过程如图所示。 2.实例：如图是中间载体1和中间载体2(利用融合PCR技术构建成)构建成叶绿体定点整合表达载体示意图(限制酶酶切位点标注于载体外侧)，叶绿体定点整合表达载体通过与叶绿体基因的同源重组，将目的基因整合于叶绿体DNA上的特定位点上。 【典例1】丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）引起的一种传染病。为研制针对HCV的多肽疫苗，某研究小组构建LTB-R9-Bp融合基因的过程如图，进而构建出融合基因表达载体，其中LTB是一种免疫增强剂基因，R9-Bp是HCV两个相连的包膜蛋白基因。下列说法正确的是（    ） A．PCR反应体系中需加入待扩增的模板、引物、原料、耐高温的DNA水解酶 B．若要大量扩增LTB-R9-Bp融合基因，可选择引物P2和引物P3继续进行PCR C．融合基因表达载体的组成元件有融合基因、标记基因、启动子和终止密码子等 D．若利用转基因植物生产该疫苗，需用到基因工程、植物组织培养和抗原抗体杂交技术 【答案】D 【解析】PCR扩增时，需要耐高温的DNA聚合酶，A错误；通过PCR技术扩增LTB-R9-Bp融合基因，需要与融合基因两端序列互补配对的引物，结合图示分析，可选择引物P1和引物P4继续进行PCR，B错误；终止密码子存在于mRNA上，不会存在于融合基因中，C错误；若利用转基因植物生产该疫苗，则需要通过基因工程获得含有目的基因的受体细胞，再通过植物组织培养获得具备产生疫苗的植物，最终需要通过抗原抗体杂交技术进行目的基因成功表达的鉴定，D正确。 【典例2】（2026•湖北模拟）细菌中的M蛋白在酶X的作用下被ATP磷酸化，磷酸化的M蛋白积累会抑制细菌的生长，酶Y则可使其发生去磷酸化。研究人员用X基因（编码酶X）、Y基因（编码酶Y）和GFP基因（编码绿色荧光蛋白）构建3种融合基因（GFP基因均位于融合基因的上游），并将3种融合基因分别导入不含X和Y基因的大肠杆菌中，以研究酶Y的功能。回答下列问题。 （1）将融合基因a和质粒构建的基因表达载体导入大肠杆菌后，接种在含卡那霉素的培养基上，从长出的菌落中提取DNA，选用引物组合 　 　 进行PCR，以检测融合基因a是否正确插入。若实验操作规范但未获得扩增产物，其原因可能是 　 　 。 （2）构建融合基因b时，应将GFP基因中编码 　 　 的序列删除，使得受体细胞合成GFP﹣酶X融合蛋白。为检测导入融合基因b的工程菌内融合基因b是否完整表达以及酶X的活性，首先从具有 　 　 特征的菌落中提取蛋白质进行电泳，在泳道中添加的物质还应包括 　 　 ，后续实验用特异性识别磷酸化的M蛋白的抗体检测，通过是否出现阳性结果来判断酶X的活性。 （3）将以上3种融合基因分别转化的工程菌与未转化的大肠杆菌通过 　 　 法接种到同一平板的①～④区域。一段时间后，菌落生长状况如图2所示，推测导入融合基因a的工程菌被接种在图中的 　 　 区域。为从中筛选出高活性酶Y的突变菌株，基 本思路是 　 。 答案：（1）1、4或2、3；融合基因a未成功导入或与质粒反向连接 （2）终止密码子；绿色荧光；M蛋白和ATP （3）稀释涂布平板；③；从③区域挑取菌落制成菌液后，涂布到平板上进行培养，筛选出较大的菌落 【解析】（1）融合基因要插入到启动子与终止子之间，要检测融合基因a是否正确插入，需选择能与融合基因a两端互补配对的引物组合，即引物1、4或2、3。若实验操作规范但未获得扩增产物，原因可能是融合基因a未成功导入，或者导入的质粒反向连接，导致引物无法与目的基因正确结合进行扩增。 （2）构建融合基因b时，为使受体细胞合成GFP﹣X融合蛋白，应将GFP基因中编码终止密码子的序列删除，否则翻译会提前终止，无法形成融合蛋白。检测融合基因b是否完整表达及酶X活性时，先从具有绿色荧光特征的菌落中提取蛋白质，因为融合基因b含GFP基因，表达后有绿色荧光。在电泳道中添加的物质还应包括M蛋白和ATP，因为酶X可使M蛋白磷酸化（需要ATP的磷酸基团），通过检测是否出现磷酸化的M蛋白来判断酶X的活性。 （3）将转化的工程菌与未转化的大肠杆菌通过稀释涂布平板法接种到同一平板的①﹣④区域。由于融合基因a中含X基因，X基因表达的酶X使M蛋白磷酸化抑制细菌生长，而Y基因表达的产物使其发生去磷酸化，所以导入融合基因a的工程菌接种在图中的③区域（菌落相对较少），导入融合基因c和导入空白质粒的大肠杆菌表现为正常生长，对应图中②④区域，导入融合基因b的大肠杆菌表现为抑制生长，对应图中①区域。筛选高活性酶Y的突变菌株的基本思路是从③区域（导入融合基因c，含Y基因）挑取菌落制成菌液后，涂布到平板上进行培养，筛选出较大的菌落。因为高活性的酶Y能使磷酸化的M蛋白去磷酸化，解除对细菌生长的抑制，使菌落生长较大。 (四)反向PCR技术扩增未知基因序列 1.条件：当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。 2思路：先从未知序列的两侧把DNA 切成片段，然后通过DNA连接酶将DNA片段环化；再利用已知序列的两端设计引物，只不过引物相对于已知序列是反向配置的，所以子链反向延伸(如图)。 反向PCR可用于检测目的基因在受体细胞基因组上的插入位点等未知DNA片段。 