3.1重组DNA技术的基本工具 课件 2025—2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

情境导入 传统癌症免疫疗法的核心难题在于，癌细胞由人体自身细胞变异而来，表面抗原与正常细胞相似，导致免疫系统难以识别和攻击。如何为癌细胞贴上“危险分子”的专属标签，成为科学家们探索的方向。 中国研究团队另辟蹊径，从跨物种免疫排斥现象中获得灵感。猪的器官移植到人体时，会因携带α-gal抗原引发强烈免疫排斥。这种抗原在人类和其他灵长类动物中天然缺失，却能触发人体免疫排斥反应，迅速标记并清除携带该抗原的细胞。 思考1：为什么医生认为“人体对猪器官的排斥”可能是对抗癌症的新武器？ 思考2：如何让人类的癌细胞长出“猪标签”？ 情境导入 获取 获取α-gal抗原基因 患者癌细胞 导入 α-gal抗原基因在癌细胞中表达 将癌细胞表面“涂装”成“猪细胞”，引发免疫反应 第3章 人教版 选择性必修3 基因工程 3 基因工程 指按照人们的愿望，通过 等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的 和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA 上进行设计和施工的，因此又叫作 。 转基因 新的生物类型 分子水平 别名 重组DNA技术、转基因技术 操作环境 操作对象 操作水平 结果 原理 优点 主要在生物体外 基因（DNA） DNA分子水平 创造出符合人们需要的新的生物类型和生物产品 基因重组 克服远缘杂交不亲和障碍，定向改造生物的遗传特性； 重组DNA技术 基因工程 【问题探究1】为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？ ①DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸） ②都遵循碱基互补配对原则 ③DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构 【问题探究2】为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？ ①基因是控制生物性状的结构与功能单位 ②遗传信息的传递都遵循中心法则 ③生物界共用一套遗传密码。 （相同的遗传信息在不同的生物体内表达出相同的蛋白质）。 情境导入 思考3：如果科学家手中有一份猪的基因，需要哪些工具才能将α-gal抗原基因整合到人类癌细胞的DNA上并表达？ 准确切割DNA分子 剪 将DNA片段连接起来 接 将体外重组好的DNA分子导入受体细胞 运 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 简称：限制酶 背景：限制酶就是细菌的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。 1.来源： 主要从原核生物中分离纯化出来 2.种类： 数千种 限制酶不是一种酶，而是一类酶 3.作用： 识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的 断开。 磷酸二酯键 限制酶只能识别并切开双链DNA分子，不能识别RNA。 *确切来说应该是催化磷酸二酯键断开 *该过程“特定”体现了酶的专一性 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 4.识别序列： 大多数限制酶的识别序列由___个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由___个、___个或 的核苷酸组成。 6 4 8 其他数量 限制酶所识别的序列有什么特点？ 思考 ①都可以找到一条中心轴线（如图虚线）。 ②中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。 ③正向读与另一条链反向读的碱基顺序完全一致。 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 5.切割结果： C C C G G G G G G C C C Sma Ⅰ限制酶的切割： 只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。 C C C G G G G G G C C C G G G C C C C C C G G G 当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。 从5’→3’方向的识别序列均为CCCGGG，并切断C和G之间的磷酸二酯键 产生平末端 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 5.切割结果： EcoR Ⅰ限制酶的切割： 专一识别GAATTC的序列，并使G和A之间切开。 A A G T T C C T T A A G G C T T A A A A T T C G A A G T T C C T T A A G A A T T C G G C T T A A 从5’→3’方向的识别序列均为GAATTC，并切断G和A之间的磷酸二酯键 黏性末端 黏性末端 注意：限制酶切割磷酸二酯键后氢键会自动断裂！ 产生黏性末端：AATT 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 5.切割结果： *一个限制酶切割一次形成_______个黏性末端 *同一种限制酶切割形成的黏性末端_________ *两个黏性末端有__________个游离的磷酸基团。 两 相同 2 EcoR Ⅰ 产生黏性末端：AATT BamH Ⅰ________ EcoR Ⅰ________ Hind Ⅲ________ Bgl Ⅱ ________ GATC- AATT- AGCT- GATC- 思考：你从中发现什么现象了？ 不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端 例1.写出下列限制酶切割形成的黏性末端 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 同尾酶：识别的靶序列不同，但是酶切后形成的黏性末端相同 例3.限制酶切割一次可断开____个磷酸二酯键;产生____个游离的磷酸基团;产生____个黏性末端;消耗____分子水。 例2.以下黏性末端是由 种限制酶作用产生的 3 思考：你从中发现了什么现象？ 相同的黏性末端也可能是由不同限制酶作用形成的 2 2 2 2 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 例4：下图甲是一个DNA片段，箭头处代表不同限制酶的切点，据图回答： (1)用Eco RⅠ酶切，能得到 种DNA片段； (2)用PstⅠ完全酶切，能得到 种DNA片段； 2 3 例5：想一想，为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？（P74拓展应用1） 含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰 5 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 活动一：用剪刀模拟EcoR Ⅰ剪切目的基因（猪α-gal抗原基因） （1）用铅笔标出EcoR Ⅰ识别的核苷酸序列和切割位点； （2）用剪刀模拟EcoR Ⅰ“切割”目的基因（猪α-gal抗原基因） 要想获得某个特定基因必须要用限制酶切_____个切口;可产生______个黏性末端。 2 4 问题探讨 【资料1】细胞内存在多种核酸酶，这些酶可以识别切割外源DNA片段。 【资料2】当外源基因没有整合到受体细胞基因组中，其不能自主复制，随着受体细胞分裂，外源基因逐渐被稀释并最终丢失。 思考：现在已得到了猪的α-gal抗原基因，能否将其直接导入人的癌细胞中使其表达？ 不能； 游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。 