高频抢分05 生物技术与工程（冲刺抢分必刷）（上海专用）2026年高考生物终极冲刺讲练测

**基本信息** 聚焦生物技术与工程高频考点，以高考真题为载体，通过“析典例-建模型-研技法-通关练”体系化提炼解题方法，构建从基础原理到实验应用的知识逻辑链，渗透生命观念与科学思维。 **专项设计** |模块|题量/典例|方法提炼|知识逻辑| |----|-----------|----------|----------| |发酵工程与细胞工程|3道高考真题+2个典例|比较法（发酵类型对比）、“圈”法（微生物筛选鉴定）、细胞培养条件分析|从微生物代谢原理到发酵技术操作，再到工程应用的递进| |基因工程|2道高考真题+2个典例|限制酶选择策略、PCR引物设计、基因编辑技术原理|从目的基因获取到载体构建，再到表达鉴定的操作逻辑链|

高频抢分05生物技术与工程 答案版 热点角度01 发酵工程与细胞工程 析典例·建模型 【答案】3．A 4．ABC 5．C 6．ABC 7． ②③ ②③ 8．A 9．∆H转运葡萄糖不消耗能量，葡萄糖浓度越高，进入细胞的葡萄糖越多，节省的能量可以用于菌体增殖，因此增殖比野生型更快 10．【答案】(1)细胞质基质 (2)负反馈 (3)AB (4) 选择 不同 平板划线法 (5)随机突变 (6)D (7)要点1：由题意与对比图中b、h1、h2、h3组可知，大肠杆菌的三种H转运蛋白均能在导入后提高谷氨酸棒状杆菌膜上的苏氨酸转运能力，从而提高菌株苏氨酸产量。要点2：对比图中h1、h2、h3组可知，相对于H1而言，H2、H3基因在导入后的表达能力相对更强，得到的可用的转运蛋白数量更多，转运苏氨酸能力就更强。要点3：对比图中h2、h3组可知，尽管H2基因表达量略高于H3，但H3蛋白转运苏氨酸的能力比H2更强，使得h3苏氨酸产量更高。要点4：又由于转运效率高使得膜内苏氨酸浓度降低，对AK酶的抑制作用降低，更多的天冬氨酸顺利转化成苏氨酸前体物质天冬酰胺，进一步提高了h3的苏氨酸产量。综上，从结果上看，h3苏氨酸的产量最高。 通关特训 1．【答案】(1)富含钨 (2)平板划线 (3)②③ (4)2.94×1011 (5)②④ (6)在高温条件下其他微生物的酶变性失活，生长繁殖受抑制，或在高浓度甲酸条件，其他微生物因失水过多而死亡 (7)C 2．【答案】(1)AB (2)稀释涂布平板法 (3)BCD (4)A (5)8.25×1010 (6)AB (7)⑤③⑥① (8)通入无菌空气，适当搅拌，加入消泡剂等 (9)BCD 热点角度02 基因工程 析典例·建模型 【答案】1．A 2．ABC 3．C 4．ABC 5． ②③ ②③ 6．A 7．∆H转运葡萄糖不消耗能量，葡萄糖浓度越高，进入细胞的葡萄糖越多，节省的能量可以用于菌体增殖，因此增殖比野生型更快 通关特训 1.【答案】（1）A （2）D （3）B （4） ①④ ⑤④ （6）C （7）A （8）Flox/+ （9）BC 16．B 2.【答案】(1)①②。 (2)D (3)②③ (4)ABC (5)B (6)ACD (7)AC (8)杂交育种：将具有不同优良性状的水稻杂交，从后代中筛选出高产的水稻新品种。诱变育种：利用物理/化学诱变剂诱导水稻发生基因突变，从变异后代中筛选出高产变异株。 （或单倍体育种：取杂交后F1的花药离体培养，秋水仙素诱导染色体加倍，可快速获得纯合高产水稻；多倍体育种：诱导水稻染色体加倍，获得多倍体高产水稻） / 学科网（北京）股份有限公司 $ 高频抢分05生物技术与工程 【命题解码·定方向】 命题趋势+3年高考真题热点角度拆解 【解题建模·通技法】 析典例，建模型，通关抢分特训 热点角度01 发酵工程与细胞工程 （2025·上海·高考真题） （2024·上海·高考真题） （2024·上海·高考真题） 热点角度02 基因工程 （2025·上海·高考真题） 热点角度01 发酵工程与细胞工程 析典例·建模型 （2025·上海·高考真题）I.野生型大肠杆菌质膜上有一种转运葡萄糖的S蛋白，转运时需耗能。研究人员欲将另一种膜蛋白H改造为∆H蛋白，来替代S蛋白转运葡萄糖，形成一种不耗能的转运方式。图1是技术路线图，图2为构建的含有∆H基因的表达载体，其中①～④表示载体中的相应位置，PstⅠ和BamHⅠ表示相应限制性内切核酸酶的酶切位点。 3．图1过程Ⅰ～Ⅳ中，获取目的基因发生在___________。(单选) A．Ⅰ B．Ⅱ C．Ⅲ D．Ⅳ 4．图1过程Ⅱ中，需要使用的酶有___________。(多选) A．PstⅠ B．DNA连接酶 C．BamHⅠ D．DNA聚合酶 5．图2中，∆H基因的启动子的位置和转录方向最可能是___________。(单选) A．①，逆时针 B．②，逆时针 C．③，顺时针 D．④，顺时针 6．为确定表达载体是否含有∆H基因，可以采用的方法有___________。(多选) A．对表达载体进行基因测序 B．对表达载体上的特定片段进行PCR C．酶切表达载体后检测DNA片段长度 D．观察导入了表达载体的菌株的氨苄抗性 II.如同源染色体联会时发生的交叉互换，两个DNA分子若含有相同序列，可发生重组。在过程Ⅲ中，欲用DNA2中的片段⑦替换野生型大肠杆菌基因组(DNA1)中的S基因，图3中①～⑦代替相应DNA片段，且序列均不相同、无相互包含关系。S基因和替换片段⑦约3000bp(碱基对)，片段①～⑥约为15～25bp。 7．以DNA2为模板，采用PCR获得含有替换片段⑦的PCR产物。若要用该PCR产物与DNA1重组，以完成对S基因的准确替换，则在该PCR产物中，除⑦外还包含①～⑥中的___________；PCR引物的设计应依据的片段是①～⑥中的___________。(编号选填) 下表是野生型菌株和∆H菌株在仅碳源含量不同的培养基中的增殖情况，M值越大，反映菌株增殖越快。 培养基中碳源含量 M值 野生型菌株 ∆H菌株 50g/L 0.137 0.157 100g/L 0.127 0.228 8．根据研究目的，培养基中的碳源应该选择___________。(单选) A．葡萄糖 B．葡萄糖和淀粉 C．淀粉 D．琼脂 9．据表中数据，比较∆H菌株和野生型菌株的增殖情况，并分析两者产生差异的原因。 10．（2024·上海·高考真题）苏氨酸的生物合成大肠杆菌可高产苏氨酸，但会混有大肠杆菌自身产生的有毒物质。谷氨酸棒状杆菌也能产生苏氨酸，虽产量低，但不会产生有毒物质。因此科学家想利用通过改良谷氨酸棒状杆菌使其达到高产苏氨酸的目的。如图1显示了谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌合成苏氨酸的部分途径。其中细胞膜上的字母代表的是转运蛋白。    (1)据图1可知，谷氨酸棒状杆菌细胞合成苏氨酸的场所是______。 (2)据图1可知，维持细胞内苏氨酸含量稳定的调节机制是______（正反馈/负反馈）调节。 (3)据图1可知，两种细胞产生的苏氨酸的过程中不同的是______。 A．转运蛋白的种类 B．外排的氨基酸种类 C．苏氨酸的碳骨架 D．合成的起始底物 科学家从土壤中筛选出了谷氨酸棒状杆菌，得到了一株产苏氨酸的菌株a。通过对菌株a的AK酶改良，得到了苏氨酸高产菌株b。部分操作过程如图2，其中培养基Ⅰ和培养基Ⅱ的配方相同。    (4)培养基Ⅰ属于______（通用/选择/鉴定）培养基；培养基Ⅰ和Ⅱ上获得的细菌种类数______（相同/不同）；在培养基Ⅱ上采用的接种方法是______。 (5)若AK酶结构未知，为迅速获得AK酶突变株，应选用的策略是______（定点突变/随机突变）。 (6)据题意可知，与菌株a相比，菌株b中的AK______。 A．与天冬氨酸结合力增强 B．与苏氨酸结合力增强 C．与天冬氨酸结合力下降 D．与苏氨酸结合力下降 科学家利用基因工程技术将大肠杆菌H1、H2、H3三种转运蛋白基因分别导入菌株b中，获得了菌株h1、h2、h3，并测定苏氨酸产量和导入基因相对表达量，结果如图3。    (7)分析并阐述h3苏氨酸产量最高的原因________。 