【典例1】如图所示，在一段未知序列的突变体DNA片段中，插入了已知序列的T－DNA，要想对T－DNA两侧的未知序列进行测序，下列做法正确的是(　　) A．用引物①和引物④直接进行PCR扩增之后再测序 B．用引物②和引物③直接进行PCR扩增之后再测序 C．用DNA连接酶连接成环状后，再用引物①④PCR扩增后测序 D．用DNA连接酶连接成环状后，再用引物②③PCR扩增后测序 【答案】C 【解析】直接选用引物①、④组合进行PCR，引物选择方向相反，无法完成扩增，A错误；用引物②和引物③可实现对已知的T－DNA序列进行扩增，但达不到预期目的，B、D错误；用DNA连接酶连接成环状后，用引物①④PCR扩增后测序，恰好可扩增出T－DNA两侧的未知序列，C正确。 【典例2】(2025·山东卷)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T－DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为____________________。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaⅠ和__________对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是__________。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶__________进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为__________bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是T－DNA插入小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T－DNA的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为______(填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶，且T－DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段__________，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为____________________(填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，________(填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。 答案：(1)复制原点　XbaⅠ　DNA聚合酶　SpeⅠ、SmaⅠ　550　(2)4　连接成环(或环化)　测序和序列比对　(3)不能 【解析】(1)Ti质粒和普通质粒一样，具有复制原点，与其在宿主中的复制能力密切相关。选择载体上的酶切位点，首先BamHⅠ不能选，因为涉及终止子序列被切开；其次，能与SmaⅠ组合的只剩下XbaⅠ和PstⅠ，这两个限制酶能切出黏性末端；第三，涉及要补平黏性末端，只有XbaⅠ切出的黏性末端(5′端突出的末端)可以作为模板，在DNA聚合酶的催化下，从其互补链的3′端开始连接脱氧核苷酸补平黏性末端，如图1所示；而PstⅠ切出的黏性末端是3′端突出的末端，无法作为模板，无法从其互补链的5′端开始连接脱氧核苷酸，如图2所示。 首先，补平的载体和SmaⅠ切割的抗除草剂基因X既可以正向连接也可以反向连接；其次，SmaⅠ切出的平末端和补平的XbaⅠ的黏性末端连接后形成的重组位点，两个限制酶识别序列消失，另一边2个SmaⅠ位点连接后形成的重组位点仍然能保留该酶切位点；第三，能切出较准确片段的只剩下SmaⅠ和目的基因内的SpeⅠ两个酶切位点；第四，在进行目的基因和载体连接过程中，由于使用了单酶切，因此，存在载体自连、载体串联、载体和单一基因连接及载体和串联基因连接等情况，但无论何种连接方式，只有单基因和单载体的连接片段在SmaⅠ和SpeⅠ切割下能出现一长一短两条带，且短的条带约为550 bp才是正向连接(图3)，而反向连接的片段切出的较短条带是200 bp(图4)。 (2)PCR扩增的目标片段大小限制以及扩增的区域是两个引物之间的限定片段。根据题意，一方面要求限制酶能在基因组中切割更多更小的片段，识别序列长度为4、6、8个碱基对的限制酶在基因组中理论上分别为每44、46、48碱基对区域内会有一个酶切位点。因此，选择识别序列为4个碱基对的酶切割小麦基因组可产生更短的切割序列，连接后有利于后续PCR进行。另外，要对图乙的未知序列进行扩增，只有连接成环后，才能形成两个引物之间的扩增目标区，无论串连还是自连，都可以达到扩增引物之间区域的目的。琼脂糖凝胶电泳只能判断产物的有无或大小，但无法确定碱基序列，所以不能用于判断是否属于同一个基因。测序可以确定碱基序列，要确定两个片段是否属于同一个基因，进行序列比对即可。