大题05 现代生物技术的原理、操作流程和应用（2大热点角度剖析）（广东专用）2026年高考生物终极冲刺讲练测

**基本信息** 以“命题趋势-解题建模-实战刷题”为框架，通过流程推演模型、层级逻辑拆解和信息转译方法，系统构建现代生物技术原理与应用的解题体系，融合生命观念与科学思维。 **专项设计** |模块|题量/典例|方法提炼|知识逻辑| |----|-----------|----------|----------| |命题解码|3年真题+趋势分析|命题热点定位（过程推演/信息转译）|生物技术操作流程→多尺度应用关联| |解题建模|2典例+技法表格|流程链推导、图表信息转译、实验设计逻辑|基因工程-微生物工程原理→操作规范→结果分析| |实战刷题|6模拟+5真题|类题变式迁移、综合应用建模|核心技术（载体构建/代谢调控）→实际问题解决|

专题05 现代生物技术的原理、操作流程和应用 内容导航 【命题解码·定方向】命题趋势+3年高考真题热点角度拆解 【解题建模·通技法】析典例，建模型，技法贯通破类题/变式 【实战刷题·冲高分】精选高考大题+名校模拟题，强化实战能力，得高分 命题·趋势·定位 1.重过程推演：从“识工具”转向基因工程四步流程的时序推导、单克隆抗体制备的链式逻辑、发酵条件的动态优化机制推导。 2.重层级差异：基因水平操作+细胞水平培养/个体水平筛选/群体水平发酵叠加，强化微观操作与宏观产出间的尺度转化考查。 3.重信息转译：以质粒图谱与限制酶切位点、PCR扩增曲线、细胞融合筛选示意图、发酵参数变化表为核心载体。 4.重综合关联：与疾病诊疗、作物育种、环境修复、生物制药、伦理安全深度融合，突出科技向善与社会责任。 热点·角度·拆解 热点角度01 基因工程的操作流程与表达载体构建及筛选应用 2023年广东卷22（1）（3）：农杆菌转化法将野生型DAI基因导入突变体，构建表达载体时需启动子和终止子；利用限制酶X切割PCR产物进行突变检测核酸电泳图谱绘制； 2024年广东卷23（2）（3）（4）（5）：构建蓝光调控的基因表达载体，分析启动子PT7、PBAD的选择与光控机制；大观霉素抗性基因用于筛选并防止杂菌污染；蓝光照射区域因酪氨酸酶表达催化黑色素生成而染黑；提出替换色素合成酶的思路实现不同颜色图案。 热点角度02 微生物工程与代谢调控及合成生物学应用 2022年广东卷18（1）（2）（3）（4）：深海冷泉拟杆菌的分离纯化（高压蒸汽灭菌、平板划线）、碳源利用分析（纤维素最佳）；推测微生物难分离原因（依赖特定环境因子）；分析拟杆菌作为分解者在深海碳循环中的作用；推断低温环境下多糖降解酶的特性（耐低温）； 2025年广东卷22（3）（4）：基于莽草酸合成途径，设计敲除酶B基因并导入两个调控质粒的重组菌株构建思路，实现快速生长期保证正常生长、稳定期大量积累莽草酸。 热点角度01 基因工程的操作流程与表达载体构建及筛选应用 析典例·建模型 1.（2026·广东深圳·一模）某些细菌会释放酰基高丝氨酸内酯（AHL），AHL可自由进出细菌，其浓度达到一定阈值后会作用于细菌使其发生代谢变化（图1）。科学家试图利用细菌这一系统开发一种工程菌，来实现特定药物的合成和释放。 回答下列问题： (1)研究人员将构建的质粒①和质粒②导入大肠杆菌前，通常需先用________处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，导入后的菌体最适合用________法接种于选择培养基上，由此构建工程菌。 (2)据图1分析，当工程菌密度升高时，________积累达到阈值，才能与________蛋白结合形成复合物，该复合物与启动子结合，启动下游D基因的表达。 (3)为实现工程菌在肠道病灶部位裂解，研究人员利用基因E构建了质粒③（图2），其编码的蛋白E可诱导大肠杆菌裂解。在相同培养条件下，测定一段时间内含质粒①、③的工程菌和野生型大肠杆菌的种群密度变化（图3），在培养早期该曲线趋于一致，而在培养后期出现明显差异，在整个培养时间中出现这种现象的原因是________。 (4)综合上述研究，研究人员将质粒________导入大肠杆菌构建特定药物合成和释放的工程菌。结合图3分析，该工程菌的药物释放特征是________。 【解题建模】 第一步，思路模板 1.确定过程起点：明确信号分子（AHL）的浓度积累是触发整个基因表达系统的逻辑开关，其本质是将菌群密度转化为化学信号。 2.梳理过程链条： 信号传导链：菌群密度↑ → AHL浓度积累达阈值 → AHL与LuxR蛋白结合 → 复合物激活启动子PLuxI → 启动下游基因（D基因/药物,E基因/裂解）表达。 群体行为链：低密度时系统沉默（避免过早代谢负担）；高密度时系统激活 → 药物合成 → 裂解释放 → 菌群密度下降 → AHL浓度下降 → 系统关闭 → 细菌重新增殖 → 循环。 实验验证链：对比工程菌（含质粒①+③）与野生型生长曲线，前期重合（系统沉默）、后期分叉并波动（系统周期性开关）。 3.标注关键节点： 双质粒协同逻辑：质粒①（LuxR/LuxI调控元件）、质粒②（药物D基因）、质粒③（裂解E基因）各自的角色，以及三者如何被同一个PLuxI启动子统合。 图3曲线特征：工程菌后期密度下降并呈现降-升-降波动，对应“增殖→触发裂解→死亡→幸存者再增殖”的节律。 基因工程操作流程：感受态制备（Ca²⁺）、转化、筛选（稀释涂布平板+抗生素）。 4.链式推导结论： 激活公式：高菌群密度 → AHL达阈值 → AHL-LuxR复合物 → 激活基因表达。 周期释放公式：激活 → 裂解死亡 → 密度降低 → AHL下降 → 系统关闭 → 存活菌再生长 → 再次激活。 工程菌设计方案：感受态细胞 + 质粒①②③共转化 → 稀释涂布抗性平板 → 阳性克隆筛选 → 验证密度依赖型合成与释放 第二步，思路拆解 设问 过程起点 遗传/实验链条 关键节点 推导结论 (1) 大肠杆菌感受态制备与筛选 将质粒导入大肠杆菌这一受体细胞 Ca²⁺处理 → 细胞膜通透性增强 → 吸收外源DNA；转化后菌液 → 涂布于含抗生素的选择培养基 → 通过菌落生长与否/标记基因鉴定 大肠杆菌是微生物，导入方法为标准“感受态转化法”；筛选需菌落分离 Ca²⁺；稀释涂布平板 (2) 触发下游D基因表达的条件 图1信号调控通路：密度→AHL→LuxR→启动子 AHL随密度积累 → 与胞内LuxR结合 → 复合物结合P_LuxI启动子 → 转录 启动子名称P_LuxI；正向调控逻辑 AHL；LuxR (3) 图3培养后期出现明显差异及全周期曲线特征的原因 工程菌（质粒①+③） vs 野生型大肠杆菌 低密度时：AHL未达阈值 → 裂解基因E不表达 → 两者生长曲线重合；高密度时：AHL达阈值 → 裂解基因E表达 → 工程菌自溶 → 曲线下降并波动 核心是“密度依赖性负反馈”：菌多→裂解增多→菌少→裂解减少→恢复增长 在培养早期，菌群密度低，AHL未达阈值，无法激活LuxR，裂解基因E不表达，工程菌与野生型生长趋势一致；培养后期菌群密度升高，AHL积累至阈值，与LuxR结合激活E基因表达，导致细菌裂解死亡，种群密度下降且呈波动 (4) 工程菌构建方案及药物释放特征 综合图1（调控+药物合成）和图2（裂解） 质粒①（调控元件，提供LuxR/LuxI） + 质粒②（药物D基因） + 质粒③（裂解E基因） → 三者共导入 所有功能模块均受同一P_LuxI调控，实现密度同步触发 ①②③；当菌群密度达到阈值时，同步启动药物合成（D基因）和细胞裂解（E基因），释放药物后菌群密度下降，系统关闭；幸存细菌增殖后再次触发，呈现周期性循环合成和释放药物的特征 第三步，尝试作答 (1) Ca2+ 稀释涂布平板 (2) AHL LuxR (3)在低细胞密度时，AHL浓度较低，不足以激活LuxR，因此裂解基因E不表达，细胞生长不受影响；当细胞密度升高，AHL积累到阈值以上，激活LuxR，启动裂解基因E表达，导致细胞死亡 (4) ①②③ 呈现周期性循环合成和释放药物 研考点·通技法 1.将导入目的基因的方法 受体细胞类型 常用方法 关键原理 实例/常考情境 微生物细胞 （如大肠杆菌） Ca²⁺处理法 （感受态细胞法） 用CaCl₂溶液处理，使细胞膜的通透性增加，成为能吸收周围环境中DNA分子的感受态细胞 将重组质粒导入大肠杆菌 （本题第7题(1)小题） 动物细胞 显微注射法 在显微操作仪下，用极细的玻璃毛细管直接将DNA溶液注射到受精卵或胚胎干细胞的核内 将重组质粒导入家蚕受精卵 （本题第8题(2)小题） 转基因超级鼠 植物细胞 农杆菌转化法 （最常用） 利用农杆菌中Ti质粒上的T-DNA（可转移DNA）能整合到植物染色体DNA上的特性，将目的基因插入T-DNA中转入植物细胞 转基因抗虫棉、转基因水稻 破类题·提能力 1．（2026·广东韶关·二模）近年来，利用光合微生物将二氧化碳转化为有机物产品，成为解决能源与环境问题的新兴策略。我国科研团队成功构建了一种能利用CO2高效合成生物可降解塑料——聚乳酸（PLA）的工程蓝细菌（图1）。 (1)研究者构建的PLA的合成途径包含三步酶促反应（图1），LDH、PCT、PHA三种外源酶分别由来自三种不同细菌的ldhD、pct、pha基因编码。根据目的基因的_______（填3′或5′）端碱基序列设计引物，并利用_______技术获取目的基因。 (2)研究者首先构建了质粒A和B（图2），分别将目的基因导入两组蓝细菌，并全程添加等量IPTG，以PLA产量反映质粒功能。 ①质粒A中，多个基因共用一个启动子转录出一条mRNA，再分别翻译出不同蛋白质。这种结构在DNA较短的原核生物中普遍存在，其意义是_______，但该结构存在缺陷，即距离启动子越远的基因表达量逐渐衰减。 ②最终测得质粒B的PLA产量远高于质粒A，其原因是_______。 ③研究者构建质粒C，通过敲低脂肪酸合成酶基因的表达（不删基因，只是抑制其转录或翻译）来提高PLA产量。推测靶向序列转录的sRNA应与_______的mRNA互补，从而抑制其翻译，该过程需在hfq基因编码的伴侣蛋白HFQ协助下进行。hfq基因的翻译受茶碱诱导的核糖开关调控，据图3说明茶碱诱导HFQ翻译开启的机制：_______。 (3)脂肪酸是合成蓝细菌细胞膜的关键原料，缺少脂肪酸将无法生长和分裂；而持续大量表达外源酶也会给细胞造成代谢负担，不利于细胞增殖。因此，在利用工程蓝细菌（含质粒B和C）发酵生产时，应该在即将达到K值时加入_______，目的是在工程菌的快速增长期实现_______，而在数量稳定期实现_______。 热点角度02 微生物工程与代谢调控及合成生物学应用 析典例·建模型 1.（2026·广东佛山·二模）广东顺德桑蚕养殖历史悠久，蚕丝主要由丝素重链(FibH)等蚕丝蛋白聚合而成，韧性不足。蜘蛛丝被称为“生物钢”，由蛛丝蛋白(MiSp)聚合而成，有着超强韧性。科研人员利用人工改造后的piggyBac质粒(如图)作为载体，构建能表达MiSp的转基因家蚕，以期改良蚕丝的品质。 (1)经改造的蛛丝可作为手术缝合线，术后无需拆线，推测其原因是___________。 (2)下表为构建转基因家蚕的过程，请完成表格内容。 基本步骤 操作要点 第一步：获取目的基因 运用PCR技术扩增MiSp基因时需要的条件有：___________(至少写出两点) 第二步：构建重组质粒 为保证MiSp基因能与质粒正确连接并准确表达，MiSp基因必须插入到piggyBac质粒的启动子和终止子之间，进行基因扩增时，需选择的引物是___________，且在其5’端分别加上___________限制酶的识别序列。 第三步：将目的基因导入受体细胞 利用___________方法将重组质粒导入家蚕的受精卵细胞。 第四步：目的基因的检测和鉴定 若观察到家蚕___________，则说明目的基因导入受体细胞。可采用⑥___________技术，检测家蚕是否能产生蛛丝蛋白。 (3)研究者提出可应用现代发酵工程技术生产蛛丝蛋白的思路：筛选出高产蛛丝蛋白的菌种经___________，再接种到___________中大规模生产。 【解题建模】 第一步，思路模板 1.确定过程起点：以 “目标性状缺陷” （蚕丝韧性不足）为问题起点，引向 “获取外源优质基因” （蛛丝蛋白MiSp基因），进行物种间的基因转移。 