3.1 重组DNA技术的基本工具-2025—2026学年高二生物下学期选择性必修3

该高中生物学课件聚焦基因工程基本工具及DNA粗提取实验，通过“棉铃虫防治”案例导入，衔接基因结构与功能的知识回顾，构建从理论到实践的学习支架。 其亮点在于以科学思维分析工具作用原理，如通过“限制酶不切割自身DNA”讨论培养逻辑推理能力，结合实验操作视频与分步指导落实探究实践，习题融入高考真题。学生能深化结构与功能观，教师可提升教学效率。

◎科技探索之路：基因工程发展历程 　　指按照 ，进行严格的设计并通过 DNA重组和 等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的 。由于基因工程是在 上进行设计和施工的，因此又叫作 。 人们的愿望 体外 转基因 新的生物类型和生物产品 DNA分子水平 重组DNA技术 基因工程 ◎科技探索之路：基因工程发展历程 基因工程的别名： 操作环境： 操作对象： 操作水平： 基本过程： 原理： 结果： 重组DNA技术、 转基因技术 生物体外 基因 DNA 分子水平 剪切 基因重组 创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 →拼接 →导入 →表达 优点： 克服 不亲和障碍、 改造生物性状。 定向 基因工程 水母的绿色荧光蛋白基因 ◎科技探索之路：基因工程发展历程 远缘杂交 1.以下有关基因工程的叙述，正确的是（ ） A．基因工程是细胞水平上的生物工程 B．基因工程的目的是获得目的基因表达的蛋白质产物 C．基因工程产生的变异属于人工诱变 D．基因工程育种的优点之一是可以定向地使生物产生可遗传的变异 D 习题检测 2.下列关于基因工程的叙述，不正确的是（ ） A．基因工程的原理主要是基因重组 B．运用基因工程技术，可使生物发生定向变异 C．一种生物的基因转接到另一种生物的DNA分子上，属于基因工程的内容 D．是非同源染色体上非等位基因的自由组合 D 习题检测 1.基因与DNA的关系？ 2.基因的基本单位是什么？ 基因是有遗传效应的DNA片段 DNA平面结构 DNA立体结构 CH2 H OH H H H H 碱基 磷酸 5’ 4’ 3’ 2’ 1’ 脱氧核苷酸 第3章 基因工程 知识回顾——基因的结构和功能 3.基因的功能？ 储存、传递、表达遗传信息 复制 子代DNA 转录、翻译 控制蛋白质合成 复制 转录 翻译 DNA RNA 逆转录 复制 蛋白质 知识回顾——基因的结构和功能 第3章 基因工程 第1节 重组DNA技术的基本工具 第3章 选择性必修三：生物技术与工程 基因工程 学习目标 核心素养要求 1.通过分析资料和模拟操作，阐明限制酶和DNA连接酶的作用特点。 2. 通过模拟操作，概述DNA连接酶的作用部位及种类。 3. 通过小组合作，模拟目的基因和质粒拼接的过程，理解基因工程中三种工具之间的联系。 1. 生命观念、 科学思维：以结构与功能观、物质与能量观说明基因工程及相关技术的理论基础与原理，并在给定情境中，运用相应原理对结果作出解释。 2.科学探究：通过教具演示，体验并阐明基因工程三种基本工具的作用 重组DNA技术的基本工具 选择性必修三：生物技术与工程 一 DNA连接酶——“分子缝合针” 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 二 三 DNA的粗提取与鉴定 四 本节目录 内容聚焦 10 【资料】在棉花种植过程中常常会受到一些害虫的侵袭。其中以棉铃虫最为常见，它可以使棉花产量减少三分之一，甚至绝收。棉花本身不具有“杀虫基因”，而苏云金杆菌有一种“杀虫基因--Bt抗虫蛋白基因”，它能通过编码产生抗虫蛋白来杀死棉铃虫。 大量施用农药？ × 思考1：通常棉花怎么抵抗虫害呢? 杂交育种？ × 造成农产品和环境污染 同种生物之间进行 诱变育种？ × 不定向 普通棉花 转基因抗虫棉 思考2：能否培育出自身就能抵抗虫害的棉花呢? 提取苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因，转入棉花中，进而让棉花产生抗虫蛋白来杀死棉铃虫 从社会中来 我国是棉花的生产和消费大国，棉花在种植过程中常常会受到棉铃虫的侵袭，这会使棉花大量减产。大量施用农药不仅提高了生产成本，还可能造成农产品和环境的污染，如果能培育出自身能抵抗棉铃虫的棉花就能解决这个问题。 11 1.为什么苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因和棉花细胞基因能拼接起来？ （拼接的基础） DNA立体结构 DNA平面结构 CH2 H OH H H H H 碱基 磷酸 5’ 4’ 3’ 2’ 1’ 脱氧 核糖 ①DNA的组成单位都是4种 。 ②空间结构都是规则的 结构。 ③都遵循 原则。 思考讨论 基因工程诞生的理论基础 从社会中来 脱氧核苷酸 双螺旋 碱基互补配对 12 2.为什么Bt抗虫蛋白基因可以在棉花细胞内表达？（表达的基础） 相同的遗传信息在不同生物体内表达出相同的蛋白质，同一蛋白质在不同细胞中的功能相同。 DNA RNA 蛋白质 转录 翻译 复制 思考讨论 ①基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能单位。 ②遗传信息的传递都遵循 。 ③生物界共用一套 。 从社会中来 基因工程诞生的理论基础 中心法则 遗传密码 遗传信息的传递都遵循中心法则 13 资料：DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。 限制性内切核酸酶（限制酶） DNA连接酶 基因进入受体细胞的载体（如质粒） “分子运输车” “分子手术刀” “分子缝合针” （作用：准确切割DNA分子） （作用：将DNA片段连接起来） （作用：将体外重组好的DNA分子导入受体细胞） 从社会中来 科学家究竟用到了哪些“分子工具”？ 这些 “分子工具”各具有什么特征呢？ 思考讨论 1. 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 1.来源： 主要是原核生物 T A C G G C A T G C G C A T 5´ 3´ 5´ 3´ 4. 作用特点： 能够 双链DNA分子的特定脱氧核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的 断开。 2.化学本质： 蛋白质 3. 种类： 数千种 （限制酶不是一种酶，而是一类酶） 识别 磷酸二酯键 内容1 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” “分子手术刀” 大肠杆菌 蓝细菌 1.你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？ 