3.1 重组DNA技术的基本工具课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章 基因工程 基因工程：指按照人们的愿望,通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 原理 结果 育种优点 基因重组 DNA分子水平 获得新的生物类型和生物产品 生物体外 基因 克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状。 剪切→拼接→导入→表达 基因工程的诞生和发展 1.了解基因工程的概念和原理。 2.说出DNA重组技术的实现需要的分子工具。 3.阐述基因工程的工具酶作用及特点。 第2章 细胞工程 第1节 重组DNA技术的基本工具 理论基础 1、为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？（拼接的基础） 2、为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？（表达的基础） ①DNA的组成单位相同，都是4种脱氧核苷酸 ②空间结构相同，都是规则的双螺旋结构 ③都遵循碱基互补配对原则 脱氧 核糖 含氮碱基 磷酸 DNA平面结构 ①基因是控制生物性状的独立遗传单位 ②遗传信息的传递都遵循中心法则 ③生物界共用一套遗传密码 相同的遗传信息在不同生物体内表达出相同的蛋白质。 一、“分子手术刀”——限制性内切核酸酶（简称“限制酶”） 1. 来源： 2. 作用： 主要来自原核生物，也可人工合成。 能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 专一性(特异性) 4. 结果: 形成黏性末端或平末端 3. 特点： EcoRⅠ限制酶 识别序列：5‘—GAATTC—3’ 切割位点：G与A之间的磷酸二酯键 黏性末端 黏性末端 DNA两条单链的切口处，伸出几个核苷酸，刚好能互补配对，这样的切口叫黏性末端。 SmaⅠ限制酶 识别序列：5‘—CCCGGG—3’ 切割位点：C与G之间的磷酸二酯键 平末端 切口处是平整的，这样的切口叫平末端。 一、“分子手术刀”——限制性内切核酸酶（简称“限制酶”） 阅读72页资料卡“限制酶的命名”，说说EcoRⅠ各个字母的代表含义。 EcoRⅠ 属名Escherichia首字母 种名coli前两个字母 R型菌株 从中分离的第一个限制酶 练习：粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）中分离的第一种限制酶即_______；流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的d菌株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:________________________________。 SmaⅠ HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ 拓展——限制酶的命名 1.推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么？（P71旁栏思考） 限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以达到保证自身的目的。 2.想一想，为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？（P74拓展应用1） ①含某种限制酶的细菌的DNA分子 ②不具备这种限制酶的识别序列 ③限制酶所识别序列的碱基被甲基化，使限制酶不能将其切开 思考.讨论 3.限制酶能切割RNA分子吗？ 不能 检测提升 1.请写出下列限制酶切割形成的末端序列。 BamHⅠ EcoRⅠ__________________________ Hind Ⅲ Bgl Ⅱ _________________________ -G -CCTAG -G -CTTAA -A -TTCGA -A -TCTAG 和 GATCC- G- 和 AATTC- G- 和 AGCTT- A- 和 GATCT- A- 思考 ①同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？ ②不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？ 相同 可能相同(比如BamHⅠ、BglⅡ) 同尾酶：识别的靶序列不同，但是酶切后形成的黏性末端相同。 检测提升 2.请结合图示，推断限制酶切割一次可断开____个磷酸二酯键;产生____个游离的磷酸基团;产生____个黏性末端;消耗____个水分子。 2 2 2 2 3.下图甲是一个DNA片段，箭头处代表不同限制酶的切点，据图回答： (1)用Eco RⅠ酶切，能得到 种DNA片段； (2)用PstⅠ完全酶切，能得到 种DNA片段； (3)要想获得抗病基因必须要用限制酶切_____个切口;可产生______个黏性末端。 2 3 2 4 选择限制酶切割目的基因的基本原则是：能切下目的基因且不破坏目的基因 思考.讨论 C G G C C G T A T A A T A T G C G C G C T A A T C G T A T A A T A T G C T A T A 用同种限制酶切割(EcoRⅠ) C G G C C G T T A A A A T T G C G C G C T A A T C G T T A A A A T T G C T A T A C G G C C G T T A A A A T T G C T A T A 把两种来源不同的DNA分子进行拼接，应该怎样处理呢？ 完全互补的黏性末端能通过氢键暂时连接在一起，但并不稳定。 缺口怎么办 DNA连接酶 — “分子缝合针” 恢复被限制酶切开的磷酸二酯键 二、“分子缝合针”——DNA连接酶 二、“分子缝合针”——DNA连接酶 1.作用： 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_____________。 磷酸二酯键 2.种类： 类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 功能 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌 T4噬菌体 缝合_________和_______ 磷酸二酯键 缝合_________和_______ （连接平末端效率远低于T4 DNA连接酶） 平末端 黏性末端 黏性末端 平末端 二、“分子缝合针”——DNA连接酶 思考：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？ P72 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 DNA复制、基因工程 DNA复制、基因工程 在两个DNA片段间形成磷酸二酯键 将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键 拓展：几种相关酶的比较 项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶 DNA酶 作用部位 作用对象 作用结果 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键 DNA片段 DNA 单个的 脱氧核苷酸 DNA DNA 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割双链DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链 DNA连接酶、限制酶、 DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶 检测提升 A．