2027届高三生物一轮复习课件第3讲基因工程，第2部分：基因工程的基本工具和操作步骤

该高中生物学高考复习课件聚焦“基因工程及生物技术的安全性与伦理问题”专题，依据高考评价体系梳理了DNA重组技术工具、基因工程操作程序等核心考点，通过真题分析明确限制酶选择、PCR技术等高频考点权重，归纳酶切位点判断、表达载体构建等常考题型，体现备考针对性。 课件亮点在于“真题解析+技巧提炼+素养培育”，如以限制酶选择原则、PCR引物设计为例，培养科学思维和探究实践素养，通过例3中DNA连接酶类型判断等典型题解析，帮助学生掌握答题逻辑，教师可据此精准突破考点，助力学生高效冲刺高考。

第十单元　生物技术与工程 第4讲　基因工程及生物技术的安全性与伦理问题 一、DNA重组技术的基本工具 1、限制性内切核酸酶（限制酶） ①来源： ②作用： ③作用后的结果： 主要从原核生物中分离纯化 识别、剪切 粘性末端、平末端 同时产生4个黏性末端， 限制酶作为防御性工具可切断外源DNA保护自身，为什么限制酶不会切断生物自身细胞里的DNA？ 自身DNA中无其识别的特定序列； 自身的特定序列已被甲基化修饰。 能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列（大多6个或4碱基）；使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 断开。 2 限制酶的选择 (1)选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 (2)选择的切点不能破坏目的基因，如图甲不能选择SmaⅠ。 (3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，可用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ (但要确保质粒上也有这两种酶的切点)，与图乙所示质粒连接。 (4)目的基因应插入质粒的启动子和终止子之间。 2、DNA连接酶 ①作用： ②种类： 连接两个DNA片段，在两个核苷酸之间形成“磷酸二酯键” E.Coli DNA连接酶（只能连接黏性末端）； T4DNA连接酶（既能连接黏性末端，又能连接平末端） DNA连接酶 DNA聚合酶 作用实质 都是催化两个脱氧核苷酸之间形成 。 是否需要模板 作用对象 作用结果 连接两个DNA片段 形成DNA子链 不需要 需要 DNA片段（在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键） 单个脱氧核苷酸（将单个核苷酸连接到已存在的核酸片段的3′端的羟基上） 磷酸二酯键 ③DNA连接酶与DNA聚合酶的比较 ④与DNA有关酶的比较 4 3、基因进入受体细胞的载体 ①作用： ②种类： 将目的基因导入受体细胞，使其在受体细胞中稳定遗传和表达 质粒、病毒（动植物病毒、噬菌体的衍生物） 最常用的载体： 质粒——裸露的、结构简单的、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。天然质粒要进行人工改造后才能用于基因工程操作。 ③特点 例1．在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，不正确的是(　　) A．该载体最可能为环形DNA分子 B．两种限制酶在载体上各有一个酶切位点 C．限制酶R1与R2的切割位点最短相距200bp D．限制酶作用于该载体会导致氢键和肽键断裂 D D　[当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正确；当仅用一种限制酶切割载体时，两种限制酶切割产生的DNA片段等长，而两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；由图可知，两种限制酶同时切割时则产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点至少相距200 bp，C正确；限制酶切割DNA分子，破坏的是作用位点上两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，D错误。] 6 例2．如图为农杆菌Ti质粒的T­DNA区段结构示意图。农杆菌附着植物细胞后，T­DNA首先在农杆菌中从右边界到左边界被剪切、复制，然后进入植物细胞并整合到染色体上，继而诱发细胞异常生长和分裂，形成植物肿瘤。以下有关叙述不正确的是(　　) A．Ti质粒存在于农杆菌的拟核DNA之外 B．植物肿瘤的形成与A、B两个基因的表达有关 C．清除植物肿瘤组织中的农杆菌后肿瘤不再生长 D．利用T­DNA进行转基因时需保留LB、RB序列 C C　[质粒是独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，存在于细胞质中，具有自我复制能力的环状双链DNA分子，Ti质粒存在于农杆菌的拟核DNA之外，A正确；因为质粒整合到植物染色体上以后能诱发细胞异常生长和分裂，形成植物肿瘤，所以可推测植物肿瘤的形成与质粒上的细胞分裂素和生长素基因过量表达有关，B正确；清除植物肿瘤组织中的农杆菌后，还有整合到植物DNA上的T­DNA，通过基因的复制表达也会导致肿瘤继续生长，C错误；农杆菌的T­DNA能整合到染色体上的前提是Ti质粒上的LB、RB序列被剪切，才能连接整合到植物细胞DNA上，D正确。] 7 例3．用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。 (1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中______酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中________ _酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。 (2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是______。 EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ　 EcoRⅠ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ　 磷酸二酯键 [解析]　(1)由题图可以看出，EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端，E.coli DNA连接酶可用于连接黏性末端，T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。(2)DNA连接酶催化DNA链的5′端与另一DNA链的3′端生成磷酸二酯键。(3)复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒在宿主细胞中进行复制。质粒上有限制酶切割位点，该位点可被限制酶切开并使外源目的基因插入其中。在含有特定抗生素的培养基上进行选择性培养可以将含质粒载体的细胞筛选出来。(4)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。 8 例3、用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。 (3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能__________；质粒DNA分子上有________， 便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是_____ ___。 (4)表达载体含有启动子，启动子是指__ _____。 复制 限制酶切割位点　 选择性培养　 RNA聚合酶识别和结合的部位 [解析]　(1)由题图可以看出，EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端，E.coli DNA连接酶可用于连接黏性末端，T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。(2)DNA连接酶催化DNA链的5′端与另一DNA链的3′端生成磷酸二酯键。(3)复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒在宿主细胞中进行复制。质粒上有限制酶切割位点，该位点可被限制酶切开并使外源目的基因插入其中。在含有特定抗生素的培养基上进行选择性培养可以将含质粒载体的细胞筛选出来。(4)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。 9 2.基因表达载体的构建 1.目的基因的筛选与获取 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的 检测与鉴定 Bt基因 Ti质粒 重组DNA分子 将目的基因插入染色体DNA中 二、基因工程的基本操作程序 目的基因：用于改变受体细胞性状或者获得预期表达产物的基因 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。 ①构建基因文库获取目的基因；②利用PCR获取和扩增目的基因；③人工合成。 Bt基因—从苏云金芽孢杆菌中提取的抗虫蛋白基因 分子水平的检测（利用PCR技术检测染色体的DNA上是否插入了目的基因，受体细胞是否转录出了mRNA，利用抗原抗体杂交技术检测目的基因是否翻译出了相应的蛋白质） 个体水平的鉴定（是否具有抗虫特性） 10 （一）获取目的基因 ①从基因文库获取目的基因；②人工合成目的基因；③利用PCR获取和扩增目的基因 1、PCR（聚合酶链式反应）的原理、场所、条件（模板、原料、酶、引物）？ 6、至少经过几轮循环才能得到两条链相等的DNA片段？ 2、什么是引物？PCR扩增目的基因时需要几种引物？ 3、引物会结合在DNA的母链的那一端？ 5’ 3’ 3’ 5’ 目的基因 3’ 3 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基互补配对的短单链核酸（20-30个核苷酸） 4、具体过程分为哪3步？ 5、PCR反应时，将温度上升到90℃后再降温至50℃，其目的是什么？ 使基因双链解旋为单链后，便于引物与模板链通过碱基互补配对原则结合 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。 11 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 目的基因 条件：DNA模板、4种脱氧核苷酸、引物 和TaqDNA聚合酶(在缓冲溶液中，控制温度等) 过程：变性→复性→延伸... PCR反应过程演示 第1轮 第2轮 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 5’ 3’ 引物1 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 第2轮 第3轮 设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图)，请分别说明理由。 第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效　 第2组：引物Ⅰ自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。 (二)基因表达载体的构建（基因工程的核心） ①构建基因表达载体的目的是什么？ ②基因表达载体的组成包括哪些？ 使目的基因在受体细胞中稳定存在，使目的基因能够表达并发挥作用 抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等 ③目的基因的插入位点是随意的吗？ ④基因工程中通过标记基因筛选出的细胞一定含有重组质粒吗？ 目的基因应插入启动子与终止子之间 ⑤结合甲、乙两图分析，为了使目的基因与载体连接，应用哪种限制酶进行切割，为什么？能用限制酶SmaⅠ吗？ 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 位置 化学本质 作用 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因的转录 终止基因 的转录　 蛋白质合成开始的信号　 终止蛋白质合成(终点)　　　 “启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”的区别 基因的上游 基因的下游 mRNA上 mRNA上 DNA序列 DNA序列 RNA序列 RNA序列 16 （三）将目的基因导入受体细胞 例、下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图，以下相关叙述，正确的是 (　　) A．②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与 B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上 C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就一定表现出抗虫性状 D．⑤若表现出抗虫性，则该植株发生的变异是可遗传的 D 【解析】②重组质粒的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与，A错误；③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T－DNA整合到④的染色体上，B错误；受体细胞的染色体上含抗虫基因，说明目的基因已经成功导入，但这不代表该基因就一定成功表达，因此不能确定⑤是否表现出抗虫性状，C错误；⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异，D正确。 18 （四）目的基因的检测与鉴定 例1．基因工程是一种 DNA 操作技术，其表达载体的构建和检测筛选是两个重要步骤。下图1为某种质粒简图，箭头所指分别为限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点。已知目的基因X的两端分别有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在内的多种酶的酶切位点。图2表示运用影印培养法(指在一系列平板培养基的相同位置上接种并培养出相同菌落的一种微生物培养方法)检测表达载体是否导入大肠杆菌。下列有关叙述错误的是(　　) A．同时使用EcoRⅠ和BamHⅠ切割质粒，可避免酶切后质粒的自身环化 B．转化方法是将质粒表达载体溶于缓冲液后与经Ca2＋处理的大肠杆菌混合 C．培养基 A 和培养基 B分别含有青霉素和四环素 D．从筛选结果分析，含目的基因X的菌落是1、2、3、5 D D　[为避免酶切后质粒的自身环化，可同时使用EcoRⅠ和BamHⅠ切割质粒，A正确；转化方法是将质粒表达载体溶于缓冲液后与经Ca2＋处理的大肠杆菌混合，B正确；用EcoRⅠ和BamHⅠ两种限制酶对质粒进行切割时，会破坏四环素抗性基因，但不会破坏青霉素抗性基因，因此导入重组质粒的大肠杆菌能在含有青霉素的培养基上生存，但不能在含有四环素培养基上生存，所以培养基A和培养基B分别含有青霉素、四环素，含目的基因X的菌落是4和6，C正确，D错误。] 20 例2、下图为某种质粒表达载体的简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tetR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在内的多种酶的酶切位点。 （1）将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有______________________、__________________、_________________________三种 目的基因—载体连接物 载体—载体连接物 目的基因—目的基因连接物 （2）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是_________________。 EcoRⅠ和BamHⅠ 21 例3．(广东选择性考试)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线(下图)，可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料)，以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高生产率。 (1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有______ ________________(答出两种即可)。 (2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有________________(答出两种即可)。 (3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备_________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有___ _______________。 从基因文库中获取、人工合成　 酶解法(使用蛋白酶进行水解)、高温处理　 感受态 抗原—抗体杂交技术　 [解析]　(1)获得目的基因的方法除PCR技术外，还有从基因文库中获取、人工合成等方法。 (2)蛋白酶可分解蛋白质，但不会分解DNA；蛋白质在高温条件下会变性失活，而DNA虽然在高温时会变性，但在低温时又会复性，因此在制备高质量的DNA模板时，去除蛋白可采用酶解法或高温处理。 (3)将大肠杆菌作为基因工程的受体细胞时，首先应用Ca2＋处理，使其成为能吸收外界DNA的感受态细胞。检测目的基因是否成功表达出酶蛋白可采用抗原—抗体杂交技术 22 (4)依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是______________。 在分子水平上，可以通过改变_ _______________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。 例3．(广东选择性考试)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线(下图)，可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料)，以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高生产率。 可溶性淀粉的分解效率降低　 酶相应基因的碱基序列 (4)酶的作用条件有适宜的温度、pH等，温度过低，酶的活性会降低，温度过高、强酸或强碱的情况下，酶的活性会降低甚至失活，依据题图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系，这4种酶的最适反应条件不同，会导致可溶性淀粉的分解效率降低。可通过蛋白质工程实现对酶特性的改造和优化，在分子水平上，改变酶相应基因的碱基序列，从而改变酶蛋白的结构，最终实现优化酶特性的目的。 23 例4．某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1­GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。 (1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是__________。使用这两种酶进行酶切是为了保证______________，也是为了保证____________________。 (2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。 E1和E4　 甲的完整　 甲与载体正确连接　 转录 翻译　 例4．某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1­GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。 (3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的____________移入牛的____ ________中、体外培养、胚胎移植等。 (4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定。在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的____________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。 细胞核 去核卵母细胞　 核DNA 25 $