2.梳理过程链条： 基因工程四步链：获取目的基因（PCR扩增）→ 构建表达载体（酶切连接，确保启动子-目的基因-终止子方向）→ 导入受体细胞（显微注射法，针对动物受精卵）→ 检测与鉴定（标记基因观察 + 抗原-抗体杂交验证蛋白表达）。 质粒图谱分析链：识别启动子、终止子、标记基因（红色荧光蛋白）、多克隆位点（各限制酶位点位置）→ 选择目的基因插入位点（不破坏标记基因、不破坏复制原点、方向正确）→ 确定引物需添加的限制酶识别序列。 产物应用链：蛛丝蛋白特性（可降解、高强度） → 医用缝合线（免拆线） → 扩展到发酵工程大规模生产。 3.标注关键节点： 引物选择与酶切位点逻辑：PCR扩增方向从模板3'端添加，引物5'端添加限制酶识别序列。需保证插入后与载体上启动子转录方向一致，且不破坏标记基因。 导入方法与受体对应关系：动物受精卵 → 显微注射法；植物 → 农杆菌转化/基因枪法；微生物 → 感受态转化法。 多层次检测逻辑：个体/细胞水平（红色荧光，标记基因表型）→ 分子水平（抗原-抗体杂交，检测目标蛋白）。前者确认“导入成功”，后者确认“表达成功”。 4.链式推导结论： 质粒构建公式：目的基因扩增（引物5'带酶切位点）→ 双酶切 → 连接到载体启动子与终止子之间 → 转化 → 筛选。 引物设计公式：正义链引物5'端加限制酶1识别序列；反义链引物5'端加限制酶2识别序列。 鉴定公式：看见荧光=导入成功；杂交带出现=蛋白表达成功。 第二步，思路拆解 设问 过程起点 遗传/实验链条 关键节点 推导结论 (1) 蛛丝缝合线免拆线的原因 手术缝合线有“拆线”与“免拆线”的区别 免拆线意味着材料在体内存留一段时间后可自行被机体吸收/降解 蛛丝蛋白本质是蛋白质，可被蛋白酶水解成氨基酸 蛛丝蛋白（MiSp）可以被人体组织逐渐降解并吸收 (2) 第一步：PCR扩增条件 PCR技术基本原理 PCR反应体系五要素：模板、引物、耐热DNA聚合酶、dNTP、缓冲液（含Mg²⁺） 至少写出两点，选择最核心的组份 模板DNA（含MiSp基因片段）、引物、Taq DNA聚合酶、dNTP（任答两点即可） (2) 第二步：引物选择与酶切位点 质粒图谱：MiSp基因片段欲插入的位置、红色荧光蛋白报告基因、多个限制酶位点 1. 标记基因（红色荧光蛋白）不可被破坏；2. 载体上有两个MhoI位点（会破坏载体完整性）；3. 用NheI会切掉红色荧光蛋白基因的启动子；4. PCR延伸方向从3'端，需选择一正一反两个引物 引物选择②和③（扩增MiSp基因内部片段）；载体可用位点为SalI和BamHI 2和3；BamHI和SalI (2) 第三步：导入方法 受体细胞为家蚕受精卵（动物细胞） 动物细胞导入外源基因的标准方法 显微注射法是动物转基因最常用有效的方法 显微注射法 (2) 第四步：导入检测与蛋白检测 质粒载体带有红色荧光蛋白标记基因 导入成功的标志：报告基因表达；目标蛋白生产的标志：蛋白质免疫学检测 红色荧光→肉眼/荧光显微镜可见；蛛丝蛋白检测→抗原-抗体特异性结合 发出红色荧光；抗原-抗体杂交技术 (3) 发酵工程生产蛛丝蛋白 筛选出的高产菌种到大规模生产 发酵工程流程：菌种筛选 → 扩大培养（种子罐） → 接种至发酵罐（大规模生产）→ 产物分离纯化 “扩大培养”是连接菌种保藏与主发酵的桥梁 扩大培养；发酵罐 第三步，尝试作答 (1)蛛丝蛋白(MiSp)可以被人体组织逐渐降解并吸收 (2) 模板DNA（MiSp基因）、引物、TaqDNA聚合酶、dNTP 2和3 BamHI和SalI 显微注射法 红色荧光 抗原-抗体杂交技术 (3) 扩大培养 发酵罐 研考点·通技法 1.发酵工程的基本环节 基本环节 核心操作要点 菌种选育 筛选、诱变或通过基因工程获得性状优良的生产菌种 培养基配制 根据菌种需求，配制包含碳源、氮源、无机盐、水等的营养物质，并进行灭菌处理 灭菌 对培养基、发酵罐及所有管路、空气过滤系统进行严格灭菌，杜绝杂菌污染 扩大培养 将保存的菌种经活化后，逐级转移到种子罐中，以获得足够数量和活力的菌种 发酵过程 （中心环节） 将种子液接种至发酵罐，严格控制温度、pH、溶氧量、营养物质流加等条件，维持菌体生长和产物合成 分离提纯 发酵完成后，通过过滤/离心分离菌体，再采用沉淀、萃取、层析等方法获取并纯化目标产物 破类题·提能力 1．（2026·湖南邵阳·二模）石油烃（碳氢化合物）是石油工业和石油提炼过程中产生的复杂废弃物，对环境和人类健康造成严重威胁，已知almA基因表达产物为可以降解石油烃的胞外酶。研究人员利用下图来自大肠杆菌的PET-28a质粒，通过基因工程构建枯草杆菌工程菌来降解石油烃。 (1)培育枯草杆菌工程菌的核心工作是_____，启动子通常具有物种特异性，插入质粒中的almA基因，其上游启动子应选择_____的启动子。 (2)研究人员为使目的基因almA正确连接到载体上，最好选用_____酶对载体进行酶切处理，引物F的序列为5'_____3'（写出9个碱基序列）。 (3)枯草杆菌具有发达的蛋白质分泌功能，研究人员敲除了其中8个胞外分泌蛋白酶基因，原因是_____。 (4)在含有氨苄青霉素的培养基上接种，能正常生长的_____（填“是”或“不一定是”“一定不是”）含重组载体的枯草杆菌，理由是_____。 (5)研究人员为进一步筛选获得能降解石油烃的菌株，配制的培养基除添加石油烃、琼脂外，还需要添加_____。 （建议用时：75分钟） 刷模拟 1．（2026·广东湛江·二模）杂种优势利用是提高作物产量的重要途径。为简化杂交流程，实现可视化分选，我国研究团队创制了新型雄性不育系繁育系统ASPT。该系统包括CRISPR/Cas9基因编辑组件、育性恢复基因M、花粉致死基因P和甜菜红素（显示红色）报告系统RUBY整合到同一载体，结构如下图，并将该系统在黄玉米繁育中进行实践。 回答下列问题： (1)CRISPR/Cas9基因编辑组件对玉米原育性基因进行重新编辑，通常会剪切掉一段DNA序列，使原育性基因转变为无法表达的m基因，这种变异方式属于_____。根据密码子的_____对育性恢复基因M进行改造，使该基因在不改变功能的前提下，无法被CRISPR/Cas9组件通过碱基互补配对识别。 (2)科研人员通过转基因和基因编辑技术，并进行多次杂交最终获得了（m/m，ASPT/–）保持系（与雄性不育系杂交时，能使后代保持雄性不育特征），由该保持系进行繁育，过程如下图。 ①该保持系通过自交获得F1玉米籽粒颜色及比例为_____。RUBY系统可以从种子一直表达到幼苗阶段，所以可以在种子和幼苗阶段进行两次筛选，多重筛选的目的是_____。 ②两次筛选后由F1进行杂交种子生产，请简要阐述杂交过程：_____。 (3)从转基因安全性角度考虑，ASPT系统中整合花粉致死基因P的意义是_____。 2．（2026·广东佛山·二模）DNA分子已成为信息存储领域的新型载体。研究人员开发了一种可标记荧光的DNA凝聚体，使其通过荧光标记的差异性获得信息存储、动态编辑和信息加密的能力，凝聚体的合成过程如图所示。 回答下列问题： (1)DNA凝聚体由两种存在重复序列的长单链DNA分子构成。为得到长链DNA，研究人员通过______________酶将基础DNA首尾相连形成环状模板，再利用特定的______________酶进行复制。获得产物后，先使内核DNA按照设定结构形成核心，再______________（填“升高”或“降低”）温度，使外壳DNA通过碱基互补配对与内核DNA相结合，形成凝聚体。 (2)向凝聚体中加入带有红/绿/蓝色荧光的DNA分子探针，选择性地杂交标记于凝聚体内核（序列n）或外壳（序列m）上。序列m和n应避免设计成互补配对序列，理由是______________。为保证解码准确性，每种荧光在凝聚体结构中最多出现一次，根据三种荧光在凝聚体上的位置差异，共能得到______________种不同的组合搭配，将其与不同英文字母相对应，可建立空间—荧光双编码的存储与读写规则，如图所示。 (3)为提高信息存储的安全性，研究人员还开发了特殊的加密及解密机制。通过荧光密钥的置换反应，使原本被标记的部位消除荧光或使原本无荧光的部位发出荧光，从而实现信息转换，如图所示。图中字母U经密钥解密后对应的字母信息是______________。 (4)“适配体S”是一种单链核酸，可作为小分子核酸的载体，同时也可以与特定细胞表面的抗原结合。这种结合会导致适配体发生构象变化，释放其携带的核酸分子。根据以上机制，提出进一步提高解密系统安全性的设计方案并说明使用方法：______________。 3．（2026·广东韶关·二模）近年来，利用光合微生物将二氧化碳转化为有机物产品，成为解决能源与环境问题的新兴策略。我国科研团队成功构建了一种能利用CO2高效合成生物可降解塑料——聚乳酸（PLA）的工程蓝细菌（图1）。 (1)研究者构建的PLA的合成途径包含三步酶促反应（图1），LDH、PCT、PHA三种外源酶分别由来自三种不同细菌的ldhD、pct、pha基因编码。根据目的基因的_______（填3′或5′）端碱基序列设计引物，并利用_______技术获取目的基因。 (2)研究者首先构建了质粒A和B（图2），分别将目的基因导入两组蓝细菌，并全程添加等量IPTG，以PLA产量反映质粒功能。 ①质粒A中，多个基因共用一个启动子转录出一条mRNA，再分别翻译出不同蛋白质。这种结构在DNA较短的原核生物中普遍存在，其意义是_______，但该结构存在缺陷，即距离启动子越远的基因表达量逐渐衰减。 ②最终测得质粒B的PLA产量远高于质粒A，其原因是_______。 ③研究者构建质粒C，通过敲低脂肪酸合成酶基因的表达（不删基因，只是抑制其转录或翻译）来提高PLA产量。推测靶向序列转录的sRNA应与_______的mRNA互补，从而抑制其翻译，该过程需在hfq基因编码的伴侣蛋白HFQ协助下进行。hfq基因的翻译受茶碱诱导的核糖开关调控，据图3说明茶碱诱导HFQ翻译开启的机制：_______。 (3)脂肪酸是合成蓝细菌细胞膜的关键原料，缺少脂肪酸将无法生长和分裂；而持续大量表达外源酶也会给细胞造成代谢负担，不利于细胞增殖。因此，在利用工程蓝细菌（含质粒B和C）发酵生产时，应该在即将达到K值时加入_______，目的是在工程菌的快速增长期实现_______，而在数量稳定期实现_______。 4．（2026·广东东莞·一模）瓜氨酸是一种非蛋白质氨基酸，因具有显著健康功效，全球市场需求持续增长。大肠杆菌BL21产生瓜氨酸的代谢过程如图a所示，研究人员以该菌株为基础通过基因工程技术逐步构建了一株高效、无质粒、无需诱导的瓜氨酸生产菌株。 注：酶后面的英文表示控制该酶合成的基因的缩写；脯氨酸、谷氨酸和精氨酸是组成蛋白质的氨基酸，缺乏这些氨基酸会影响大肠杆菌的生命活动。 回答下列问题： (1)基因工程的核心步骤是_________。研究人员把大肠杆菌BL21拟核DNA上的argG基因敲除，构建出CTL1菌株。配制含不同浓度精氨酸的培养液，发酵结果见下表，实验结果说明精氨酸对瓜氨酸的合成起_________作用。据图表分析，BL21菌株中未检测到瓜氨酸的两个主要原因分别是____________。 检测指标 BL21 CTL1+精氨酸（g/L） CTL1+0 CTL1+0.1 CTL1+0.3 CTL1+0.5 CTL1+1.0 瓜氨酸（g/L） 0 0.32 0.31 0.17 0.12 0.10 (2)研究人员将CTL1菌株的proB基因敲除，构建出CTL2菌株，发酵48h后检测发现CTL2菌株的瓜氨酸产量显著下降。推测出现此结果的原因是_____。据此，为减少CTL1菌株中脯氨酸对瓜氨酸产量的影响，请提出一种改造菌株的新策略______。 (3)为进一步提高瓜氨酸产量，研究人员分别敲除CTL1菌株的speC和speE基因，构建出CTL3和CTL4菌株。根据下图b的发酵结果，正确的策略是保留____基因，敲除____基因。 (4)相比目的基因在受体菌的质粒上，目的基因位于拟核DNA上有什么优势：_________（答出1点即可）。 5．（2026·广东汕头·一模）为实现草莓在西北地区的扩种，科研人员将水稻耐盐碱基因M导入不耐盐碱的草莓中，培育出了耐盐碱草莓新品种，其操作流程及可能用到的限制酶如下图1及表所示。