2.为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？ 原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。 通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶识别的特定核苷酸序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。 原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰 切割外源DNA、使之失效，以保证自身安全 一 内容1 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 思考讨论 【思考】这些限制酶识别的特定序列有何特点？ 归纳限制酶识别序列特征 5′ 3′ 5′ 3′ C G C G C G C G C G C G SamⅠ EcoRⅠ C T 5′ 3′ 5′ 3′ T A G C A G A T T A ②每一种限制酶都有各自 。 ①大多数限制酶的识别序列由 组成；也有少数限制酶的识别序列 由 的核苷酸组成。 回文序列 ③中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。 内容1 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 2. 限制酶的识别序列 中轴线 6个核苷酸 4个、8个或其他数量 特定识别的序列 Sma I 限制酶只能识别 序列，切割 和 之间的 切开，切割后产生 。 3. 限制酶的作用结果 A G T C A T T C G A T A G G A T C A T C A T A T 大肠杆菌(E.coli)的EcoRⅠ 限制酶能特异性识别_________序列，并切割___和___之间的____________，切割后产生__________。 GAATTC G A 磷酸二酯键 黏性末端 Eco RI 限制酶 Sma I 限制酶 CCCGGG C G 磷酸二酯键 平末端 C C C G G G G G G C C C G G G C C C C C C G G G 限制酶 限制酶 内容1 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” *EcoRⅠ识别序列为GAATTC *EcoRⅠ切割部位为GA之间的磷酸二酯键 *形成的黏性末端（从5’往3’读）为__________ *一个限制酶切割一次形成_______个黏性末端 *同一种限制酶切割形成的黏性末端_________ *两个黏性末端有__________个游离的磷酸基团。 AATT- 两 相同 2 EcoR Ⅰ 内容1 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 内容1 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 【视频】限制性内切核酸酶 4. 限制酶的命名 限制酶是用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了三个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。限制酶的命名是根据细菌种类而定，以EcoRI为例: E：Escherichia （属名） co：coli （种加词） R：RY13 （品系） I：首先发现 在此类细菌中发现的顺序 EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶； SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。 练习：流感嗜血杆菌的d菌株（Haemophilus influenzae d）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为： 。 HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ 内容1 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 拓展巩固 1. 请写出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？ 提示： 同种限制酶产生的黏性末端 。 相同 结论1： 内容1 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” A TGATC CTAGA T CTAGT A T AGATC 结论2： 不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端，可通过DNA连接酶连接。 A TGATC CTAGA T (同尾酶) 使切割点的选择范围扩大。 1. 请写出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？ 内容1 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 同尾酶 1.请判断：以下黏性末端是由 种限制酶作用产生的。 3 注意观察识别序列和切割位点 ①找到切割位点 ②补全序列 做题技巧： 习题检测 2.下图所示的黏性末端属于同一种限制酶切割产生的是（ ） C A.①② B.①③ C.②④ D.③④ 习题检测 如何将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 G C T T A A A A T T C G G C T T A A A A T T C G 用DNA连接酶连接两个片段之间的 。 磷酸二酯键 内容2 DNA连接酶——“分子缝合针” DNA连接酶——“分子缝合针” 将双链 “缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 。 DNA片段 磷酸二酯键 1. 作用： 2. 分类： 类型 来源 功能 相同点 差别 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 大肠杆菌 T4噬菌体 连接平末端效率较高。 连接平末端效率较低 都能连接黏性末端和平末端。恢复磷酸二酯键， 内容2 DNA连接酶——“分子缝合针” “分子缝合针” A G T C A T T C G A T A 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来； E.coli DNA连接酶 T C G A T C 注意： DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但 将单个脱氧核苷酸连接到DNA链上！ 