获取基因a的限制酶的作用部位是图中的① B．基因工程所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶、质粒 C．连接基因a与载体的DNA连接酶的作用部位是图中的② D．一种限制酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子 3．(2024·青岛高二检测)某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶(Amy)基因a，通过基因工程的方法，将基因a与载体结合后导入马铃薯植株中，经检测发现Amy在成熟块茎细胞中存在。结合图形分析下列有关这一过程的叙述，正确的是(　　) A 三、“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体 1.作用： 将 送入 ，在受体细胞内对目的基因进行 。 外源基因 受体细胞 大量复制 3.种类： 在基因工程中使用的载体包括 等。 质粒、噬菌体和动植物病毒 2.载体需具备的条件：（以质粒为例） ①有一个至多个限制酶切割位点 便于插入目的基因 （便于鉴定和筛选含有重组DNA分子的细胞） ④对受体细胞无害 ②能自我复制或整合到受体DNA上 真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 ③有特殊的标记基因 4.标记基因的筛选原理： 导入 受体细胞 培养 加入氨苄青霉素 ①导入重组质粒的受体细胞存活并繁殖 ②导入普通载体的受体细胞存活并繁殖 含有氨苄青霉素抗性基因载体（如质粒） ❖重组DNA导入受体细胞不是100%，而且导入率较低 目的基因一定成功重组到质粒上了吗？ 三、“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体 思考.讨论 重组DNA分子 P73 动手剪一剪，拼一拼 请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI 的识别序列和切割位点。 然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。 …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… …TCCTAG …AGGATCTTAA GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG AATTCCATAC… GGTATG… GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG 思考.讨论 重组DNA分子 P73 讨论 1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？ 剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。 如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。 不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。 2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？ 3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？ …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG 思考.讨论 …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG 思考 1. 从以上操作可推知，在切割含“目的片段”的DNA分子时，需用限制酶切割____次此DNA分子，产生____个黏性末端。 2. 目的片段翻转过来，可以连接吗？______ 3. 目的片段可以自身环化吗？_______ 4. 切割目的基因和载体时，一般需要用______限制酶，目的是__________________。 2 4 可以 可以 同种 产生相同的黏性末端 *必须用同一种限制酶吗？ 不一定，不同的限制酶切割可能形成相同的黏性末端。 重组DNA分子 (3)限制酶________(填“能”或“不能”)切割原核细胞自身的DNA；不同生物的DNA分子能拼接起来的原因是 _____________________________________________________________ ___________________________________________________(写出两点)。 (4)质粒携带目的基因进入受体细胞后能进行自我复制，是因为其具有__________，此外质粒上具有标记基因的目的是______________________________________________________。 3．(2025·张家口高二期中)限制酶、DNA连接酶和载体是基因工程所需的三种基本工具，下图是几种限制酶的切割位点，回答以下问题： (1)经Pst Ⅰ 切割后产生的末端类型是__________。 (2)DNA连接酶和限制酶作用的部位都是________________，该作用部位位于右下图中的________；若将环状DNA分子的一段切割下来，需 要破坏________个该化学键。 黏性末端 磷酸二酯键 ② 4 不能 不同生物的DNA分子的空间结构； DNA分子的基本组成单位相同 复制原点 用于筛选成功导入目的基因的受体细胞 检测提升 探究·实践 DNA的粗提取与鉴定 1.实验原理： （1）提取DNA的原理 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精 DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液 初步分离DNA和蛋白质 溶解DNA 0 DNA溶解度 NaCl浓度（mol/L） 0.14 2 （2）鉴定DNA的原理 在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 溶解度最小，DNA析出 溶解度大，DNA溶解 探究·实践 DNA的粗提取与鉴定 2.方法步骤： (1)破碎细胞 洋葱＋研磨液→充分研磨 1.如果研磨不充分会对实验结果产生怎样的影响？ DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而使研磨液中的DNA含量较低，影响最终提取的DNA量。 (2)提取上清液 ①纱布过滤，在4℃冰箱中静置后，取上清液 ②将研磨液倒入塑料离心管中，离心取上清液 (3)DNA的析出 (4)DNA的鉴定 2.过滤能否用滤纸代替纱布？ 不可以。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。 3.此步骤获得的上清液中可能含有哪些细胞成分？ 可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。 ①在上清液中加入体积相等的预冷的酒精溶液, 静置2~3min后出现白色丝状物就是粗提取的DNA ②将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干 4.酒精预冷的作用？ ①抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； ②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出； ③低温有利于增加 DNA分子的柔韧性，减少断裂。 5.为什么要用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌？ 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。 探究·实践 DNA的粗提取与鉴定 2.方法步骤： (1)破碎细胞 (2)提取上清液 (3)DNA的析出 (4)DNA的鉴定 沸水浴加热 6.如何评价结果？ （1）DNA纯度： 看提取物颜色 （2）DNA的量：看与二苯胺反应颜色的深浅 空白对照：在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。 实验组 对照组 DNA＋二苯胺，沸水中加热5min，冷却，出现蓝色 探究·实践 DNA的粗提取与鉴定 3.结果分析与评价 (1)你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？ 观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。 (2)你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？ 含有核蛋白、多糖等杂质 (3)与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。 实验结果不明显的可能原因： ①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。 ②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。 ③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。 检测提升 2.下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是（     ） A.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热 B.DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂 C.预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA D.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近 1.下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（     ） A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C.DNA在不同浓度NaCI溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 D 鉴定DNA D 哺乳动物(如兔)成熟的红细胞无细胞核和众多的细胞器，细胞内基本不含DNA 检测提升 3．从目标生物提取分离DNA是进行基因工程操作的基础。以洋葱为材料进行“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是(　　) A.将粗提取的DNA用二苯胺试剂鉴定会呈现蓝色 B.洋葱研磨后应该使用垫有滤纸的漏斗进行过滤 C.将滤液静置后，取下层溶液加入95%的冷酒精 D.将蒸馏水加入切碎的洋葱中充分研磨以释放核DNA A 4.下列利用洋葱进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（ ） A.采用体积分数为95%酒精溶液析出DNA的方法可去除部分杂质 B.将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，要弃去上清液 C.用塑料离心管是因为用玻璃离心管容易破损 D.将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后振荡，观察颜色变化 A 限制酶 作用部位： 种类 E.coli DNA连接酶 载体 条件 ①有一个至多个限制酶切割位点 质粒、噬菌体、动植物病毒 DNA连接酶 作用部位： 切开DNA分子的磷酸二酯键 来源： 主要存在于原核生物中 特点： 具有专一性（能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列） T4 DNA连接酶 ④对受体细胞无害 ②能自我复制或整合到宿主DNA上 ③常有特殊的标记基因 种类： 磷酸二酯键 作用结果： 产生黏性末端或平末端 基因工程的基本工具 本节小结 3.1 重组DNA技术的基本工具 概念检测 1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ） A. 能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B. 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C. 能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D. 只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端 C 2. 在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ） A. 大肠杆菌的质粒 B. 切割DNA分子的酶 C. DNA片段的黏性末端 D. 用来识别特定基因的DNA探针 A 拓展应用 2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶Spe I进行切割，B片段分别用限制酶Hind Ⅲ、Xba I、EcoR V和Xho I进行切割。 （1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的DNA片段相连接?为什么? XbaⅠ。产生了相同的黏性末端。 （2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义? 切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。 同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。 (1)根据图3分别写出Bgl Ⅱ 与BamH Ⅰ 酶切后形成的末端序列： _____________、______________。 (2)使用Bgl Ⅱ 处理重组质粒，可以得到________________________。 检测提升 (3)Bgl Ⅱ 酶切后的质粒X与BamH Ⅰ 酶切后的目的基因Y能够连接的原因是 ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 (4)将连接后的产物转入一种Z细菌，Z细菌对卡那霉素敏感，且不能在缺乏亮氨酸的培养基中培养。要筛选含有重组质粒的Z细菌，应选择______________________的培养基。 3．(2024·石家庄高二检测)为制备目的基因Y(图1)与质粒X(图2)的重组DNA，将质粒X与含Y的DNA片段加入含有限制性内切核酸酶Bgl Ⅱ 与BamH Ⅰ 的反应混合物中，酶切后的片段再加入含有连接酶的反应体系中。其中，质粒X含有leu2基因，可用于合成亮氨酸，目的基因Y含有卡那霉素抗性基因KanR。请回答下列问题： 长度为3 300 bp的环状双链DNA Bgl Ⅱ 酶切后的质粒X与BamH Ⅰ 酶切后的目的基因Y具有相同的黏性末端，并遵循碱基互补配对原则 含卡那霉素但不含亮氨酸 Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.7.28 Lavf55.48.100 Lavf56.40.101 Tencent APD MTS Lavf56.40.101 Tencent APD MTS $