图中Ampr为氨苄青霉素抗性基因，Tetr为四环素抗性基因，Bar为抗除草剂基因。请回答下列问题： 限制酶 Smal BamHI Sacl BclI 识别序列和切割位点 -CCC↓GGG- -G↓GATCC- -GAGCT↓C- -T↓GATCA- (1)由于水稻耐盐碱基因M序列已知，可以从__________中快速检索获取其完整序列，其中部分序列如图2所示，为了能将基因M与Ti质粒重组，应选择图2中的引物________，并在其______（填“3’端”或“5’端”）添加限制酶识别序列，然后进行PCR扩增，用相应的限制酶进行切割后得到图1所示的黏性末端。图1虚线框的黏性末端是被表1中限制酶________切割后产生的。 (2)Ti质粒中的53S是启动子，它是________识别和结合的位点，能够驱动基因的转录。应选用表1中的限制酶________切割质粒并与目的基因M连接从而形成表达载体，然后利用农杆菌转化法将其导入草莓的愈伤组织细胞中。为确定转基因耐盐碱草莓是否培育成功，可通过__________从个体生物学水平进行鉴定。 (3)经检测，科研人员发现转基因草莓中的基因M表达的mRNA量不足以达到耐盐碱水平，请根据所学知识，提出一条改进思路：_______。 6．（2026·广东佛山·一模）肿瘤环境中虽存在免疫细胞，但这些免疫细胞常处于抑制状态，无法清除肿瘤细胞。我国科学家最新研究发现，沙门氏菌（一种致病细菌）表面脂质的乙酰化修饰可激活免疫细胞，发挥抗肿瘤功能，机制如图所示。回答下列问题： 注：TLR4和IL-10R是两种特异性受体；IL-10是一种细胞因子，由巨噬细胞合成、释放。 (1)据图分析，在沙门氏菌抗肿瘤过程中，IL-10存在______反馈调节。IL-10对细胞毒性T细胞的作用是______，从而增强对肿瘤细胞的杀伤作用。 (2)肿瘤组织往往结构致密，环境偏酸性且含氧量较低。为保证沙门氏菌能迅速在肿瘤区域稳定存活并繁殖，同时又不危害机体正常细胞，研究人员设计了氧气敏感型启动子，改造沙门氏菌以实现靶向效果。改造后的沙门氏菌（DB1）的部分DNA结构如图所示。 注：P1为组成型启动子，可持续发挥作用；P2、P3为诱导型启动子，需要特殊因素诱导才能发挥作用；h基因表达产物可增强沙门氏菌的肿瘤穿透能力。 ①图中“？”应为______（填“促进”或“抑制”）。 ②将改造后的DNA构建成基因表达载体，导入到用______处理的沙门氏菌中。为验证DB1的靶向效果，可将图中启动子______替换为______后，形成DB1的对照组。若抗肿瘤接种实验结果为对照组肿瘤区域的沙门氏菌含量显著低于DB1组，则可说明该DB1具有靶向效果。 (3)综合上述信息，请分析使用DB1进行肿瘤靶向治疗的优势或潜在风险：______。 刷真题 1．（2025·广东·高考真题）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题： (1)研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及______检测，筛选获得重组菌株W1。 (2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有______（答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是________。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是________。 (3)研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为________。 (4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路：______。 2．（2022·广东·高考真题）“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。 回答下列问题： (1)研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对________________，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。 (2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是________________，终止子的作用是________________。 (3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是________________，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。 (4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了________________，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于________________，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。 3．（2022·广东·高考真题）研究深海独特的生态环境对于开发海洋资源具有重要意义。近期在“科学号”考察船对中国南海科考中，中国科学家采集了某海域1146米深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株并进一步研究了其生物学特性。 回答下列问题： (1)研究者先制备富集培养基，然后采用________________法灭菌，冷却后再接入沉积物样品，28℃厌氧培养一段时间后，获得了含拟杆菌的混合培养物，为了获得纯种培养物，除了稀释涂布平板法，还可采用________________法。据图分析，拟杆菌新菌株在以________________为碳源时生长状况最好。 (2)研究发现，将采集的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原因可能是________________。（答一点即可） (3)藻类细胞解体后的难降解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系统组成成分的角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是________________。 (4)深海冷泉环境特殊，推测此环境下生存的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能还有________________。 4．（2024·广东·高考真题）驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。 回答下列问题： (1)研究者优化了培养基的_______（答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和 BC膜的复合物）。 (2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为________，理由是___________。 (3)光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为________________________（答两点）。 (4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是_____。 (5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路______。 5．（2023·广东·高考真题）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。 回答下列问题： (1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与_________植株的种子大小相近。 (2)用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和_________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备_________。 (3)转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。    ①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了_________。 ②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约_________%的培养基中幼苗继续培养。 ③将②中选出的T2代阳性植株_________（填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到_________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑_________。        01123    4 / 20 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题05 现代生物技术的原理、操作流程和应用 破类题·提能力： 热点角度01 (1) 3' PCR（聚合酶链式反应） (2) 节约遗传物质，（以最少调控元件或最短的序列）实现多基因协同表达 质粒B基因无表达衰减，酶量充足；质粒A反之 脂肪酸合成酶基因 茶碱与mRNA结合后使RBS暴露，核糖体与暴露的RBS结合启动翻译 (3) IPTG、茶碱 正常合成脂肪酸、增殖且不合成PLA 减少脂肪酸合成，大量合成PLA 热点角度02 (1) 基因表达载体的构建 枯草杆菌 (2) EcoRⅠ和BamHⅠ（或者“EcoRⅠ和BclⅠ”） GAATTCCAT (3)降低了蛋白酶对almA基因表达产物的降解，提高了石油烃降解酶的含量，增强了对石油烃的降解 (4) 不一定是 枯草杆菌导入不含目的基因的PET-28a质粒也能生长 (5)氮源、水、无机盐 实战刷题·冲高分： 刷模拟： 1．(1) 基因突变 简并性 (2) 红色：黄色=1：1 提高不育系的纯度 将不育系与正常可育玉米进行杂交就可以生产杂交种子 (3)防止转入的基因通过花粉进行传播 2．(1) DNA连接 DNA聚合 降低 (2) 避免序列m、n结合使探针无法结合；避免探针相互结合 27（或26） (3)字母M (4)设计方案：将“适配体S”与密钥结合形成复合体；使用方法：将复合体与特定细胞表面的抗原结合，释放密钥 3．(1) 3' PCR（聚合酶链式反应） (2) 节约遗传物质，（以最少调控元件或最短的序列）实现多基因协同表达 质粒B基因无表达衰减，酶量充足；质粒A反之 脂肪酸合成酶基因 茶碱与mRNA结合后使RBS暴露，核糖体与暴露的RBS结合启动翻译 (3) IPTG、茶碱 正常合成脂肪酸、增殖且不合成PLA 减少脂肪酸合成，大量合成PLA 4．(1) 构建基因表达载体 抑制 精氨酸的合成以瓜氨酸为底物，导致瓜氨酸无法积累；精氨酸会抑制瓜氨酸的合成，精氨酸浓度越高抑制作用越强 (2) CTL2菌株因无法合成脯氨酸而生长增殖受到抑制，削弱了瓜氨酸的合成 将PutP基因敲除 (3) speC speE (4)能稳定遗传，传代过程中不易丢失 5．(1) 序列数据库（基因文库） ②③ 5’端 BamHI或BclI (2) RNA聚合酶 SacI和BclI 浇灌一定浓度的盐水 (3)为基因M组装在草莓细胞中特异性表达的基因的启动子/组装多个启动子/组装强启动子改造M基因使其更加适合于在草莓细胞内表达 6．