研考点・通技法 比较果酒、果醋和泡菜的制作 项目 果酒的制作 果醋的制作 泡菜的制作 菌种 酵母菌（真核生物，异养兼性厌氧型） 醋酸菌（原核生物，异养需氧型） 乳酸菌（原核生物，异养厌氧型） 原理 在有氧时，酵母菌大量繁殖；在无氧时，酵母菌进行酒精发酵 当氧气、糖源都充足时，醋酸菌通过复杂的化学反应将糖分解成乙酸；在缺少糖源和有氧条件下，醋酸菌可将乙醇转化乙醛，再将乙醛变为乙酸 在无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸 原料选择 新鲜葡萄（或苹果）等 萝卜、黄瓜、豇豆等新鲜蔬菜 发酵温度 18～30 ℃ 30～35 ℃ 室温 对氧需求 前期需氧，后期不需氧 需充足氧 不需氧 检测指标 嗅味、品尝、通过酸性重铬酸钾检测酒精 是否形成菌膜、嗅味、品尝、pH检测 色泽、口味、亚硝酸盐含量等 筛选与鉴定微生物的“圈”法 抑菌圈 透明圈 变色圈 生长圈 原 理 用抗生素等对菌体具有杀抑作用的物质抑制菌体的生长，形成清晰的抑菌圈 菌体能降解或利用浑浊或带有颜色的培养基中的某特定物质，在菌落周围形成清晰的透明圈 微生物代谢产物显色或代谢产物与特定指示剂反应而变色，在菌落周围会形成变色圈 代谢缺陷型微生物在能大量合成某特定营养物质的菌体周围生长，形成明显的生长圈 应 用 筛选与鉴定抗生素产生菌；评估待测药物的抑菌杀菌效应 筛选与鉴定能降解（或合成某种酶）和利用特定物质的微生物，如：用含刚果红的纤维素培养基筛选能分解纤维素的细菌 筛选与鉴定能合成某种酶或产物的微生物，如：用含酚红指示剂培养基筛选能利用尿素或产生脲酶的微生物 筛选特定营养物质产生菌；鉴定微生物的代谢缺陷 特 点 抑菌圈直径（抑菌圈/菌落）越大，抑菌作用越强，反之则越弱 透明圈与菌落大小的比值大，说明菌体降解某物质的能力强 变色圈的颜色及大小与微生物代谢产物及代谢能力相关 可根据生长圈的直径大小初步判断菌体合成和释放某物质的能力 哺乳动物细胞培养过程中，细胞的变化及应用 对正常细胞进行体外培养时，要经历原代培养和1至多次的传代培养（N0为培养瓶中细胞的初始数量），图示为培养瓶中细胞的数量变化。原代培养与初次传代培养，细胞数量可呈“S”形增长，传代培养中会出现部分细胞停止分裂与衰老死亡，极少数细胞因发生核型改变而成为不死性细胞（具有癌细胞的特征）。通过细胞培养技术，可将核型未改变的细胞用于移植，可检测某药物对细胞代谢或增殖的影响，可研究导致细胞核型发生改变的因素及细胞增殖的调控等。 哺乳动物细胞的培养条件可与人体内环境稳态的维持及调节相联系。注意比较： （1）培养液与人体细胞外液的化学组成（包括营养物质、激素等活性物质）、理化性质（pH、温度、渗透压等）； （2）细胞的代谢（物质的吸收、转化等）及生命历程（增殖、衰老、癌变等）。 通关特训 1．温室效应，全球气候变暖，会给人们及地球带来很多危害。大肠杆菌中的甲酸氢裂酶（FHL）能将甲酸氧化成还原性H和CO2。科学家利用大肠杆菌难于区分钼和钨这一特点，通过一定方式培养大肠杆菌，使得FHL中的钼替换成钨，改变了FHL的催化特性，改造后的大肠杆菌能够利用H2和CO2转化为甲酸，这为减缓温室效应提供新的研究方向。 (1)为了获得目的菌株，首先需要将大肠杆菌置于_____的培养液中进行培养，完成元素的替换过程。 (2)然后通过图1所示的_____法分离出单个菌落。 (3)在对分离纯化的菌株进行筛选和鉴定后，扩大培养所用的培养基类型是_____（编号选填）。 ①固体培养基②液体培养基③通用培养基④选择培养基 (4)扩大培养过程中需要对大肠杆菌进行计数，如图2所示，取10mL培养液经过一系列梯度稀释后涂布0.1mL稀释液到固体培养基中培养，得到的菌落数分别为298、296、288个，则每升培养液中大肠杆菌数量为_____个。 (5)除了用该方法计数外，还可以用显微镜计数法，其特点是_____（编号选填）。 ①只能检测活菌数量 ②不能区分死菌和活菌 ③测得值往往偏小 ④测得值大于实际的活菌数 (6)嗜热古细菌具有高浓度甲酸盐耐受性，在80℃温度条件下可以持续氧化甲酸盐产生H2和碳酸氢盐，为其他生物提供原料。该发酵系统不需要经过灭菌，其他微生物也很难生长繁殖，原因可能是_____（写出2条）。 (7)抗生素在现代生活中被广泛应用，为了检测改造后的大肠杆菌对抗生素的敏感性，分别将含有A、B、C三种抗生素的滤纸片均匀放置在布满了改造后大肠杆菌的平板的不同位置，培养一段时间后结果如图3所示，改造后的大肠杆菌对抗生素_____（图中字母选填）的抗性最强。 2．为了解某种医用防护口罩（经灭菌）佩戴时间对防护功能的影响，进行了实验研究，参加实验的医务人员随机分为ABC三组，在无菌实验室佩戴不同时间后取样。 取样过程：分别剪取口罩内层（与口和皮肤接触面）和外层6cm×6cm纱布，剪碎后加入5mL培养基X中，震荡2分钟，待纱布碎片自然沉降后，取上清液1mL经稀释后接种于培养基Y上，37℃培养箱培养48小时后在放大镜下统计每cm2培养基上的菌落数，每组取平均值。滤菌率=（内层菌落数-外层菌落数）/内层菌落数。结果见表。 组别 佩戴时间 培养基上每cm2菌落数（个） 滤菌率% 内层 外层 A 20分钟 23.67 0.95 96.13 B 2小时 73.93 2.91 96.06 C 4小时 129.75 10.16 92.17 (1)上述实验中，需要进行高压蒸汽灭菌处理的是_________。 A．剪刀 B．培养基 C．放大镜 D．取样的口罩纱布 (2)实验中“取上清液1mL接种于培养基Y上”，此操作采用的接种方法是_________。 (3)该接种方法需要用到的器材有_________。 A． B． C． D． (4)培养基X与Y在成分及功能上的特点是_____。 A．X不含琼脂，Y含琼脂 B．X为通用培养基，Y为选择培养基 C．X和Y都只需碳源、无机盐和水 D．X用于分离菌落，Y用于纯化菌落 将佩戴4小时的口罩内层纱布剪碎后加入X培养基中混合，取上清液1mL经稀释后接种于培养基Y上的稀释过程具体如图。 (5)结合表和图中数据分析（培养基面积为63.6cm2），从X培养基中取出的1mL上清液中含有菌体数量为__________。（保留2位小数） (6)口罩上细菌可能的来源有____。 A．人体皮肤 B．人体呼出气体 C．口罩 D．外界空气 人体汗液、皮肤分泌物、呼出的水汽中含有尿素，长时间佩戴会形成微生物温床，有利于能合成脲酶（分解尿素）的微生物生长繁殖，使口罩“发臭”。 (7)在利用久戴后“发臭”口罩，筛选及分离、纯化高产脲酶的细菌过程中，需要进行的研究步骤是_________________。（选择正确的编号并排序） ①测定脲酶的活性 ②配制含蛋白胨的培养基分离目标菌 ③配制以尿素为唯一氮源的培养基分离目标菌 ④用自来水采集微生物的样品 ⑤用无菌水采集微生物的样品 ⑥挑取单菌落再次划线纯化培养 (8)脲酶生产过程是高度好氧过程，为满足通气，将目标菌接种到发酵罐中后，需要________。（写出2点） (9)许多豆科植物中也含有脲酶，可以利用生物反应器培养大豆细胞获得脲酶，下列操作或说法错误的是_________。 A．培养大豆细胞的生物反应器内需保证无菌 B．需要在培养基中添加纤维素酶和果胶酶去掉细胞壁 C．该过程利用了植物细胞具有全能性 D．需要在光照下培养 热点角度02 基因工程 析典例·建模型 （2025·上海·高考真题）I.野生型大肠杆菌质膜上有一种转运葡萄糖的S蛋白，转运时需耗能。研究人员欲将另一种膜蛋白H改造为∆H蛋白，来替代S蛋白转运葡萄糖，形成一种不耗能的转运方式。图1是技术路线图，图2为构建的含有∆H基因的表达载体，其中①～④表示载体中的相应位置，PstⅠ和BamHⅠ表示相应限制性内切核酸酶的酶切位点。 1．图1过程Ⅰ～Ⅳ中，获取目的基因发生在___________。(单选) A．Ⅰ B．Ⅱ C．Ⅲ D．Ⅳ 2．图1过程Ⅱ中，需要使用的酶有___________。(多选) A．PstⅠ B．DNA连接酶 C．BamHⅠ D．DNA聚合酶 3．图2中，∆H基因的启动子的位置和转录方向最可能是___________。(单选) A．①，逆时针 B．②，逆时针 C．③，顺时针 D．④，顺时针 4．为确定表达载体是否含有∆H基因，可以采用的方法有___________。(多选) A．对表达载体进行基因测序 B．对表达载体上的特定片段进行PCR C．酶切表达载体后检测DNA片段长度 D．观察导入了表达载体的菌株的氨苄抗性 II.如同源染色体联会时发生的交叉互换，两个DNA分子若含有相同序列，可发生重组。