二、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 1.作用 将 送入 ，在受体细胞内对目的基因进行 。 外源基因 受体细胞 大量复制 2.种类： 质粒、噬菌体和动植物病毒等。 将外源基因导入大肠杆菌 等受体细胞 将外源基因导入植物细胞 将外源基因导入动物细胞 来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别 二、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 3.最常用的载体——质粒 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有 能力的 。 自我复制 环状双链DNA分子 二、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 4.载体需具备的条件 便于插入目的基因 (便于鉴定和筛选含有重组DNA分子的细胞) ③对受体细胞无害， 不会影响受体细胞正常的生命活动 （自我复制或者整合到受体DNA同步复制） ②能够在宿主细胞中复制并稳定地保存 ④有特殊的标记基因 ①有一个至多个限制酶切割位点 标记基因的筛选原理 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。 二、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 标记基因通常有: ①抗生素的抗性基因，如: 抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr) ②荧光蛋白基因，如: 绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP) 标记基因的筛选原理 二、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 想一想：如何将目的基因与载体连接起来？ 用相同的限制酶切割目的基因和运载体，获得相同的末端 用DNA连接酶连接目的基因和运载体，形成重组质粒。 …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… …TCCTAG …AGGATCTTAA GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG AATTCCATAC… GGTATG… GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 三、DNA连接酶——“分子缝合针” 三、DNA连接酶——“分子缝合针” 1.作用： 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_____________。 磷酸二酯键 2.种类 大肠杆菌 T4噬菌体 黏性末端 黏性末端 平末端 磷酸二酯键 三、DNA连接酶——“分子缝合针” A G T C A T T C G A T A (1)把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来； (2)两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来。 黏性末端的缝合作用 T C G A T C 注意： DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能将单个脱氧核苷酸连接到DNA链上！ 三、DNA连接酶——“分子缝合针” 平末端的缝合作用 C C C G G G G G G C C C 把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低。 （2）T4 DNA连接酶连接平末端的效率和连接黏性末端的效率相同。 判断以下说法是否正确： 因为黏性末端的碱基是互补的，在连接时，黏性末端可以通过碱基互补配对，加快DNA连接酶的连接速度，而平末端则不能。 （1）两个DNA片段的黏性末端必须互补才能通过DNA连接酶 连接起来。 （3）DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事。 三、DNA连接酶——“分子缝合针” 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子或DNA的一条链 形成DNA的一条链 基因工程、DNA复制 DNA复制 只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 　【归纳拓展】与DNA有关的几种酶的比较 磷酸二酯键 DNA分子片段 脱氧核苷酸 碱基对中的氢键 磷酸二酯键 活动二：先用铅笔标出EcoR Ⅰ识别的核苷酸序列和切割位点，然后用剪刀模拟“切割”载体。 活动三：用透明胶模拟DNA连接酶连接载体和目的基因，形成重组DNA分子。 为什么会有两种拼接方式？ 活动三：用透明胶模拟DNA连接酶连接载体和目的基因，形成重组DNA分子。 (1)观察你得到的目的基因片段的末端，你有什么发现？ (2)还发现了其他的问题吗？ 用同一种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段。 a b c d a、b、c、d 四个黏性末端相同。 限制酶切割 启动子方向 目的基因转录方向 DNA连接酶连接 缺点1 质粒自身环化 缺点3 反向连接重组DNA 缺点2 目的基因自身环化 用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段 限制酶a切割 限制酶b切割 限制酶a切割 限制酶b切割 DNA连接酶连接 a b c d 黏性末端a与c相同；黏性末端b与d相同。 双酶切 限制酶a切割 限制酶b切割 限制酶a切割 限制酶b切割 DNA连接酶连接 a b c d 质粒不会重新环化 目的基因不会被环化 优点1 优点2 优点3 目的基因与质粒 不会发生反向连接 确保目的基因与运载体定向连接，减少重组杂物。 限制酶 DNA连接酶 载体 ①对受体细胞无害； ②有一个至多个限制酶切割位点； ③有特殊的标记基因； ④能自我复制或能整合到宿主DNA上。 质粒、 噬菌体 、动植物病毒 基因工程的基本工具 作为载体的条件 种类: 磷酸二酯键 来源： 主要来源于原核生物 特点： 作用部位： 具有专一性 结果： 形成黏性末端或平末端 连接部位：磷酸二酯键 种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶 作用：把两条双链DNA片段拼接起来 课堂小结 1.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶切speⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、 XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 (1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶speⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？ XbaⅠ。 因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。 随堂演练 2.下列操作中最好选用什么限制酶切割来构建重组质粒？ 图1 图2 BamH I 和 Hind III ① 防止目的基因、质粒自身环化 不能单用E.coRI的原因 ② 防止目的基因反向连接到载体 （1）所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因。 （2）选目的基因两端和运载体都有的酶切位点。 选择酶切位点的原则： （双酶切法优于单酶切法） 随堂演练 3.(2021·全国乙卷，38)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。 