(1) 正 促进细胞毒性T细胞分裂分化 (2) 抑制 /CaCl2 P2（或P2、P3） P1 (3)优点：可依靠细菌自主繁殖持续发挥作用；增强沙门氏菌的肿瘤穿透能力，靶向杀伤肿瘤细胞，不危害正常细胞；缺点：沙门氏菌在体内过度繁殖引起机体患病 刷真题： 1．(1)mKate2蛋白或荧光 (2) 细菌计数板计数法 作为mKate2蛋白的荧光对照 PGro在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解 (3)快速生长期荧光值较低，生长稳定期快速增强 (4)先敲除野生菌株中的酶B基因，再将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，并将两种质粒导入敲除酶B基因的野生菌株中 2．(1)引物 (2) 作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞 终止转录，使转录在需要的地方停下来 (3)酶蛋白大量表达需要消耗大量能量，而厌氧代谢供能不足 (4) 工业废气资源化 通过捕获二氧化 碳，实现固碳减排 3．(1) 高压蒸汽灭菌 平板划线 纤维素 (2)某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物质才能生存（或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活） (3)拟杆菌作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行 (4) 耐低温 4．(1)碳源、氮源、无机盐 (2) PT7、PBAD 和PBAD 启动子②和③选用 PBAD可以使工程菌无论有、无蓝光 照射都可表达无活性的T7RNAP，在蓝光照射后，无活性的 T7RNAP 转变为有活性的T7RNAP，与特异性启动子P7识别结合并转录基因1，即可用蓝光控制酪氨酸酶的表达 (3)杀死不含光控表达载体的杂菌，避免杂菌污染；筛选出含光控表达载体的工程菌 (4)蓝光诱导酪氨酸酶基因的表达，酪氨酸酶催化酪氨酸转化为黑色素，蓝光照射不到的部位酪氨酸酶不表达 (5)将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白) 5．(1)野生型 (2) 载体（基因表达载体） 启动子和终止子 (3) DAI基因和卡那霉素抗性基因 75 自交 100 4 / 20 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题05 现代生物技术的原理、操作流程和应用 内容导航 【命题解码·定方向】命题趋势+3年高考真题热点角度拆解 【解题建模·通技法】析典例，建模型，技法贯通破类题/变式 【实战刷题·冲高分】精选高考大题+名校模拟题，强化实战能力，得高分 命题·趋势·定位 1.重过程推演：从“识工具”转向基因工程四步流程的时序推导、单克隆抗体制备的链式逻辑、发酵条件的动态优化机制推导。 2.重层级差异：基因水平操作+细胞水平培养/个体水平筛选/群体水平发酵叠加，强化微观操作与宏观产出间的尺度转化考查。 3.重信息转译：以质粒图谱与限制酶切位点、PCR扩增曲线、细胞融合筛选示意图、发酵参数变化表为核心载体。 4.重综合关联：与疾病诊疗、作物育种、环境修复、生物制药、伦理安全深度融合，突出科技向善与社会责任。 热点·角度·拆解 热点角度01 基因工程的操作流程与表达载体构建及筛选应用 2023年广东卷22（1）（3）：农杆菌转化法将野生型DAI基因导入突变体，构建表达载体时需启动子和终止子；利用限制酶X切割PCR产物进行突变检测核酸电泳图谱绘制； 2024年广东卷23（2）（3）（4）（5）：构建蓝光调控的基因表达载体，分析启动子PT7、PBAD的选择与光控机制；大观霉素抗性基因用于筛选并防止杂菌污染；蓝光照射区域因酪氨酸酶表达催化黑色素生成而染黑；提出替换色素合成酶的思路实现不同颜色图案。 热点角度02 微生物工程与代谢调控及合成生物学应用 2022年广东卷18（1）（2）（3）（4）：深海冷泉拟杆菌的分离纯化（高压蒸汽灭菌、平板划线）、碳源利用分析（纤维素最佳）；推测微生物难分离原因（依赖特定环境因子）；分析拟杆菌作为分解者在深海碳循环中的作用；推断低温环境下多糖降解酶的特性（耐低温）； 2025年广东卷22（3）（4）：基于莽草酸合成途径，设计敲除酶B基因并导入两个调控质粒的重组菌株构建思路，实现快速生长期保证正常生长、稳定期大量积累莽草酸。 热点角度01 基因工程的操作流程与表达载体构建及筛选应用 析典例·建模型 1.（2026·广东深圳·一模）某些细菌会释放酰基高丝氨酸内酯（AHL），AHL可自由进出细菌，其浓度达到一定阈值后会作用于细菌使其发生代谢变化（图1）。科学家试图利用细菌这一系统开发一种工程菌，来实现特定药物的合成和释放。 回答下列问题： (1)研究人员将构建的质粒①和质粒②导入大肠杆菌前，通常需先用________处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，导入后的菌体最适合用________法接种于选择培养基上，由此构建工程菌。 (2)据图1分析，当工程菌密度升高时，________积累达到阈值，才能与________蛋白结合形成复合物，该复合物与启动子结合，启动下游D基因的表达。 (3)为实现工程菌在肠道病灶部位裂解，研究人员利用基因E构建了质粒③（图2），其编码的蛋白E可诱导大肠杆菌裂解。在相同培养条件下，测定一段时间内含质粒①、③的工程菌和野生型大肠杆菌的种群密度变化（图3），在培养早期该曲线趋于一致，而在培养后期出现明显差异，在整个培养时间中出现这种现象的原因是________。 (4)综合上述研究，研究人员将质粒________导入大肠杆菌构建特定药物合成和释放的工程菌。结合图3分析，该工程菌的药物释放特征是________。 【解题建模】 第一步，思路模板 1.确定过程起点：明确信号分子（AHL）的浓度积累是触发整个基因表达系统的逻辑开关，其本质是将菌群密度转化为化学信号。 2.梳理过程链条： 信号传导链：菌群密度↑ → AHL浓度积累达阈值 → AHL与LuxR蛋白结合 → 复合物激活启动子PLuxI → 启动下游基因（D基因/药物,E基因/裂解）表达。 群体行为链：低密度时系统沉默（避免过早代谢负担）；高密度时系统激活 → 药物合成 → 裂解释放 → 菌群密度下降 → AHL浓度下降 → 系统关闭 → 细菌重新增殖 → 循环。 实验验证链：对比工程菌（含质粒①+③）与野生型生长曲线，前期重合（系统沉默）、后期分叉并波动（系统周期性开关）。 3.标注关键节点： 双质粒协同逻辑：质粒①（LuxR/LuxI调控元件）、质粒②（药物D基因）、质粒③（裂解E基因）各自的角色，以及三者如何被同一个PLuxI启动子统合。 图3曲线特征：工程菌后期密度下降并呈现降-升-降波动，对应“增殖→触发裂解→死亡→幸存者再增殖”的节律。 基因工程操作流程：感受态制备（Ca²⁺）、转化、筛选（稀释涂布平板+抗生素）。 4.链式推导结论： 激活公式：高菌群密度 → AHL达阈值 → AHL-LuxR复合物 → 激活基因表达。 周期释放公式：激活 → 裂解死亡 → 密度降低 → AHL下降 → 系统关闭 → 存活菌再生长 → 再次激活。 工程菌设计方案：感受态细胞 + 质粒①②③共转化 → 稀释涂布抗性平板 → 阳性克隆筛选 → 验证密度依赖型合成与释放 第二步，思路拆解 设问 过程起点 遗传/实验链条 关键节点 推导结论 (1) 大肠杆菌感受态制备与筛选 将质粒导入大肠杆菌这一受体细胞 Ca²⁺处理 → 细胞膜通透性增强 → 吸收外源DNA；转化后菌液 → 涂布于含抗生素的选择培养基 → 通过菌落生长与否/标记基因鉴定 大肠杆菌是微生物，导入方法为标准“感受态转化法”；筛选需菌落分离 Ca²⁺；稀释涂布平板 (2) 触发下游D基因表达的条件 图1信号调控通路：密度→AHL→LuxR→启动子 AHL随密度积累 → 与胞内LuxR结合 → 复合物结合P_LuxI启动子 → 转录 启动子名称P_LuxI；正向调控逻辑 AHL；LuxR (3) 图3培养后期出现明显差异及全周期曲线特征的原因 工程菌（质粒①+③） vs 野生型大肠杆菌 低密度时：AHL未达阈值 → 裂解基因E不表达 → 两者生长曲线重合；高密度时：AHL达阈值 → 裂解基因E表达 → 工程菌自溶 → 曲线下降并波动 核心是“密度依赖性负反馈”：菌多→裂解增多→菌少→裂解减少→恢复增长 在培养早期，菌群密度低，AHL未达阈值，无法激活LuxR，裂解基因E不表达，工程菌与野生型生长趋势一致；培养后期菌群密度升高，AHL积累至阈值，与LuxR结合激活E基因表达，导致细菌裂解死亡，种群密度下降且呈波动 (4) 工程菌构建方案及药物释放特征 综合图1（调控+药物合成）和图2（裂解） 质粒①（调控元件，提供LuxR/LuxI） + 质粒②（药物D基因） + 质粒③（裂解E基因） → 三者共导入 所有功能模块均受同一P_LuxI调控，实现密度同步触发 ①②③；当菌群密度达到阈值时，同步启动药物合成（D基因）和细胞裂解（E基因），释放药物后菌群密度下降，系统关闭；幸存细菌增殖后再次触发，呈现周期性循环合成和释放药物的特征 第三步，尝试作答 (1) Ca2+ 稀释涂布平板 (2) AHL LuxR (3)在低细胞密度时，AHL浓度较低，不足以激活LuxR，因此裂解基因E不表达，细胞生长不受影响；当细胞密度升高，AHL积累到阈值以上，激活LuxR，启动裂解基因E表达，导致细胞死亡 (4) ①②③ 呈现周期性循环合成和释放药物 研考点·通技法 1.将导入目的基因的方法 受体细胞类型 常用方法 关键原理 实例/常考情境 微生物细胞 （如大肠杆菌） Ca²⁺处理法 （感受态细胞法） 用CaCl₂溶液处理，使细胞膜的通透性增加，成为能吸收周围环境中DNA分子的感受态细胞 将重组质粒导入大肠杆菌 （本题第7题(1)小题） 动物细胞 显微注射法 在显微操作仪下，用极细的玻璃毛细管直接将DNA溶液注射到受精卵或胚胎干细胞的核内 将重组质粒导入家蚕受精卵 （本题第8题(2)小题） 转基因超级鼠 植物细胞 农杆菌转化法 （最常用） 利用农杆菌中Ti质粒上的T-DNA（可转移DNA）能整合到植物染色体DNA上的特性，将目的基因插入T-DNA中转入植物细胞 转基因抗虫棉、转基因水稻 破类题·提能力 1．（2026·广东韶关·二模）近年来，利用光合微生物将二氧化碳转化为有机物产品，成为解决能源与环境问题的新兴策略。我国科研团队成功构建了一种能利用CO2高效合成生物可降解塑料——聚乳酸（PLA）的工程蓝细菌（图1）。 (1)研究者构建的PLA的合成途径包含三步酶促反应（图1），LDH、PCT、PHA三种外源酶分别由来自三种不同细菌的ldhD、pct、pha基因编码。根据目的基因的_______（填3′或5′）端碱基序列设计引物，并利用_______技术获取目的基因。 (2)研究者首先构建了质粒A和B（图2），分别将目的基因导入两组蓝细菌，并全程添加等量IPTG，以PLA产量反映质粒功能。 ①质粒A中，多个基因共用一个启动子转录出一条mRNA，再分别翻译出不同蛋白质。这种结构在DNA较短的原核生物中普遍存在，其意义是_______，但该结构存在缺陷，即距离启动子越远的基因表达量逐渐衰减。 ②最终测得质粒B的PLA产量远高于质粒A，其原因是_______。 ③研究者构建质粒C，通过敲低脂肪酸合成酶基因的表达（不删基因，只是抑制其转录或翻译）来提高PLA产量。推测靶向序列转录的sRNA应与_______的mRNA互补，从而抑制其翻译，该过程需在hfq基因编码的伴侣蛋白HFQ协助下进行。hfq基因的翻译受茶碱诱导的核糖开关调控，据图3说明茶碱诱导HFQ翻译开启的机制：_______。 (3)脂肪酸是合成蓝细菌细胞膜的关键原料，缺少脂肪酸将无法生长和分裂；而持续大量表达外源酶也会给细胞造成代谢负担，不利于细胞增殖。