不能 内容2 DNA连接酶——“分子缝合针” ➋ T4 DNA连接酶 还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，效率较 . C C C G G G G G G C C C 高 内容2 DNA连接酶——“分子缝合针” 内容2 DNA连接酶——“分子缝合针” 【视频】DNA连接酶 1. 结合下图，推断限制酶切一次可断开几个磷酸二酯键？产生多少游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？ 限制酶切一次可断开 个磷酸二酯键，产生 个游离的磷酸基团，产生 个黏性末端，消耗 分子水 2 2 2 2 内容1 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 2.若某链状DNA分子中含有两个BamHⅠ的识别序列，该DNA分子将被切成____个片段，共断裂____个磷酸二酯键，形成几个_____黏性末端。 3 4 4 习题检测 解旋酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 游离的 脱氧核苷酸 5´ 5´ 3´ 3´ 新合成的子链 【思考】DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？ 内容2 DNA连接酶——“分子缝合针” 【思考】DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？ 内容2 DNA连接酶——“分子缝合针” 【视频】 DNA聚合酶 DNA连接酶 2026/6/9 34 【比较】 DNA连接酶与DNA聚合酶的比较 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 基因工程 DNA复制 只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 内容2 DNA连接酶——“分子缝合针” ① DNA聚合酶 ② DNA连接酶 ③ DNA解旋酶 ④ 限制酶 下列是有关DNA的各种酶，请选择对应的作用位点： 氢键 磷酸二酯键 T A C G G C A T G C G C 5´ 3´ 5´ 3´ 内容2 DNA连接酶——“分子缝合针” 几种相关酶的比较 归纳小结 名称 作用部位 作用结果 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA(水解)酶 解旋酶 磷酸二酯键 碱基对之间的氢键 将DNA切成两个片段 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链。 【思考】如何将人目标基因基因运送到大肠杆菌细胞呢？ 习题检测 2.载体种类： 一、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 1.载体的作用： ①作为运载工具，将 导入受体细胞中 ②在受体细胞内对目的基因进行大量 。 外源基因 复制 内容3 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” “分子运输车” 种类 用途 不同点 将外源基因导入 细胞 将外源基因导入 等细胞 将外源基因导入 细胞 将外源基因导入 细胞 质粒 噬菌体 植物病毒 动物病毒 (主) 各种 植物 大肠杆菌 动物 来源不同，在大小、结构、复制方式； 以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别 拟核 质粒 大肠杆菌细胞 氨苄青霉素抗性基因 目的基因插入位点 复制原点 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 主要存在于细菌和真菌体内 3. 最常用的载体——质粒 (1)定义： (2)来源： (3)本质： 环状双链DNA分子 (细胞质基因) 一、 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 内容3 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 4. 载体需具备的条件： ①有一个至多个限制酶切割位点 氨苄青霉素抗性基因 目的基因插入位点 复制原点 启动子 终止子 供外源DNA片段（基因）插入其中 ②能在细胞中进行自我复制，或整合到 受体DNA上，随受体DNA同步复制。 ③具有特殊的标记基因。 (便于重组DNA分子的筛选) 如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等 ④对受体细胞无害。 酶的结合位点，能复制并带着插入的目的基因一起复制 转录的起点 转录的终点 在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 内容3 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” DNA聚合 5. 标记基因的筛选原理 重组DNA导入受体细胞 100%，而且导入率 。 培养 含氨苄青霉素的培养基 未导入质粒 导入空载质粒 导入重组质粒 存活 存活 无法存活 内容3 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 【讨论】目的基因一定成功重组到质粒上了吗？ ①导入重组质粒的受体细胞存活并繁殖 ②导入普通载体的体细胞存活并繁殖 不是 较低 思考：如何提高筛选的准确性？ 【资料】LacZ 基因表达产生的 β-半乳糖甘酶能够分解 X-gal ，产生蓝色物质，从而使菌落呈蓝色；否则菌落呈白色。 请分析下列3种大肠杆菌在含 X-gal 和青霉素的固体培养基上的存活情况及菌落颜色。 LacZ 基因 氨苄青霉素抗性基因 无法存活 存活；蓝色 存活；白色 5. 标记基因的筛选原理 内容3 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 如： 绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP) 【补充1】标记基因通常有: ①抗生素的抗性基因 如： 抗氨苄青霉素基因(ampr)、 抗四环素基因(tetr) ②荧光蛋白基因 内容3 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 下列操作中选用哪种限制酶切割来构建重组质粒？ 