在过程Ⅲ中，欲用DNA2中的片段⑦替换野生型大肠杆菌基因组(DNA1)中的S基因，图3中①～⑦代替相应DNA片段，且序列均不相同、无相互包含关系。S基因和替换片段⑦约3000bp(碱基对)，片段①～⑥约为15～25bp。 5．以DNA2为模板，采用PCR获得含有替换片段⑦的PCR产物。若要用该PCR产物与DNA1重组，以完成对S基因的准确替换，则在该PCR产物中，除⑦外还包含①～⑥中的___________；PCR引物的设计应依据的片段是①～⑥中的___________。(编号选填) 下表是野生型菌株和∆H菌株在仅碳源含量不同的培养基中的增殖情况，M值越大，反映菌株增殖越快。 培养基中碳源含量 M值 野生型菌株 ∆H菌株 50g/L 0.137 0.157 100g/L 0.127 0.228 6．根据研究目的，培养基中的碳源应该选择___________。(单选) A．葡萄糖 B．葡萄糖和淀粉 C．淀粉 D．琼脂 7．据表中数据，比较∆H菌株和野生型菌株的增殖情况，并分析两者产生差异的原因。 研考点・通技法 限制酶的选择 （1）根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限制酶SmaⅠ。 ②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙）。酶（如 （2）根据质粒的特点选择限制图） （3）农杆菌转化法中，酶切位点应位于Ti质粒的T-DNA内部。图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取。 PCR引物的设计和修饰 （1）PCR引物的设计 ①引物长度要适宜，一般引物的长度为15～23 bp。过长会导致其延伸温度大于74 ℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；引物过短特异性差，可导致引物与模板链随机结合。 ②引物内部应避免自身互补。引物自身不能有连续4个碱基的互补，以免形成发夹状结构，这种结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。 ③引物之间应避免互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补，尤其应避免3'端的互补重叠以防形成引物二聚体。 （2）引物的修饰 ①引物3'端不可修饰。引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。 ②引物5'端可以修饰。引物5'端常见修饰包括：添加酶切位点、引入启动子序列、插入突变序列等。 CRISPR/Cas9基因编辑技术 CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA（sgRNA）引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割（如图）。CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是与靶向基因（目的基因）上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合， 并在特定位点切割DNA。 CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是可将目的基因定点插入所需位点，避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。 Cre/LoxP重组酶系统 这个系统主要由两部分组成：Cre重组酶和LoxP位点。 （1）Cre重组酶：最早是从P1噬菌体中发现的，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。 （2）LoxP序列：来源于P1噬菌体的DNA序列，包括两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。 （3）①同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。 ②反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。 通关特训 1.平滑肌细胞(SMC)是高等动物血管壁的重要组成，其功能障碍会导致主动脉瘤的发生。研究人员进行了如下实验，获得同时含有图1所示基因的杂合小鼠C．Cre重组酶可识别DNA分子中的loxP序列，当DNA分子上存在两个同向loxP时，Cre重组酶可将两个loxP之间的DNA序列切除。 （1）SMC由胚胎发育过程中的中胚层细胞分化而来，下列可以作为中胚层细胞分化为SMC的标志的是___________。(单选) A．细胞表达肌肉收缩所需的肌动蛋白 B．细胞表达细胞周期蛋白p53 C．细胞表达RNA聚合酶 D．细胞表达ATP合酶 （2）构建小鼠A时，先通过PCR获得CE基因，欲得到大量完整的CE基因，该技术的最后一个环节应选用引物___________。(单选) A．P1和P2 B．P3和P4 C．P2和P3 D．P1和P4 （3）为保证CE在SMC中特异性表达，应该可采取的策略是___________。(单选) A．促进CE序列发生甲基化修饰 B．在CE基因编码序列前插入SMC特异性启动子 C．在CE基因编码序列后插入SMC特异性终止密码子 D．在CE基因编码序列的第一位插入SMC特异性起始密码子 （4）已知CE基因中有XbaI的识别序列，图3为用于构建融合基因表达载体的质粒部分示意图。为使CE基因与质粒高效拼接，可用___________限制酶对质粒进行酶切，在CE基因的两端分别添加___________限制酶的识别序列。(编号选填) ①XbaI    ②BamHI    ③SmaI    ④EcoRI    ⑤SpeI （5）构建同时含有loxP、Stop和tdT的表达载体，以获得小鼠B，最合适的受体细胞是___________。(单选) A．小鼠骨髓瘤细胞 B．人胚胎干细胞 C．小鼠受精卵细胞 D．小鼠SMC （6）外源药物他莫昔芬可以与细胞质中的雌激素受体结合并使其进入细胞核。用他莫昔芬饲喂小鼠C后，可观察到___________。(单选) A．小鼠C的SMC发出红色荧光 B．小鼠C未发出荧光 C．小鼠C的全身发出红色荧光 D．小鼠C的SMC之外的部分发出红色荧光 为利用CE杂合小鼠研究血管SMC中特异性表达的S基因在主动脉瘤形成中的作用，在S基因两侧分别引入一个loxP，这样的S基因称为flox基因，获得flox杂合小鼠(flox/+)后，开展如图4所示的杂交实验。已知S基因和CE位于小鼠的非同源染色体上。 （7）为获得F2中的小鼠E，仅考虑S基因的遗传，用于与F1杂交的小鼠D的基因型应为___________。 （8）经过他莫昔芬诱导后，下列基因可能存在于小鼠E血管SMC基因组中的有___________。(多选) A．S基因 B．tdT基因 C．CE基因 D．flox基因 （9）为了使研究更具有科学性，适用于检测评估CE表达的组织特异性的是___________。(单选) A．检测SMC中tdT基因的表达情况 B．检测多种组织中tdT基因的表达情况 C．检测多种组织中S基因的表达情况 D．检测SMC中是否具有loxP序列 2.高产水稻 随着耕地的减少，提高作物产量是人类面临的一个重大课题。研究发现，一种名为PEL的调控因子可能在水稻维管束鞘细胞的叶绿体发育中发挥重要作用，从而提高水稻光合效率，获得高产水稻。为此，科研人员构建了PEL基因过表达植株来研究PEL的功能。左图是部分实验过程、右图是表达载体示意图，其中ori为复制原点，Hptr为潮霉素抗性基因，Kanr为卡那霉素抗性基因。 (1)现在PEL基因的完整序列已知，那么过程I可采用的方法有_________。（编号选填） ①PCR        ②化学合成         ③大规模筛选 (2)为促进PEL基因高水平表达，需在表达载体中加入强效启动子。则该强效启动子的位置和转录方向最可能是______。（单选） A．m，顺时针 B．m，逆时针 C．n，顺时针 D．n，逆时针 (3)过程Ⅲ培养农杆菌时，加入卡那霉素可以筛选出_________。（编号选填） ①未导入任何载体的农杆菌 ②导入过表达载体的农杆菌 ③导入“空载”载体的农杆菌 (4)过程Ⅳ中，用水稻愈伤组织作为受体细胞而不用水稻的其他细胞，可能是因为愈伤组织__________。（多选） A．全能性高，便于植株再生 B．分裂旺盛，便于基因整合 C．结构松散，便于农杆菌接触 D．含抗性基因，便于多次筛选 (5)过程Ⅴ除了在培养基中加入潮霉素外，还经常加入头孢霉素。推测同时加入这两种物质的目的是__________。（单选） A．筛选成功转化的愈伤组织，筛选成功导入的农杆菌 B．筛选成功转化的愈伤组织，杀死成功导入的农杆菌 C．杀死成功转化的愈伤组织，筛选成功导入的农杆菌 D．杀死成功转化的愈伤组织，杀死成功导入的农杆菌 (6)过程Ⅵ获得PEL基因过表达植株的过程不会发生__________（多选） A．脱分化 B．再分化 C．细胞融合 D．细胞壁再生 (7)研究PEL的功能，除PEL基因过表达水稻作为实验组外，还应设计的对照组有__________。（多选） A．野生型水稻 B．野生型小麦 C．导入“空载”载体的水稻 D．PEL基因过表达的拟南芥 (8)除了上述方法外，获得水稻高产品种的方法还有很多，请根据已学知识提出两种不同的方法，并作出简要说明。_____________________________________________。 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 高频抢分05生物技术与工程 【命题解码·定方向】 命题趋势+3年高考真题热点角度拆解 【解题建模·通技法】 析典例，建模型，通关抢分特训 热点角度01 发酵工程与细胞工程 （2025·上海·高考真题） （2024·上海·高考真题） （2024·上海·高考真题） 热点角度02 基因工程 （2025·上海·高考真题） 热点角度01 发酵工程与细胞工程 析典例·建模型 （2025·上海·高考真题）I.野生型大肠杆菌质膜上有一种转运葡萄糖的S蛋白，转运时需耗能。研究人员欲将另一种膜蛋白H改造为∆H蛋白，来替代S蛋白转运葡萄糖，形成一种不耗能的转运方式。图1是技术路线图，图2为构建的含有∆H基因的表达载体，其中①～④表示载体中的相应位置，PstⅠ和BamHⅠ表示相应限制性内切核酸酶的酶切位点。 3．图1过程Ⅰ～Ⅳ中，获取目的基因发生在___________。(单选) A．Ⅰ B．Ⅱ C．Ⅲ D．Ⅳ 4．图1过程Ⅱ中，需要使用的酶有___________。(多选) A．PstⅠ B．DNA连接酶 C．BamHⅠ D．DNA聚合酶 5．图2中，∆H基因的启动子的位置和转录方向最可能是___________。(单选) A．①，逆时针 B．②，逆时针 C．③，顺时针 D．④，顺时针 6．为确定表达载体是否含有∆H基因，可以采用的方法有___________。(多选) A．对表达载体进行基因测序 B．对表达载体上的特定片段进行PCR C．酶切表达载体后检测DNA片段长度 D．观察导入了表达载体的菌株的氨苄抗性 II.如同源染色体联会时发生的交叉互换，两个DNA分子若含有相同序列，可发生重组。在过程Ⅲ中，欲用DNA2中的片段⑦替换野生型大肠杆菌基因组(DNA1)中的S基因，图3中①～⑦代替相应DNA片段，且序列均不相同、无相互包含关系。S基因和替换片段⑦约3000bp(碱基对)，片段①～⑥约为15～25bp。 7．以DNA2为模板，采用PCR获得含有替换片段⑦的PCR产物。若要用该PCR产物与DNA1重组，以完成对S基因的准确替换，则在该PCR产物中，除⑦外还包含①～⑥中的___________；PCR引物的设计应依据的片段是①～⑥中的___________。(编号选填) 下表是野生型菌株和∆H菌株在仅碳源含量不同的培养基中的增殖情况，M值越大，反映菌株增殖越快。 培养基中碳源含量 M值 野生型菌株 ∆H菌株 50g/L 0.137 0.157 100g/L 0.127 0.228 8．根据研究目的，培养基中的碳源应该选择___________。(单选) A．葡萄糖 B．葡萄糖和淀粉 C．淀粉 D．琼脂 9．据表中数据，比较∆H菌株和野生型菌株的增殖情况，并分析两者产生差异的原因。 【答案】3．A 4．ABC 5．C 6．ABC 7． ②③ ②③ 8．A 9．∆H转运葡萄糖不消耗能量，葡萄糖浓度越高，进入细胞的葡萄糖越多，节省的能量可以用于菌体增殖，因此增殖比野生型更快 【解析】3．过程I的内容是改造H基因、大量复制ΔH基因，ΔH基因就是本实验的目的基因，因此获取目的基因发生在过程I，A正确。 4．图1过程Ⅱ是获得目的基因表达载体的过程，需要使用的酶有DNA连接酶和限制性核酸内切酶，根据图2可知，该目的基因表达载体构建过程中采用了双酶切的方法，因此构建过程中需要的酶有PstⅠ、DNA连接酶、BamHⅠ，ABC正确，D错误。 5．启动子是RNA聚合酶结合位点，位于目的基因的上游，终止子位于目的基因下游，转录方向从启动子指向终止子。图2中终止子位于ΔH基因下游靠近④一侧，因此启动子应位于ΔH基因上游的③位置，转录方向为顺时针（从③经ΔH指向终止子），C正确。 6．A、对表达载体测序可以直接确认是否含有ΔH基因，A正确； B、对表达载体上的特定片段进行PCR可以实现对目的基因的检测，B正确； C、酶切后检测DNA片段长度，若片段长度符合预期（插入ΔH基因后的长度），即可证明含有目的基因，C正确； D、氨苄抗性基因位于载体上，无论是否插入ΔH基因，载体都携带氨苄抗性，不能通过氨苄抗性鉴定目的基因，D错误。 7．同源重组需要同源序列，要替换DNA1中S基因，需要ΔH基因（⑦）两侧带有与S基因两侧相同的同源序列②和③，才能准确重组替换S基因，因此PCR产物除⑦外还需要②③；PCR引物需要与待扩增片段两端互补，因此引物设计依据②和③的序列。 8．本实验的研究目的是检验ΔH蛋白能否转运葡萄糖，因此需要选择葡萄糖作为唯一碳源，才能检测菌株利用葡萄糖的能力，A正确。 9．野生型大肠杆菌吸收葡萄糖需要消耗能量，即吸收葡萄糖的方式为主动运输，∆H菌株吸收葡萄糖的方式不需要消耗能量，为协助扩散，节省的能量可以用于菌体增殖，因此增殖比野生型更快。 10．（2024·上海·高考真题）苏氨酸的生物合成大肠杆菌可高产苏氨酸，但会混有大肠杆菌自身产生的有毒物质。谷氨酸棒状杆菌也能产生苏氨酸，虽产量低，但不会产生有毒物质。因此科学家想利用通过改良谷氨酸棒状杆菌使其达到高产苏氨酸的目的。如图1显示了谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌合成苏氨酸的部分途径。其中细胞膜上的字母代表的是转运蛋白。    (1)据图1可知，谷氨酸棒状杆菌细胞合成苏氨酸的场所是______。 (2)据图1可知，维持细胞内苏氨酸含量稳定的调节机制是______（正反馈/负反馈）调节。 (3)据图1可知，两种细胞产生的苏氨酸的过程中不同的是______。 A．转运蛋白的种类 B．外排的氨基酸种类 C．苏氨酸的碳骨架 D．合成的起始底物 科学家从土壤中筛选出了谷氨酸棒状杆菌，得到了一株产苏氨酸的菌株a。通过对菌株a的AK酶改良，得到了苏氨酸高产菌株b。部分操作过程如图2，其中培养基Ⅰ和培养基Ⅱ的配方相同。    (4)培养基Ⅰ属于______（通用/选择/鉴定）培养基；培养基Ⅰ和Ⅱ上获得的细菌种类数______（相同/不同）；在培养基Ⅱ上采用的接种方法是______。 (5)若AK酶结构未知，为迅速获得AK酶突变株，应选用的策略是______（定点突变/随机突变）。 (6)据题意可知，与菌株a相比，菌株b中的AK______。 A．与天冬氨酸结合力增强 B．与苏氨酸结合力增强 C．与天冬氨酸结合力下降 D．与苏氨酸结合力下降 科学家利用基因工程技术将大肠杆菌H1、H2、H3三种转运蛋白基因分别导入菌株b中，获得了菌株h1、h2、h3，并测定苏氨酸产量和导入基因相对表达量，结果如图3。    (7)分析并阐述h3苏氨酸产量最高的原因________。 【答案】(1)细胞质基质 (2)负反馈 (3)AB (4) 选择 不同 平板划线法 (5)随机突变 (6)D (7)要点1：由题意与对比图中b、h1、h2、h3组可知，大肠杆菌的三种H转运蛋白均能在导入后提高谷氨酸棒状杆菌膜上的苏氨酸转运能力，从而提高菌株苏氨酸产量。要点2：对比图中h1、h2、h3组可知，相对于H1而言，H2、H3基因在导入后的表达能力相对更强，得到的可用的转运蛋白数量更多，转运苏氨酸能力就更强。要点3：对比图中h2、h3组可知，尽管H2基因表达量略高于H3，但H3蛋白转运苏氨酸的能力比H2更强，使得h3苏氨酸产量更高。要点4：又由于转运效率高使得膜内苏氨酸浓度降低，对AK酶的抑制作用降低，更多的天冬氨酸顺利转化成苏氨酸前体物质天冬酰胺，进一步提高了h3的苏氨酸产量。综上，从结果上看，h3苏氨酸的产量最高。 【分析】1.原核细胞与真核细胞的根本区别在于有无以核膜为界限的细胞核。 2.在培养基上常用的接种方法有：稀释涂布平板法和平板划线法。 【详解】（1）谷氨酸棒状杆菌为原核生物，没有以核膜为界限的细胞核，只具有唯一的一种细胞器核糖体，据图1可知，合成苏氨酸的场所是细胞质基质。 （2）依据图1可知，当苏氨酸含量过高时，会抑制天冬氨酸转化为天冬酰胺，所以维持细胞内苏氨酸含量稳定的调节机制是负反馈调节。 （3）据图可知，为重两种细胞的细胞膜上的字母不同，说明位于细胞膜上的转运蛋白不同，转运蛋白对物质的运输具有特异性，所以外排的氨基酸种类也不同，AB正确，CD错误。 故选AB。 （4）实验的目的是筛选谷氨酸棒状杆菌，所以培养基Ⅰ为选择培养基；通过选择培养后，在培养基Ⅰ和Ⅱ上获得的细菌种类数会出现差异；据图可知，在培养基Ⅱ上采用的接种方法是平板划线法。 （5）由于AK酶结构未知，所以为迅速获得AK酶突变株，应进行随机突变。 （6）菌株b与菌株a相比较，苏氨酸更高产，所以可推知，菌株b中AK与苏氨酸的结合力下降，D正确，ABC错误。 故选D。 （7）据图可知，①由题意，对比图中b、h1、h2、h3组可知，大肠杆菌的三种H转运蛋白均能在导入后提高谷氨酸棒状杆菌膜上的苏氨酸转运能力，从而提高菌株苏氨酸产量；②对比图中h1、h2、h3组可知，相对于H1而言，H2、H3基因在导入后的表达能力相对更强，得到的可用的转运蛋白数量也更多，转运苏氨酸能力就更强；③对比图中h2、h3组可知，尽管H2基因表达量略高于H3，但H3蛋白转运苏氨酸的能力比H2更强，使得h3苏氨酸产量更高；④由于转运效率高，使得膜内苏氨酸浓度降低，而对AK酶的抑制作用降低，更多的天冬氨酸顺利转化成苏氨酸前体物质天冬酰胺，进一步提高了h3的苏氨酸产量。综上，从结果上看，h3苏氨酸的产量最高。 研考点・通技法 比较果酒、果醋和泡菜的制作 项目 果酒的制作 果醋的制作 泡菜的制作 菌种 酵母菌（真核生物，异养兼性厌氧型） 醋酸菌（原核生物，异养需氧型） 乳酸菌（原核生物，异养厌氧型） 原理 在有氧时，酵母菌大量繁殖；在无氧时，酵母菌进行酒精发酵 当氧气、糖源都充足时，醋酸菌通过复杂的化学反应将糖分解成乙酸；在缺少糖源和有氧条件下，醋酸菌可将乙醇转化乙醛，再将乙醛变为乙酸 在无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸 原料选择 新鲜葡萄（或苹果）等 萝卜、黄瓜、豇豆等新鲜蔬菜 发酵温度 18～30 ℃ 30～35 ℃ 室温 对氧需求 前期需氧，后期不需氧 需充足氧 不需氧 检测指标 嗅味、品尝、通过酸性重铬酸钾检测酒精 是否形成菌膜、嗅味、品尝、pH检测 色泽、口味、亚硝酸盐含量等 筛选与鉴定微生物的“圈”法 抑菌圈 透明圈 变色圈 生长圈 原 理 用抗生素等对菌体具有杀抑作用的物质抑制菌体的生长，形成清晰的抑菌圈 菌体能降解或利用浑浊或带有颜色的培养基中的某特定物质，在菌落周围形成清晰的透明圈 微生物代谢产物显色或代谢产物与特定指示剂反应而变色，在菌落周围会形成变色圈 代谢缺陷型微生物在能大量合成某特定营养物质的菌体周围生长，形成明显的生长圈 应 用 筛选与鉴定抗生素产生菌；评估待测药物的抑菌杀菌效应 筛选与鉴定能降解（或合成某种酶）和利用特定物质的微生物，如：用含刚果红的纤维素培养基筛选能分解纤维素的细菌 筛选与鉴定能合成某种酶或产物的微生物，如：用含酚红指示剂培养基筛选能利用尿素或产生脲酶的微生物 筛选特定营养物质产生菌；鉴定微生物的代谢缺陷 特 点 抑菌圈直径（抑菌圈/菌落）越大，抑菌作用越强，反之则越弱 透明圈与菌落大小的比值大，说明菌体降解某物质的能力强 变色圈的颜色及大小与微生物代谢产物及代谢能力相关 可根据生长圈的直径大小初步判断菌体合成和释放某物质的能力 哺乳动物细胞培养过程中，细胞的变化及应用 对正常细胞进行体外培养时，要经历原代培养和1至多次的传代培养（N0为培养瓶中细胞的初始数量），图示为培养瓶中细胞的数量变化。原代培养与初次传代培养，细胞数量可呈“S”形增长，传代培养中会出现部分细胞停止分裂与衰老死亡，极少数细胞因发生核型改变而成为不死性细胞（具有癌细胞的特征）。通过细胞培养技术，可将核型未改变的细胞用于移植，可检测某药物对细胞代谢或增殖的影响，可研究导致细胞核型发生改变的因素及细胞增殖的调控等。 哺乳动物细胞的培养条件可与人体内环境稳态的维持及调节相联系。注意比较： （1）培养液与人体细胞外液的化学组成（包括营养物质、激素等活性物质）、理化性质（pH、温度、渗透压等）； （2）细胞的代谢（物质的吸收、转化等）及生命历程（增殖、衰老、癌变等）。 通关特训 1．温室效应，全球气候变暖，会给人们及地球带来很多危害。大肠杆菌中的甲酸氢裂酶（FHL）能将甲酸氧化成还原性H和CO2。科学家利用大肠杆菌难于区分钼和钨这一特点，通过一定方式培养大肠杆菌，使得FHL中的钼替换成钨，改变了FHL的催化特性，改造后的大肠杆菌能够利用H2和CO2转化为甲酸，这为减缓温室效应提供新的研究方向。 (1)为了获得目的菌株，首先需要将大肠杆菌置于_____的培养液中进行培养，完成元素的替换过程。 (2)然后通过图1所示的_____法分离出单个菌落。 (3)在对分离纯化的菌株进行筛选和鉴定后，扩大培养所用的培养基类型是_____（编号选填）。 ①固体培养基②液体培养基③通用培养基④选择培养基 (4)扩大培养过程中需要对大肠杆菌进行计数，如图2所示，取10mL培养液经过一系列梯度稀释后涂布0.1mL稀释液到固体培养基中培养，得到的菌落数分别为298、296、288个，则每升培养液中大肠杆菌数量为_____个。 (5)除了用该方法计数外，还可以用显微镜计数法，其特点是_____（编号选填）。 ①只能检测活菌数量 ②不能区分死菌和活菌 ③测得值往往偏小 ④测得值大于实际的活菌数 (6)嗜热古细菌具有高浓度甲酸盐耐受性，在80℃温度条件下可以持续氧化甲酸盐产生H2和碳酸氢盐，为其他生物提供原料。该发酵系统不需要经过灭菌，其他微生物也很难生长繁殖，原因可能是_____（写出2条）。 (7)抗生素在现代生活中被广泛应用，为了检测改造后的大肠杆菌对抗生素的敏感性，分别将含有A、B、C三种抗生素的滤纸片均匀放置在布满了改造后大肠杆菌的平板的不同位置，培养一段时间后结果如图3所示，改造后的大肠杆菌对抗生素_____（图中字母选填）的抗性最强。 【答案】(1)富含钨 (2)平板划线 (3)②③ (4)2.94×1011 (5)②④ (6)在高温条件下其他微生物的酶变性失活，生长繁殖受抑制，或在高浓度甲酸条件，其他微生物因失水过多而死亡 (7)C 【详解】（1）根据题意，科学家利用大肠杆菌难于区分钼和钨这一特点，让大肠杆菌在过量的钨中生长，完成钨与钼的交换，因此将大肠杆菌置于富含钨的培养基中进行培养完成元素的替换过程； （2）图1的操作特征是用接种环在培养基表面连续划线，通过划线逐步稀释菌液，最终在划线末端获得单个菌落，图1所示的是平板划线法进行分离出单个菌落； （3）②液体培养基能让微生物充分接触营养物质，代谢旺盛、增殖速度快，是微生物扩大培养的首选培养基类型；且不需要选择作用，使用通用培养基即可，因此选②液体培养基、③通用培养基。 （4）稀释涂布平板法进行计数时，需要计算三个培养基菌落数（选取30-300的菌落）的平均值，然后再计算每升原水样中大肠杆菌数，根据题意，培养液被稀释了105倍，则每升培养液中大肠杆菌数量为（298+296+288）÷3÷0.1×105×103=2.94×1011个； （5）①②显微镜无法区分死菌和活菌，该方法会计数所有菌体（死菌 + 活菌），不是只能检测活菌，①错误，②正确； ③稀释涂布平板法会因菌落重叠等问题导致测得值偏小，显微镜计数法无此问题，③错误； ④计数结果包含死菌，因此测得值大于实际的活菌数，④正确。 （6）根据题意，嗜热古细菌具有高浓度甲酸盐耐受性，在80℃温度条件下可以持续氧化甲酸盐产生H2和碳酸氢盐，因此嗜热古细菌也具有耐高温的特点，在高温条件下其他微生物的酶变性失活，生长繁殖受抑制，或在高浓度甲酸条件，其他微生物因失水过多而死亡，故发酵系统不需要经过灭菌，其他微生物也很难生长繁殖； （7）识图分析可知，将含有A、B、C三种抗生素的滤纸片均匀放置在布满了改造后大肠杆菌的平板的不同位置，培养一段时间后结果显示抗生素A的抑菌圈最大，其次是抗生素B，抑菌圈最小的是抗生素C，因此改造后的大肠杆菌对抗生素C的抗性最强。 2．为了解某种医用防护口罩（经灭菌）佩戴时间对防护功能的影响，进行了实验研究，参加实验的医务人员随机分为ABC三组，在无菌实验室佩戴不同时间后取样。 取样过程：分别剪取口罩内层（与口和皮肤接触面）和外层6cm×6cm纱布，剪碎后加入5mL培养基X中，震荡2分钟，待纱布碎片自然沉降后，取上清液1mL经稀释后接种于培养基Y上，37℃培养箱培养48小时后在放大镜下统计每cm2培养基上的菌落数，每组取平均值。滤菌率=（内层菌落数-外层菌落数）/内层菌落数。结果见表。 组别 佩戴时间 培养基上每cm2菌落数（个） 滤菌率% 内层 外层 A 20分钟 23.67 0.95 96.13 B 2小时 73.93 2.91 96.06 C 4小时 129.75 10.16 92.17 (1)上述实验中，需要进行高压蒸汽灭菌处理的是_________。 A．剪刀 B．培养基 C．放大镜 D．取样的口罩纱布 (2)实验中“取上清液1mL接种于培养基Y上”，此操作采用的接种方法是_________。 (3)该接种方法需要用到的器材有_________。 A． B． C． D． (4)培养基X与Y在成分及功能上的特点是_____。 A．X不含琼脂，Y含琼脂 B．X为通用培养基，Y为选择培养基 C．X和Y都只需碳源、无机盐和水 D．X用于分离菌落，Y用于纯化菌落 将佩戴4小时的口罩内层纱布剪碎后加入X培养基中混合，取上清液1mL经稀释后接种于培养基Y上的稀释过程具体如图。 (5)结合表和图中数据分析（培养基面积为63.6cm2），从X培养基中取出的1mL上清液中含有菌体数量为__________。（保留2位小数） (6)口罩上细菌可能的来源有____。 A．人体皮肤 B．人体呼出气体 C．口罩 D．外界空气 人体汗液、皮肤分泌物、呼出的水汽中含有尿素，长时间佩戴会形成微生物温床，有利于能合成脲酶（分解尿素）的微生物生长繁殖，使口罩“发臭”。 (7)在利用久戴后“发臭”口罩，筛选及分离、纯化高产脲酶的细菌过程中，需要进行的研究步骤是_________________。（选择正确的编号并排序） ①测定脲酶的活性 ②配制含蛋白胨的培养基分离目标菌 ③配制以尿素为唯一氮源的培养基分离目标菌 ④用自来水采集微生物的样品 ⑤用无菌水采集微生物的样品 ⑥挑取单菌落再次划线纯化培养 (8)脲酶生产过程是高度好氧过程，为满足通气，将目标菌接种到发酵罐中后，需要________。（写出2点） (9)许多豆科植物中也含有脲酶，可以利用生物反应器培养大豆细胞获得脲酶，下列操作或说法错误的是_________。 A．培养大豆细胞的生物反应器内需保证无菌 B．需要在培养基中添加纤维素酶和果胶酶去掉细胞壁 C．该过程利用了植物细胞具有全能性 D．需要在光照下培养 【答案】(1)AB (2)稀释涂布平板法 (3)BCD (4)A (5)8.25×1010 (6)AB (7)⑤③⑥① (8)通入无菌空气，适当搅拌，加入消泡剂等 (9)BCD 【详解】（1）A、剪刀作为取材工具，要防止取材时杂菌污染，需要进行高压蒸汽灭菌，A正确； B、培养基进行微生物的培养，需要高压蒸汽灭菌，B正确； C、放大镜为观察器具，不需要灭菌，C错误； D、取样的口罩纱布是待观察活菌数的实验材料，不能进行高压灭菌，D错误。 （2）Y培养基为固体培养基，又要观察细菌菌落总数目，故要采用稀释涂布平板法。 （3）稀释涂布平板法用到的器材有涂布器、滴管、酒精灯，BCD正确，A错误。 （4）A、X培养基为液体培养基分离菌落，Y为固体培养基 ，故两者在成分上的区别是X不含琼脂，Y含琼脂，A正确； B、该实验要计算所有口罩上的细菌，故不是选择培养基，B错误； C、Y培养基要满足所有口罩上细菌的繁殖，故Y培养基上还要含有某些特殊的营养物质，C错误； D、X用来分离菌落，Y用来繁殖菌落，纯化菌落是选择培养基的作用，D错误。 （5）根据梯度稀释，三次稀释后总稀释倍数为102×102×102=106，接种量为0.1mL，培养基总菌落数为129.75×63.6=8252.1，计算得：1mL原液中菌体数=8252.1/0.1×106=8.25×1010。 （6）A、口罩内层与人体皮肤接触，人体表面存在细菌，A正确； B、人体口腔内也有细菌，会随呼吸到达口罩，B正确； C、口罩是经消毒灭菌后才销售的，故口罩本身不应含有细菌，C错误； D、实验在无菌实验室进行，空气中无细菌，D错误。 （7）筛选产脲酶细菌的步骤：取样需要用无菌水，避免引入杂菌，选⑤；需要以尿素为唯一氮源的选择培养基分离，只有产脲酶细菌可以生长，选③；分离后挑单菌落纯化培养，选⑥；最后筛选高产菌株需要测定脲酶活性，选①，正确排序为⑤③⑥①。 （8）好氧发酵需要满足氧气需求，可通入无菌空气，适当搅拌，加入消泡剂等满足通气需求。 （9）A、植物细胞培养生物反应器必须保证无菌，A正确； B、培养大豆细胞不需要去除细胞壁，只有原生质体培养才需要去壁，B错误； C、该过程仅培养大豆细胞获得细胞产物，不需要发育为完整植株，不利用植物细胞全能性，C错误； D、培养愈伤组织来获取细胞产物，不需要光照，D错误。 热点角度02 基因工程 析典例·建模型 （2025·上海·高考真题）I.野生型大肠杆菌质膜上有一种转运葡萄糖的S蛋白，转运时需耗能。研究人员欲将另一种膜蛋白H改造为∆H蛋白，来替代S蛋白转运葡萄糖，形成一种不耗能的转运方式。图1是技术路线图，图2为构建的含有∆H基因的表达载体，其中①～④表示载体中的相应位置，PstⅠ和BamHⅠ表示相应限制性内切核酸酶的酶切位点。 1．图1过程Ⅰ～Ⅳ中，获取目的基因发生在___________。(单选) A．Ⅰ B．Ⅱ C．Ⅲ D．Ⅳ 2．图1过程Ⅱ中，需要使用的酶有___________。(多选) A．PstⅠ B．DNA连接酶 C．BamHⅠ D．DNA聚合酶 3．图2中，∆H基因的启动子的位置和转录方向最可能是___________。(单选) A．①，逆时针 B．②，逆时针 C．③，顺时针 D．④，顺时针 4．为确定表达载体是否含有∆H基因，可以采用的方法有___________。(多选) A．对表达载体进行基因测序 B．对表达载体上的特定片段进行PCR C．酶切表达载体后检测DNA片段长度 D．观察导入了表达载体的菌株的氨苄抗性 II.如同源染色体联会时发生的交叉互换，两个DNA分子若含有相同序列，可发生重组。在过程Ⅲ中，欲用DNA2中的片段⑦替换野生型大肠杆菌基因组(DNA1)中的S基因，图3中①～⑦代替相应DNA片段，且序列均不相同、无相互包含关系。S基因和替换片段⑦约3000bp(碱基对)，片段①～⑥约为15～25bp。 5．以DNA2为模板，采用PCR获得含有替换片段⑦的PCR产物。若要用该PCR产物与DNA1重组，以完成对S基因的准确替换，则在该PCR产物中，除⑦外还包含①～⑥中的___________；PCR引物的设计应依据的片段是①～⑥中的___________。(编号选填) 下表是野生型菌株和∆H菌株在仅碳源含量不同的培养基中的增殖情况，M值越大，反映菌株增殖越快。 培养基中碳源含量 M值 野生型菌株 ∆H菌株 50g/L 0.137 0.157 100g/L 0.127 0.228 6．根据研究目的，培养基中的碳源应该选择___________。(单选) A．葡萄糖 B．葡萄糖和淀粉 C．淀粉 D．琼脂 7．据表中数据，比较∆H菌株和野生型菌株的增殖情况，并分析两者产生差异的原因。 【答案】1．A 2．ABC 3．C 4．ABC 5． ②③ ②③ 6．A 7．∆H转运葡萄糖不消耗能量，葡萄糖浓度越高，进入细胞的葡萄糖越多，节省的能量可以用于菌体增殖，因此增殖比野生型更快 【解析】1．过程I的内容是改造H基因、大量复制ΔH基因，ΔH基因就是本实验的目的基因，因此获取目的基因发生在过程I，A正确。 2．图1过程Ⅱ是获得目的基因表达载体的过程，需要使用的酶有DNA连接酶和限制性核酸内切酶，根据图2可知，该目的基因表达载体构建过程中采用了双酶切的方法，因此构建过程中需要的酶有PstⅠ、DNA连接酶、BamHⅠ，ABC正确，D错误。 3．启动子是RNA聚合酶结合位点，位于目的基因的上游，终止子位于目的基因下游，转录方向从启动子指向终止子。图2中终止子位于ΔH基因下游靠近④一侧，因此启动子应位于ΔH基因上游的③位置，转录方向为顺时针（从③经ΔH指向终止子），C正确。 4．A、对表达载体测序可以直接确认是否含有ΔH基因，A正确； B、对表达载体上的特定片段进行PCR可以实现对目的基因的检测，B正确； C、酶切后检测DNA片段长度，若片段长度符合预期（插入ΔH基因后的长度），即可证明含有目的基因，C正确； D、氨苄抗性基因位于载体上，无论是否插入ΔH基因，载体都携带氨苄抗性，不能通过氨苄抗性鉴定目的基因，D错误。 5．同源重组需要同源序列，要替换DNA1中S基因，需要ΔH基因（⑦）两侧带有与S基因两侧相同的同源序列②和③，才能准确重组替换S基因，因此PCR产物除⑦外还需要②③；PCR引物需要与待扩增片段两端互补，因此引物设计依据②和③的序列。 6．本实验的研究目的是检验ΔH蛋白能否转运葡萄糖，因此需要选择葡萄糖作为唯一碳源，才能检测菌株利用葡萄糖的能力，A正确。 7．野生型大肠杆菌吸收葡萄糖需要消耗能量，即吸收葡萄糖的方式为主动运输，∆H菌株吸收葡萄糖的方式不需要消耗能量，为协助扩散，节省的能量可以用于菌体增殖，因此增殖比野生型更快。 研考点・通技法 限制酶的选择 （1）根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限制酶SmaⅠ。 ②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙）。酶（如 （2）根据质粒的特点选择限制图） （3）农杆菌转化法中，酶切位点应位于Ti质粒的T-DNA内部。图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取。 PCR引物的设计和修饰 （1）PCR引物的设计 ①引物长度要适宜，一般引物的长度为15～23 bp。过长会导致其延伸温度大于74 ℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；引物过短特异性差，可导致引物与模板链随机结合。 ②引物内部应避免自身互补。引物自身不能有连续4个碱基的互补，以免形成发夹状结构，这种结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。 ③引物之间应避免互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补，尤其应避免3'端的互补重叠以防形成引物二聚体。 （2）引物的修饰 ①引物3'端不可修饰。引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。 ②引物5'端可以修饰。引物5'端常见修饰包括：添加酶切位点、引入启动子序列、插入突变序列等。 CRISPR/Cas9基因编辑技术 CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA（sgRNA）引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割（如图）。CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是与靶向基因（目的基因）上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合， 并在特定位点切割DNA。 CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是可将目的基因定点插入所需位点，避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。 Cre/LoxP重组酶系统 这个系统主要由两部分组成：Cre重组酶和LoxP位点。 （1）Cre重组酶：最早是从P1噬菌体中发现的，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。 （2）LoxP序列：来源于P1噬菌体的DNA序列，包括两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。 （3）①同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。 ②反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。 通关特训 1.平滑肌细胞(SMC)是高等动物血管壁的重要组成，其功能障碍会导致主动脉瘤的发生。研究人员进行了如下实验，获得同时含有图1所示基因的杂合小鼠C．Cre重组酶可识别DNA分子中的loxP序列，当DNA分子上存在两个同向loxP时，Cre重组酶可将两个loxP之间的DNA序列切除。 （1）SMC由胚胎发育过程中的中胚层细胞分化而来，下列可以作为中胚层细胞分化为SMC的标志的是___________。(单选) A．细胞表达肌肉收缩所需的肌动蛋白 B．细胞表达细胞周期蛋白p53 C．细胞表达RNA聚合酶 D．细胞表达ATP合酶 （2）构建小鼠A时，先通过PCR获得CE基因，欲得到大量完整的CE基因，该技术的最后一个环节应选用引物___________。(单选) A．P1和P2 B．P3和P4 C．P2和P3 D．P1和P4 （3）为保证CE在SMC中特异性表达，应该可采取的策略是___________。(单选) A．促进CE序列发生甲基化修饰 B．在CE基因编码序列前插入SMC特异性启动子 C．在CE基因编码序列后插入SMC特异性终止密码子 D．在CE基因编码序列的第一位插入SMC特异性起始密码子 （4）已知CE基因中有XbaI的识别序列，图3为用于构建融合基因表达载体的质粒部分示意图。为使CE基因与质粒高效拼接，可用___________限制酶对质粒进行酶切，在CE基因的两端分别添加___________限制酶的识别序列。(编号选填) ①XbaI    ②BamHI    ③SmaI    ④EcoRI    ⑤SpeI （5）构建同时含有loxP、Stop和tdT的表达载体，以获得小鼠B，最合适的受体细胞是___________。(单选) A．小鼠骨髓瘤细胞 B．人胚胎干细胞 C．小鼠受精卵细胞 D．小鼠SMC （6）外源药物他莫昔芬可以与细胞质中的雌激素受体结合并使其进入细胞核。用他莫昔芬饲喂小鼠C后，可观察到___________。(单选) A．小鼠C的SMC发出红色荧光 B．小鼠C未发出荧光 C．小鼠C的全身发出红色荧光 D．小鼠C的SMC之外的部分发出红色荧光 为利用CE杂合小鼠研究血管SMC中特异性表达的S基因在主动脉瘤形成中的作用，在S基因两侧分别引入一个loxP，这样的S基因称为flox基因，获得flox杂合小鼠(flox/+)后，开展如图4所示的杂交实验。已知S基因和CE位于小鼠的非同源染色体上。 （7）为获得F2中的小鼠E，仅考虑S基因的遗传，用于与F1杂交的小鼠D的基因型应为___________。 （8）经过他莫昔芬诱导后，下列基因可能存在于小鼠E血管SMC基因组中的有___________。(多选) A．S基因 B．tdT基因 C．CE基因 D．flox基因 （9）为了使研究更具有科学性，适用于检测评估CE表达的组织特异性的是___________。(单选) A．检测SMC中tdT基因的表达情况 B．检测多种组织中tdT基因的表达情况 C．检测多种组织中S基因的表达情况 D．检测SMC中是否具有loxP序列 【答案】（1）A （2）D （3）B （4） ①④ ⑤④ （6）C （7）A （8）Flox/+ （9）BC 16．B 【解析】（1）A、中胚层细胞分化为 SMC（平滑肌细胞），平滑肌细胞具有收缩功能，会表达肌肉收缩所需的肌动蛋白，因此细胞表达肌肉收缩所需的肌动蛋白可以作为中胚层细胞分化为 SMC 的标志，A正确； B、细胞周期蛋白p53主要与细胞周期调控和细胞凋亡等过程相关，不是中胚层细胞分化为SMC的特异性标志，B错误； C、RNA 聚合酶参与转录过程，几乎在所有活细胞中都有表达，不是中胚层细胞分化为 SMC 的特异性标志，C错误； D、ATP合酶参与ATP的合成过程，几乎所有活细胞都有表达，不是中胚层细胞分化为 SMC 的特异性标志，D错误。 （2）CE是Cre重组酶与雌激素受体的融合基因，需要扩增包含完整Cre基因和完整雌激素受体基因的片段，PCR扩增需要引物分别结合目的基因两端，延伸方向为5'→3'，因此选择最左侧的正向引物P1和最右侧的反向引物P4，可扩增出完整的CE基因，D正确。 （3）基因的特异性表达依赖组织特异性启动子，启动子是RNA聚合酶结合的位点，决定基因表达的特异性，因此在CE基因编码序列前插入SMC特异性启动子，可保证CE仅在SMC中特异性表达；甲基化会抑制基因表达，终止密码子仅结束翻译、起始密码子仅启动翻译，都不能决定组织表达特异性，B正确，ACD错误。 （4）CE基因内部存在XbaI识别序列，若CE两端添加XbaI，酶切时会切断CE基因。SpeI和XbaI是同尾酶，酶切后产生的黏性末端相同，因此可以在CE两端分别添加SpeI（⑤）和EcoRI（④）的识别序列；质粒用XbaI（①）和EcoRI（④）酶切后，可与酶切后的CE高效拼接，且不会发生质粒自连。 （5）A、小鼠骨髓瘤细胞是已经发生癌变的细胞，其遗传物质和细胞特性发生改变，不适合作为构建转基因小鼠的受体细胞，A错误； B、人胚胎干细胞是人源细胞，不能用于构建小鼠，B错误； C、小鼠受精卵细胞具有全能性，能够发育成完整个体，是构建转基因小鼠最常用的受体细胞，用它作为受体细胞导入含有 loxP、Stop 和 tdT 的表达载体，可以获得含有相应基因的小鼠 B，C正确； D、小鼠 SMC 是高度分化的细胞，不具有全能性，不能发育成完整个体，不适合作为构建转基因小鼠的受体细胞，D错误。 （6）外源药物他莫昔芬的诱导下，细胞质中与Cre重组酶耦连的雌激素受体进入细胞核，Cre重组酶能导致loxP位点间的序列丢失，则Stop序列丢失，tdT表达出红色荧光蛋白，由于CE在SMC中特异性表达，经杂交后，小鼠C同时含有CE和tdT，所以可观察到SMC发出红色荧光，A正确，BCD错误。 （7）仅考虑S基因的遗传，用于与 F1 杂交的小鼠D的基因型应为flox/+。 （8）经过他莫昔芬诱导后，定位于细胞质中的雌激素受体进入细胞核，Cre重组酶能导致loxP位点间的序列丢失，在S基因两侧分别引入一个loxP位点，所以经他莫昔芬诱导后，SMC中S基因被敲除，故存在于小鼠 E 基因组中的有tdT基因和CE基因，BC正确。 （9）CE表达产生Cre重组酶，Cre切除Stop后tdT才会表达，因此tdT的表达位置可以反映CE的表达位置；要检测CE表达的组织特异性，需要检测多种不同组织中tdT的表达，确认只有SMC中tdT表达，才能证明CE的组织特异性，B正确。 2.高产水稻 随着耕地的减少，提高作物产量是人类面临的一个重大课题。研究发现，一种名为PEL的调控因子可能在水稻维管束鞘细胞的叶绿体发育中发挥重要作用，从而提高水稻光合效率，获得高产水稻。为此，科研人员构建了PEL基因过表达植株来研究PEL的功能。左图是部分实验过程、右图是表达载体示意图，其中ori为复制原点，Hptr为潮霉素抗性基因，Kanr为卡那霉素抗性基因。 (1)现在PEL基因的完整序列已知，那么过程I可采用的方法有_________。（编号选填） ①PCR        ②化学合成         ③大规模筛选 (2)为促进PEL基因高水平表达，需在表达载体中加入强效启动子。则该强效启动子的位置和转录方向最可能是______。（单选） A．m，顺时针 B．m，逆时针 C．n，顺时针 D．n，逆时针 (3)过程Ⅲ培养农杆菌时，加入卡那霉素可以筛选出_________。（编号选填） ①未导入任何载体的农杆菌 ②导入过表达载体的农杆菌 ③导入“空载”载体的农杆菌 (4)过程Ⅳ中，用水稻愈伤组织作为受体细胞而不用水稻的其他细胞，可能是因为愈伤组织__________。（多选） A．全能性高，便于植株再生 B．分裂旺盛，便于基因整合 C．结构松散，便于农杆菌接触 D．含抗性基因，便于多次筛选 (5)过程Ⅴ除了在培养基中加入潮霉素外，还经常加入头孢霉素。推测同时加入这两种物质的目的是__________。（单选） A．筛选成功转化的愈伤组织，筛选成功导入的农杆菌 B．筛选成功转化的愈伤组织，杀死成功导入的农杆菌 C．杀死成功转化的愈伤组织，筛选成功导入的农杆菌 D．杀死成功转化的愈伤组织，杀死成功导入的农杆菌 (6)过程Ⅵ获得PEL基因过表达植株的过程不会发生__________（多选） A．脱分化 B．再分化 C．细胞融合 D．细胞壁再生 (7)研究PEL的功能，除PEL基因过表达水稻作为实验组外，还应设计的对照组有__________。（多选） A．野生型水稻 B．野生型小麦 C．导入“空载”载体的水稻 D．PEL基因过表达的拟南芥 (8)除了上述方法外，获得水稻高产品种的方法还有很多，请根据已学知识提出两种不同的方法，并作出简要说明。_____________________________________________。 【答案】(1)①②。 (2)D (3)②③ (4)ABC (5)B (6)ACD (7)AC (8)杂交育种：将具有不同优良性状的水稻杂交，从后代中筛选出高产的水稻新品种。诱变育种：利用物理/化学诱变剂诱导水稻发生基因突变，从变异后代中筛选出高产变异株。 （或单倍体育种：取杂交后F1的花药离体培养，秋水仙素诱导染色体加倍，可快速获得纯合高产水稻；多倍体育种：诱导水稻染色体加倍，获得多倍体高产水稻） 【详解】（1）目的基因序列已知时，可以通过PCR技术扩增获得目的基因，也可以通过人工化学合成获得；大规模筛选适用于目的基因序列未知的情况，因此选①②。 （2）启动子是RNA聚合酶结合位点，需要位于目的基因的上游，且转录方向需要和目的基因一致。由图可知，PEL基因转录方向为向左，也就是逆时针方向，因此启动子应位于PEL基因上游位置n，转录方向为逆时针，故选D。 （3）卡那霉素抗性基因(Kanr)位于载体上，无论是插入PEL的过表达载体，还是空载载体都携带该抗性基因，因此导入了载体（过表达载体/空载）的农杆菌都能在含卡那霉素的培养基存活，未导入载体的农杆菌会被杀死，因此可筛选出②③。 （4）愈伤组织是植物细胞脱分化形成的薄壁细胞：全能性高，更容易再生为完整植株；分裂旺盛，便于外源基因整合到受体染色体上；结构松散，便于农杆菌接触感染；水稻愈伤组织本身不含抗性基因，抗性基因来自导入的载体，D错误，故选ABC。 （5）潮霉素抗性基因用于筛选成功转化（导入目的基因）的愈伤组织；头孢霉素是抗生素，可以杀死共培养后残留的农杆菌，避免农杆菌过度生长影响愈伤组织发育，故选B。 （6）过程VI是将已经获得的目标愈伤组织培养为完整植株，该过程会发生再分化，脱分化是获得愈伤组织的过程，已经在之前步骤完成，本过程不会发生；该实验是转基因技术，不涉及细胞融合，且愈伤组织本身已有细胞壁，不需要再产生细胞壁，因此不会发生的是ACD。 （7）实验目的是研究PEL基因在水稻中的功能，对照组需要设置野生型水稻（和过表达植株比较性状）、导入空载载体的水稻（排除转基因操作、载体插入位点对结果的干扰），实验对象为水稻，不需要其他物种对照，故选AC。 （8）除了上述方法外，获得水稻高产品种的方法还有很多，如①杂交育种：将具有不同优良性状的水稻杂交，从后代中筛选出高产的水稻新品种。②诱变育种：利用物理/化学诱变剂诱导水稻发生基因突变，从变异后代中筛选出高产变异株。 （或单倍体育种：取杂交后F1的花药离体培养，秋水仙素诱导染色体加倍，可快速获得纯合高产水稻；多倍体育种：诱导水稻染色体加倍，获得多倍体高产水稻） / 学科网（北京）股份有限公司 $