(3)如果在突变体中检测到野生型基因存在，只能说明该基因已经整合进突变体基因组中。外源野生型基因只有在突变体中正确表达才可能恢复野生型性状。因此，仅凭检测到野生型基因不足以确定该植株的表型为野生型。 (五)“双脱氧法”基因测序 1.原理：(1)双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3′-OH，因此每当DNA链加入分子ddNTP时，延伸便终止。 (2)每一次DNA测序是由4个独立的PCR反应组成的，4个PCR反应体系均加入模板、引物、dNTP、DNA聚合酶，唯一不同的是4个反应体系分别加入不同的含有标记的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。 (3)PCR反应后，在反应体系中就形成了大量起始点相同、终止点不同的DNA片段，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带，依据电泳条带读取DNA双链的碱基序列。 (4)双脱氧法原理示意图： 2.实例：通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。 上述PCR反应体系中只加入一种引物，对照个体PCR子链的测序结果为5′­CTACCCGTGAT­3′，该序列与对照个体双链DNA分子中模板链的互补链的序列相同，患者为5′­CTACCTGTGAT­3′，对比可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T。 【典例1】ddNTP(双脱氧核苷三磷酸)缺少3′羟基，无法形成新的磷酸二酯键，能使DNA链的延伸终止，因此常被用于DNA测序。某实验室欲利用PCR技术对某DNA进行测序，已知参与反应的物质有被测序的DNA、dNTP(脱氧核苷三磷酸)、引物、相关酶等，且不同ddNTP参与反应的结果如表所示，其中“■”代表引物。下列叙述正确的是(　　) ddNTP类型 子链类型 ddATP ■—GATTCGAGCTGddATP ■—GATTCGddATP ■—GddATP ddCTP ■—GATTCGAGddCTP ■—GATTddCTP ddGTP ■—GATTCGAGCTddGTP ■—GATTCGAddGTP ■—GATTCddGTP ■—ddGTP ddTTP ■—GATTCGAGCddTTP ■—GATddTTP ■—GAddTTP A.题中相关酶包括解旋酶、DNA聚合酶等 B．若不考虑引物，则被测的DNA的序列应为5′－CTAAGCTCGACT－3′ C．引物的碱基序列与模板链的3′端的一段碱基序列相同 D．dNTP可为DNA复制提供原料和能量 【答案】D 【解析】PCR利用温度进行解旋，不需要解旋酶的参与，A错误；ddNTP的3号碳上没羟基，参与聚合反应后无法与游离脱氧核苷酸形成磷酸二酯键，因此ddNTP一旦参与聚合反应，则DNA单链延伸即终止，依据图中碱基的排序可知，图中子代DNA的碱基序列是5′－GATTCGAGCTGA－3′，则被测的DNA的序列应为3′－CTAAGCTCGACT－5′，B错误；引物的碱基序列与模板链的3′端的一段碱基序列是互补关系，C错误。 【典例2】(2024·湖南卷)（不定项）最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（　　） A. 上述PCR反应体系中只加入一种引物 B. 电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C. 5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列 D. 患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 【答案】AC 【解析】利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确；电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢。B错误；依据分析中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA片段）的3'终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带（DNA片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3'，患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3'，C正确；对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D错误。 (六)实时荧光定量PCR技术(qRT－PCR) 1.获取cDNA。从样本中提取RNA（有多种RNA），通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA。 2.PCR扩增cDNA。在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。 