1、选目的基因两端和运载体都有的 ； 2、所选酶切位点 破坏目的基因以及标记基因。 【补充2】规律——选择酶切位点的原则： ① 防止目的基因的自身环化。 不能用EcoRI 的原因 ② 防止目的基因反向连接到载体。 图1 图2 不能 BamH I 和 Hind III 酶切位点 内容3 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 1.若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是？ 噬菌体 噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕 病毒对宿主细胞的侵染具有一定的物种（组织）特异性。 分析载体的种类和载体需具备的条件 2．根据标记基因的作用，有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞不一定是导入目的基因的受体细胞，这种说法是否合理？请解释。 合理，因为仅导入载体的和导入插入了目的基因的载体的受体细胞均能在该培养基中存活。 合作探究： 内容3 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 1、在重组DNA技术中，将外源基因导入受体细胞，通常是利用质粒作为载体。下列关于质粒的叙述，正确的是（ ） A. 质粒是一种只存在于原核细胞中的结构简单的环状DNA分子 B. 质粒的复制和表达过程都遵循中心法则和碱基互补配对原则 C. 目的基因只有通过质粒整合到受体细胞的DNA中才能表达 D. 大多数天然质粒都不需要人工改造，可以直接作为载体使用 B 习题检测 2、质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插人的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是（ ） A. 质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点 B. ①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b C. 质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个 D. 将外源基因与质粒连接时需用 DNA 聚合酶 C 项目 细菌在含氨苄青霉素的 培养基上生长情况 细菌在含四环素的 培养基上生长情况 ① 能生长 不能生长 ② 能生长 能生长 ③ 不能生长 能生长 习题检测 3.下面是四种不同质粒的示意图，其中ori为复制原点，AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因，箭头表示一种限制性内切核酸酶的酶切位点。若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA的细胞，应选用的质粒是（ ） C 习题检测 解析:A图中酶切位点在ori序列上，该序列被破坏，重组质粒将无法进行复制，因此受体细胞既不能在四环素培养基上生长，也不能在氨苄 青霉素培养基上生长。 B图中限制性内切核酸酶没有破坏三个基因，因此含重组DNA的细胞既能在四环素培养基上生长，也能在氨苄青霉素培养基上生长。 C图中酶切位点在氨苄青霉素抗性基因上，氨苄青霉素抗性基因被破坏，则含重组 DNA的细胞能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长。 D图中酶切位点在四环素抗性基因上，由于仅四环素抗性基因被破坏，则含重组 DNA的细胞能在氨苄青霉素培养基上生长而不能在四环素培养基上生长。 实验 DNA 的粗提取与鉴定 1.实验设计思路： DNA、RNA、蛋白质和脂质等在 方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。 物理和化学性质 内容4 实验 · DNA 的粗提取与鉴定 不溶于 2 mol/L 二苯 胺 2.基本原理： 0 0.14 NaCI浓度（mol/L） DNA溶解度 实验 DNA 的粗提取与鉴定 内容4 实验 · DNA 的粗提取与鉴定 3. 材料用具 （1）选材： DNA含量 的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。 问：能否选用牛、羊、马、猪等哺乳动物成熟的红细胞做实验材料？ 不能， 哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和线粒体，几乎不含DNA 问：能否选用鸡血细胞做实验材料？ 能，鸡是鸟类动物 相对较高 内容4 实验 · DNA 的粗提取与鉴定 二苯胺试剂要现配现用用棕色瓶保存 （2）试剂： ①研磨液 ②体积分数为95%的酒精 ③2mol/L 的NaCl溶液 ④二苯胺试剂 含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl 析出DNA 溶解DNA 鉴定DNA 课本P117——附录2 研磨液成分 作用 Tris-HCl缓冲液 稳定DNA EDTA 抑制DNA酶 SDS 使蛋白质变性 · 溶/瓦解细胞膜 · 使蛋白质变性与DNA分离 内容4 实验 · DNA 的粗提取与鉴定 3. 材料用具 家用洗洁精含有SDS；洗衣粉含有蛋白酶和表面活性剂，可裂解细胞膜、使蛋白质变性。 4. 实验步骤 取材、研磨 过滤或离心取上清液 预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA NaCl溶液溶解DNA并鉴定 内容4 实验 · DNA 的粗提取与鉴定 （1）取材、研磨（破碎细胞） 称取30g洋葱， ，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分 。 ①研磨的目的： 破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中。 ②利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法： 切碎 研磨 动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破(省去研磨步骤) 4. 实验步骤 内容4 实验 · DNA 的粗提取与鉴定 ②上清液中除了DNA之外，可能含有那些杂质？ （2）过滤或离心取上清液 →去除滤液中的杂质 方案一 在漏斗中垫上 ，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取 。 低温抑制DNA水解酶的活性，进而抑制DNA降解 ①用纱布过滤的方法中，低温放置几分钟的作用？ 