回答下列问题： (1)常用的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中________ 酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中 酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。 EcoR Ⅰ、 Pst Ⅰ EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ 随堂演练 (2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是________ ______。 (3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能 ；质粒DNA分子上有________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是_____________________________________________________________________。 (4)表达载体含有启动子，启动子是指_____________________________________ ____________。 磷酸二 酯键 自我复制 限制酶切割位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 RNA聚合酶识别、结合和驱动转录的一 段DNA序列 随堂演练 4.下面是四种不同质粒的示意图，其中ori为复制原点，Amp为氨苄青霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因，箭头表示一种限制性内切核酸酶的酶切位点。若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA的细胞，应选用的质粒是（ ） C 随堂演练 基因工程在DNA分子水平上进行，如何提取并鉴定DNA呢？ 裂解细胞使核酸分子释放出来 从释放出来的细胞成分中分离DNA 纯化获得DNA 四、DNA的粗提取与鉴定 1.实验原理 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 鉴定DNA DNA不溶于酒精， 但某些蛋白质溶于酒精 DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同能溶于物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液 在一定温度下， DNA被二苯胺试剂染成蓝色 初步分离 DNA和蛋白质 溶解DNA 2.目的要求 (1)了解DNA的物理和化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。 (2)学会DNA粗提取的方法以及用二苯胺试剂对DNA进行鉴定。 3.材料用具 DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。 【注意】不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。 四、DNA的粗提取与鉴定 3.材料用具 ①研磨液 ②体积分数为95%的酒精 ③2mol/L 的NaCl溶液 ④二苯胺试剂 ⑤蒸馏水 溶解并提取DNA 析出DNA 溶解DNA 鉴定DNA，要现配现用 4.方法步骤 破碎细胞 过滤 析出DNA 鉴定DNA 称取洋葱，切碎，放入研钵，倒入研磨液，充分研磨。 (1)如果研磨不充分会对实验结果产生怎样的影响？ DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而使研磨液中的DNA含量较低，影响最终提取的DNA量。 四、DNA的粗提取与鉴定 破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中 破碎细胞 过滤 析出DNA 鉴定DNA (2)过滤能否用滤纸代替纱布？ 不可以。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。 在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取上清液；或将研磨液倒入塑料离心管中离心取上清液。 (3)此步骤获得的上清液中可能含有哪些细胞成分？ 可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。 4.方法步骤 四、DNA的粗提取与鉴定 破碎细胞 过滤 析出DNA 鉴定DNA (4)酒精预冷的作用？ ①抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； ②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出； ③低温有利于增加 DNA分子的柔韧性，减少断裂。 (5)为什么要用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌？ 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。 在上清液中加入体积相等的预冷的酒精溶液, 静置2~3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。 4.方法步骤 四、DNA的粗提取与鉴定 实验组 对照组 水浴加热 破碎细胞 过滤 析出DNA 鉴定DNA (6)如何评价结果？ DNA纯度： 看提取物颜色 DNA的量： 看与二苯胺反应颜色 的深浅 四、DNA的粗提取与鉴定 4.方法步骤 取两支试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。 四、DNA的粗提取与鉴定 5.结果分析与评价 鉴定结果 【思考】若实验组颜色不变蓝，可能原因是？ ①实验材料的选取失误 ②材料中的核DNA没有充分释放，如研磨不充分或收集的滤液的量过少 ③加入酒精后摇动或搅拌过猛，DNA被破坏 【注意事项】 ①以血液为实验材料时，每100mL血液中需要加入3g柠檬酸钠， 。 ②利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。 ③加入研磨液后，必须充分研磨，否则细胞核不会充分破碎，释放出的DNA量就会减少。 ④加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧 ，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。 ⑤预冷的酒精具有以下优点： a.可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制 ； b.抑制分子运动，使DNA易形成 ； c.低温有利于 。 防止血液凝固 DNA分子的断裂 DNA降解 沉淀析出 增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂 四、DNA的粗提取与鉴定 1.(2023·广东高考)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　　) A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 D 随堂演练 2.(2024·安徽高考)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（     ） A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C.DNA在不同浓度NaCI溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 D 随堂演练 A A T T C G G A T C···α基因···G G C C T A G···α基因···C T T A A 5‘···G 3‘···C T T A A 5‘ A A T T C T···3’ G A···5’ Lavf56.40.101 Tencent APD MTS $