因此，在利用工程蓝细菌（含质粒B和C）发酵生产时，应该在即将达到K值时加入_______，目的是在工程菌的快速增长期实现_______，而在数量稳定期实现_______。 【答案】(1) 3' PCR（聚合酶链式反应） (2) 节约遗传物质，（以最少调控元件或最短的序列）实现多基因协同表达 质粒B基因无表达衰减，酶量充足；质粒A反之 脂肪酸合成酶基因 茶碱与mRNA结合后使RBS暴露，核糖体与暴露的RBS结合启动翻译 (3) IPTG、茶碱 正常合成脂肪酸、增殖且不合成PLA 减少脂肪酸合成，大量合成PLA 【详解】（1）PCR扩增目的基因时，引物延伸方向为5′→3′，引物需要与模板链的3′端互补配对，因此需要根据目的基因的3′端序列设计引物；获取已知序列的目的基因常用PCR技术。 （2）①原核生物DNA总长度较短，多个基因共用一个启动子转录，可充分利用有限的DNA序列，提高遗传物质的利用率，以最少调控元件或最短的序列实现多基因协同表达，适应原核生物的基因组特点。 ②质粒A仅一个启动子，且存在“距离启动子越远基因表达量衰减”的缺陷，远端的目的基因表达量低；质粒B中每个目的基因都有独立的诱导型启动子，无表达衰减，三个基因都能被IPTG诱导高效表达，三种酶合成量充足，因此PLA产量更高。 ③该实验要敲低脂肪酸合成酶基因的表达，因此sRNA需要与脂肪酸合成酶的mRNA互补配对，从而抑制其翻译；根据图3的机制：无茶碱时，核糖体结合位点RBS被封闭在mRNA的结构中，核糖体无法结合，翻译不能起始；茶碱结合后改变mRNA的空间结构，使RBS暴露，核糖体可结合RBS，从而开启HFQ的翻译。 （3）快速增殖期的工程菌需要合成脂肪酸构建细胞膜，因此不需要提前抑制脂肪酸合成；当菌体数量即将达到K值（稳定期）时，加入IPTG和茶碱，同时开启HFQ和LDH、PCT、PHA三种外源酶的表达，进而抑制脂肪酸合成促进PLA合成，既保证了快速增长期工程菌正常合成脂肪酸、增殖且不合成PLA，积累足够的菌体，在稳定期又能减少脂肪酸合成，使更多丙酮酸（代谢前体）流向PLA合成，提高PLA产量。 热点角度02 微生物工程与代谢调控及合成生物学应用 析典例·建模型 1.（2026·广东佛山·二模）广东顺德桑蚕养殖历史悠久，蚕丝主要由丝素重链(FibH)等蚕丝蛋白聚合而成，韧性不足。蜘蛛丝被称为“生物钢”，由蛛丝蛋白(MiSp)聚合而成，有着超强韧性。科研人员利用人工改造后的piggyBac质粒(如图)作为载体，构建能表达MiSp的转基因家蚕，以期改良蚕丝的品质。 (1)经改造的蛛丝可作为手术缝合线，术后无需拆线，推测其原因是___________。 (2)下表为构建转基因家蚕的过程，请完成表格内容。 基本步骤 操作要点 第一步：获取目的基因 运用PCR技术扩增MiSp基因时需要的条件有：___________(至少写出两点) 第二步：构建重组质粒 为保证MiSp基因能与质粒正确连接并准确表达，MiSp基因必须插入到piggyBac质粒的启动子和终止子之间，进行基因扩增时，需选择的引物是___________，且在其5’端分别加上___________限制酶的识别序列。 第三步：将目的基因导入受体细胞 利用___________方法将重组质粒导入家蚕的受精卵细胞。 第四步：目的基因的检测和鉴定 若观察到家蚕___________，则说明目的基因导入受体细胞。可采用⑥___________技术，检测家蚕是否能产生蛛丝蛋白。 (3)研究者提出可应用现代发酵工程技术生产蛛丝蛋白的思路：筛选出高产蛛丝蛋白的菌种经___________，再接种到___________中大规模生产。 【解题建模】 第一步，思路模板 1.确定过程起点：以 “目标性状缺陷” （蚕丝韧性不足）为问题起点，引向 “获取外源优质基因” （蛛丝蛋白MiSp基因），进行物种间的基因转移。 2.梳理过程链条： 基因工程四步链：获取目的基因（PCR扩增）→ 构建表达载体（酶切连接，确保启动子-目的基因-终止子方向）→ 导入受体细胞（显微注射法，针对动物受精卵）→ 检测与鉴定（标记基因观察 + 抗原-抗体杂交验证蛋白表达）。 质粒图谱分析链：识别启动子、终止子、标记基因（红色荧光蛋白）、多克隆位点（各限制酶位点位置）→ 选择目的基因插入位点（不破坏标记基因、不破坏复制原点、方向正确）→ 确定引物需添加的限制酶识别序列。 产物应用链：蛛丝蛋白特性（可降解、高强度） → 医用缝合线（免拆线） → 扩展到发酵工程大规模生产。 3.标注关键节点： 引物选择与酶切位点逻辑：PCR扩增方向从模板3'端添加，引物5'端添加限制酶识别序列。需保证插入后与载体上启动子转录方向一致，且不破坏标记基因。 导入方法与受体对应关系：动物受精卵 → 显微注射法；植物 → 农杆菌转化/基因枪法；微生物 → 感受态转化法。 多层次检测逻辑：个体/细胞水平（红色荧光，标记基因表型）→ 分子水平（抗原-抗体杂交，检测目标蛋白）。前者确认“导入成功”，后者确认“表达成功”。 4.链式推导结论： 质粒构建公式：目的基因扩增（引物5'带酶切位点）→ 双酶切 → 连接到载体启动子与终止子之间 → 转化 → 筛选。 引物设计公式：正义链引物5'端加限制酶1识别序列；反义链引物5'端加限制酶2识别序列。 鉴定公式：看见荧光=导入成功；杂交带出现=蛋白表达成功。 第二步，思路拆解 设问 过程起点 遗传/实验链条 关键节点 推导结论 (1) 蛛丝缝合线免拆线的原因 手术缝合线有“拆线”与“免拆线”的区别 免拆线意味着材料在体内存留一段时间后可自行被机体吸收/降解 蛛丝蛋白本质是蛋白质，可被蛋白酶水解成氨基酸 蛛丝蛋白（MiSp）可以被人体组织逐渐降解并吸收 (2) 第一步：PCR扩增条件 PCR技术基本原理 PCR反应体系五要素：模板、引物、耐热DNA聚合酶、dNTP、缓冲液（含Mg²⁺） 至少写出两点，选择最核心的组份 模板DNA（含MiSp基因片段）、引物、Taq DNA聚合酶、dNTP（任答两点即可） (2) 第二步：引物选择与酶切位点 质粒图谱：MiSp基因片段欲插入的位置、红色荧光蛋白报告基因、多个限制酶位点 1. 标记基因（红色荧光蛋白）不可被破坏；2. 载体上有两个MhoI位点（会破坏载体完整性）；3. 用NheI会切掉红色荧光蛋白基因的启动子；4. PCR延伸方向从3'端，需选择一正一反两个引物 引物选择②和③（扩增MiSp基因内部片段）；载体可用位点为SalI和BamHI 2和3；BamHI和SalI (2) 第三步：导入方法 受体细胞为家蚕受精卵（动物细胞） 动物细胞导入外源基因的标准方法 显微注射法是动物转基因最常用有效的方法 显微注射法 (2) 第四步：导入检测与蛋白检测 质粒载体带有红色荧光蛋白标记基因 导入成功的标志：报告基因表达；目标蛋白生产的标志：蛋白质免疫学检测 红色荧光→肉眼/荧光显微镜可见；蛛丝蛋白检测→抗原-抗体特异性结合 发出红色荧光；抗原-抗体杂交技术 (3) 发酵工程生产蛛丝蛋白 筛选出的高产菌种到大规模生产 发酵工程流程：菌种筛选 → 扩大培养（种子罐） → 接种至发酵罐（大规模生产）→ 产物分离纯化 “扩大培养”是连接菌种保藏与主发酵的桥梁 扩大培养；发酵罐 第三步，尝试作答 (1)蛛丝蛋白(MiSp)可以被人体组织逐渐降解并吸收 (2) 模板DNA（MiSp基因）、引物、TaqDNA聚合酶、dNTP 2和3 BamHI和SalI 显微注射法 红色荧光 抗原-抗体杂交技术 (3) 扩大培养 发酵罐 研考点·通技法 1.发酵工程的基本环节 基本环节 核心操作要点 菌种选育 筛选、诱变或通过基因工程获得性状优良的生产菌种 培养基配制 根据菌种需求，配制包含碳源、氮源、无机盐、水等的营养物质，并进行灭菌处理 灭菌 对培养基、发酵罐及所有管路、空气过滤系统进行严格灭菌，杜绝杂菌污染 扩大培养 将保存的菌种经活化后，逐级转移到种子罐中，以获得足够数量和活力的菌种 发酵过程 （中心环节） 将种子液接种至发酵罐，严格控制温度、pH、溶氧量、营养物质流加等条件，维持菌体生长和产物合成 分离提纯 发酵完成后，通过过滤/离心分离菌体，再采用沉淀、萃取、层析等方法获取并纯化目标产物 破类题·提能力 1．（2026·湖南邵阳·二模）石油烃（碳氢化合物）是石油工业和石油提炼过程中产生的复杂废弃物，对环境和人类健康造成严重威胁，已知almA基因表达产物为可以降解石油烃的胞外酶。研究人员利用下图来自大肠杆菌的PET-28a质粒，通过基因工程构建枯草杆菌工程菌来降解石油烃。 (1)培育枯草杆菌工程菌的核心工作是_____，启动子通常具有物种特异性，插入质粒中的almA基因，其上游启动子应选择_____的启动子。 (2)研究人员为使目的基因almA正确连接到载体上，最好选用_____酶对载体进行酶切处理，引物F的序列为5'_____3'（写出9个碱基序列）。 (3)枯草杆菌具有发达的蛋白质分泌功能，研究人员敲除了其中8个胞外分泌蛋白酶基因，原因是_____。 (4)在含有氨苄青霉素的培养基上接种，能正常生长的_____（填“是”或“不一定是”“一定不是”）含重组载体的枯草杆菌，理由是_____。 (5)研究人员为进一步筛选获得能降解石油烃的菌株，配制的培养基除添加石油烃、琼脂外，还需要添加_____。 【答案】(1) 基因表达载体的构建 枯草杆菌 (2) EcoRⅠ和BamHⅠ（或者“EcoRⅠ和BclⅠ”） GAATTCCAT (3)降低了蛋白酶对almA基因表达产物的降解，提高了石油烃降解酶的含量，增强了对石油烃的降解 (4) 不一定是 枯草杆菌导入不含目的基因的PET-28a质粒也能生长 (5)氮源、水、无机盐 【详解】（1）培育枯草杆菌工程菌的核心工作是基因表达载体的构建，启动子需要被受体细胞（枯草杆菌）的RNA聚合酶识别，因此需要选择枯草杆菌的启动子。 （2）限制酶SmaⅠ会破坏目的基因，不能选择，限制酶XmaⅠ与限制酶SmaⅠ具有相同的识别序列，也不能选择，由于BamHⅠ与BclⅠ会形成相同的粘性末端，最好选用EcoRⅠ和BamHⅠ（或者“EcoRⅠ和BclⅠ”）对载体进行酶切处理，根据转录分向，a链为转录的模板链，引物F的左侧添加EcoRⅠ的识别序列，引物F的序列为5'GAATTCCAT3'。 （3）研究人员敲除了其中8个胞外分泌蛋白酶基因，原因是降低了蛋白酶对almA基因表达产物的降解，提高了石油烃降解酶的含量，增强了对石油烃的降解。 （4）无论质粒是否插入目的基因，都带有氨苄青霉素抗性基因，因此枯草杆菌导入不含目的基因的PET-28a质粒也能生长，所以能生长的不一定是含重组载体的枯草杆菌。 （5）该培养基以石油烃作为唯一碳源筛选目的菌株，琼脂作为凝固剂，还需要补充微生物生长必需的其他基本营养：水、氮源、无机盐。 （建议用时：75分钟） 刷模拟 1．（2026·广东湛江·二模）杂种优势利用是提高作物产量的重要途径。为简化杂交流程，实现可视化分选，我国研究团队创制了新型雄性不育系繁育系统ASPT。该系统包括CRISPR/Cas9基因编辑组件、育性恢复基因M、花粉致死基因P和甜菜红素（显示红色）报告系统RUBY整合到同一载体，结构如下图，并将该系统在黄玉米繁育中进行实践。 回答下列问题： (1)CRISPR/Cas9基因编辑组件对玉米原育性基因进行重新编辑，通常会剪切掉一段DNA序列，使原育性基因转变为无法表达的m基因，这种变异方式属于_____。根据密码子的_____对育性恢复基因M进行改造，使该基因在不改变功能的前提下，无法被CRISPR/Cas9组件通过碱基互补配对识别。 (2)科研人员通过转基因和基因编辑技术，并进行多次杂交最终获得了（m/m，ASPT/–）保持系（与雄性不育系杂交时，能使后代保持雄性不育特征），由该保持系进行繁育，过程如下图。 ①该保持系通过自交获得F1玉米籽粒颜色及比例为_____。RUBY系统可以从种子一直表达到幼苗阶段，所以可以在种子和幼苗阶段进行两次筛选，多重筛选的目的是_____。 ②两次筛选后由F1进行杂交种子生产，请简要阐述杂交过程：_____。 (3)从转基因安全性角度考虑，ASPT系统中整合花粉致死基因P的意义是_____。 【答案】(1) 基因突变 简并性 (2) 红色：黄色=1：1 提高不育系的纯度 将不育系与正常可育玉米进行杂交就可以生产杂交种子 (3)防止转入的基因通过花粉进行传播 【详解】（1）CRISPR/Cas9基因编辑对基因的修饰属于基因突变范畴。