可能含有核蛋白、多糖、脂质等杂质 ③ 过滤能否用滤纸代替纱布？ 不可以。 因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。 纱布 上清液 4. 实验步骤 内容4 实验 · DNA 的粗提取与鉴定 方案二 也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下 ，再取上清液放入烧杯中。 →去除滤液中的杂质 离心5min 4. 实验步骤 内容4 实验 · DNA 的粗提取与鉴定 （2）过滤或离心取上清液 ①搅拌时应轻缓、并沿一个方向： （3）预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA（粗提取） 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子 ②预冷的酒精具有以下优点： ①可抑制DNA水解酶的活性，进而抑制DNA降解 ②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出 ③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂 方案一 在上清液中加入体积 的、预冷的 (体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的 物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向 ，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。 【思考】此步骤的目的是： 使蛋白质等溶解在酒精中，DNA 不溶于酒精而析出。 相等 酒精溶液 白色丝状 搅拌 4. 实验步骤 内容4 实验 · DNA 的粗提取与鉴定 方案一 在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。 方案二 或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min， 上清液，将管底的 晾干。 弃 沉淀物（粗提取的DNA） 4. 实验步骤 内容4 实验 · DNA 的粗提取与鉴定 （3）预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA（粗提取） (4) NaCl溶液溶解DNA并鉴定 实验组 水浴加热5min，冷却后 对照组 取两支20mL的试管，各加入 5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的 试剂。 混合均匀后，将试管置于 中加热5min，待试管 后，比较两支试管中溶液颜色的变化 蓝色 2mol/L的NaCl溶液 沸水 二苯胺 4. 实验步骤 内容4 实验 · DNA 的粗提取与鉴定 如何评价结果？ （1）DNA纯度：看提取物颜色。 （2）DNA的量：看与二苯胺反应颜色的深浅。 冷却 5.结果分析与评价 二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功； 如果不呈现蓝色，可能的原因： ①实验材料的选取失误。 ②材料中的核DNA没有充分释放，如研磨不充分或收集的滤液的量过少。③加入酒精后摇动或搅拌过猛，DNA被破坏 本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质 （1）你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？ （2）你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？ 观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多 内容4 实验 · DNA 的粗提取与鉴定 【注意事项】 ①以血液为实验材料时，每100mL血液中需要加入3g柠檬酸钠， 。 ②利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨 破。 ③加入研磨液后，必须充分研磨，否则细胞核不会充分破碎，释放出的DNA量 就会减少。 ④加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧 ，导致 DNA分子不能形成絮状沉淀。 防止血液凝固 DNA分子的断裂 内容4 实验 · DNA 的粗提取与鉴定 ◎ 内容4 实验 · DNA 的粗提取与鉴定 1.下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是(　　) A.新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于DNA的粗提取 B.植物材料需先研磨破碎细胞 C.DNA只能溶于2 mol/L的NaCl溶液 D.溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂后颜色呈紫色 B 习题检测 2.某研究所的研究人员拟将生长激素基因通过质粒介导进入大肠杆菌的细胞内，已知质粒中存在两个抗性基因：A是抗链霉素基因，B是抗氨苄青霉素基因，目的基因要插入基因B中，且大肠杆菌本身不带有任何抗性基因。下列叙述正确的是( ) A.导入大肠杆菌的质粒一定为重组质粒 B.抗生素抗性基因是目的基因表达的必要条件 C.成功导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基上生长 D.能在含链霉素的培养基中生长的大肠杆菌不一定符合生产要求 D 习题检测 3.(2023·江苏苏州高三期末)下列以洋葱为实验材料进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（ ） A.洋葱研磨液需要用滤纸过滤，以保证提取的DNA量 B.滤液中加入冷酒精后，用玻璃棒搅拌会使DNA的提取量增加 C.向含DNA的滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液有利于去除杂质 D.用二苯胺试剂鉴定DNA时，需沸水浴加热冷却后再观察颜色变化 D 习题检测 4.下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图。下列相关叙述不正确的是（ ） A.选用植物细胞提取DNA时需先 研磨破碎细胞 B.图2所示实验操作中有一处明显 错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显 C.图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶于酒精 D.图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺试 剂出现蓝色 D 习题检测 5.(2019·江苏)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是（ ） A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近 B.DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂 C.预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNA D.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热 A 习题检测 D 6.(2023·江苏盐城调研)图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是(　　) A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因 C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接 D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长 习题检测 7.(2021·全国乙卷，38)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。 回答下列问题： (1)常用的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中________ 酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中 酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。 EcoR Ⅰ、 Pst Ⅰ EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ 习题检测 (2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是________ ______。 (3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能 ；质粒DNA分子上有________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是_____________________________________________________________________。 (4)表达载体含有启动子，启动子是指_____________________________________ ____________。 磷酸二 酯键 自我复制 限制酶切割位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 RNA聚合酶识别、结合和驱动转录的一 段DNA序列 习题检测 限制酶 DNA连接酶 载体 ①对受体细胞无害； ②有一个至多个限制酶切割位点； ③有特殊的标记基因； ④能自我复制或能整合到受体细胞DNA上。 质粒、 噬菌体、动植物病毒 基因工程的基本工具 作为载体的条件 种类: 磷酸二酯键 来源： 主要来源于原核生物 特点： 作用部位： 具有专一性 结果： 形成黏性末端或平末端 连接部位：磷酸二酯键 种类： E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶 作用： 把两条双链DNA片段拼接起来 课堂总结 【概念检测】 1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ） A. 能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B. 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C. 能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D. 只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端 2. 在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ） A. 大肠杆菌的质粒 B. 切割DNA分子的酶 C. DNA片段的黏性末端 D. 用来识别特定基因的DNA探针 A C 练习与应用 【扩展应用】 1. 想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ 是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。 练习与应用 【扩展应用】 有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶切speⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ, XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 (1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶speⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？ XbaⅠ。 因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。 (2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？ 识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。 例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。 练习与应用 Lavf58.45.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Lavf55.48.100 Lavf55.48.100 Lavf58.20.100 Lavf58.20.100 Lavf58.20.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.3.79 $