3.荧光检测。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小(如图)。 【典例】实时荧光定量PCR简称qPCR，灵敏度高、特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将标有荧光素的Taqman探针与待测样本DNA混合后，在变性、复性、延伸的热循环中，与待测样本DNA配对结合的Taqman探针被Taq酶切断，在特定光激发下发出荧光(如图所示)，随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值。 (1)做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1对引物和______种Taqman探针。 (2)设初始目的基因有m个，扩增n次，需消耗探针____________个。 (3)Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就________。 答案：(1)1　(2)m(2n－1)　(3)越小 （七）巢式PCR技术 1.原理：巢式PCR是指先后用外引物和内引物扩增目的基因的方法，其原理为先以比目的基因大的DNA片段为模板，用外引物(F1、R1)进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物(F2、R2)扩增目的基因。 2.过程图示： （注：第二轮PCR使用内引物以第一轮PCR产物为模板进行再次扩增，第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定；如果两套引物一起加入反应体系中，外引物长度应大于内引物长度，复性温度需高于内引物，使外引物先进行反应。） （八）不对称PCR技术 1.原理：不对称PCR是一种通过控制引物浓度比例选择性扩增单链DNA的技术，其核心原理是使用限制性引物与非限制性引物按1：50的比例进行PCR扩增，初期生成双链DNA，当限制性引物耗尽后转为单链扩增，该方法可用于制备DNA探针。 2.过程图示： （注：制备的单链DNA探针与目标DNA的α链相同。） 【典例1】DNA分子杂交时，常需要大量的单链DNA探针。不对称PCR是一种常见的单链DNA探针制备方法，其原理是反应体系中加入一对数量不相等的引物。假设在PCR反应的早期10个循环中，扩增产物是双链DNA，当较少的限制性引物耗尽后，数量较多的非限制性引物将引导合成大量目标DNA单链。下列叙述正确的是(　　) A．若a链为所需的DNA分子探针，则非限制性引物应选用引物Ⅲ B．进行最初10个循环的目的是为了将限制性引物消耗完，以保证获得大量的单链DNA探针 C．设计较长的限制性引物与较短的非限制性引物，以便于后阶段通过提高温度来控制产物生成量 D．如果体系中原模板DNA的数量为m，共进行25次循环，则最终获得的单链探针数为15×210m 【答案】D 【解析】由于DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，引物Ⅱ和Ⅲ不能作为扩增探针序列的引物，若a链为所需的DNA分子探针，则非限制性引物应选用引物Ⅳ，A错误；进行最初10个循环的目的是增加模板DNA的量，以便后期更快得到较多数量的单链DNA探针，B错误；引物越短，复性时可与模板链形成的氢键数越少，越容易被高温破坏，因此可设计较短的限制性引物与较长的非限制性引物，适当提高复性温度以避免残留限制性引物与模板结合，从而提高产物生成量，C错误；如果体系中原模板DNA的数量为m，最初10次循环产物为双链DNA分子共210×m个，其中有210×m个b链，以这些链为模板，利用引物又进行了15次循环，每次循环生成的都是a链，不改变b链的数目，即b链的数量每次循环开始都是210×m个，15次循环每次生成a链的数量也是210×m个，故最终获得的单链探针数共为15×210×m个，D正确。 【典例2】(2026·四川成都七中诊断)不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法，如图所示。不对称PCR中加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物，两者的比例通常为1∶100，PCR反应最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。下列相关说法错误的是(　　) A.用不对称PCR方法扩增目的基因时，不需要知道基因的全部序列 B.进行最初若干次循环的目的是增加模板DNA的量 C.最后大量获得的ssDNA与图中乙链的碱基序列一致 D.因为双链DNA和单链DNA的分子量大小不同，可通过电泳方法将其分离 【答案】C 【解析】不对称PCR中加入的一对引物中含量较多的被称为非限制性引物，非限制性引物能与乙链碱基互补配对，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列一致，C错误。 1 学科网（北京）股份有限公司 $