该技术可特异性编辑细胞内原有育性基因，而不影响后续导入的外源育性基因。若要对导入的育性基因进行序列改造，同时保证其编码蛋白质的功能不变，可利用密码子的简并性进行碱基替换。 （2）①m/m，ASPT/-自交，作为母本可以产生m，ASPT和m，-两种配子，作为父本只能产生m，-一种配子，因为ASPT中有花粉致死基因，所以自交结果是红色：黄色=1：1．RUBY系统可以从种子一直表达到幼苗阶段，并且表达了RUBY系统是肉眼可见的，所以在种子阶段和到幼苗阶段都可以进行双重筛选，提高不育系的纯度。 ②由F1进行杂交种子生产，需要将不育系与正常可育玉米进行杂交就可以生产杂交种子，后代都是杂交种子。 （3）从转基因安全性角度考虑，花粉致死基因P可以防止其他转入的基因通过花粉进行传播，提高转基因的安全性。 2．（2026·广东佛山·二模）DNA分子已成为信息存储领域的新型载体。研究人员开发了一种可标记荧光的DNA凝聚体，使其通过荧光标记的差异性获得信息存储、动态编辑和信息加密的能力，凝聚体的合成过程如图所示。 回答下列问题： (1)DNA凝聚体由两种存在重复序列的长单链DNA分子构成。为得到长链DNA，研究人员通过______________酶将基础DNA首尾相连形成环状模板，再利用特定的______________酶进行复制。获得产物后，先使内核DNA按照设定结构形成核心，再______________（填“升高”或“降低”）温度，使外壳DNA通过碱基互补配对与内核DNA相结合，形成凝聚体。 (2)向凝聚体中加入带有红/绿/蓝色荧光的DNA分子探针，选择性地杂交标记于凝聚体内核（序列n）或外壳（序列m）上。序列m和n应避免设计成互补配对序列，理由是______________。为保证解码准确性，每种荧光在凝聚体结构中最多出现一次，根据三种荧光在凝聚体上的位置差异，共能得到______________种不同的组合搭配，将其与不同英文字母相对应，可建立空间—荧光双编码的存储与读写规则，如图所示。 (3)为提高信息存储的安全性，研究人员还开发了特殊的加密及解密机制。通过荧光密钥的置换反应，使原本被标记的部位消除荧光或使原本无荧光的部位发出荧光，从而实现信息转换，如图所示。图中字母U经密钥解密后对应的字母信息是______________。 (4)“适配体S”是一种单链核酸，可作为小分子核酸的载体，同时也可以与特定细胞表面的抗原结合。这种结合会导致适配体发生构象变化，释放其携带的核酸分子。根据以上机制，提出进一步提高解密系统安全性的设计方案并说明使用方法：______________。 【答案】(1) DNA连接 DNA聚合 降低 (2) 避免序列m、n结合使探针无法结合；避免探针相互结合 27（或26） (3)字母M (4)设计方案：将“适配体S”与密钥结合形成复合体；使用方法：将复合体与特定细胞表面的抗原结合，释放密钥 【详解】（1）将基础 DNA 首尾相连成环状模板，需要DNA 连接酶（催化DNA片段间磷酸二酯键的形成），以环状 DNA 为模板扩增长链DNA，需要DNA聚合酶（或Taq酶），通过滚环复制或 PCR 扩增得到长链产物。使外壳DNA与内核DNA通过碱基互补配对结合，需要先让内核DNA形成二级结构，再降低温度（退火），让单链的外壳DNA与内核DNA互补配对，形成稳定的双链结构。 （2）序列m（外壳）和n（内核）避免设计成互补配对序列，理由是：防止m和n自身发生碱基互补配对，避免序列m、n结合使探针无法结合；避免探针相互结合。三种荧光（红、绿、蓝）在凝聚体上的位置组合总数计算如下：每种荧光有3种状态：出现在外壳（○）  出现在内核（●）  不出现（-）。因此总组合数为：33=27（排除“全不出现”（---）这一无意义情况，有效组合数为：27-1=26，该数量恰好对应26个英文字母，可实现一一映射，满足存储与读写需求），因此每种荧光在凝聚体结构中最多出现一次，根据三种荧光在凝聚体上的位置差异，共能得到27（或26）种不同的组合搭配。 （3）初始状态（加密前）：  红光通道：红光探针m*有荧光→红+，绿光通道：绿光探针m有荧光，n被淬灭→绿+，蓝光通道：蓝光探针未被置换→蓝+；加密过程（使用蓝光密钥m + 红光密钥n）：蓝光密钥m置换红光m* → 红-，红光密钥n激活红光n* → 红+， 蓝光密钥m置换绿光m* →绿-，红光密钥n去淬灭绿光n*→绿+，蓝光通道不变→蓝+。加密后状态：红+、绿+、蓝+；解密过程（使用红光密钥m + 蓝光密钥n）：  红光密钥m恢复红光m*荧光→红+，蓝光密钥n使红光n*失活→红-，红光密钥m恢复绿光m*荧光→绿+，蓝光密钥n使绿光n*重新淬灭→绿-，蓝光通道仍保持→蓝+。解密后状态：红+、绿+、蓝+。对应字母识别：根据题图中字母荧光模式表，红+绿+蓝+ 对应字母M。 （4）利用“适配体S”可与特定细胞表面抗原结合并释放携带核酸分子这一机制，设计方案为：使用适配体S携带加密核酸分子，将“适配体S”与密钥结合形成复合体，当适配体S与抗原结合后构象变化，释放出加密核酸分子，从而实现针对该肿瘤细胞的特异性解密。使用方法是：先将复合体与特定细胞表面的抗原结合，然后将其导入含有特定肿瘤细胞的环境中，适配体S与肿瘤细胞表面抗原结合，释放出密钥进行解密。 3．（2026·广东韶关·二模）近年来，利用光合微生物将二氧化碳转化为有机物产品，成为解决能源与环境问题的新兴策略。我国科研团队成功构建了一种能利用CO2高效合成生物可降解塑料——聚乳酸（PLA）的工程蓝细菌（图1）。 (1)研究者构建的PLA的合成途径包含三步酶促反应（图1），LDH、PCT、PHA三种外源酶分别由来自三种不同细菌的ldhD、pct、pha基因编码。根据目的基因的_______（填3′或5′）端碱基序列设计引物，并利用_______技术获取目的基因。 (2)研究者首先构建了质粒A和B（图2），分别将目的基因导入两组蓝细菌，并全程添加等量IPTG，以PLA产量反映质粒功能。 ①质粒A中，多个基因共用一个启动子转录出一条mRNA，再分别翻译出不同蛋白质。这种结构在DNA较短的原核生物中普遍存在，其意义是_______，但该结构存在缺陷，即距离启动子越远的基因表达量逐渐衰减。 ②最终测得质粒B的PLA产量远高于质粒A，其原因是_______。 ③研究者构建质粒C，通过敲低脂肪酸合成酶基因的表达（不删基因，只是抑制其转录或翻译）来提高PLA产量。推测靶向序列转录的sRNA应与_______的mRNA互补，从而抑制其翻译，该过程需在hfq基因编码的伴侣蛋白HFQ协助下进行。hfq基因的翻译受茶碱诱导的核糖开关调控，据图3说明茶碱诱导HFQ翻译开启的机制：_______。 (3)脂肪酸是合成蓝细菌细胞膜的关键原料，缺少脂肪酸将无法生长和分裂；而持续大量表达外源酶也会给细胞造成代谢负担，不利于细胞增殖。因此，在利用工程蓝细菌（含质粒B和C）发酵生产时，应该在即将达到K值时加入_______，目的是在工程菌的快速增长期实现_______，而在数量稳定期实现_______。 【答案】(1) 3' PCR（聚合酶链式反应） (2) 节约遗传物质，（以最少调控元件或最短的序列）实现多基因协同表达 质粒B基因无表达衰减，酶量充足；质粒A反之 脂肪酸合成酶基因 茶碱与mRNA结合后使RBS暴露，核糖体与暴露的RBS结合启动翻译 (3) IPTG、茶碱 正常合成脂肪酸、增殖且不合成PLA 减少脂肪酸合成，大量合成PLA 【详解】（1）PCR扩增目的基因时，引物延伸方向为5′→3′，引物需要与模板链的3′端互补配对，因此需要根据目的基因的3′端序列设计引物；获取已知序列的目的基因常用PCR技术。 （2）①原核生物DNA总长度较短，多个基因共用一个启动子转录，可充分利用有限的DNA序列，提高遗传物质的利用率，以最少调控元件或最短的序列实现多基因协同表达，适应原核生物的基因组特点。 ②质粒A仅一个启动子，且存在“距离启动子越远基因表达量衰减”的缺陷，远端的目的基因表达量低；质粒B中每个目的基因都有独立的诱导型启动子，无表达衰减，三个基因都能被IPTG诱导高效表达，三种酶合成量充足，因此PLA产量更高。 ③该实验要敲低脂肪酸合成酶基因的表达，因此sRNA需要与脂肪酸合成酶的mRNA互补配对，从而抑制其翻译；根据图3的机制：无茶碱时，核糖体结合位点RBS被封闭在mRNA的结构中，核糖体无法结合，翻译不能起始；茶碱结合后改变mRNA的空间结构，使RBS暴露，核糖体可结合RBS，从而开启HFQ的翻译。 （3）快速增殖期的工程菌需要合成脂肪酸构建细胞膜，因此不需要提前抑制脂肪酸合成；当菌体数量即将达到K值（稳定期）时，加入IPTG和茶碱，同时开启HFQ和LDH、PCT、PHA三种外源酶的表达，进而抑制脂肪酸合成促进PLA合成，既保证了快速增长期工程菌正常合成脂肪酸、增殖且不合成PLA，积累足够的菌体，在稳定期又能减少脂肪酸合成，使更多丙酮酸（代谢前体）流向PLA合成，提高PLA产量。 4．（2026·广东东莞·一模）瓜氨酸是一种非蛋白质氨基酸，因具有显著健康功效，全球市场需求持续增长。大肠杆菌BL21产生瓜氨酸的代谢过程如图a所示，研究人员以该菌株为基础通过基因工程技术逐步构建了一株高效、无质粒、无需诱导的瓜氨酸生产菌株。 注：酶后面的英文表示控制该酶合成的基因的缩写；脯氨酸、谷氨酸和精氨酸是组成蛋白质的氨基酸，缺乏这些氨基酸会影响大肠杆菌的生命活动。 回答下列问题： (1)基因工程的核心步骤是_________。研究人员把大肠杆菌BL21拟核DNA上的argG基因敲除，构建出CTL1菌株。配制含不同浓度精氨酸的培养液，发酵结果见下表，实验结果说明精氨酸对瓜氨酸的合成起_________作用。据图表分析，BL21菌株中未检测到瓜氨酸的两个主要原因分别是____________。 检测指标 BL21 CTL1+精氨酸（g/L） CTL1+0 CTL1+0.1 CTL1+0.3 CTL1+0.5 CTL1+1.0 瓜氨酸（g/L） 0 0.32 0.31 0.17 0.12 0.10 (2)研究人员将CTL1菌株的proB基因敲除，构建出CTL2菌株，发酵48h后检测发现CTL2菌株的瓜氨酸产量显著下降。推测出现此结果的原因是_____。据此，为减少CTL1菌株中脯氨酸对瓜氨酸产量的影响，请提出一种改造菌株的新策略______。 (3)为进一步提高瓜氨酸产量，研究人员分别敲除CTL1菌株的speC和speE基因，构建出CTL3和CTL4菌株。根据下图b的发酵结果，正确的策略是保留____基因，敲除____基因。 (4)相比目的基因在受体菌的质粒上，目的基因位于拟核DNA上有什么优势：_________（答出1点即可）。 【答案】(1) 构建基因表达载体 抑制 精氨酸的合成以瓜氨酸为底物，导致瓜氨酸无法积累；精氨酸会抑制瓜氨酸的合成，精氨酸浓度越高抑制作用越强 (2) CTL2菌株因无法合成脯氨酸而生长增殖受到抑制，削弱了瓜氨酸的合成 将PutP基因敲除 (3) speC speE (4)能稳定遗传，传代过程中不易丢失 【详解】（1）基因表达载体的构建是基因工程的第二步，也是基因工程的核心步骤；根据表格结果，敲除argG后，添加的精氨酸浓度越高，瓜氨酸产量越低，说明精氨酸对瓜氨酸合成起抑制作用；BL21有完整的argG基因，其表达的酶会催化瓜氨酸转化为精氨酸，瓜氨酸无法积累；同时细胞内合成的精氨酸进一步抑制瓜氨酸合成，精氨酸浓度越高抑制作用越强，因此BL21检测不到瓜氨酸。 （2）proB编码谷氨酸激酶，催化谷氨酸合成脯氨酸，而脯氨酸是大肠杆菌必需的氨基酸，敲除proB后大肠杆菌CTL2菌株因无法合成脯氨酸而生长增殖受到抑制，削弱了瓜氨酸的合成，因此瓜氨酸产量下降；若要减少CTL1菌株中脯氨酸对瓜氨酸产量的影响，可将PutP基因敲除，既满足大肠杆菌对脯氨酸的需求，又能让更多谷氨酸流向瓜氨酸合成途径。 （3）根据题意：敲除speC得到CTL3，敲除speE得到CTL4。从柱状图可知，敲除speE的CTL4瓜氨酸产量最高，敲除speC的CTL3瓜氨酸产量降低，因此正确策略是保留speC，敲除speE。 （4）质粒是游离在拟核外的DNA，细胞分裂时容易丢失，而目的基因整合到拟核DNA后，可以随拟核DNA同步复制，能稳定遗传，传代过程中不易丢失。 5．（2026·广东汕头·一模）为实现草莓在西北地区的扩种，科研人员将水稻耐盐碱基因M导入不耐盐碱的草莓中，培育出了耐盐碱草莓新品种，其操作流程及可能用到的限制酶如下图1及表所示。图中Ampr为氨苄青霉素抗性基因，Tetr为四环素抗性基因，Bar为抗除草剂基因。请回答下列问题： 限制酶 Smal BamHI Sacl BclI 识别序列和切割位点 -CCC↓GGG- -G↓GATCC- -GAGCT↓C- -T↓GATCA- (1)由于水稻耐盐碱基因M序列已知，可以从__________中快速检索获取其完整序列，其中部分序列如图2所示，为了能将基因M与Ti质粒重组，应选择图2中的引物________，并在其______（填“3’端”或“5’端”）添加限制酶识别序列，然后进行PCR扩增，用相应的限制酶进行切割后得到图1所示的黏性末端。图1虚线框的黏性末端是被表1中限制酶________切割后产生的。 (2)Ti质粒中的53S是启动子，它是________识别和结合的位点，能够驱动基因的转录。应选用表1中的限制酶________切割质粒并与目的基因M连接从而形成表达载体，然后利用农杆菌转化法将其导入草莓的愈伤组织细胞中。为确定转基因耐盐碱草莓是否培育成功，可通过__________从个体生物学水平进行鉴定。 (3)经检测，科研人员发现转基因草莓中的基因M表达的mRNA量不足以达到耐盐碱水平，请根据所学知识，提出一条改进思路：_______。 【答案】(1) 序列数据库（基因文库） ②③ 5’端 BamHI或BclI (2) RNA聚合酶 SacI和BclI 浇灌一定浓度的盐水 (3)为基因M组装在草莓细胞中特异性表达的基因的启动子/组装多个启动子/组装强启动子改造M基因使其更加适合于在草莓细胞内表达 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：受体细胞不同，导入的方法也不—样。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①DNA分子杂交技术：检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因；②分子杂交技术：检测目的基因是否转录出了mRNA；③抗原—抗体杂交技术：检测目的基因是否翻译成蛋白质。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）由于水稻耐盐碱基因M序列已知，可以从序列数据库（基因文库）中快速检索获取其完整序列，序列数据库可以看作是某种生物的基因仓库，其中部分序列如图2所示，为了能将基因M与Ti质粒重组，应选择图2中的引物②③进行扩增，因为子链的延伸是在引物的3’端进行的，且互补的DNA双链表现为方向平行，同时在引物的“5’端”添加限制酶识别序列，然后进行PCR扩增，用相应的限制酶进行切割后得到图1所示的黏性末端。图1虚线框的黏性末端是被表1中限制酶切割后产生的，根据黏性末端可以判断，参与切割的限制酶BamHI或BclI。 （2）Ti质粒中的53S是启动子，它是RNA聚合酶识别和结合的位点，能够驱动基因的转录。根据基因M两端的黏性末端判断，应选用表1中的限制酶SacI和BclI（由于标记基因Ampr上有BamHI的切割位点）切割质粒并与目的基因M连接从而形成表达载体，然后利用农杆菌转化法将其导入草莓的愈伤组织细胞中。为确定转基因耐盐碱草莓是否培育成功，可通过浇灌一定浓度的盐水观察个体的表现来确定耐盐性状是否表现出来，这属于个体生物学水平鉴定。 （3）经检测，科研人员发现转基因草莓中的基因M表达的mRNA量不足以达到耐盐碱水平，需要设法提升基因M的表达量，因此需要强启动子与M基因结合起来达到相应的目的，则改进思路为基因M组装在草莓细胞中特异性表达的基因的启动子或组装多个启动子或组装强启动子改造M基因使其更加适合于在草莓细胞内表达。 6．（2026·广东佛山·一模）肿瘤环境中虽存在免疫细胞，但这些免疫细胞常处于抑制状态，无法清除肿瘤细胞。我国科学家最新研究发现，沙门氏菌（一种致病细菌）表面脂质的乙酰化修饰可激活免疫细胞，发挥抗肿瘤功能，机制如图所示。回答下列问题： 注：TLR4和IL-10R是两种特异性受体；IL-10是一种细胞因子，由巨噬细胞合成、释放。 (1)据图分析，在沙门氏菌抗肿瘤过程中，IL-10存在______反馈调节。IL-10对细胞毒性T细胞的作用是______，从而增强对肿瘤细胞的杀伤作用。 (2)肿瘤组织往往结构致密，环境偏酸性且含氧量较低。为保证沙门氏菌能迅速在肿瘤区域稳定存活并繁殖，同时又不危害机体正常细胞，研究人员设计了氧气敏感型启动子，改造沙门氏菌以实现靶向效果。改造后的沙门氏菌（DB1）的部分DNA结构如图所示。 注：P1为组成型启动子，可持续发挥作用；P2、P3为诱导型启动子，需要特殊因素诱导才能发挥作用；h基因表达产物可增强沙门氏菌的肿瘤穿透能力。 ①图中“？”应为______（填“促进”或“抑制”）。 ②将改造后的DNA构建成基因表达载体，导入到用______处理的沙门氏菌中。为验证DB1的靶向效果，可将图中启动子______替换为______后，形成DB1的对照组。若抗肿瘤接种实验结果为对照组肿瘤区域的沙门氏菌含量显著低于DB1组，则可说明该DB1具有靶向效果。 (3)综合上述信息，请分析使用DB1进行肿瘤靶向治疗的优势或潜在风险：______。 【答案】(1) 正 促进细胞毒性T细胞分裂分化 (2) 抑制 /CaCl2 P2（或P2、P3） P1 (3)优点：可依靠细菌自主繁殖持续发挥作用；增强沙门氏菌的肿瘤穿透能力，靶向杀伤肿瘤细胞，不危害正常细胞；缺点：沙门氏菌在体内过度繁殖引起机体患病 【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）分析题图可知，IL-10与巨噬细胞膜上的IL-10R（IL-10特异性受体）结合后，会促进IL-10的分泌，使巨噬细胞分泌更多的IL-10，进而又会增大它与IL-10R结合的概率，释放出更多的IL-10，该反馈调节属于正反馈调节。IL-10是一种细胞因子，能促进细胞毒性T细胞分裂分化，从而增强对肿瘤细胞的杀伤作用。 （2）①肿瘤组织含氧量低，氧气敏感型启动子P2在低氧环境下应发挥作用，而图中显示在正常氧环境下P2应不发挥作用，所以“?”应为抑制。 ②将目的基因导入微生物细胞常用感受态细胞法，用CaCl2处理细胞可使其成为感受态细胞，即有利于吸收周围环境中DNA分子的状态，故将改造后的DNA构建成基因表达载体，导入到用CaCl2处理的沙门氏菌中。为验证DB1的靶向效果，需设置对照组，将诱导型启动子替换为组成型启动子，即将P2（或P2、P3）替换为P1，这样对照组的基因表达不受氧含量影响，若对照组肿瘤区域的沙门氏菌含量显著低于DB1组，说明DB1能在肿瘤低氧环境下更好地发挥作用，具有靶向效果。 （3）优势方面：从题干可知，改造后的沙门氏菌可依靠细菌自主繁殖持续发挥作用；增强沙门氏菌的肿瘤穿透能力，靶向杀伤肿瘤细胞，不危害正常细胞。 缺点：沙门氏菌在体内过度繁殖引起机体患病。 刷真题 1．（2025·广东·高考真题）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题： (1)研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及______检测，筛选获得重组菌株W1。 (2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有______（答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是________。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是________。 (3)研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为________。 (4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路：______。 【答案】(1)mKate2蛋白或荧光 (2) 细菌计数板计数法 作为mKate2蛋白的荧光对照 PGro在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解 (3)快速生长期荧光值较低，生长稳定期快速增强 (4)先敲除野生菌株中的酶B基因，再将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，并将两种质粒导入敲除酶B基因的野生菌株中 【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 2、引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。用于PCR的引物长度通常为20—30个核苷酸。 3、启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。 【详解】（1）在基因工程中，筛选重组菌株时，常用的检测方法除了PCR，根据质粒中存在红色荧光蛋白基因，可利用荧光检测，筛选获得重组菌株W1。 （2）检测培养液中细胞密度常用的方法是细菌计数板计数法。接种前检测液体培养基的荧光强度，作用是作为mKate2蛋白的荧光对照。进入生长稳定期后，由于PGro在生长稳定期停止基因转录，所以不再合成带有SsrA短肽的mKate2，同时C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解，导致荧光强度快速下降。 （3）在重组菌株W2中，启动子PX被阻遏蛋白X阻遏转录。在细胞快速生长阶段，阻遏蛋白X 阻遏mKate2基因的表达；随着细胞进入生长稳定器，阻遏蛋白X停止表达并被降解，对PX启动子的阻遏作用降低，mKate2基因开始表达，荧光强度开始上升，由于原料的限制，最后保持稳定，所以培养期间荧光强度的变化趋势为快速生长期荧光值较低，生长稳定期快速增强 。 （4）为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路是：首先对野生型大肠杆菌进行改造，敲除酶B基因；然后将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，使相关代谢途径关键酶在快速生长期正常表达以保证细胞正常生长，进入生长稳定期后该酶降解，减少对莽草酸的转化；同时将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，利用其调控机制在生长稳定期实现莽草酸合成相关基因的稳定表达，从而大量积累莽草酸，最后将两种质粒导入敲除酶B基因的野生菌株。 2．（2022·广东·高考真题）“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。 回答下列问题： (1)研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对________________，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。 (2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是________________，终止子的作用是________________。 (3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是________________，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。 (4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了________________，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于________________，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。 【答案】(1)引物 (2) 作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞 终止转录，使转录在需要的地方停下来 (3)酶蛋白大量表达需要消耗大量能量，而厌氧代谢供能不足 (4) 工业废气资源化 通过捕获二氧化 碳，实现固碳减排 【分析】（1）PCR技术的原理是DNA半保留复制，是在体外大量复制DNA的技术，该技术的关键是Taq酶可以从引物的3’端延伸子链。 （2）减缓温室效应，一方面要减少二氧化碳的排放，另一方面通过植树造林等手段增加大气中二氧化碳的消耗。 【详解】（1）利用PCR技术扩增目标酶基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物与模板链结合后，Taq酶才能从引物的3’端延伸子链。 （2）基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞，终止子可终止转录，使转录在需要的地方停下来。 （3）重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，需要消耗大量能量，而厌氧代谢供能不足，所以会导致生长迟缓。 （4）根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以高污染企业排放的二氧化碳等一碳温室气体为原料，实现了工业废气资源化，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术生产丙酮的过程通过捕获二氧化 碳，实现固碳减排，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。 3．（2022·广东·高考真题）研究深海独特的生态环境对于开发海洋资源具有重要意义。近期在“科学号”考察船对中国南海科考中，中国科学家采集了某海域1146米深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株并进一步研究了其生物学特性。 回答下列问题： (1)研究者先制备富集培养基，然后采用________________法灭菌，冷却后再接入沉积物样品，28℃厌氧培养一段时间后，获得了含拟杆菌的混合培养物，为了获得纯种培养物，除了稀释涂布平板法，还可采用________________法。据图分析，拟杆菌新菌株在以________________为碳源时生长状况最好。 (2)研究发现，将采集的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原因可能是________________。（答一点即可） (3)藻类细胞解体后的难降解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系统组成成分的角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是________________。 (4)深海冷泉环境特殊，推测此环境下生存的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能还有________________。 【答案】(1) 高压蒸汽灭菌 平板划线 纤维素 (2)某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物质才能生存（或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活） (3)拟杆菌作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行 (4) 耐低温 【分析】进行微生物纯种培养物时，人们需要按照微生物对营养物质的不同需求配制培养基；还需要防止杂菌污染，无菌技术主要包括消毒和灭菌。获得微生物纯培养物的常用方法有平板划线法和稀释涂布平板法。 【详解】（1）培养基通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。可以采用稀释涂布平板法或平板划线法，将单个微生物分散在固体培养基上，经过培养得到单菌落，从而获得纯净培养物。分析图12可知，在以纤维素为碳源的培养基中，细胞数量最多，可推知拟杆菌新菌株在以纤维素为碳源时生长状况最好。 （2）深海冷泉中可能存在某些微生物，只有利用冷泉中的特有物质才能生存（或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活），故将采集的样品置于各种培养基中培养，仍可能有很多微生物不能被分离筛选出来。 （3）拟杆菌为异养生物，作为该生态系统的分解者，能将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行。 （4）深海冷泉温度较低，故生活在其中的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，应具有耐低温的特性，才能高效降解多糖，保证拟杆菌的正常生命活动所需。 4．（2024·广东·高考真题）驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。 回答下列问题： (1)研究者优化了培养基的_______（答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和 BC膜的复合物）。 (2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为________，理由是___________。 (3)光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为________________________（答两点）。 (4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是_____。 (5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路______。 【答案】(1)碳源、氮源、无机盐 (2) PT7、PBAD 和PBAD 启动子②和③选用 PBAD可以使工程菌无论有、无蓝光 照射都可表达无活性的T7RNAP，在蓝光照射后，无活性的 T7RNAP 转变为有活性的T7RNAP，与特异性启动子P7识别结合并转录基因1，即可用蓝光控制酪氨酸酶的表达 (3)杀死不含光控表达载体的杂菌，避免杂菌污染；筛选出含光控表达载体的工程菌 (4)蓝光诱导酪氨酸酶基因的表达，酪氨酸酶催化酪氨酸转化为黑色素，蓝光照射不到的部位酪氨酸酶不表达 (5)将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白) 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。 （2）题图二a分析可知，蓝光照射下，T7RNAP N端-nMag与T7RNAP C端结合，导致无活性的T7RNAP变成有活性的T7RNAP，结合图一，蓝光处理后，RNA聚合酶（T7RNAP）识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合上述分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD 和PBAD。 （3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，可杀死不含光控表达载体的杂菌，避免杂菌污染；筛选出含光控表达载体的工程菌。 （4）由小问2分析可知，细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。蓝光照射不到的部位酪氨酸酶不表达。 （5）由小问2分析可知，题干信息的设计思路最终BC膜被染成黑色，希望生产其他颜色图案的BC膜，则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)。 5．（2023·广东·高考真题）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。 回答下列问题： (1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与_________植株的种子大小相近。 (2)用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和_________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备_________。 (3)转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。    ①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了_________。 ②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约_________%的培养基中幼苗继续培养。 ③将②中选出的T2代阳性植株_________（填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到_________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑_________。      【答案】(1)野生型 (2) 载体（基因表达载体） 启动子和终止子 (3) DAI基因和卡那霉素抗性基因 75 自交 100    【分析】1、基因突变是基因结构的改变，包括碱基对的增添、缺失或替换；基因突变发生的时间主要是细胞分裂的间期；基因突变的特点是低频性、普遍性、少利多害性、随机性、不定向性。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 【详解】（1）根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。 （2）利用PCR技术扩增DAI基因后，应该用同种限制性核酸内切酶对DAI基因和运载体进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。 （3）①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌（T-DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因）液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基（含有卡那霉素）上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。 ②T1代阳性植株都含有DAI基因，由于T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。 ③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有150bp，突变型有50bp和100bp，如图：    。 4 / 20 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $