专题03 基因工程（期中真题汇编，湖南专用）高二生物下学期

专题03 基因工程 5大高频考点概览 考点01 重组DNA技术的基本工具 考点02 基因工程的基本操作程序 考点03 基因工程的应用 考点04 蛋白质工程的原理和应用 考点05 基因工程的综合 地 城 考点01 重组DNA技术的基本工具 一、单项选择题 1．（24-25高二下·湖南邵阳·期中）下列关于“DNA粗提取与鉴定实验”的叙述，正确的是（　　） A．DNA析出过程中，玻璃棒搅拌操作要迅速均匀有力以利于DNA析出 B．可以用菜花、洋葱、猪血、猪肝等作为实验材料粗提取DNA C．将过滤液中加入等体积预冷的酒精可抑制DNA酶的活性和溶解DNA D．粗提取物需溶于盐溶液后加入二苯胺试剂沸水浴后变蓝色 2.（24-25高二下·湖南长沙·期中）最新研究发现，小麦细胞中甘油-3-磷酸酰基转移酶可通过促进细胞膜外“屏障”形成，减少细胞内Na+积累，显著提升小麦耐盐性。下列有关组成细胞的水与无机盐叙述正确的是（　　） A．将小麦秸秆充分晒干后，其体内剩余的物质主要是无机盐 B．结合水是细胞结构的重要组成成分，主要存在于液泡中 C．无机盐既参与维持细胞的酸碱平衡也参与某些有机物的合成 D．用2mol/LNaCl溶液可析出小麦根尖细胞提取液中的DNA 3．（24-25高二下·湖南长沙·期中）如图是利用基因工程技术生产可食用疫苗的部分过程，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ和ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法正确的是（　　） A．图示过程需要的工具只有限制酶和载体 B．限制酶识别的核苷酸序列和切割位点是特定的 C．图中的质粒只能来自原核细胞 D．限制酶作用于双链DNA中的氢键，将其断开 4．（24-25高二下·湖南·期中）细胞内DNA复制时，一条新子链按5'→3'方向进行连续复制，而另一条链按5'→3'方向合成的是冈崎片段(如图所示)。已知DNA聚合酶不能直接起始DNA新链或冈崎片段的合成，需先借助引物酶以DNA为模板合成RNA引物，DNA聚合酶再在引物的3'-OH上聚合脱氧核苷酸。当DNA整条单链合成完毕或冈崎片段相连后，DNA聚合酶再把RNA引物去掉，换上相应的DNA片段。人体细胞内的DNA复制过程和体外进行PCR过程分别如下，则下列叙述中错误的是（    ） A．引物酶、DNA聚合酶、DNA连接酶都会催化磷酸二酯键的形成 B．上述两个过程中的DNA聚合酶都只能由5'端→3'端延伸子链 C．PCR时所有子链都是连续复制，而细胞内DNA复制时部分子链不连续复制 D．细胞内DNA复制所需引物是细胞自行合成的，PCR过程需要加入引物，子链合成后引物都会被切掉 5．（24-25高二下·湖南衡阳·期中）下图是几种限制酶的切割位点，下列说法正确的是（　　） A．限制酶SmaI和EcoRV切割形成的末端，可通过E ．coliDNA连接酶相互连接 B．DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成 C．所有限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成 D．SmaI切割后产生的是黏性末端 6．（24-25高二下·湖南长沙·期中）聚合酶链式反应（PCR）是一种分子生物学技术，通过模拟生物体内DNA的自然复制过程，在体外特异性地去复制特定的DNA片段，它的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。下列说法正确的是（　　） A．利用PCR技术获取目的基因，需要DNA聚合酶和DNA连接酶 B．配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料 C．PCR过程中用到的引物在一定范围内片段越长，扩增出来的DNA片段的脱氧核苷酸序列差别就越小 D．理论上推测，第n轮循环产物中只含有一种引物的DNA片段所占比例为1/2n-1 7．（23-24高二下·湖南·期中）下图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是（　　） A．用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸，在设计引物时，应尽量避免引物自身或引物之间发生碱互补配对，影响扩增的效果 B．从理论上推测，第n轮循环后同时含有引物A、B的DNA分子占的比例为（2n-1）/2n C．在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 D．PCR的产物一般可以利用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定，DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度都会影响DNA在凝胶中的迁移速率 8．（23-24高二下·湖南·期中）母乳来源的胆盐激活酯酶(BSSL)是一种脂肪酶，具有广泛的底物水解活性，对乳脂消化吸收具有重要作用。因此，对胆盐激活酯酶的研究是“人乳化牛奶”计划的重要组成部分。下图表示含有BSSL基因的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，限制性内切核酸酶MspI、SmaI识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、CCC↓GGG。下列叙述错误的是（    ） A．限制酶能识别双链DNA中特定核苷酸序列，并断开特定位置的磷酸二酯键 B．若用MspI酶切割BSSL基因产生的黏性末端只能用E.coliDNA连接酶连接 C．若要将外源基因导入细胞，可以用质粒、噬菌体、动植物病毒等作为载体 D．若用限制酶Sma I完全切割图中DNA片段，其产物长度为339 bp、9844 bp、533 bp 9．（22-23高二下·湖南·期中）多重PCR-电泳技术，是指同一个PCR反应体系中包含多对引物，各引物特异性地结合到相应的目的基因上，扩增产生不同长度的片段，再通过电泳进行分离和识别，从而对病原体进行鉴别检测。下列相关叙述错误的是（　　） A．多重PCR过程中，不同的引物之间不能互补 B．PCR和电泳都必须无菌条件下操作，防止外源DNA污染 C．该技术可同时进行多种病原微生物的检测 D．不同大小的DNA分子在电泳时，迁移的速率不同 二、不定向选择题 10．（24-25高二下·湖南衡阳·期中）下列关于基因工程中载体的说法，正确的是（    ） A．必须有一至多个限制酶切割位点 B．所有的质粒都可以作为基因工程的载体 C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子 D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA分子进行检测与鉴定的标记基因 11．（24-25高二下·湖南·期中）某研究小组利用转基因技术，将抗除草剂基因（bar基因）整合到野生型玉米Gata基因一端，如图1所示。为获得Gata－bar基因纯合子，将转基因玉米自交，收获F1。图2是利用PCR技术检测F1中4个个体的电泳结果。下列相关分析正确的是（    ） A．从F1细胞中提取总DNA，再利用PCR技术检测 B．PCR扩增时选择的引物组合是引物1和引物3 C．电泳时，琼脂糖凝胶的加样孔在图2的A端 D．图示1～4号F1个体中，符合要求的是2号个体 12．（24-25高二下·湖南·期中）限制酶的酶切产物可通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。如图1表示某DNA片段及限制酶酶切位点，用限制酶XhoⅠ和SalⅠ分别处理该DNA片段后，酶切产物电泳分离的结果如图2所示。下列叙述正确的是（    ） A．实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行灭菌处理 B．在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小、构象等有关 C．泳道①②分别是用限制酶XhoⅠ和限制酶SalⅠ处理得到的产物 D．用限制酶XhoⅠ和限制酶SalⅠ同时处理该DNA片段，可得到6种电泳产物 13．（22-23高二下·湖南长沙·期中）以下是有关分离与鉴别DNA的技术，其中说法正确的是（    ） A．DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最大 B．PCR的两种引物一般20-30个核苷酸，过长易发生引物内部的折叠 C．对PCR循环30次之后的DNA分子进行琼脂糖凝胶电泳，与标样对照判断是否存在目的基因片段 D．琼脂糖凝胶电泳从阴极加样，分子量较大的接近于加样孔 三、非选择题 14．（24-25高二下·湖南长沙·期中）基因工程中，为满足不同需要，除了常规PCR，还有不对称PCR、反向PCR、重叠延伸PCR等。 Ⅰ、不对称PCR常用来制备单链DNA分子探针。不对称PCR中使用的一对引物的量不相等，其中少的称为限制性引物，多的称为非限制性引物。下图中，β链为所需的DNA分子探针，已知图示DNA有1个，前10次循环的产物为双链DNA，后10次循环的产物是单链DNA，结合图示信息回答以下问题： Ⅱ、反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。结合下图信息回答相应问题： (1)DNA聚合酶从引物的_______端开始连接脱氧核苷酸，图中非限制性引物是引物_______。 (2)此过程需要非限制性引物的个数为_______。 (3)设计引物时，序列中的GC碱基含量越高，退火温度_______。结合图中信息，应选择以上引物中的___________（填两种）进行PCR扩增。 (4)通过反向PCR得到的产物是__________。 A．包含未知序列和所有已知序列的环状DNA分子 B．包含未知序列和所有已知序列的链状DNA分子 C．包含部分已知序列和未知序列的环状DNA分子 D．包含部分已知序列和未知序列的链状DNA分子 15．（24-25高二下·湖南长沙·期中）请回答下列问题： (1)D分子经限制酶切割产生的DNA片段通常末端有___________和___________。 (2)PCR技术扩增目的基因的条件是：模板DNA、四种脱氧核苷酸，___________、___________等。 (3)进行动物细胞培养时，为什么要选择10代以内的细胞？___________。 (4)早期胚胎培养时，培养液的成分有有机盐、___________、激素、___________、氨基酸、核苷酸以及动物血清等物质。 16．（24-25高二下·湖南·期中）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图所示。请回答下列问题。 (1)分别进行PCR扩增片段与片段时，配制的两个反应体系中不同的有___________，扩增程序中最主要的不同是___________。 (2)有关基因序列如下表所示，引物应在下列选项中选用___________。 EGFP基因序列：：5'—ATGGTGAGCAAGGGC……GACGAGCTGTACAAG—3' AnB1基因序列：5'—CATGTCCAGCTGCAG……CCAAAACCACAACCA—3' A．ATGGTG……CAACCA B．TGGTTG……CACCAT C．GACGAG……CTGCAG D．CTGCAG……CTCGTC (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一操作无需使用的酶主要有___________。 (4)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物和进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有___________。 (5)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是___________。 地 城 考点02 基因工程的基本操作程序 一、单项选择题 1．（24-25高二下·湖南长沙·期中）目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定与检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是（　　） ①检测受体细胞中是否有目的基因          ②检测受体细胞中是否有致病基因 ③检测目的基因是否转录出了mRNA        ④检测目的基因是否翻译成蛋白质 A．①②③ B．②③④ C．①③④ D．①②④ 2.（24-25高二下·湖南长沙·期中）科研人员将黄粉虫细胞内的抗冻蛋白基因TmAFP（图1）与改造后的Ti质粒（图2）构建基因表达载体，导入拟南芥细胞中培育拟南芥耐低温新品种，图3表示相关限制酶识别序列和切割位点。[Kanr为卡那霉素抗性基因；Bar为草铵膦（一种除草剂）抗性基因；Ampr为氨苄青霉素抗性基因；农杆菌对卡那霉素、氨苄青霉素敏感]。下列说法错误的是（　　） A．利用1个TmAFP基因进行PCR扩增，共消耗126个引物分子，则该过程DNA扩增了6次 B．构建基因表达载体时，选用限制酶BamHI和HindⅢ切割TmAFP基因所在的DNA和质粒 C．利用含卡那霉素的培养基对成功导入含重组质粒的农杆菌进行筛选 D．采用农杆菌转化法将重组质粒导入拟南芥细胞，需用Ca2+处理拟南芥细胞使其成为感受态细胞 3．（24-25高二下·湖南常德·期中）下图为构建基因表达载体和检测受体细胞是否含有目的基因的过程示意图，其中LacZ基因控制合成的酶可以分解物质X产生蓝色物质，使平板上形成的菌落呈蓝色，否则菌落为白色。下列叙述错误的是（　　） A．①过程需要使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶 B．②过程可用Ca2+处理进而有利于重组DNA的吸收 C．③过程的培养基中除基本成分外仅需加入物质X D．实验结果形成白色菌落的大肠杆菌中含有目的基因 4．（24-25高二下·湖南·期中）蛛丝有超强韧性，其主要成分蛛丝蛋白是一种特殊的纤维蛋白，具有独特的结构与性质。科学家将蛛丝蛋白基因转入羊的受精卵中以生产蛛丝蛋白，下图是蛛丝蛋白基因的DNA片段。下列说法错误的是（    ） A．若受体细胞为大肠杆菌，则蛛丝蛋白可能需要进一步加工才具有相应的功能 B．科学家需将蛛丝蛋白基因与乳腺中特异性表达的基因的启动子等调控元件重组在一起 C．用PCR技术扩增图中的蛛丝蛋白基因，可选择图中的引物①和④ D．若一个蛛丝蛋白基因扩增了4次，则共消耗引物30个 5．（22-23高二下·湖南长沙·期中）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段（Fn与R），将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。下列有关叙述错误的是（    ）    A．为将扩增后的产物定向插入载体，指导荧光蛋白基因表达，需用MunI和XhoI处理载体 B．从产物扩增到载体构建完成的整个过程需6种酶 C．将构建的载体导入去除BCL1IA基因的受体细胞，可能出现含F1与R扩增产物的受体细胞无荧光，而含F2-F7与R扩增产物的受体细胞有荧光 D．向培养液中添加适量的雌激素，可导致部分受体细胞不再有荧光 6．（23-24高二下·湖南岳阳·期中）OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图所示），利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述正确的是（　　） A．可用抗原﹣抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量 B．四个基因转录时都以DNA的同一条单链为模板 C．应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞 D．四个基因都在水稻叶绿体内进行转录翻译 7．（21-22高二下·湖南长沙·期中）CRISPR/Cas9是一种生物学工具，能够通过“剪切和连接”脱氧核糖核酸（DNA）序列的机制来编辑基因组。这套系统源自细菌的防御机制，是一种对任何生物基因组均有效的基因编辑工具。CRISPR/Cas9基因组编辑系统由向导RNA（也叫sgRNA）和Cas9蛋白组成，向导RNA识别并结合靶基因DNA．Cas9蛋白切断双链DNA使其形成两个末端。这两个末端通过“断裂修复”重新连接时通常会有个别碱基对的插入或缺失，从而实现基因敲除，如图所示。CRISPR/Cas9基因组编辑技术有时存在编辑出错而造成脱靶。下列叙述正确的是（　　）    A．Cas9蛋白能作用于脱氧核糖和碱基之间的化学键 B．对不同目标DNA进行编辑时，使用Cas9蛋白和相同的sgRNA进行基因编辑 C．CRISPR/Cas9基因组编辑系统使细菌获得抵抗溶菌酶或抗生素的能力 D．其他DNA序列含有与 sgRNA互补配对的序列，会造成 sgRNA错误结合而脱靶 8．（22-23高二下·湖南·期中）甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质，将甜蛋白基因导入番茄可提高番茄甜味，改善番茄品质。下图是甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶切割位点示意图。下列叙述正确的是（　　） A．可使用XbaⅠ和HindⅢ处理切割甜蛋白基因和Ti质粒 B．可使用XbaⅠ和EcoRⅠ处理切割甜蛋白基因和Ti质粒 C．启动子能被DNA聚合酶识别，启动转录 D．重组质粒成功导入受体细胞后，受体细胞能合成卡那霉素 二、不定向选择题 9．（24-25高二下·湖南·期中）如图表示利用新冠病毒包膜表面的S蛋白制备疫苗的相关过程，SUC2是酵母菌的蔗糖转化酶基因，其表达产物存在于液泡中，可以催化蔗糖水解成单糖被细胞利用，其中m、n分别是启动子和终止子。下表中是可供选择使用的限制酶及其识别序列和酶切位点。据图表推测，下列叙述错误的是（    ） 限制酶 BamHⅠ NheⅠ NcoⅠ SphⅠ Sau3AⅠ 识别序列和酶切位点     ↓ 5'-GGATCC-3'     ↓ 5'-GCTAGC-3'     ↓ 5'-CCATGG-3'       ↓ 5'-GCATGC-3'   ↓ 5'-GATC-3' A．过程①所需的酶是DNA聚合酶 B．过程②所使用的两种限制酶是Sau3AⅠ和NcoI C．据图推测，目的基因S转录的模板链最可能是b链 D．SUC2可作标记基因，对导入B的酵母菌进行筛选 10．（24-25高二下·湖南·期中）乙肝基因工程疫苗的生产过程如图所示，其中质粒上箭头所指部位为相应的限制酶的切割位点。质粒中LacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的X-gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。下列相关分析错误的是（    ） A．过程①选择BamHⅠ和EcoRⅤ切割目的基因和质粒，可避免目的基因和质粒反向连接 B．过程②利用农杆菌的T-DNA可将重组质粒上的目的基因转移到大肠杆菌细胞的DNA上 C．筛选大肠杆菌的培养基中需要添加青霉素和X-gal，便于重组质粒的筛选 D．若添加X-gal的培养基上的大肠杆菌菌落呈现白色，则说明该大肠杆菌成功导入重组质粒 11．（22-23高二下·湖南长沙·期中）蜘蛛丝（丝蛋白）有着超强的抗张强度，可制成防弹背心、降落伞绳等。科学家研究出集中生产蜘蛛丝的方法——培育转基因蜘蛛羊。以下叙述正确的是（    ） A．从蜘蛛细胞中直接提取的丝蛋白基因与逆转录获得的丝蛋白基因，两者的主要区别在于启动子、终止子 B．在PCR中获取引物可以从GenBank获得丝蛋白基因序列，设计两个不同的引物 C．该过程需要在蜘蛛羊的泌乳期定向诱导蜘蛛丝蛋白基因基因选择性表达 D．可以使用PCR等技术检测山羊的染色体DNA是否插入了丝蛋白基因或者检测丝蛋白基因是否转录出mRNA 三、非选择题 12．（24-25高二下·湖南永州·期中）PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为（碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。请分析并回答下列问题： (1)为获取phb2基因，先提取该动物肝脏组织的总RNA，再经_____过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板。 (2)图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，设计引物时需要在两引物的_____（填“5’端”或“3’端”）分别引入_____两种限制酶的识别序列。 (3)设计并合成引物后，即可通过PCR仪扩增目的基因，之后进行基因表达载体的构建。其操作步骤是，先用前述两种限制酶切割phb2基因和载体；再用_____（填“E。coliDNA连接酶”或“连接酶”）进行连接。 相关限制酶的识别序列及切割位点 名称 识别序列 名称 识别序列 HindⅢ EcoRI PvitⅡ PstI 5’—CTGC↓AG—3’ KpnI BamHI 注：识别序列只展示了单链，其中“”表示切割位点 (4)将转化后的大肠杆菌接种在含_____的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图2，分析可知：_____号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。 注：为指示分子大小的标准参照物；小于的DNA分子条带未出现在图中 13．（24-25高二下·湖南郴州·期中）RDX是某种军用弹药使用后残留的危险污染物，研究人员将源于细菌的RDX降解酶基因XplA和XplB插入柳枝稷草染色体中，让转基因植物修复因军用炸药RDX污染的土壤。基因XplA和XplB与引物结合位点及模板链分布情况如图1所示。图2为筛选含融合基因表达载体的农杆菌的示意图。回答下列问题：    (1)从细菌中提取DNA的过程中，使用预冷酒精(体积分数为95%)初步分离DNA与蛋白质，原理是___________然后再利用 PCR的方法从提取的 DNA中获取目的基因，PCR的反应条件为94℃、30s，55℃、30s，72℃、1min，其中55℃、30s的过程称为复性，进行此过程的目的___________。 (2)若要构建图2中的融合基因，应选择图1的引物组合___________，以便通过PCR检测其中的Xp1A和Xp1B基因形成的融合基因是否准确。 (3)将融合基因与农杆菌Ti质粒的T-DNA重组，构建基因表达载体用Ca2+溶液处理农杆菌后使其处于___________的生理状态，将其与基因表达载体混合一段时间，在添加___________的培养基中，经筛选得到含基因表达载体的农杆菌。通过农杆菌的___________作用，就可以使融合基因进入植物细胞。 (4)用上述农杆菌侵染柳枝稷草愈伤组织，经组织培养获得植株，为检测转基因植株是否含有XplA和XplB的表达产物，可采用的方法是___________。 14．（24-25高二下·湖南·期中）某科研团队为了验证农杆菌转化植物的功能，利用葡萄植株上的冠瘿瘤为材料，根据科学史上一系列研究进行了以下实验。请回答下列问题。 (1)切下冠瘿瘤的一部分，经破碎离心后，取液体部分，稀释后利用___________法接种至LB固体培养基中，获得较好分散度的单菌落。 (2)分别取平板上的每个单菌落制成菌悬液后，侵染植物愈伤组织，结果发现只有部分菌落的菌种能致瘤，说明冠瘿瘤表面或内部含有农杆菌与其他微生物。接种一段时间后杀死农杆菌，发现冠瘿瘤的生长不再依赖于农杆菌，且冠瘿组织的无限生长不需要外源的植物激素，原因是___________。 (3)取其中致瘤的农杆菌菌种，接种至LB液体培养基进行扩大培养，48h后提取其中的DNA，并通过电泳分离纯化得到其中的质粒DNA，发现质粒DNA分子量大于处在相同位置的线性MarkerDNA，说明等分子量的___________迁移速率更大。 (4)科研团队还研究了质粒中Vir系列基因的作用，发现敲除农杆菌内质粒上的VirC与VirD基因后，无法合成___________酶从而无法在农杆菌内切割与复制得到游离的T-DNA． (5)将农杆菌分为两组，分别将GFP(绿色荧光蛋白)基因连接至甲组农杆菌质粒的T-DNA内部基因启动子下游与乙组农杆菌质粒的T-DNA外部基因启动子下游。侵染愈伤组织后，可在甲组___________中检测到绿色荧光，乙组该处检测到不绿色荧光，原因是___________。 15．（24-25高二下·湖南·期中）幽门螺杆菌（HP）与胃炎、胃食管反流病等多种疾病有关。Ipp20基因作为幽门螺杆菌的核心功能基因，在疫苗研发中具有重要价值。实验人员以Ipp20基因为目的基因，通过基因工程制备HP疫苗的过程如图所示。回答下列问题： (1)据图分析，使用限制酶切割质粒时________（填“能”或“不能”）选择限制酶BamHⅠ，理由是_______。 (2)过程①需要的原料是________。为了使质粒和Ipp20基因正确连接，在设计引物时需要在引物的________（填“5’”或“3’”）端添加限制酶的识别序列。 (3)实验人员通过过程③将重组质粒导入大肠杆菌体内进行扩增。该过程中，一般先用________处理大肠杆菌，有利于大肠杆菌吸收DNA。 (4)为了筛选成功导入重组质粒的大肠杆菌，过程④将大肠杆菌培养在含有________的培养基A中，能在其中生长的大肠杆菌即可能导入了重组质粒的大肠杆菌。初步筛选出的大肠杆菌存在导入空质粒（不含有Ipp20基因）或导入重组质粒的情况。实验人员用影印培养法（将培养基A上的菌落全部转移到丝绒面上，再将丝绒面印在培养基B上）来进行筛选。结合图中信息分析，培养基B添加了________，能用于制备HP疫苗的大肠杆菌菌落是________（填图中数字）。 16．（24-25高二下·湖南·期中）甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质。为改善番茄口感和品质，科学家采用农杆菌转化法将某种甜蛋白基因成功导入番茄细胞，获取转基因番茄。完成下列问题： (1)PCR扩增甜蛋白基因时，微量离心管中需加入的物质有：模板、特异性引物、原料、含Mg2+缓冲液、______________。PCR过程中特异性引物的作用是__________。 (2)利用PCR技术，可以鉴定甜蛋白基因是否转录。若甜蛋白基因的mRNA部分序列如下，根据下述序列应选择引物______（填字母）进行PCR。 5′—AUGGCU……AGGAAC—3′ A．引物：5′—TACCGA—3′ B．引物：5′—GTTCCT—3′ C．引物：5′—AUGGCU—3′ D．引物：5′—ATGGCT—3′ (3)利用转基因技术获得转基因番茄的核心步骤是构建基因表达载体，用限制酶切割含有甜蛋白基因的DNA片段时，不用限制酶BamHⅠ的原因是_______________。作为科研人员该过程选择_____________限制酶切割甜蛋白基因和Ti质粒最合适。 (4)为了让甜蛋白基因进入受体细胞并整合到受体细胞的染色体DNA上，可以将甜蛋白基因插入Ti质粒的T-DNA中。将基因表达载体导入农杆菌前，需用Ca2+处理农杆菌，其目的是_______________。 17．（23-24高二下·湖南岳阳·期中）赖氨酸是人体细胞不能合成的必需氨基酸。科学家把某种必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因（R）导入玉米中，使玉米中赖氨酸的含量提高30%。回答下列问题。    (1)利用PCR技术扩增R基因时，需要在一定的缓冲液中才能进行，其中需要加入__________酶和激活该酶所需的 __________。为了特异性扩增R基因序列，需根据 ____________________设计特异性引物。 (2)在构建基因表达载体时，若为了避免R基因和质粒的自连或反向连接，提高重组效率，应该选择的限制酶是 _______________。 (3)随着转化方法的突破，农杆菌侵染玉米这种单子叶植物也取得了成功。科研人员从新鲜的玉米叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，当农杆菌侵染玉米细胞后，能将 _________上的T﹣DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到 ________________。 (4)检测R基因是否表达的方法是 ___________。 (5)在基因工程中若要培养转基因小鼠，将基因表达载体导入受体细胞常用的方法是 __________，常用的受体细胞是 ________。 地 城 考点03 基因工程的应用 一、单项选择题 1．（24-25高二下·湖南衡阳·期中）下列关于转基因动植物的描述，错误的是（    ） A．可将外源生长激素基因导入动物细胞内，提高动物的生长速率 B．可将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，降低乳汁中乳糖的含量，进而改善畜产品的品质 C．可利用转基因植物来建立某些人类疾病的转基因植物模型 D．可以利用转基因动物作为器官移植的供体 2．（23-24高二下·湖南·期中）基因工程自20世纪70年代兴起后，在农牧业、医药卫生和食品工业等方面得到了飞速的发展。下列关于基因工程应用的叙述，正确的是（　　） A．通过将肠乳糖酶导入到奶牛乳腺细胞中，以降低乳汁中乳糖含量，从而解决部分人群的乳糖不耐受问题 B．通过X射线、紫外线综合处理，将青霉素产量低的菌种培育成产量高的菌株属于基因工程技术的应用 C．通过制备山羊膀胱生物反应器，使人乳铁蛋白基因只存在于膀胱细胞中，进而可以从尿液中分离纯化出所需要的人乳铁白蛋白，实现大量制备的目的 D．与人细胞分泌的天然生长激素相比，将人的生长激素基因导入大肠杆菌制备的工程菌无法对生长激素进行正常的加工和修饰 3．（24-25高二下·湖南长沙·期中）草甘膦是某种除草剂的主要成分.如图表示研究人员利用草甘膦抗性基因（CP4基因）培育抗草甘膦的灿稻新品种的过程。下列相关叙述错误的是（　　） A．构建基因表达载体时，应将CP4基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA中 B．将重组Ti质粒导入农杆菌前，用处理农杆菌可提高转化率 C．若检测出粒稻的染色体DNA上插入了CP4基因，则该抗草甘膦新品种培育成功 D．在喷洒除草剂的农田中，种植抗草甘膦籼稻新品种对提高作物产量有重要意义 4．（21-22高二下·湖南长沙·期中）苏云金芽孢杆菌会合成Bt蛋白，在棉铃虫的碱性肠道环境中，Bt蛋白在特定的酶作用下产生毒性，导致棉铃虫死亡。我国科学家利用农杆菌转化法培育转Bt蛋白基因的抗虫棉。下列说法错误的是（    ） A．可根据苏云金杆菌的DNA特定序列设计引物，用PCR技术扩增获得Bt基因 B．需要将Bt基因整合到Ti质粒的T-DNA上，从而构建基因表达载体 C．Bt基因可以整合到棉花染色体上，抗虫棉自交后代不会发生性状分离 D．Bt毒蛋白具有高度专一性，对害虫天敌、人畜均无毒性，在环境中易分解 5．（22-23高二下·湖南邵阳·期中）植物生物反应器主要以整株植物、植物组织或植物悬浮细胞为加工场所，生产药物蛋白。叶绿体遗传转化体系是近年发展起来的一种新的植物生物反应器。叶绿体转化是以同源重组原理将外源目的基因整合到目标叶绿体基因组中的种方式，是一种高表达、安全性极高的遗传转化方法。下列相关叙述不正确的是（    ） A．植物生物反应器涉及的现代生物学技术是基因工程和植物细胞工程 B．构建的基因表达载体中含有叶绿体特异启动子，使得目的基因只能在叶绿体中表达 C．植物叶绿体表达体系可以防止转基因作物的目的基因通过花粉在自然界中扩散 D．把目的基因导入叶绿体DNA中，将来产生的配子一定含有此目的基因 二、不定向选择题 6．（24-25高二下·湖南邵阳·期中）科学家发现栽种含有抗除草剂基因的农作物后，会使附近的与其亲缘关系较近的野生植物也获得抗除草剂基因。下列说法正确的是（    ） A．野生植物通过自然杂交获得抗除草剂基因 B．野生植物发生了基因重组 C．基因工程不会导致基因污染 D．转基因生物会危及生物圈的稳定 7．（24-25高二下·湖南常德·期中）蜘蛛丝（丝蛋白）被称为“生物钢”，有着超强的抗张强度，可制成防弹背心、降落伞绳等。蜘蛛丝还可被制成人造韧带和人造肌腱。科学家研究出集中生产蜘蛛丝的方法——培育转基因羊作为乳腺生物反应器。下列有关乳腺生物反应器的说法正确的是（    ） A．从转基因羊乳汁中提取的丝蛋白在自然界中是可以找到的 B．将丝蛋白基因直接导入羊乳腺细胞中即可获得乳腺生物反应器 C．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别等限制，受体来源更广泛 D．人们可以利用乳腺生物反应器生产所需要的药物 三、非选择题 8．（22-23高二下·湖南长沙·期中）科研人员为获得可用于生产基因工程的疫苗，将病毒外壳蛋白基因导入猪细胞中，然后通过核移植技术培育转基因猪，具体操作过程如图所示。回答下列问题： (1)在收集A细胞时需要用_____处理1号猪，选用该细胞的优点是_____（答两点）。为了使胚胎能够成功移植到2号猪子宫内，需要对2号猪进行_____处理。 (2)过程②体现了细胞膜的_____性，该转基因猪的培育过程运用了_____等技术。 (3)3号猪与1号猪相比，不同点主要是_____。 9．（21-22高二下·湖南·期中）生物柴油作为新型能源已经成为世界上应用最广泛、发展迅猛的可再生能源之一、研究人员利用基因工程的方法，将油料作物紫苏的产油基因DGAT1与含有氨苄青霉素抗性基因的PMD克隆质粒构建PMD一DGAT1重组质粒，然后导入大肠杆菌扩大培养；再提取出扩增的pMD-DGAT1克隆质粒，与pBI121空载体同时用Xbal，BamHI两种酶酶切，构建pB121一DGAT1表达载体：最后将表达载体导入四尾栅藻获得产油微藻，利用地热废水培养产油微藻不仅能生产生物柴油，还能治理地热废水。回答下列问题： (1)提取紫苏组织细胞RNA经过_____得到cDNA，再利用PCR技术扩增得到DGATI基因。在PCR扩增之前，对DGAT1基因进行一次预变性的目的是_____。 (2)在配制培养大肠杆菌的培养基时，要在培养基灭菌并冷却到30℃左右后，加入用无菌水配制的适宜浓度的氨苄青霉素溶液，氨苄青霉素不能与培养基一同灭菌的原因可能是_____。 (3)基因工程技术中的转化是指_____。将DGAT1基因插入到pBI121空载体的启动子与终止子之间的目的是_____。若用DGAT1基因探针检测产油微藻，能检测到细胞中的_____。判断产油微藻细胞中DGAT1基因是否成功表达，需要加入_____排行检测。 (4)为检测产油微藻对地热废水的去污能力，研究人员设计实验并得到相应实验结果如下表： 指标 总氮（mg/L） 总磷（mg/L） 氟化物（mg/L） 废水培养基 23．2 4．32 4．56 培养转基因产油微藻11天后 1．9 0．45 0．84 该实验不能说明产油微藻显著提高了去污能力。请进一步完善实验设计_____。 地 城 考点04 蛋白质工程的原理和应用 一、单项选择题 1．（24-25高二下·湖南长沙·期中）下列关于蛋白质工程的说法，错误的是（　　） A．蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子结构 B．蛋白质工程能定向改造蛋白质分子的结构，使之更加符合人类需要 C．蛋白质工程能产生自然界中不曾存在的新型蛋白质分子 D．蛋白质工程的操作起点是从预期的蛋白质功能出发，设计出相应的基因，并借助基因工程实现 2．（24-25高二下·湖南长沙·期中）多氯联苯（PCBs）是一类典型的具有持久性、蓄积性和高毒性特点的有机污染物，常大量吸附于土壤。科学家通过蛋白质工程改造微生物体内的相关酶来应对PCBs污染。下列关于此过程的叙述，正确的是（　　） A．改造后的酶只能在微生物体内发挥催化PCBs降解的作用 B．该工程的基础是氨基酸分子的结构规律及其与生物功能之间的关系 C．改造后的酶提高了对PCBs的降解速率，其最适温度也会大幅升高 D．将改造后的酶的基因导入合适的微生物宿主，构建的工程菌与原微生物相比，可更高效降解土壤中的PCBs 3．（24-25高二下·湖南·期中）T4溶菌酶是一种重要的工业用酶，但在温度较高时易失去活性，科学家研究发现，若将其第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，可在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成一个二硫键，提高T4溶菌酶的耐热性。对T4溶菌酶基因进行改造，导入酵母菌细胞内，可持续获得耐热T4溶菌酶。下列有关叙述不合理的是（    ） A．T4溶菌酶是否耐热取决于蛋白质的空间结构 B．通过改造基因获得耐热T4溶菌酶，属于蛋白质工程 C．改造T4溶菌酶基因需用到基因定点突变技术来进行碱基替换 D．基因工程和蛋白质工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质 4．（24-25高二下·湖南邵阳·期中）新型蛋白质进化模型EVOLVEpro可以利用氨基酸序列，仅通过少量学习和最低限度的实验测试来预测蛋白质空间结构，从而获得新型高活性蛋白质改造方案。下列有关说法正确的是（　　） A．通过EVOLVEpro得到的蛋白质还需要进行进一步的功能检测实验才可以投入生产 B．预测蛋白质结构需要依据肽链中肽键的结构、氨基酸的物理性质与结构 C．氨基酸是蛋白质的基本单位，氨基酸发生替换一定使蛋白质的结构和功能发生改变 D．EVOLVEpro在蛋白质工程广泛应用后将不再需要借助基因工程手段改造蛋白质 5．（22-23高二下·湖南长沙·期中）生物工程应用广泛，成果丰硕，下列对应工程技术应用正确的是（    ） A．利用乳腺反应器生产药物，属于基因工程与动物细胞工程 B．制造一种能降解石油的“超级细菌”属于发酵工程 C．利用苏云金芽孢杆菌制成生物农药属于基因工程 D．人工生产牛胰岛素属于蛋白质工程 6．（24-25高二下·湖南常德·期中）纤维素合酶（CesA）定位于质膜上，催化纤维素的合成。通过实验发现，改变CesA的第540位天冬氨酸、第742位天冬氨酸、第784位色氨酸会导致CesA活性明显降低，影响棉花的产量。下列叙述错误的是（　　） A．由葡萄糖组成的纤维素是植物细胞壁的组成成分 B．第540、742、784位氨基酸改变不会影响CesA的空间结构 C．氨基酸分子在核糖体上脱水缩合，形成CesA的肽链结构 D．可通过蛋白质工程提高CesA的活性，提高棉花纤维的品质 7．（23-24高二下·湖南长沙·期中）AK、DHDPS是玉米中合成赖氨酸的两种关键酶，赖氨酸达到一定浓度就会与两种酶结合抑制它们的活性，如图所示，因此玉米中赖氨酸含量比较低。将AK中第352位苏氨酸变成异亮氨酸，DHDPS中第104位天冬酰胺变成异亮氨酸，该变化影响了其与赖氨酸的结合，使玉米叶片和种子内游离的赖氨酸分别提高5倍和2倍。下列有关分析错误的是（    ） A．玉米中赖氨酸含量比较低与负反馈调节密切相关 B．要替换AK、DHDPS中的氨基酸需要通过改造相应基因来实现 C．改造后的AK和DHDPS 活性提高，导致玉米合成赖氨酸的能力增强 D．改造后的AK和DHDPS空间结构改变，与赖氨酸结合的能力降低 二、不定向选择题 8．（22-23高二下·湖南益阳·期中）腈水合酶（N0）广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1）。下列有关叙述正确的是（    ）。 A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一 B．加入连接肽需要通过改造基因来实现 C．获得N1的过程需要进行转录和翻译 D．自然界中的酶都可以通过蛋白质工程进行改造 9．（21-22高二下·湖南长沙·期中）蛋白酶应用于洗涤剂、制革及丝绸工业。某研究小组利用蛋白质工程将该蛋白酶中第188位丙氨酸替换为脯氨酸、第239位谷氨酰胺替换为精氨酸、第262位缬氨酸替换为亮氨酸，结果发现该酶的催化活性大幅度提高。下列叙述正确的是（    ） A．对枯草杆菌蛋白酶进行改造通过直接改造蛋白酶的分子结构来实现 B．通过基因工程和蛋白质工程生产的枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列相同 C．改造后的枯草杆菌蛋白酶可能使空间结构发生改变导致其催化活性提高 D．对枯草杆菌蛋白酶进行分子设计必须从预期蛋白酶的功能特点入手 三、非选择题 10．（23-24高二下·湖南株洲·期中）脂肪酶在食品工业中有着广泛的应用，食品生产常需要在高温条件下进行，天然脂肪酶难以满足生产需求。科学家对已知氨基酸序列的脂肪酶进行改造，获得了耐高温的脂肪酶，提高了食品工业的生产效率。回答下列问题。 (1)根据耐高温脂肪酶的结构特点，推测其氨基酸序列，然后重新设计新脂肪酶的基因序列，获得耐高温的脂肪酶的技术称为___。一般来说，新的脂肪酶基因脱氧核苷酸序列会有多种可能，其原因是__。 (2)在设计出耐高温的脂肪酶基因后，对其进行PCR扩增的过程包括_____、复性和延伸。延伸过程中由于DNA聚合酶的特性，子链延伸的方向为________。 (3)利用质粒将改造后的耐高温脂肪酶基因导入大肠杆菌，构建基因工程菌甲，若要检测工程菌甲中的耐高温脂肪酶基因是否成功表达，则需利用到___杂交技术，若出现杂交带，则说明基因能在工程菌内正常表达。 (4)利用工程菌甲生产耐高温脂肪酶的过程中，传代多次后，生产条件未变，但某子代菌株不再产生耐高温脂肪酶。分析可能的原因是___(答出两点即可)。 11．（24-25高二下·湖南常德·期中）绿色荧光蛋白（GFP）是由一条肽链组成的蛋白质，通过蛋白质工程技术可获得增强型荧光蛋白。某研究人员设计引物，通过3次PCR反应（一次PCR反应包括多轮循环）将一对突变碱基引入编码GFP的DNA片段（片段甲），获得了编码增强型荧光蛋白的DNA片段（目的基因）。实验过程如图所示，图中a、b、c、d表示引物，→表示5＇→3＇方向，■代表突变碱基。 回答下列问题。 (1)以片段甲为模板，通过两次独立的PCR反应（步骤①和步骤②在不同的试管中进行）分别获得DNA片段乙和丙，步骤①和步骤②所用的引物对分别是________、________。 (2)步骤③是将纯化的DNA片段乙和丙混合，经热变性、退火，得到产物X和Y；步骤④是在DNA聚合酶的催化下进行的延伸反应。步骤③的产物中能形成DNA片段丁的是________，原因是________。 (3)以DNA片段丁为模板，通过PCR反应扩增目的基因时，所选用的PCR引物为________。 (4)上述获得增强型荧光蛋白的过程利用了蛋白质工程技术，其基本思路是从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→________→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或________→获得所需要的蛋白质。 地 城 考点05 基因工程的综合 一、不定向选择题 1．（22-23高二下·湖南益阳·期中）下图为利用生物技术获得生物新品种的过程，有关说法正确的是（    ） A．A→B过程中用到的原料有4种，加入的引物有2种 B．A→B过程利用了DNA半保留复制原理，需要使用耐高温的DNA聚合酶 C．B→C为转基因绵羊的培育过程，常选用的受体细胞是卵母细胞 D．B→D为转基因植物的培育过程，其中④过程常用的方法是农杆菌转化法 二、非选择题 2．（24-25高二下·湖南永州·期中）下图所示为科学家采用不同方法培育良种牛的过程，为操作过程请据图回答有关问题。 (1)图中c操作的名称是_____，d、f操作的名称是_____。 (2)图中用到的激素是_____，其目的是获得更多的卵母细胞，卵母细胞受精后发育可得到早期胚胎；图中的早期胚胎处于胚胎发育的_____阶段，其中胚胎干细胞来源于_____（填数字标号）。 (3)过程常用的方法是_____。 3．（24-25高二下·湖南长沙·期中）苦荞中含有的黄酮类化合物具有降血糖、降血脂等功效。CHS是合成黄酮类化合物的关键酶。把经修饰过的CHS基因导入苦荞细胞中，培育高产黄酮苦荞品系。据图回答下列问题： (1)重组Ti质粒中启动子的作用是_________________________。 (2)图中的①过程常用Ca2+处理农杆菌，使其成为感受态细胞，即细胞处于一种_________________________的生理状态。 (3)若要检测修饰后的CHS基因是否插入苦荞细胞的DNA上，可以采用__________等技术。为了防止转基因作物的目的基因通过花粉转移到自然界的其他植物中，可设法将目的基因整合到受体细胞的_______________（填结构）中。 (4)某种苦荞因为受到病毒感染而减产，现需要以该苦荞为材料获得脱毒苗，宜选用其茎尖作为外植体，理由是________________________________________。 4．（24-25高二下·湖南长沙·期中）大米中铁含量极低，科研人员通过基因工程、植物组织培养等现代生物技术，培育出了铁含量比普通大米高60%的转基因水稻，改良了稻米的营养品质。如图为培育转基因水稻过程示意图，其中①～⑥为过程，EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ为限制酶。 (1)该转基因水稻培育过程中选取的目的基因是____________________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是__________。PCR反应体系的成分中能够决定复制特定DNA片段的是__________（填“模板”“引物”或“Taq DNA聚合酶”）；从引物设计的角度考虑，如果目的基因两侧没有酶切位点，用PCR技术__________（填“可以”或“不可以”）为目的基因设置酶切位点。 (2)完成图中①过程需选用__________限制酶处理Ti质粒和含目的基因的DNA。为了筛检成功导入重组质粒的农杆菌，1号培养基需要加入__________。诱导组织细胞失去分化的是__________号培养基。 (3)图中④⑤⑥过程，属于__________技术，该技术依据的基本原理（理论基础）是__________。 5．（24-25高二下·湖南长沙·期中）转基因植物中标记基因的剔除可有效防止基因污染，常用分离剔除法和重组剔除法进行剔除。分离剔除法是在转基因时将目的基因和标记基因分别构建在两个Ti质粒上，通过共转化得到转基因植物后让其自交得到不含标记基因的转基因个体；重组剔除法利用Cre/LoxP重组酶系统，Cre酶能有效剔除重组载体中含有标记基因的序列，只留下一个LoxP位点。回答下列问题： 说明：▲代表GOI基因，◆代表SMG基因 (1)分离剔除法中，将目的基因和标记基因分别构建在两个Ti质粒上，且都要插入Ti质粒的T-DNA序列内部，这是因为T-DNA具有__________的特性，从而确保目的基因和标记基因能够______。 (2)在分离剔除法中，得到共转化的转基因植物后进行自交，进而筛选出不含标记基因的转基因个体，该过程中发生的变异类型为________。从遗传角度分析，该过程与孟德尔______实验原理相似。 (3)重组剔除法利用Cre/LoxP重组酶系统，Cre酶能特异性地识别LoxP位点并剔除标记基因序列，仅留下一个LoxP位点。该种情况处理后的标记基因（见图2）在受体细胞中也无法表达，其原因是_________。该方法相较于分离剔除法，优势在于_______。 6．（24-25高二下·湖南·期中）引起人类肺炎的一种冠状病毒（nCoV）是一种单链RNA病毒，其包膜糖蛋白（GP）是该病毒侵染宿主细胞的关键蛋白，科学家利用大肠杆菌作为工程菌批量生产GP以制备疫苗，流程图如下。回答下列问题： 注：图中为四环素抗性基因；LacZ基因的表达产物能分解X－gal，使白色的大肠杆菌菌落变成蓝色。 (1)从nCoV基因组中分离的GP基因不能直接与质粒重组，其原因是______。过程①所需的原料及酶是______。 (2)构建的基因表达载体除目的基因、标记基因、复制原点外，还必须含有______等。过程③之前，先用处理大肠杆菌，目的是______。 (3)为筛选导入重组质粒的大肠杆菌，应在培养基中加入______和X－gal，筛选______（填“蓝色”或“白色”）菌落。 (4)利用抗原—抗体杂交技术检测大肠杆菌是否表达出目标产物时，应提取______，再用______进行抗原—抗体杂交。 (5)利用大肠杆菌生产疫苗的优点有______（答出2点）。 7．（24-25高二下·湖南邵阳·期中）番茄在运输和储藏过程中，会由于过早成熟而易腐烂。应用基因工程技术抑制某种促进果实成熟的激素的合成，可使番茄储藏时间延长，培育成耐储藏的番茄新品种。请回答下列问题。 (1)促进果实成熟的重要激素是___________。 (2)在培育转基因番茄的操作中，所用的“分子手术刀”是___________，基因的“分子缝合针”是_________，基因的“分子运输车”是___________。 (3)与杂交育种、诱变育种相比，通过基因工程来培育新品种的主要优点是____________，育种周期短，能克服远缘杂交不亲和的障碍。 8．（24-25高二下·湖南长沙·期中）炎症性肠病（IBD）是一种易导致结肠癌的慢性疾病，患者肠道内会产生硫代硫酸盐，且生成量与疾病严重程度呈正相关。为简化疾病诊断和精确用药，科研人员开发了智能工程菌。 (1)科研人员将抗炎蛋白基因与硫代硫酸盐特异性诱导激活的启动子P连接，构建出图1所示表达载体。先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于________的生理状态，再将表达载体导入其中，筛选得到菌株E。饲喂菌株E的IBD小鼠症状明显缓解。选用启动子P的优点是仅在IBD发生时才表达抗炎蛋白且表达量与________呈正相关，能精准治疗IBD． (2)科研人员拟向菌株E中导入新元件，得到菌株Ec，以通过观察饲喂菌株Ec的小鼠粪便中的荧光情况来诊断IBD严重程度。制备新元件有图2所示两种方案。 ①与方案1相比，方案2的主要优势是排除不同的小鼠粪便样品中_________对诊断结果的影响。 A．Ec菌数量差异    B．EC菌活性差异    C．硫代硫酸盐含量 ②利用方案2所获得的EC菌饲喂IBD小鼠后，若粪便样品中仅发红色荧光的菌为x个，同时发红色和绿色荧光的菌为y个，则反映IBD发病程度的数学表达式为_______。 (3)硫代硫酸盐易被分解，因此EC菌荧光情况的观察只能反映观察时刻的情况。为了让曾经患过IBD的情况被记录下来，科研人员继续向菌株EC中导入含图3所示元件的表达载体，得到智能工程菌R。正常的LacZ基因编码的蛋白可使大肠杆菌菌落在含X-gal（无色）的培养基上呈现蓝色。突变基因A-LacZ无法表达LacZi酶，B-sgRNA能使突变基因A-LacZ恢复正常序列。 给小鼠饲喂智能工程菌R后，收集小鼠粪便中的工程菌R，将工程菌R涂布在含____________的平板上，若________，则说明小鼠曾患IBD． 9．（24-25高二下·湖南长沙·期中）P蛋白是植物逆境响应过程中的重要物质，在对该蛋白研究的过程中，科研团队利用无缝克隆技术将P蛋白基因与GUS基因（一种报告基因，基因工程中用来指示外源基因的表达情况）融合，通过农杆菌转化法导入其他作物进行研究，相关过程如图所示。    (1)无缝克隆时，利用T5核酸外切酶水解DNA，其目的是形成_______。无缝克隆时所需的酶除T5核酸外切酶外还有_______。用无缝克隆技术构建GUS-P融合基因的关键是引物R2的5＇端序列与引物_________互补。 (2)为了利用农杆菌转化法将GUS-P融合基因导入植物细胞，需要先将融合基因插入Ti质粒的________中。 (3)Ti质粒的结构如下图所示，若GUS-P融合基因拼接处存在XbaⅠ的识别序列，为使融合基因和Ti质粒高效连接，且使P基因、GUS基因和M基因都正确表达，应用__________两种限制酶对Ti质粒进行酶切，并在GUS-P融合基因两端添加________两种限制酶的识别序列。    10．（23-24高二下·湖南常德·期中）2019年新冠疫情爆发以来，疫情防控成为社会关注的热点问题。下图所示某科研团队运用基因工程研制新冠病毒疫苗的过程。质粒中lacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。回答下列问题： (1)获取目的基因时，首先提取新冠病毒的RNA，再通过逆转录过程获得cDNA，该过程需要的酶是_____。 (2)图中过程①有两种限制酶选择方案（注：图中几种限制酶切割产生的末端不同）：方案一：选用1种限制酶；方案二：选用2种限制酶，最佳选择是________________________________ ；方案二优于方案一的原因是________________________________。 (3)需要用一定浓度的________处理大肠杆菌，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将重组质粒导入其中。筛选含重组质粒的大肠杆菌时，须在培养大肠杆菌的通用培养基中加入_____________________，培养一段时间后，挑选出______色的菌落进一步培养获得大量目的菌。 (4)利用PCR技术获取目的基因时，PCR扩增仪中要加入缓冲液、目的基因、引物、___________、_________等。据下图分析，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的____________________。 11．（23-24高二下·湖南·期中）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。    (1)基因工程中，为了防止插入片段的反向连接，对载体一般采用__________（填“单酶切”或“双酶切”）。将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成除使用上述限制酶外，还需使用________酶。 (2)基因表达载体必须含有的组分是________，将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是________________。 (3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于________________。 12．（22-23高二下·湖南益阳·期中）如图是将乙肝病毒表面主蛋白基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程图。巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母，能将甲醇作为其唯一碳源。该酵母菌体内无天然质粒，科学家改造出了图中所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。已知当甲醇作为唯一碳源时，该酵母菌中AOX1基因受到诱导而表达[5′AOX1和3′AOX1（TT）分别是AOX1基因的启动子和终止子]。请分析回答下列问题： (1)为实现HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该选择____________切割质粒，并在HBsAg基因两侧的A和B位置接上_______________，这样设计的优点是___________。 (2)酶切获取HBsAg基因后，需用____________将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取____________。 (3)步骤3中应选用限制酶____________来切割重组质粒以获得重组DNA，然后再将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。 (4)为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入________以便筛选；若要检测转化后的细胞中是否含有HBsAg基因转录产物，可以用________技术进行检测。 13．（22-23高二下·湖南邵阳·期中）人的血清白蛋白（HSA）在临床上需求量很大，通常从人血中提取。但由于艾滋病病毒（HIV）等人类感染性病原体造成的威胁与日俱增，使人们对血液制品顾虑重重，图一是以基因工程技术获取HSA的两条途径，其中报告基因表达的产物能催化无色物质K呈现蓝色。图二为HSA基因两侧的核苷酸序列。图三为相关限制酶的识别序列和切割位点。据图回答下列问题：        (1)基因工程的核心步骤是____________。 (2)采用PCR技术扩增HSA基因，根据图二分析，需选择的一对引物序列是______ A．引物Ⅰ是5′-AATGGATCCTTC-3′，引物Ⅱ是5′-GAGAATTGAATG-3′ B．引物Ⅰ是5′-AATGGATCCTTC-3′；引物Ⅱ是5′-CATTCAATTCTC-3′ C．引物Ⅰ是5′-GAAGGATCCATT-3′，引物Ⅱ是5′-GTAAGTTAAGAG-3′ D．引物Ⅰ是5′-GAAGGATCCATT-3′，引物Ⅱ是5′-GAGAATTGAATG-3′ (3)依据图一、图二和图三分析，切割含HSA基因的DNA片段选用的限制酶是________________________；切割质粒应选用的限制酶是______________________________。 (4)图一过程①中需将植物细胞与______混合后共同培养，旨在让______整合到植物细胞染色体DNA上，除尽农杆菌后，还须转接到含______的培养基上筛选出转化的植物细胞。 14．（22-23高二下·湖南怀化·期中）甘蓝型油菜中，抑制PEP基因的表达可提高油菜籽的含油量。通过基因工程将PEP基因反向连接在启动子后，构建转反义PEP基因油菜是提高油菜籽含油量的常用技术路径。请回答下列问题： (1)为将PEP基因反向连接在启动子后，构建反义PEP基因，需要将限制酶酶切位点设计在引物上，PEP基因的上游引物和下游引物中应分别引入________酶切位点。 (2)用激光照射油菜愈伤组织时，可在细胞膜上打出一个穿孔，转反义PEP基因表达载体由此小孔进入油菜细胞，几秒钟后小孔封闭，该过程体现了细胞膜具有____________。目的基因表达载体进入细胞后，Ti质粒上的T－DNA区段可转移到油菜细胞的基因组中。 (3)筛选时，需在油菜愈伤组织培养基中加入__________进行初步选择。在激光照射下，存活的细胞一般会发出______________。为检测反义PEP基因是否整合到染色体上，研究者通常检测细胞中是否存在ntp基因，而不检测PEP基因。不直接检测PEP基因的原因是________________。 15．（22-23高二下·湖南怀化·期中）回答下列利用转基因动物生产药物的问题： (1)家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力。将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可提取干扰素用于制药。为使干扰素基因在家蚕细胞中高效表达，需要把干扰素基因片段正确插入表达载体的__________和___________之间。采用__________技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。 (2)若要获得含有人干扰素基因的转基因牛，将基因表达载体导入受体细胞。导入并培养成功后，该基因在________（填“任意体细胞”或“乳腺细胞”）中表达。构建基因工程表达载体时，若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生______（填“相同”或“不同”）黏性末端的限制酶。 16．（22-23高二下·湖南长沙·期中）人乳头瘤病毒HPV是双链DNA病毒，可以引起人皮肤黏膜上皮增生。HPV病毒的DNA分子与健康细胞的细胞核结合，利用细胞产生出两种蛋白E6、E7，它们会附着在抑癌基因p53和pRb上，并关闭它们的功能。默沙东九价HPV疫苗是利用酿酒酵母菌进行生产。 (1)相较于其他模式生物而言，酵母菌具有___________________________等特点，能更快获得工程目标。 (2)下图为重组质粒构建的过程，其中AvrⅡ的酶切序列与位点是C↓CTAGG；SnaBI的酶切序列与位点是TAC↓GTA；SacI 的酶切序列与位点是GAGCT↓C；BglII 的酶切序列与位点是 A↓GATCT。在对HPV的DNA进行PCR扩增时，需要设计两种引物以保证目的基因和质粒有相同的限制酶识别序列，根据选择的质粒及各限制酶识别序列，引物中需要有序列___________________。将得到的重组质粒置于含有Ca2+的酿酒酵母培养液中，酵母菌吸收后，接种到___________________培养基上进行初步筛选，得到含有该质粒的酵母菌，挑取菌落转移到96孔板上培养，利用___________________技术鉴定筛选确实表达了HPV的E6、E7蛋白质的酿酒酵母，再进行扩大培养。 (3)在宫颈癌筛查中有HPV检查，取病宫颈组织和局部粘液、分泌物进行HPV-DNA检测。病毒DNA的检测一般采取Real-time PCR技术即实时荧光测序（如下图所示），需要的物质有___________________、4种脱氧核苷酸、患者的组织或分泌物、水、缓冲液、两种引物 。探针序列含有HPV的特定序列，随着PCR循环次数的增加，很快就检测到了荧光，说明该患者___________________（有\没有）HPV病毒。 17．（22-23高二下·湖南·期中）下图是获得转基因动物和植物的流程图，请据图回答： (1)培育转基因动物和植物的核心工作是__________。 (2)图示获得大量目的基因的方法是__________，若模板双链DNA的数量为n个，经过32次循环需要消耗的引物数量是__________。 (3)图中过程③使用的激素是__________。过程⑥常用的方法是__________。 (4)研究人员按照上图所示将白羊草的抗旱基因转入莴苣细胞中，培育出转基因莴苣，欲进一步确定白羊草的抗旱基因与转基因莴苣的抗旱性是否有关，请写出简要的实验设计思路。__________。 18．（22-23高二下·湖南·期中）某种病毒可通过其S蛋白和RBD蛋白与人体细胞表面的受体结合而进入细胞，是宿主抗体的重要作用位点。下图是科研人员利用该病毒S蛋白基因和RBD蛋白基因，研制该病毒双抗原疫苗的技术路线。 (1)PCR扩增时，需在______催化下，在两种引物的______端进行DNA链的延伸，获得扩增产物。 (2)为使S-RBD基因能与pX质粒相连接，并在工程菌中表达时先合成S蛋白，则PCR过程中，应在引物1的5′端添加的限制酶序列是______。 (3)将重组pX质粒导入工程菌前，需用钙离子处理工程菌，使其处于一种______的生理状态，便于重组质粒的导入。 (4)在工程菌的筛选时，可先后用两种抗生素进行影印培养实验（即先将工程菌接种到培养基A上，待长出菌落后使用无菌的绒毡布压在培养基A的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B上），则培养基A上应添加的抗生素为______（填“青霉素”或“四环素”）。若培养基B中有存活的菌落，则这些菌落的细胞内______（填“含”或“不含”）S-RBD基因。鉴定pX质粒和重组pX质粒是否导入工程菌还可以采用的方法是______。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题03 基因工程 5大高频考点概览 考点01 重组DNA技术的基本工具 考点02 基因工程的基本操作程序 考点03 基因工程的应用 考点04 蛋白质工程的原理和应用 考点05 基因工程的综合 地 城 考点01 重组DNA技术的基本工具 一、单项选择题 1．D 2.C 3．B 4．D 5．B 6．C 7．B 8．B 9．B 二、不定向选择题 10．AD 11．ACD 12．ABD 13．BC 三、非选择题 14．（24-25高二下·湖南长沙·期中） (1) 3' I (2)11×210-1 (3) 越高 1和4 (4)B 15．（24-25高二下·湖南长沙·期中） (1) 平末端 黏性末端 (2) 引物 耐高温的DNA聚合酶 (3)保持细胞正常的二倍体核型 (4) 无机盐 维生素 16．（24-25高二下·湖南·期中） (1) 模板、引物 引物的设计 (2)CD (3)限制酶、DNA连接酶 (4)P3、P4 (5)电泳只能测大小(长度)，不知道具体序列 地 城 考点02 基因工程的基本操作程序 一、单项选择题 1．C 2.D 3．C 4．C 5．C 6．A 7．D 8．A 二、不定向选择题 9．AC 10．AB 11．ABD 三、非选择题 12．（24-25高二下·湖南永州·期中） (1)逆转录 (2) 5’端 PvitII、EcoRI (3)连接酶 (4) 氨苄青霉素 3 13．（24-25高二下·湖南郴州·期中） (1) DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精 使引物通过碱基互补配对与模板链结合 (2)引物1、引物3 (3) 能吸收周围环境中DNA分子 潮霉素 转化 (4)抗原—抗体杂交 14．（24-25高二下·湖南·期中） (1)稀释涂布平板 (2)农杆菌中的T-DNA已经转移至植物细胞内，且T-DNA中含有相关植物激素合成基因并能在植物细胞内成功表达 (3)质粒 (4)限制酶与DNA聚合 (5) 愈伤组织/植物细胞 T-DNA内部基因启动子在植物细胞内发挥作用而T-DNA外部基因启动子在农杆菌中发挥作用 15．（24-25高二下·湖南·期中） (1)不能 图中质粒至少存在两个BamHI的切割位点，使用BamHI切割质粒，会导致质粒被切割成多个片段，破坏质粒的完整性和功能 (2) 脱氧核苷酸 5' (3)Ca2+ (4) 潮霉素 氯霉素 3、5 16．（24-25高二下·湖南·期中） (1) 耐高温DNA聚合酶（Taq酶） 引物能使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 (2)BD (3) 会破坏甜蛋白基因 XbaⅠ和HindⅢ (4)使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 17．（23-24高二下·湖南岳阳·期中） (1) 耐高温的DNA聚合酶 Mg2+ R基因两端的碱基（核苷酸）序列 (2)PstI、EcoRI (3) Ti质粒 该细胞的染色体DNA上 (4)抗原﹣抗体杂交技术 (5) 显微注射法 受精卵 地 城 考点03 基因工程的应用 一、单项选择题 1．C 2．D 3．C 4．C 5．D 二、不定向选择题 6．ABD 7．ACD 三、非选择题 8．（22-23高二下·湖南长沙·期中） (1) 促性腺激素 营养物质丰富；体积大，易操作；含有激发细胞核全能性表达的物质 同期发情 (2) （一定的）流动 动物细胞核移植技术、早期胚胎培养、胚胎移植、转基因 (3)3号猪能够产生病毒外壳蛋白 9． （21-22高二下·湖南·期中） (1)逆转录 提高DGAT1基因的变性概率 (2)高温会破坏氨苄青霉素的结构而导致失效 (3) 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程 保证DGAT1基因能在产油微藻细胞中表达 DGAT1基因及其转录出的mRNA DGAT1抗体 (4)添加用地热废水培养四尾栅藻的对照组，11天后检测总氮、总磷和氟化物的含量 地 城 考点04 蛋白质工程的原理和应用 一、单项选择题 1．A 2．D 3．D 4．A 5．C 6．B 7．C 二、不定向选择题 8．ABC 9．CD 三、非选择题 10．（23-24高二下·湖南株洲·期中） (1) 蛋白质工程 密码子的简并性 (2) 变性 5'端→3'端 (3)抗原-抗体 (4)耐高温脂肪酶基因突变、缺失或丢失；工程菌甲在分裂过程中质粒丢失，未遗传给下一代 11．（24-25高二下·湖南常德·期中） (1) a和c b和d (2) Y DNA聚合酶只能从有模板的3＇端延伸DNA链 (3)a和d (4) 推测应有的氨基酸序列 合成新的基因 地 城 考点05 基因工程的综合 一、不定向选择题 1．ABD 二、非选择题 2．（24-25高二下·湖南永州·期中） (1)胚胎分割 胚胎移植 (2) 促性腺激素 囊胚 ③ (3)显微注射法 3．（24-25高二下·湖南长沙·期中） (1)RNA聚合酶的识别和结合位点，驱动转录出mRNA (2)容易吸收周围环境中DNA分子 (3) PCR 细胞质（叶绿体） 4．（24-25高二下·湖南长沙·期中） (1) 铁合蛋白基因 加热至90～95℃ 引物 可以 (2) HindⅢ、BamHⅠ 潮霉素 2 (3) 植物组织培养 植物细胞的全能性 5．（24-25高二下·湖南长沙·期中） (1) 可转移至受体细胞，并且转移到受体细胞染色体DNA上 成功整合到受体细胞染色体DNA上 (2) 基因重组 自由组合 (3) 经重组剔除后的标记基因没有启动子，而启动子的作用是驱动转录，故经重组剔除后的标记基因无法启动基因的转录 无需自交筛选，直接在转化后的植株中通过Cre/LoxP系统剔除标记基因，效率更高且节省时间 6．（24-25高二下·湖南·期中） (1) nCoV-GP 基因为单链RNA，不能直接与双链DNA 相连 四种脱氧核苷酸和逆转录酶 (2)启动子、终止子 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 (3)四环素 白色 (4) GP 抗GP的抗体 (5)繁殖速度快，目的蛋白易获得，可大量生成 7．（24-25高二下·湖南邵阳·期中） (1)乙烯 (2) 限制性内切核酸酶（或限制酶） DNA连接酶 载体 (3)能定向改变生物性状 8．（24-25高二下·湖南长沙·期中） (1) 能吸收周围环境中DNA分子 IBD程度 (2) AB y/（x+y） (3) X-gal 出现蓝色菌落 9．（24-25高二下·湖南长沙·期中） (1) 黏性末端 DNA聚合酶和DNA连接酶 F1 (2)T-DNA (3) Xba I、EcoR I Spe I、EcoR I 10．（23-24高二下·湖南常德·期中） (1)逆转录酶、耐高温的DNA聚合酶 (2) 方案二 既防止了目的基因和质粒的自身环化，又能保证目的基因和质粒的正向连接 (3) Ca2+ 青霉素和X-gal 白 (4) 耐高温的DNA聚合酶 原料 乙、丙 11．（23-24高二下·湖南·期中） (1) 双酶切 SalI Taq酶、限制酶EcoR Ⅰ 、限制酶Mun Ⅰ 、限制酶Xho Ⅰ 、DNA连接酶 (2) 启动子、目的基因、终止子、标记基因、复制原点 F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达 (3)引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 12．（22-23高二下·湖南益阳·期中） (1) SnaBⅠ、AvrⅡ 相应的限制酶识别序列 确保定向连接（避免质粒和目的基因自身环化及目的基因和质粒反向连接） (2) DNA连接酶 大量重组质粒 (3)BglⅡ (4) 卡拉霉素 PCR 13． （22-23高二下·湖南邵阳·期中） (1)基因表达载体的构建 (2)A (3)酶B和酶C 酶B和A (4)农杆菌 T-DNA 物质K 14．（22-23高二下·湖南怀化·期中） (1)ScaⅠ、HamHⅠ (2)流动性 (3)新霉素 绿色荧光 油菜细胞的基因组中本身有PEP基因 15．（22-23高二下·湖南怀化·期中） (1)启动子 终止子 PCR (2) 乳腺细胞 相同 16．（22-23高二下·湖南长沙·期中） (1)繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 (2) CTAGG-和-TAC（或-GGATC和-ATG） 含有氨苄青霉素 抗原-抗体杂交 (3) 耐高温的DNA聚合酶 有 17．（22-23高二下·湖南·期中） (1)基因表达载体的构建 (2) PCR（扩增技术） 2n（232-1） (3) 促性腺激素 农杆菌转化法 (4)将转基因莴苣与非转基因莴苣（野生型莴苣）分别置于干旱环境中培养，一段时间后观察比较两组莴苣的生长状况 18．（22-23高二下·湖南·期中） (1)耐高温DNA聚合酶（Taq酶） 3’ (2)5’AAGCTT3’ (3)能吸收周围环境中DNA分子 (4)青霉素 不含 观察菌落是否具有荧光 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题03 基因工程 5大高频考点概览 考点01 重组DNA技术的基本工具 考点02 基因工程的基本操作程序 考点03 基因工程的应用 考点04 蛋白质工程的原理和应用 考点05 基因工程的综合 地 城 考点01 重组DNA技术的基本工具 一、单项选择题 1．（24-25高二下·湖南邵阳·期中）下列关于“DNA粗提取与鉴定实验”的叙述，正确的是（　　） A．DNA析出过程中，玻璃棒搅拌操作要迅速均匀有力以利于DNA析出 B．可以用菜花、洋葱、猪血、猪肝等作为实验材料粗提取DNA C．将过滤液中加入等体积预冷的酒精可抑制DNA酶的活性和溶解DNA D．粗提取物需溶于盐溶液后加入二苯胺试剂沸水浴后变蓝色 【答案】D 【知识点】DNA的粗提取及鉴定 【分析】DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液；在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 【详解】A、DNA 析出过程中，玻璃棒搅拌操作要轻缓，以免加剧 DNA 分子的断裂，导致 DNA 分子不能形成絮状沉淀，不利于 DNA 析出，A错误； B、猪血中成熟的红细胞没有细胞核和众多细胞器，不含 DNA，不能作为该实验粗提取 DNA 的材料；而菜花、洋葱、猪肝细胞中含有 DNA，可以作为实验材料，B错误； C、将过滤液中加入等体积预冷的酒精，目的是使 DNA 析出，而不是抑制 DNA 酶的活性和溶解 DNA。因为 DNA 不溶于酒精，而某些蛋白质等杂质溶于酒精，利用这一原理可将 DNA 与杂质分离，C错误； D、粗提取的 DNA 需溶于盐溶液后，加入二苯胺试剂，在沸水浴条件下会变蓝色，这是鉴定 DNA 的方法，D正确。 故选D。 2.（24-25高二下·湖南长沙·期中）最新研究发现，小麦细胞中甘油-3-磷酸酰基转移酶可通过促进细胞膜外“屏障”形成，减少细胞内Na+积累，显著提升小麦耐盐性。下列有关组成细胞的水与无机盐叙述正确的是（　　） A．将小麦秸秆充分晒干后，其体内剩余的物质主要是无机盐 B．结合水是细胞结构的重要组成成分，主要存在于液泡中 C．无机盐既参与维持细胞的酸碱平衡也参与某些有机物的合成 D．用2mol/LNaCl溶液可析出小麦根尖细胞提取液中的DNA 【答案】C 【知识点】组成细胞的化合物、细胞中的水、细胞中的无机盐、DNA的粗提取及鉴定 【分析】1、细胞中的水包括结合水和自由水，结合水是细胞结构的重要组成成分；自由水：①良好的溶剂，②运送营养物质和代谢的废物，③参与许多化学反应，④为细胞提供液体环境，⑤提供化学反应介质，⑥维持细胞形态。2、无机盐主要以离子的形式存在，其生理作用有：（1）细胞中某些复杂化合物的重要组成成分，如Fe2+是血红蛋白的主要成分；Mg2+是叶绿素的必要成分。（2）维持细胞的生命活动，如钙可调节肌肉收缩和血液凝固，血钙过高会造成肌无力，血钙过低会引起抽搐。（3）维持细胞的酸碱平衡和细胞的形态。 【详解】A、将作物秸秆充分晒干后燃烧，其体内剩余的物质主要是无机盐，晒干后，其体内剩余的物质有很多，主要是蛋白质等，A错误； B、结合水是细胞结构的重要组成成分，液泡中的水为自由水，B错误； C、无机盐参与维持细胞的酸碱平衡，参与有机物的合成，例如铁参与血红蛋白的形成，C正确； D、DNA在2mol/LNaCl溶液中溶解度最大，不会析出DNA，D错误。 故选C。 3．（24-25高二下·湖南长沙·期中）如图是利用基因工程技术生产可食用疫苗的部分过程，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ和ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法正确的是（　　） A．图示过程需要的工具只有限制酶和载体 B．限制酶识别的核苷酸序列和切割位点是特定的 C．图中的质粒只能来自原核细胞 D．限制酶作用于双链DNA中的氢键，将其断开 【答案】B 【知识点】DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建 【分析】根据题意和图示分析可知：图示表示基因表达载体的构建过程，含抗原基因的DNA分子中含有PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ三种限制酶的识别序列，其中SmaⅠ的识别序列位于目的基因上；质粒中含有PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ四种限制酶的识别序列。图示过程需要的工具有限制酶、DNA连接酶和载体。 【详解】A、图示过程需要的工具有限制酶、DNA连接酶和载体，A错误； B、限制酶也具有专一性，故限制酶识别的核苷酸序列和切割位点是特定的，B正确； C、图中的质粒可能来自于原核细胞、真核细胞，真核细胞如真菌中有也有质粒，C错误； D、限制酶作用于双链DNA中的磷酸二酯键，将其断开，D错误。 故选B。 4．（24-25高二下·湖南·期中）细胞内DNA复制时，一条新子链按5'→3'方向进行连续复制，而另一条链按5'→3'方向合成的是冈崎片段(如图所示)。已知DNA聚合酶不能直接起始DNA新链或冈崎片段的合成，需先借助引物酶以DNA为模板合成RNA引物，DNA聚合酶再在引物的3'-OH上聚合脱氧核苷酸。当DNA整条单链合成完毕或冈崎片段相连后，DNA聚合酶再把RNA引物去掉，换上相应的DNA片段。人体细胞内的DNA复制过程和体外进行PCR过程分别如下，则下列叙述中错误的是（    ） A．引物酶、DNA聚合酶、DNA连接酶都会催化磷酸二酯键的形成 B．上述两个过程中的DNA聚合酶都只能由5'端→3'端延伸子链 C．PCR时所有子链都是连续复制，而细胞内DNA复制时部分子链不连续复制 D．细胞内DNA复制所需引物是细胞自行合成的，PCR过程需要加入引物，子链合成后引物都会被切掉 【答案】D 【知识点】DNA分子的复制过程、特点及意义、PCR扩增的原理与过程 【分析】DNA复制需要模板、原料、能量、酶等条件。DNA复制是边解旋边复制、半保留复制。DNA复制时，子链只能从5’端向3’端延伸，两条子链的延伸方向相反。 【详解】A、引物酶能合成RNA引物，其本质是形成磷酸二酯键连接核糖核苷酸；DNA聚合酶连接脱氧核苷酸，也是形成磷酸二酯键；DNA连接酶连接冈崎片段，同样是催化磷酸二酯键的形成；因此引物酶、DNA聚合酶、DNA连接酶都会催化磷酸二酯键的形成，A正确； B、DNA聚合酶催化DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸，B正确； C、在细胞内DNA复制时，只有一条子链可以连续复制，另一条不连续复制，在PCR过程中，两条子链都是连续复制的，C正确； D、细胞内DNA复制所需引物是细胞自行合成的，复制完毕后会去掉引物，PCR过程需要加入引物，引物是不会被切掉的，D错误。 故选D。 5．（24-25高二下·湖南衡阳·期中）下图是几种限制酶的切割位点，下列说法正确的是（　　） A．限制酶SmaI和EcoRV切割形成的末端，可通过E ．coliDNA连接酶相互连接 B．DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成 C．所有限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成 D．SmaI切割后产生的是黏性末端 【答案】B 【知识点】DNA重组技术的基本工具 【分析】1、限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。 2、DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 【详解】A、限制酶Sma I和EcoR V切割形成的是平末端，E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，但连接效率较低，A错误； B、DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键；DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯键；RNA聚合酶将单个核糖核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键，B正确； C、并不是所有的限制酶的识别序列都是由6个核苷酸组成，有些限制酶的识别序列有4个或8个核苷酸组成，C错误； D、SmaI切割后产生的是平末端，D错误。 故选B。 6．（24-25高二下·湖南长沙·期中）聚合酶链式反应（PCR）是一种分子生物学技术，通过模拟生物体内DNA的自然复制过程，在体外特异性地去复制特定的DNA片段，它的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。下列说法正确的是（　　） A．利用PCR技术获取目的基因，需要DNA聚合酶和DNA连接酶 B．配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料 C．PCR过程中用到的引物在一定范围内片段越长，扩增出来的DNA片段的脱氧核苷酸序列差别就越小 D．理论上推测，第n轮循环产物中只含有一种引物的DNA片段所占比例为1/2n-1 【答案】C 【知识点】PCR扩增的原理与过程 【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 【详解】A、利用PCR技术获取目的基因，需要耐高温的DNA聚合酶，不需要DNA连接酶，A错误； B、PCR反应的扩增原料是4种脱氧核糖核苷酸，而不是核糖核苷酸，B错误； C、PCR过程中用到的引物在一定范围内片段越长，对目的基因的特异性就越强，扩增出来的DNA片段的脱氧核苷酸序列差别就越小，C正确； D、DNA进行半保留复制，每次复制都需要两种引物结合在DNA的两端，第n轮循环产物共2n-1个DNA分子，仅含有其中一种引物的DNA片段为2个，故理论上推测，第n轮循环产物中只含有一种引物的DNA片段所占比例为2/2n-1=1/2n-2，D错误。 故选C。 7．（23-24高二下·湖南·期中）下图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是（　　） A．用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸，在设计引物时，应尽量避免引物自身或引物之间发生碱互补配对，影响扩增的效果 B．从理论上推测，第n轮循环后同时含有引物A、B的DNA分子占的比例为（2n-1）/2n C．在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 D．PCR的产物一般可以利用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定，DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度都会影响DNA在凝胶中的迁移速率 【答案】B 【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，所利用的原理为DNA分子的复制，因此PCR技术一般用于基因扩增。1原理:DNA复制；2条件:模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、耐高温的DNA聚合酶；方式:以指数的方式扩增，即约2n;4 过程:变性一复性一延伸。 【详解】A、用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸(引物过长或过短其特异性都较差)，在设计引物时，应尽量避免引物自身或引物之间发生碱互补配对，影响扩增的效果，A正确； B,PCR技术的原理是DNA的半保留复制，只有亲本DNA分子对应两条链新形成的DNA分子中只含有引物A或B，其余DNA分子均含有引物A和B，故从理论上推测，第n轮循环后同时含有引物A，B的DNA分子占的比例为(2n-2)/2n,B错误； C、图中的引物A和引物B均不在该片段的端点，因此复制出的子链的长短从引物开始一直延伸至模板链的未端，在第二轮复制中才会出现两个引物之间的单链，因此以此单链为模板在第三轮循环产物中可出现两条核苷酸链等长的DNA片段，即引物之间的核苷酸序列，C正确； D,PCR的产物一般可以利用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定，DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度都会影响DNA在凝胶中的迁移速率，D正确。 故选B。 8．（23-24高二下·湖南·期中）母乳来源的胆盐激活酯酶(BSSL)是一种脂肪酶，具有广泛的底物水解活性，对乳脂消化吸收具有重要作用。因此，对胆盐激活酯酶的研究是“人乳化牛奶”计划的重要组成部分。下图表示含有BSSL基因的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，限制性内切核酸酶MspI、SmaI识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、CCC↓GGG。下列叙述错误的是（    ） A．限制酶能识别双链DNA中特定核苷酸序列，并断开特定位置的磷酸二酯键 B．若用MspI酶切割BSSL基因产生的黏性末端只能用E.coliDNA连接酶连接 C．若要将外源基因导入细胞，可以用质粒、噬菌体、动植物病毒等作为载体 D．若用限制酶Sma I完全切割图中DNA片段，其产物长度为339 bp、9844 bp、533 bp 【答案】B 【知识点】DNA重组技术的基本工具 【分析】限制性核酸内切酶切断的化学键所处的具体部位是磷酸二酯键。 【详解】A、限制酶的作用是识别双链DNA中特定核苷酸序列，并断开特定位置的磷酸二酯键，A正确； B、MspI酶切割后，BSSL基因和质粒产生的黏性末端可以用E．coliDNA连接酶或T4DNA连接酶连接，平末端的连接只能用T4DNA连接酶连接，B错误； C、可以利用质粒、噬菌体、动植物病毒等作为载体将外源基因导入细胞，C正确； D、根据题意可知，SmaI的酶切位点CCC↓GGG，结合图示可知，若用限制酶Sma I完全切割图中DNA片段，其产物长度为339 bp、9844 bp、533 bp，D正确。 故选B。 9．（22-23高二下·湖南·期中）多重PCR-电泳技术，是指同一个PCR反应体系中包含多对引物，各引物特异性地结合到相应的目的基因上，扩增产生不同长度的片段，再通过电泳进行分离和识别，从而对病原体进行鉴别检测。下列相关叙述错误的是（　　） A．多重PCR过程中，不同的引物之间不能互补 B．PCR和电泳都必须无菌条件下操作，防止外源DNA污染 C．该技术可同时进行多种病原微生物的检测 D．不同大小的DNA分子在电泳时，迁移的速率不同 【答案】B 【知识点】PCR扩增的原理与过程 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】A、对于同一DNA片段的不同区段进行扩增时，不同引物的碱基排列顺序不能互补，如果互补，就会造成引物形成双链，不能与模板链结合，降低扩增的效率，A正确； B、电泳无需在无菌条件下操作，B错误； C、分析题意可知，多重PCR-电泳技术包含多对引物，各引物特异性地结合到相应的目的基因上，故该技术可同时进行多种病原微生物的检测，C正确； D、电泳时不同大小的DNA片段移动速率不同，分子量小的DNA迁移速度大，D正确。 故选B。 二、不定向选择题 10．（24-25高二下·湖南衡阳·期中）下列关于基因工程中载体的说法，正确的是（    ） A．必须有一至多个限制酶切割位点 B．所有的质粒都可以作为基因工程的载体 C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子 D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA分子进行检测与鉴定的标记基因 【答案】AD 【知识点】DNA重组技术的基本工具 【分析】基因工程中常用的运载体有：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒；质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外并具有自我复制能力的双链环状DNA分子； 作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点； ②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来；用作基因工程运载体的质粒通常是经过改造的。 【详解】A、作为基因工程的载体，必须有一至多个限制酶切割位点，有利于目的基因和运载体连结，A正确； B、作为运载体的质粒必须具备一定的条件，而自然界中的质粒往往不具备所有的条件，B错误； C、质粒是一种独立于真核细胞细胞核之外或原核细胞拟核外的小型环状DNA分子，C错误； D、作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA分子进行检测与鉴定的标记基因，便于筛选成功导入目的基因的受体细胞，D正确。 故选AD。 11．（24-25高二下·湖南·期中）某研究小组利用转基因技术，将抗除草剂基因（bar基因）整合到野生型玉米Gata基因一端，如图1所示。为获得Gata－bar基因纯合子，将转基因玉米自交，收获F1。图2是利用PCR技术检测F1中4个个体的电泳结果。下列相关分析正确的是（    ） A．从F1细胞中提取总DNA，再利用PCR技术检测 B．PCR扩增时选择的引物组合是引物1和引物3 C．电泳时，琼脂糖凝胶的加样孔在图2的A端 D．图示1～4号F1个体中，符合要求的是2号个体 【答案】ACD 【知识点】PCR扩增的原理与过程、电泳鉴定 【分析】PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 【详解】A、为了检测F1中的Gata－bar基因纯合子，从F1细胞中提取总DNA，再利用PCR技术检测，根据电泳结果可以判断，A正确； B、对比插入前后的Gata基因，若选择引物1和引物3进行PCR扩增再电泳，插入前Gata基因无法扩增获得产物，插入后的DNA片段PCR可以获得产物，那么电泳结果只会形成一种条带，因此应该选择的引物组合是引物1和引物2，B错误； C、电泳时核酸的碱基数量少迁移速度快，小片段靠近B端，说明A端是琼脂糖凝胶的加样孔，C正确； D、结合图1和图2分析，选择引物1和2进行PCR扩增再进行电泳，插入后的电泳结果是大片段，插入前的电泳结果是小片段，2号个体只有大片段，说明是Gata－bar基因纯合子，D正确。 故选ACD。 12．（24-25高二下·湖南·期中）限制酶的酶切产物可通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。如图1表示某DNA片段及限制酶酶切位点，用限制酶XhoⅠ和SalⅠ分别处理该DNA片段后，酶切产物电泳分离的结果如图2所示。下列叙述正确的是（    ） A．实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行灭菌处理 B．在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小、构象等有关 C．泳道①②分别是用限制酶XhoⅠ和限制酶SalⅠ处理得到的产物 D．用限制酶XhoⅠ和限制酶SalⅠ同时处理该DNA片段，可得到6种电泳产物 【答案】ABD 【知识点】电泳鉴定、PCR扩增的原理与过程、无菌技术 【分析】根据图1可知，该DNA中含有2个Xho Ⅰ酶切位点和3个Sal Ⅰ酶切位点。结合图2中，①有4种片段，②有3种片段可知，前者是Sal Ⅰ酶切产物，后者是Xho Ⅰ酶切产物。 【详解】A、PCR实验对污染极为敏感，微量离心管、枪头等需高压蒸汽灭菌以去除外源DNA或核酸酶，蒸馏水也需灭菌处理，A正确； B、在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，B正确； C、据题图1和图2分析可知，该DNA中含有2个Xho Ⅰ酶切位点和3个Sal Ⅰ酶切位点。结合图2中，①有4种片段，②有3种片段可知，泳道①②分别是限制酶SalⅠ和限制酶XhoⅠ处理得到的产物，C错误； D、用限制酶XhoⅠ和限制酶SalⅠ同时处理该DNA片段，该片段共有5个酶切位点，可得到6种电泳产物，D正确。 故选ABD。 13．（22-23高二下·湖南长沙·期中）以下是有关分离与鉴别DNA的技术，其中说法正确的是（    ） A．DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最大 B．PCR的两种引物一般20-30个核苷酸，过长易发生引物内部的折叠 C．对PCR循环30次之后的DNA分子进行琼脂糖凝胶电泳，与标样对照判断是否存在目的基因片段 D．琼脂糖凝胶电泳从阴极加样，分子量较大的接近于加样孔 【答案】BC 【知识点】DNA的粗提取及鉴定、PCR扩增的原理与过程 【分析】用凝胶色谱法分离蛋白质的原理是蛋白质分子量大小不同导致有些蛋白质能进入凝胶颗粒，另一些不能，所以迁移速度不同，将分子量不同的蛋白质分离，电泳的原理是利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的目的。 【详解】A、DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，在0.14mol/L的NaCl溶液中的最低，A错误； B、PCR的两种引物一般20-30个核苷酸，过长易发生引物内部的折叠，导致PCR扩增失败，B正确； C、PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定，对PCR循环30次之后的DNA分子进行琼脂糖凝胶电泳，与标样对照判断是否存在目的基因片段，C正确； D、DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH条件下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场作用下，这些带电分子就会向着与它所带电荷相反的电极移动，则加样时，可根据DNA分子所带电荷的不同，从阴极或者阳极加样，其中分子量大的蛋白质移动慢，接近于加样孔，D错误。 故选BC。 三、非选择题 14．（24-25高二下·湖南长沙·期中）基因工程中，为满足不同需要，除了常规PCR，还有不对称PCR、反向PCR、重叠延伸PCR等。 Ⅰ、不对称PCR常用来制备单链DNA分子探针。不对称PCR中使用的一对引物的量不相等，其中少的称为限制性引物，多的称为非限制性引物。下图中，β链为所需的DNA分子探针，已知图示DNA有1个，前10次循环的产物为双链DNA，后10次循环的产物是单链DNA，结合图示信息回答以下问题： Ⅱ、反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。结合下图信息回答相应问题： (1)DNA聚合酶从引物的_______端开始连接脱氧核苷酸，图中非限制性引物是引物_______。 (2)此过程需要非限制性引物的个数为_______。 (3)设计引物时，序列中的GC碱基含量越高，退火温度_______。结合图中信息，应选择以上引物中的___________（填两种）进行PCR扩增。 (4)通过反向PCR得到的产物是__________。 A．包含未知序列和所有已知序列的环状DNA分子 B．包含未知序列和所有已知序列的链状DNA分子 C．包含部分已知序列和未知序列的环状DNA分子 D．包含部分已知序列和未知序列的链状DNA分子 【答案】(1) 3' I (2)11×210-1 (3) 越高 1和4 (4)B 【知识点】PCR扩增的原理与过程 【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 【详解】（1）PCR时，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3，端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸。DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链，引物Ⅱ和Ⅲ无意义，若β链为所需的DNA分子探针，则非限制性引物应选用引物I，引物I诱导合成的序列和a互补、与β相同，那么引物Ⅳ应该是限制性引物。 （2）已知图示DNA有1个，前10次循环的产物为双链DNA，可得到210个双链DNA，此过程需要引物Ⅰ和引物IV共(210×2-2)，两种引物量是相等的，因此此过程需要引物I为(210-1)；前10次循环的产物为双链DNA，则a链就有210个，以a链为模板，利用引物I进行10次循环，每次循环生成的都是β链且不改变a链的数量，即a链每次循环开始时都是210个，而每次循环生成的β链也是210个，则后10次循环可获得10×210个所需的单链探针( β链)，需要引物I也是10×210个，因此整个过程需要非限制性引物I个数为(210-1)+ 10×210= 11×210-1。 （3）GC碱基含量与退火温度的关系:由于G-C碱基对之间有3个氨键，A-T碱基对之间有2个氢键，所以设计引物时，序列中的GC碱基含量越高，稳定性越强，退火温度越高。选择进行PCR扩增的引物：根据反向PCR的原理，引物应结合在已知序列的两端且方向相反，所以应选择引物1和引物4进行PCR扩增。 （4） 反向PCR是对已知序列两侧的未知序列进行扩增，经过酶切、环化、PCR等步骤，得到的产物是包含未知序列和所有已知序列的链状DNA分子，B正确，ACD错误。 故选B。 15．（24-25高二下·湖南长沙·期中）请回答下列问题： (1)D分子经限制酶切割产生的DNA片段通常末端有___________和___________。 (2)PCR技术扩增目的基因的条件是：模板DNA、四种脱氧核苷酸，___________、___________等。 (3)进行动物细胞培养时，为什么要选择10代以内的细胞？___________。 (4)早期胚胎培养时，培养液的成分有有机盐、___________、激素、___________、氨基酸、核苷酸以及动物血清等物质。 【答案】(1) 平末端 黏性末端 (2) 引物 耐高温的DNA聚合酶 (3)保持细胞正常的二倍体核型 (4) 无机盐 维生素 【知识点】动物细胞培养技术、DNA重组技术的基本工具、PCR扩增的原理与过程 【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】（1）经限制酶切割产生的DNA片段通常末端有平末端、黏性末端两种。 （2）PCR 是一项体外扩增DNA的技术，该技术扩增目的基因的条件是：模板 DNA、四种脱氧核苷酸（原料），一对引物和耐高温的DNA聚合酶。 （3）动物细胞培养时一般要选择10代以内的细胞进行冷冻保存，其目的是保持细胞正常的二倍体核型。 （4）早期胚胎培养的培养液成分一般比较复杂，除一些无机盐和有机盐外，还需要添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及动物血清等物质。 16．（24-25高二下·湖南·期中）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图所示。请回答下列问题。 (1)分别进行PCR扩增片段与片段时，配制的两个反应体系中不同的有___________，扩增程序中最主要的不同是___________。 (2)有关基因序列如下表所示，引物应在下列选项中选用___________。 EGFP基因序列：：5'—ATGGTGAGCAAGGGC……GACGAGCTGTACAAG—3' AnB1基因序列：5'—CATGTCCAGCTGCAG……CCAAAACCACAACCA—3' A．ATGGTG……CAACCA B．TGGTTG……CACCAT C．GACGAG……CTGCAG D．CTGCAG……CTCGTC (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一操作无需使用的酶主要有___________。 (4)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物和进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有___________。 (5)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是___________。 【答案】(1) 模板、引物 引物的设计 (2)CD (3)限制酶、DNA连接酶 (4)P3、P4 (5)电泳只能测大小(长度)，不知道具体序列 【知识点】PCR扩增的原理与过程 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）PCR反应进行的条件：引物、耐高温的DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸、模板和缓冲液(其中需要)。分别进行PCR扩增片段与片段时，配制的两个反应体系中不同的有模板(片段片段)、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素，因此扩增程序中最主要的不同是引物的设计。 （2）由图可知，引物用于扩增片段，引物用于扩增片段，C选项中5'-GACGAG-3'能与EGFP中右侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物选用C。D选项中5'-CTGCAG-3'能与AnB1中的左侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物选用D。 故选CD。 （3）传统重组质粒构建需要使用限制酶切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制酶和DNA连接酶。 （4）EGFP为720bp，AnBl为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1110bp，用引物和进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。 （5）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。 地 城 考点02 基因工程的基本操作程序 一、单项选择题 1．（24-25高二下·湖南长沙·期中）目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定与检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是（　　） ①检测受体细胞中是否有目的基因          ②检测受体细胞中是否有致病基因 ③检测目的基因是否转录出了mRNA        ④检测目的基因是否翻译成蛋白质 A．①②③ B．②③④ C．①③④ D．①②④ 【答案】C 【知识点】目的基因的检测与鉴定 【分析】目的基因的检测与鉴定： 1.分子水平上的检测 ①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因—DNA分子杂交技术 ； ②检测目的基因是否转录出了mRNA一分子杂交技术 ； ③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交技术。 2.个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、 活性鉴定等。 (例：用虫食用棉花，观察其存活情况，来鉴定棉花是否具有抗虫特性。) 【详解】①检测受体细胞中是否有目的基因，可以利用DNA分子杂交技术，①正确； ②目的基因不一定是致病基因，故基因工程中不一定需检测受体细胞中是否有致病基因，②错误； ③检测目的基因是否转录出了mRNA可以利用分子杂交技术，③正确； ④检测目的基因是否翻译成蛋白质可以利用抗原—抗体杂交技术，④正确。 ①③④正确，C正确。 故选C。 2.（24-25高二下·湖南长沙·期中）科研人员将黄粉虫细胞内的抗冻蛋白基因TmAFP（图1）与改造后的Ti质粒（图2）构建基因表达载体，导入拟南芥细胞中培育拟南芥耐低温新品种，图3表示相关限制酶识别序列和切割位点。[Kanr为卡那霉素抗性基因；Bar为草铵膦（一种除草剂）抗性基因；Ampr为氨苄青霉素抗性基因；农杆菌对卡那霉素、氨苄青霉素敏感]。下列说法错误的是（　　） A．利用1个TmAFP基因进行PCR扩增，共消耗126个引物分子，则该过程DNA扩增了6次 B．构建基因表达载体时，选用限制酶BamHI和HindⅢ切割TmAFP基因所在的DNA和质粒 C．利用含卡那霉素的培养基对成功导入含重组质粒的农杆菌进行筛选 D．采用农杆菌转化法将重组质粒导入拟南芥细胞，需用Ca2+处理拟南芥细胞使其成为感受态细胞 【答案】D 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸；转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 【详解】A、对TmAFP基因进行PCR扩增，在PCR反应体系中加入的缓冲液中含有Mg2+，Mg2+是酶的激活剂，Mg2+的作用是激活Taq DNA聚合酶。PCR技术中DNA的合成方向总是从子链的5'末端向3'末端延伸， 若扩增过程中消耗引物分子126个，说明通过DNA复制产生(126+2)÷2=64个DNA分子，因此DNA扩增了6次，A正确； B、 据图2可知，为了目的基因能表达出蛋白质，目的基因应插入启动子和终止子之间，该位置有三种酶（SmaⅠ、XbaⅠ和HindⅢ）识别序列，据图1可知，目的基因两侧并没有SmaⅠ酶切位点，因此选用限制酶BamHI和HindⅢ切割TmAFP基因所在的DNA和质粒，可以避免目的基因反接及质粒和DNA自连，B正确； C、质粒上有两个抗性基因，Kanr为卡那霉素抗性基因和Ampr为氨苄青霉素抗性基因，在构建表达载体的过程中，TmAFP基因的插入破坏了Ampr为氨苄青霉素抗性基因，故利用含卡那霉素的培养基对成功导入含重组质粒的农杆菌进行筛选，C正确； D、将含重组质粒的农杆菌与拟南芥子叶进行共培养，共培养一段时间后，再把拟南芥子叶转移到含有草铵膦的筛选培养基上培养，以获得转化成功的子叶细胞，Ca2+处理可以增大细菌细胞膜的通透性，对植物细胞无用，D错误。 故选D。 3．（24-25高二下·湖南常德·期中）下图为构建基因表达载体和检测受体细胞是否含有目的基因的过程示意图，其中LacZ基因控制合成的酶可以分解物质X产生蓝色物质，使平板上形成的菌落呈蓝色，否则菌落为白色。下列叙述错误的是（　　） A．①过程需要使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶 B．②过程可用Ca2+处理进而有利于重组DNA的吸收 C．③过程的培养基中除基本成分外仅需加入物质X D．实验结果形成白色菌落的大肠杆菌中含有目的基因 【答案】C 【知识点】基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【分析】 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品．基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 【详解】A、①过程表示基因表达载体的构建，需要使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶，A正确； B、将目的基因导入大肠杆菌，可用Ca2+处理大肠杆菌使其处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B正确； C、从图中看出，在培养基中还需要加入氨苄青霉素抗性基因进行筛选，C错误； D、目的基因插入会破坏LacZ基因，所以实验结果中形成的白色菌落中的大肠杆菌不含有LacZ基因，说明插入了目的基因，D正确。 故选C。 4．（24-25高二下·湖南·期中）蛛丝有超强韧性，其主要成分蛛丝蛋白是一种特殊的纤维蛋白，具有独特的结构与性质。科学家将蛛丝蛋白基因转入羊的受精卵中以生产蛛丝蛋白，下图是蛛丝蛋白基因的DNA片段。下列说法错误的是（    ） A．若受体细胞为大肠杆菌，则蛛丝蛋白可能需要进一步加工才具有相应的功能 B．科学家需将蛛丝蛋白基因与乳腺中特异性表达的基因的启动子等调控元件重组在一起 C．用PCR技术扩增图中的蛛丝蛋白基因，可选择图中的引物①和④ D．若一个蛛丝蛋白基因扩增了4次，则共消耗引物30个 【答案】C 【知识点】基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【分析】基因工程的主要步骤：①获取目的基因；②目的基因与运载体的结合；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、若受体细胞为大肠杆菌，大肠杆菌为原核生物，没有高尔基体和内质网，蛛丝蛋白需要进一步加工才具有相应的功能，A正确； B、要想让目的基因在乳腺中表达，需要将目的基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，B正确； C、据题图分析可知，磷酸基团为DNA的5′端，羟基为DNA的3′端，由于DNA聚合酶只能从5′→3′延伸子链，所以在PCR扩增中引物与DNA模板链的3′端结合进行延伸，故选择图中引物②和引物③，C错误； D、在DNA分子扩增时，需要2种引物，由于新合成的子链都需要引物作为复制的起点，故所需的引物数目等于新合成的DNA子链数目，若将1个含目标片段的DNA分子经PCR反应循环4次后，共需要消耗引物的数量为2×24-2=30个，D正确。 故选C。 5．（22-23高二下·湖南长沙·期中）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段（Fn与R），将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。下列有关叙述错误的是（    ）    A．为将扩增后的产物定向插入载体，指导荧光蛋白基因表达，需用MunI和XhoI处理载体 B．从产物扩增到载体构建完成的整个过程需6种酶 C．将构建的载体导入去除BCL1IA基因的受体细胞，可能出现含F1与R扩增产物的受体细胞无荧光，而含F2-F7与R扩增产物的受体细胞有荧光 D．向培养液中添加适量的雌激素，可导致部分受体细胞不再有荧光 【答案】C 【知识点】DNA重组技术的基本工具、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、观察载体的部分结构的图示，荧光蛋白基因的左侧为终止子，为了将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，扩增后的产物的插入点应在荧光蛋白基因的右侧，而荧光蛋白基因的右侧有三个限制酶切点，分别是MunI、EcoRI和XhoI限制酶的切点，但因为用EcoRI会破坏荧光蛋白基因，所以只能用MunI和XhoI限制酶切割，A正确； B、从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Taq酶、限制酶EcoRI、限制酶SalI、限制酶MunI、限制酶XhoI、DNA连接酶，B正确； C、据图可知，F1与R的序列要长于F2～F7与R序列，故不可能出现含F1与R扩增产物的受体细胞无荧光，而含F2～F7与R扩增产物的受体细胞有荧光的现象，C错误； D、分析题意可知，P是在雌激素诱导下发挥作用的启动子，向培养液中添加适量的雌激素，雌激素能诱导启动子发挥作用，构建的载体含有BCL11A基因，导入构建载体的受体细胞能合成BCL11A蛋白，γ基因的表达被抑制，故向培养液中添加适量的雌激素，可导致部分受体细胞不再有荧光，D正确。 故选C。 6．（23-24高二下·湖南岳阳·期中）OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图所示），利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述正确的是（　　） A．可用抗原﹣抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量 B．四个基因转录时都以DNA的同一条单链为模板 C．应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞 D．四个基因都在水稻叶绿体内进行转录翻译 【答案】A 【知识点】目的基因的检测与鉴定、遗传信息的翻译、遗传信息的转录 【分析】1、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 2、目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。 3、将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。 【详解】A、可用抗原-抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量，杂交带相对量越多，表明目的基因翻译成的蛋白质含量越高，A正确； B、由题图可知，在同一个T-DNA中OsGLO1启动子启动转录的方向与其他三个基因的不同，四个基因转录时不都以DNA的同一条单链为模板，B错误； C、卡那霉素抗性基因不在T-DNA中，而潮霉素抗性基因在T-DNA中，应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞，C错误； D、由题意知，利用农杆菌转化法转化水稻，可使目的基因插入到水稻细胞中染色体的DNA上，所以与叶绿体转运肽基因连接的四个基因，在水稻细胞核内进行转录，在核糖体中进行翻译，D错误。 故选A。 7．（21-22高二下·湖南长沙·期中）CRISPR/Cas9是一种生物学工具，能够通过“剪切和连接”脱氧核糖核酸（DNA）序列的机制来编辑基因组。这套系统源自细菌的防御机制，是一种对任何生物基因组均有效的基因编辑工具。CRISPR/Cas9基因组编辑系统由向导RNA（也叫sgRNA）和Cas9蛋白组成，向导RNA识别并结合靶基因DNA．Cas9蛋白切断双链DNA使其形成两个末端。这两个末端通过“断裂修复”重新连接时通常会有个别碱基对的插入或缺失，从而实现基因敲除，如图所示。CRISPR/Cas9基因组编辑技术有时存在编辑出错而造成脱靶。下列叙述正确的是（　　）    A．Cas9蛋白能作用于脱氧核糖和碱基之间的化学键 B．对不同目标DNA进行编辑时，使用Cas9蛋白和相同的sgRNA进行基因编辑 C．CRISPR/Cas9基因组编辑系统使细菌获得抵抗溶菌酶或抗生素的能力 D．其他DNA序列含有与 sgRNA互补配对的序列，会造成 sgRNA错误结合而脱靶 【答案】D 【知识点】基因编辑技术、DNA重组技术的基本工具、噬菌体侵染细菌的实验 【分析】由题意可知，CRISPR-Cas9体系是由靶基因的向导RNA和Cas9蛋白构成的复合体。向导RNA在基因组中负责寻找靶基因并与其结合；Cas9蛋白在向导RNA的引导下切割靶基因，使DNA双链断裂产生平末端。在随后DNA自我修复的过程中，容易随机引起一些碱基对的插入或缺失，导致基因功能改变。 【详解】A、Cas9蛋白识别并切断双链DNA形成两个末端，相当于限制酶，能作用于脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键即脱氧核糖与磷酸之间的磷酸二酯键，A错误； B、在对不同目标DNA进行编辑时，应使用Cas9蛋白和“不同”的sgRNA结合进而实现对不同基因的编辑，B错误； C、噬菌体是通过将自身的DNA注入细菌内，利用细菌内的物质进行自我复制而完成侵染的，而CRISPR−Cas9系统可以定向切割外源DNA，故该系统使细菌获得抵抗噬菌体的能力，但不能获得抵抗溶菌酶或抗生素的能力，C错误； D、CRISRP−Cas9基因编辑技术有时存在编辑出错而造成脱靶，其最可能的原因是其他DNA序列也含有与向导RNA（sgRNA）互补配对的序列，造成向导RNA（sgRNA）错误结合而脱靶，D正确。 故选D。 8．（22-23高二下·湖南·期中）甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质，将甜蛋白基因导入番茄可提高番茄甜味，改善番茄品质。下图是甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶切割位点示意图。下列叙述正确的是（　　） A．可使用XbaⅠ和HindⅢ处理切割甜蛋白基因和Ti质粒 B．可使用XbaⅠ和EcoRⅠ处理切割甜蛋白基因和Ti质粒 C．启动子能被DNA聚合酶识别，启动转录 D．重组质粒成功导入受体细胞后，受体细胞能合成卡那霉素 【答案】A 【知识点】基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【分析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：①不能破坏目的基因②不能破坏所有的抗性基因（至少保留一个）③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自身环化和质粒的自身环化。 【详解】A、目的基因内有BamHⅠ识别序列，因此不能选择BamHⅠ切割目的基因，因此目的基因左侧应选择限制酶XbaⅠ切割，由目的基因的转录方向可以推测，目的基因右侧应选择靠近终止子的限制酶HindⅢ，而不能选择靠近启动子的EcoRⅠ，因此需要用XbaⅠ和HindⅢ处理切割甜蛋白基因和Ti质粒，A正确； B、若用XbaⅠ和EcoRⅠ处理切割甜蛋白基因，则目的基因与质粒会发生反向连接，不能正常按转录方向转录，B错误； C、启动子能被RNA聚合酶识别，启动转录，C错误； D、重组质粒中含有的是卡那霉素抗性基因，不是卡那霉素合成基因，不能合成卡那霉素，D错误。 故选A。 二、不定向选择题 9．（24-25高二下·湖南·期中）如图表示利用新冠病毒包膜表面的S蛋白制备疫苗的相关过程，SUC2是酵母菌的蔗糖转化酶基因，其表达产物存在于液泡中，可以催化蔗糖水解成单糖被细胞利用，其中m、n分别是启动子和终止子。下表中是可供选择使用的限制酶及其识别序列和酶切位点。据图表推测，下列叙述错误的是（    ） 限制酶 BamHⅠ NheⅠ NcoⅠ SphⅠ Sau3AⅠ 识别序列和酶切位点     ↓ 5'-GGATCC-3'     ↓ 5'-GCTAGC-3'     ↓ 5'-CCATGG-3'       ↓ 5'-GCATGC-3'   ↓ 5'-GATC-3' A．过程①所需的酶是DNA聚合酶 B．过程②所使用的两种限制酶是Sau3AⅠ和NcoI C．据图推测，目的基因S转录的模板链最可能是b链 D．SUC2可作标记基因，对导入B的酵母菌进行筛选 【答案】AC 【知识点】中心法则及其发展、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定、新型冠状病毒及相关 【分析】分析题图可知，过程①表示RNA→DNA的逆转录过程，由逆转录酶催化。 【详解】A、过程①表示RNA→DNA的过程，由逆转录酶催化，A错误； B、②过程为对DNA进行切割形成黏性末端，需要两种限制性核酸内切酶，从黏性末端可看出是识别序列分别为、，因此选用的两种酶分别是BamHⅠ/Sau3AⅠ、NcoⅠ，B正确； C、结合质粒上限制酶酶切位点可知，目的基因的上链位于重组质粒的内侧，下链位于外侧，转录方向为m→n，且转录只能从模板链的为3'端开始，因此上链(a链)是模板链(方向与m→n相同)，C错误； D、SUC2基因是酵母菌的蔗糖转化酶基因，SUC2可作为B上的标记基因，可以对导入B的酵母菌进行筛选，D正确。 故选AC。 10．（24-25高二下·湖南·期中）乙肝基因工程疫苗的生产过程如图所示，其中质粒上箭头所指部位为相应的限制酶的切割位点。质粒中LacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的X-gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。下列相关分析错误的是（    ） A．过程①选择BamHⅠ和EcoRⅤ切割目的基因和质粒，可避免目的基因和质粒反向连接 B．过程②利用农杆菌的T-DNA可将重组质粒上的目的基因转移到大肠杆菌细胞的DNA上 C．筛选大肠杆菌的培养基中需要添加青霉素和X-gal，便于重组质粒的筛选 D．若添加X-gal的培养基上的大肠杆菌菌落呈现白色，则说明该大肠杆菌成功导入重组质粒 【答案】AB 【知识点】目的基因的检测与鉴定、将目的基因导入受体细胞、基因表达载体的构建 【分析】基因工程的基本操作程序是：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、由图可知，BamHI和EcoRI的酶切位点在目的基因两侧，用BamHI和EcoRI来切割含有目的基因的DNA片段可以获得完整的目的基因，且质粒上也存在这两种酶的识别位点，因此过程①应该选择BamHI和EcoRI来切割目的基因和质粒，可避免目的基因和质粒反向连接，A错误； B、过程②是将重组质粒导入大肠杆菌，需要用Ca2+处理大肠杆菌，增大其细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中 DNA分子的生理状态，B错误； C、质粒中LacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的X-gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。LacZ基因内部含有BamHI的酶切位点，构建重组质粒时，目的基因的插入导致lacZ基因被破坏，因此在添加X-gal的培养基上，含重组质粒的大肠杆菌菌落呈现白色，导入空载质粒的大肠杆菌菌落显蓝色，没有导入任何外源DNA的大肠杆菌不含青霉素抗性基因，不能在含有青霉素的培养基上生存，因此筛选含重组质粒的大肠杆菌，应在培养基中加入X-gal和青霉素，便于重组质粒的筛选，C正确； D、BamHI破坏了质粒上的LacZ基因，若添加X-gal的培养基上的大肠杆菌菌落呈现白色，则说明大肠杆菌成功导入重组质粒，D正确。 故选AB。 11．（22-23高二下·湖南长沙·期中）蜘蛛丝（丝蛋白）有着超强的抗张强度，可制成防弹背心、降落伞绳等。科学家研究出集中生产蜘蛛丝的方法——培育转基因蜘蛛羊。以下叙述正确的是（    ） A．从蜘蛛细胞中直接提取的丝蛋白基因与逆转录获得的丝蛋白基因，两者的主要区别在于启动子、终止子 B．在PCR中获取引物可以从GenBank获得丝蛋白基因序列，设计两个不同的引物 C．该过程需要在蜘蛛羊的泌乳期定向诱导蜘蛛丝蛋白基因基因选择性表达 D．可以使用PCR等技术检测山羊的染色体DNA是否插入了丝蛋白基因或者检测丝蛋白基因是否转录出mRNA 【答案】ABD 【知识点】PCR扩增的原理与过程、目的基因的检测与鉴定、筛选、获取合适的目的基因 【分析】PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。（2）原理：DNA复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。 【详解】A、从蜘蛛细胞中直接提取的丝蛋白基因与逆转录获得的丝蛋白基因，两者的主要区别在于逆转录获得的丝蛋白基因没有启动子、终止子，A正确； B、在PCR中获取引物可以从GenBank（基因库）获得丝蛋白基因序列，设计两个不同的引物，以保证两条子链从5'--3'端延伸，B正确； C、该过程无需诱导，在蜘蛛羊的泌乳期，蜘蛛丝蛋白基因会自行在相应细胞进行选择性表达，C错误； D、在分子水平的检测，可以使用PCR等技术检测山羊的染色体DNA是否插入了丝蛋白基因或者检测丝蛋白基因是否转录出mRNA，D正确。 故选ABD。 三、非选择题 12．（24-25高二下·湖南永州·期中）PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为（碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。请分析并回答下列问题： (1)为获取phb2基因，先提取该动物肝脏组织的总RNA，再经_____过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板。 (2)图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，设计引物时需要在两引物的_____（填“5’端”或“3’端”）分别引入_____两种限制酶的识别序列。 (3)设计并合成引物后，即可通过PCR仪扩增目的基因，之后进行基因表达载体的构建。其操作步骤是，先用前述两种限制酶切割phb2基因和载体；再用_____（填“E。coliDNA连接酶”或“连接酶”）进行连接。 相关限制酶的识别序列及切割位点 名称 识别序列 名称 识别序列 HindⅢ EcoRI PvitⅡ PstI 5’—CTGC↓AG—3’ KpnI BamHI 注：识别序列只展示了单链，其中“”表示切割位点 (4)将转化后的大肠杆菌接种在含_____的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图2，分析可知：_____号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。 注：为指示分子大小的标准参照物；小于的DNA分子条带未出现在图中 【答案】(1)逆转录 (2) 5’端 PvitII、EcoRI (3)连接酶 (4) 氨苄青霉素 3 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 【分析】分析图中质粒含有多个限制酶切位点，在启动子和终止子之间有三个酶切位点，KpnI在质粒上有两个酶切位点，PvitⅡ酶切后获得平末端。 【详解】（1）利用RNA获得cDNA的过程称为逆转录。先通过逆转录获得cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。 （2）为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，设计引物时需要在两引物的5'端添加限制酶的识别序列。根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间。图中看出，两者之间存在于三种限制酶切点，但是由于KpnI在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcoRI和PvitⅡ两种不同限制酶的识别序列。 （3）根据PvitⅡ的酶切序列，切出了平末端，所以构建基因表达载体时，应该用T4DNA连接酶连接质粒和目的基因。 （4）根据质粒上的标记基因，应将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养。由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培养基中，因此都含有质粒，重组质粒包含了目的基因和质粒，如果用EcoRI和PvitⅡ两种酶切割重组质粒电泳后将获得含有质粒和目的基因两条条带，由于phb2基因（目的基因）大小为0.9kb，所以对应电泳图是菌落3。 13．（24-25高二下·湖南郴州·期中）RDX是某种军用弹药使用后残留的危险污染物，研究人员将源于细菌的RDX降解酶基因XplA和XplB插入柳枝稷草染色体中，让转基因植物修复因军用炸药RDX污染的土壤。基因XplA和XplB与引物结合位点及模板链分布情况如图1所示。图2为筛选含融合基因表达载体的农杆菌的示意图。回答下列问题：    (1)从细菌中提取DNA的过程中，使用预冷酒精(体积分数为95%)初步分离DNA与蛋白质，原理是___________然后再利用 PCR的方法从提取的 DNA中获取目的基因，PCR的反应条件为94℃、30s，55℃、30s，72℃、1min，其中55℃、30s的过程称为复性，进行此过程的目的___________。 (2)若要构建图2中的融合基因，应选择图1的引物组合___________，以便通过PCR检测其中的Xp1A和Xp1B基因形成的融合基因是否准确。 (3)将融合基因与农杆菌Ti质粒的T-DNA重组，构建基因表达载体用Ca2+溶液处理农杆菌后使其处于___________的生理状态，将其与基因表达载体混合一段时间，在添加___________的培养基中，经筛选得到含基因表达载体的农杆菌。通过农杆菌的___________作用，就可以使融合基因进入植物细胞。 (4)用上述农杆菌侵染柳枝稷草愈伤组织，经组织培养获得植株，为检测转基因植株是否含有XplA和XplB的表达产物，可采用的方法是___________。 【答案】(1) DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精 使引物通过碱基互补配对与模板链结合 (2)引物1、引物3 (3) 能吸收周围环境中DNA分子 潮霉素 转化 (4)抗原—抗体杂交 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。启动子是驱动基因转录的元件，而终止子是指示转录终止的位置；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）用冷酒精（体积分数 95% ）分离 DNA 和蛋白质，是基于溶解度差异。DNA 在冷酒精中难溶，会析出，蛋白质等杂质可溶，留在酒精中，实现初步分离提纯。PCR 中 55 ∘ C 、30s 的复性步骤，是让引物与模板 DNA 链的互补序列结合，这样 DNA 聚合酶才能从引物 3’端开始延伸子链，是 PCR 扩增关键步骤。 （2）启动子是RNA聚合酶识别和结合位点，是开始转录的位点，转录时，RNA聚合酶从模板链的3'端向5'端移动，合成mRNA，所以为了构建在图2中能正确表达的融合基因，XplB基因的模板链(a链)的3'端、XplA基因的模板链(b链)的3'端应靠近融合基因的启动子。扩增融合基因时，只能把两种引物间的DNA序列扩增出来，因此引物必须分别与融合基因两侧3'端结合，且子链延伸是按模板链的3'端→5'端，故只有引物1和引物3符合。 （3）表达载体导入农杆菌时，首先用Ca2+处理细胞，使细胞成为能吸收周围环境中DNA分子的状态，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。若农杆菌得到含目的基因的表达载体，则也同时含有潮霉素抗性基因，因此可以用加有潮霉素的选择培养基把它筛选出来。通过农杆菌的转化作用，就可以使融合基因进入植物细胞。 （4）要检测转基因植株是否有 XplA 和 XplB 表达产物（蛋白质 ），利用抗原 - 抗体杂交技术。先制备针对 XplA 和 XplB 蛋白的特异性抗体，若植株蛋白提取物与抗体发生特异性结合，说明有表达产物。 14．（24-25高二下·湖南·期中）某科研团队为了验证农杆菌转化植物的功能，利用葡萄植株上的冠瘿瘤为材料，根据科学史上一系列研究进行了以下实验。请回答下列问题。 (1)切下冠瘿瘤的一部分，经破碎离心后，取液体部分，稀释后利用___________法接种至LB固体培养基中，获得较好分散度的单菌落。 (2)分别取平板上的每个单菌落制成菌悬液后，侵染植物愈伤组织，结果发现只有部分菌落的菌种能致瘤，说明冠瘿瘤表面或内部含有农杆菌与其他微生物。接种一段时间后杀死农杆菌，发现冠瘿瘤的生长不再依赖于农杆菌，且冠瘿组织的无限生长不需要外源的植物激素，原因是___________。 (3)取其中致瘤的农杆菌菌种，接种至LB液体培养基进行扩大培养，48h后提取其中的DNA，并通过电泳分离纯化得到其中的质粒DNA，发现质粒DNA分子量大于处在相同位置的线性MarkerDNA，说明等分子量的___________迁移速率更大。 (4)科研团队还研究了质粒中Vir系列基因的作用，发现敲除农杆菌内质粒上的VirC与VirD基因后，无法合成___________酶从而无法在农杆菌内切割与复制得到游离的T-DNA． (5)将农杆菌分为两组，分别将GFP(绿色荧光蛋白)基因连接至甲组农杆菌质粒的T-DNA内部基因启动子下游与乙组农杆菌质粒的T-DNA外部基因启动子下游。侵染愈伤组织后，可在甲组___________中检测到绿色荧光，乙组该处检测到不绿色荧光，原因是___________。 【答案】(1)稀释涂布平板 (2)农杆菌中的T-DNA已经转移至植物细胞内，且T-DNA中含有相关植物激素合成基因并能在植物细胞内成功表达 (3)质粒 (4)限制酶与DNA聚合 (5) 愈伤组织/植物细胞 T-DNA内部基因启动子在植物细胞内发挥作用而T-DNA外部基因启动子在农杆菌中发挥作用 【知识点】基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定、电泳鉴定 【分析】稀释涂布平板法：将一定量的菌液滴加在平板上，用无菌涂布耙均匀涂布，使菌液分散至整个平板表面，培养后挑取单个菌落，适用于菌液浓度较低或需要均匀分布的情况。 【详解】（1）要获得较好分散度的单菌落，常用的接种方法是稀释涂布平板法。因为稀释涂布平板法可以将菌液均匀地涂布在固体培养基表面，从而使单个微生物在培养基上形成单菌落。 （2）接种一段时间后杀死农杆菌，冠瘿瘤的生长不再依赖于农杆菌且不需要外源植物激素，原因是致瘤农杆菌将Ti质粒上的T-DNA整合到了植物细胞的染色体DNA上，T-DNA上含有控制合成植物激素的基因，这些基因在植物细胞中表达，使植物细胞能够自主合成植物激素，从而维持冠瘿组织的无限生长。 （3）电泳是根据DNA分子的大小、形状和电荷等特性，在电场作用下使其在凝胶中迁移，从而实现分离；发现质粒DNA分子量大于处在相同位置的线性MarkerDNA，说明在相同条件下，质粒迁移得更快，也就是等分子量的质粒迁移速率更大。 （4）由题意可知，敲除农杆菌内质粒上的VirC与VirD基因后无法在农杆菌内切割与复制得到游离的T-DNA，这一过程需要的酶是切割T-DNA的相关酶和DNA复制有关的酶，切割需要限制酶，DNA复制需要DNA聚合酶。 （5）甲组将GFP基因连接至农杆菌质粒的T-DNA内部基因启动子下游，T-DNA会整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上，随着染色体DNA的转录和翻译，可在愈伤组织细胞的细胞核中检测到绿色荧光；乙组将GFP基因连接至农杆菌质粒的T-DNA外部基因启动子下游，T-DNA不会整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上，但是由于启动子能启动转录，所以在农杆菌自身细胞内（因为基因在农杆菌质粒上，在农杆菌内进行转录和翻译 ）可检测到绿色荧光。 原因：只有当GFP基因位于T-DNA内部时，T-DNA才能整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上并在细胞内表达，而位于T -DNA外部时，不会整合到愈伤组织细胞染色体DNA上，只能在农杆菌自身细胞内表达。 15．（24-25高二下·湖南·期中）幽门螺杆菌（HP）与胃炎、胃食管反流病等多种疾病有关。Ipp20基因作为幽门螺杆菌的核心功能基因，在疫苗研发中具有重要价值。实验人员以Ipp20基因为目的基因，通过基因工程制备HP疫苗的过程如图所示。回答下列问题： (1)据图分析，使用限制酶切割质粒时________（填“能”或“不能”）选择限制酶BamHⅠ，理由是_______。 (2)过程①需要的原料是________。为了使质粒和Ipp20基因正确连接，在设计引物时需要在引物的________（填“5’”或“3’”）端添加限制酶的识别序列。 (3)实验人员通过过程③将重组质粒导入大肠杆菌体内进行扩增。该过程中，一般先用________处理大肠杆菌，有利于大肠杆菌吸收DNA。 (4)为了筛选成功导入重组质粒的大肠杆菌，过程④将大肠杆菌培养在含有________的培养基A中，能在其中生长的大肠杆菌即可能导入了重组质粒的大肠杆菌。初步筛选出的大肠杆菌存在导入空质粒（不含有Ipp20基因）或导入重组质粒的情况。实验人员用影印培养法（将培养基A上的菌落全部转移到丝绒面上，再将丝绒面印在培养基B上）来进行筛选。结合图中信息分析，培养基B添加了________，能用于制备HP疫苗的大肠杆菌菌落是________（填图中数字）。 【答案】(1)不能 图中质粒至少存在两个BamHI的切割位点，使用BamHI切割质粒，会导致质粒被切割成多个片段，破坏质粒的完整性和功能 (2) 脱氧核苷酸 5' (3)Ca2+ (4) 潮霉素 氯霉素 3、5 【知识点】目的基因的检测与鉴定、将目的基因导入受体细胞、基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【分析】基因工程技术的基本步骤：(1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。(2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4)目的基因的检测与鉴定：可利用PCR技术进行分子水平的检测，还可以进行个体水平的检测。 【详解】（1）结合图示质粒分析，图中质粒至少存在两个BamHI位点，使用BamHI切割质粒，会导致质粒被切割成多个片段，破坏质粒的完整性和功能，因此不能使用BamHI切割质粒。 （2）过程①为PCR扩增，扩增产物是DNA，合成DNA所需的原料是脱氧核苷酸。PCR扩增是是从引物的3'开始的，限制酶的识别序列应该在引物的5'。 （3）将基因表达载体导入大肠杆菌时，为了有利于大肠杆菌吸收DNA，一般先用Ca2+处理大肠杆菌，增大其通透性。 （4）根据培养基A、B呈现菌落的差异可知，选择限制酶切割质粒时的组合可能是XhoI、XbaI或PstI、XbaI（若选择XhoI、PstI，则质粒上的潮霉素抗性基因和氯霉素抗性基因均未被破坏，在培养基A、B上添加潮霉素、氯霉素的结果相同，无法起到筛选的作用）。因此潮霉素抗性基因得以保留，氯霉素抗性基因被破坏，培养基A上添加潮霉素，培养基B上添加氯霉素，其中成功导入了目的基因的表达载体的大肠杆菌在培养基A上能生存，在培养基B上不能生存，能用于制备HP疫苗的大肠杆菌菌落是3和5。 16．（24-25高二下·湖南·期中）甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质。为改善番茄口感和品质，科学家采用农杆菌转化法将某种甜蛋白基因成功导入番茄细胞，获取转基因番茄。完成下列问题： (1)PCR扩增甜蛋白基因时，微量离心管中需加入的物质有：模板、特异性引物、原料、含Mg2+缓冲液、______________。PCR过程中特异性引物的作用是__________。 (2)利用PCR技术，可以鉴定甜蛋白基因是否转录。若甜蛋白基因的mRNA部分序列如下，根据下述序列应选择引物______（填字母）进行PCR。 5′—AUGGCU……AGGAAC—3′ A．引物：5′—TACCGA—3′ B．引物：5′—GTTCCT—3′ C．引物：5′—AUGGCU—3′ D．引物：5′—ATGGCT—3′ (3)利用转基因技术获得转基因番茄的核心步骤是构建基因表达载体，用限制酶切割含有甜蛋白基因的DNA片段时，不用限制酶BamHⅠ的原因是_______________。作为科研人员该过程选择_____________限制酶切割甜蛋白基因和Ti质粒最合适。 (4)为了让甜蛋白基因进入受体细胞并整合到受体细胞的染色体DNA上，可以将甜蛋白基因插入Ti质粒的T-DNA中。将基因表达载体导入农杆菌前，需用Ca2+处理农杆菌，其目的是_______________。 【答案】(1) 耐高温DNA聚合酶（Taq酶） 引物能使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 (2)BD (3) 会破坏甜蛋白基因 XbaⅠ和HindⅢ (4)使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 【知识点】将目的基因导入受体细胞、基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【分析】PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。 2、模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 3、延伸：DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。 【详解】（1）PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，利用的原理是DNA复制，微量离心管中需加入的物质有：模板、特异性引物、原料、缓冲液和耐高温DNA聚合酶（Taq酶）。PCR过程需要特异性引物的原因是一方面引物能与目的基因中特定的核苷酸序列发生碱基互补配对，另一方面引物能使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。 （2）已知甜蛋白基因的部分序列，由于PCR技术中，子链合成的方向是从5′到3′，因此应选择引物B、D进行PCR。 （3）由图可知，限制酶BamHⅠ切割会破坏甜蛋白基因，不宜使用。在Ti质粒中，EcoRⅠ位于XbaⅠ的左侧，根据甜蛋白基因转录的方向和Ti质粒启动子到终止子的方向，应选择限制酶XbaⅠ和HindⅢ切割质粒和含有甜蛋白基因的DNA片段，选择限制酶XbaⅠ和EcoRⅠ会导致甜蛋白基因与质粒反向连接，不能表达出甜蛋白。 （4）Ti质粒的T-DNA是可转移的DNA，能够携带目的基因进入受体细胞并将其整合到受体细胞的染色体的DNA上。将基因表达载体导入农杆菌，需用Ca2+处理，使其成为感受态细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，提高转化率。 17．（23-24高二下·湖南岳阳·期中）赖氨酸是人体细胞不能合成的必需氨基酸。科学家把某种必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因（R）导入玉米中，使玉米中赖氨酸的含量提高30%。回答下列问题。    (1)利用PCR技术扩增R基因时，需要在一定的缓冲液中才能进行，其中需要加入__________酶和激活该酶所需的 __________。为了特异性扩增R基因序列，需根据 ____________________设计特异性引物。 (2)在构建基因表达载体时，若为了避免R基因和质粒的自连或反向连接，提高重组效率，应该选择的限制酶是 _______________。 (3)随着转化方法的突破，农杆菌侵染玉米这种单子叶植物也取得了成功。科研人员从新鲜的玉米叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，当农杆菌侵染玉米细胞后，能将 _________上的T﹣DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到 ________________。 (4)检测R基因是否表达的方法是 ___________。 (5)在基因工程中若要培养转基因小鼠，将基因表达载体导入受体细胞常用的方法是 __________，常用的受体细胞是 ________。 【答案】(1) 耐高温的DNA聚合酶 Mg2+ R基因两端的碱基（核苷酸）序列 (2)PstI、EcoRI (3) Ti质粒 该细胞的染色体DNA上 (4)抗原﹣抗体杂交技术 (5) 显微注射法 受精卵 【知识点】目的基因的检测与鉴定、将目的基因导入受体细胞、基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【分析】基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程的工具有限制酶、DNA连接酶、基因的载体。 基因工程的基本操作程序：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建。（3）将目的基因导入受体细胞。（4）目的基因的检测和鉴定。 【详解】（1）利用PCR技术扩增R基因时，需要在一定的缓冲液中才能进行，其中需要加耐高温的DNA聚合酶和激活该酶所需的Mg2+。为了特异性扩增R基因序列，需根据R基因两端的碱基（核苷酸）序列设计特异性引物，其中引物的作用能使DNA聚合酶从引物的3’端链接脱氧核苷酸。 （2）在构建基因表达载体时，需要用限制酶切割质粒和目的基因，然后用DNA连接酶连接目的基因和质粒。为了避免R基因和质粒的自连或反向连接，应选择两种不同的限制酶去切割质粒和目的基因。图中T-DNA区域只有PstⅠ、EcoRⅠ两种限制酶切口，而R基因左边可被PstⅠ切割、右边可被EcoRⅠ切割，所以可以选择PstⅠ、EcoRⅠ两种限制酶。 （3） 农杆菌转化法进行时，农杆菌要将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到玉米的染色体DNA上。 （4） 检测R基因是否表达，需要检测R基因控制的蛋白质是否合成，可以用抗原-抗体杂交技术，观察是否产生杂交带。 （5）进行转基因动物操作时，需要用显微注射技术将目的基因转入受体细胞，为了发育出转基因小鼠，应选择受精卵作为受体细胞。 地 城 考点03 基因工程的应用 一、单项选择题 1．（24-25高二下·湖南衡阳·期中）下列关于转基因动植物的描述，错误的是（    ） A．可将外源生长激素基因导入动物细胞内，提高动物的生长速率 B．可将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，降低乳汁中乳糖的含量，进而改善畜产品的品质 C．可利用转基因植物来建立某些人类疾病的转基因植物模型 D．可以利用转基因动物作为器官移植的供体 【答案】C 【知识点】将目的基因导入受体细胞、基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用 【分析】1、转基因食品（GeneticallyModifiedFoods，GMF）是利用现代分子生物技术，将某些生物的基因转移到其他物种中去，改造生物的遗传物质，使其在形状、营养品质、消费品质等方面向人们所需要的目标转变。以转基因生物为直接食品或为原料加工生产的食品就是“转基因食品”。 2、转基因生物：即为了达到特定的目的而将DNA进行人为改造的生物。通常的做法是提取某生物具有特殊功能（如抗病虫害、增加营养成分）的基因片断，通过基因技术加入到目标生物当中。 【详解】A、外源生长激素基因在动物体内表达可促进动物生长，A正确； B、将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，肠乳糖酶基因表达产物是乳糖酶，可分解乳糖，使乳糖含量降低，进而改善畜产品的品质，B正确； C、通过建立转基因动物模型，模拟疾病的发生和发展过程，为研究该疾病的致病机制和开发治疗药物提供依据，C错误； D、可以利用转基因动物作为器官移植的供体如基因编辑猪的心脏、肾脏已用于异种移植实验，D正确。 故选C。 2．（23-24高二下·湖南·期中）基因工程自20世纪70年代兴起后，在农牧业、医药卫生和食品工业等方面得到了飞速的发展。下列关于基因工程应用的叙述，正确的是（　　） A．通过将肠乳糖酶导入到奶牛乳腺细胞中，以降低乳汁中乳糖含量，从而解决部分人群的乳糖不耐受问题 B．通过X射线、紫外线综合处理，将青霉素产量低的菌种培育成产量高的菌株属于基因工程技术的应用 C．通过制备山羊膀胱生物反应器，使人乳铁蛋白基因只存在于膀胱细胞中，进而可以从尿液中分离纯化出所需要的人乳铁白蛋白，实现大量制备的目的 D．与人细胞分泌的天然生长激素相比，将人的生长激素基因导入大肠杆菌制备的工程菌无法对生长激素进行正常的加工和修饰 【答案】D 【知识点】将目的基因导入受体细胞、基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用、基因工程综合 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测： ①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术； ③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，乳糖酶可降解乳糖，可降低乳汁中乳糖含量，A错误； B、通过X射线、紫外线综合处理，将青霉素产量低的菌种培育成产量高的菌株属于诱变育种，B错误； C、制备山羊膀胱生物反应器时，是将人乳铁蛋白基因导入山羊受精卵，这样山羊的每一个细胞都会含有人乳铁蛋白基因。构建时加入膀胱特异性启动子，使得人乳铁蛋白基因只在膀胱细胞中表达，而不是人乳铁蛋白基因只存在于膀胱细胞中，C错误； D、由于大肠杆菌缺乏对蛋白质进行加工和分装的内质网和高尔基体，因此与人细胞分泌的天然生长激素相比，将人的生长激素基因导入大肠杆菌制备的工程菌无法对生长激素进行正常的加工和修饰，D正确。 故选D。 3．（24-25高二下·湖南长沙·期中）草甘膦是某种除草剂的主要成分.如图表示研究人员利用草甘膦抗性基因（CP4基因）培育抗草甘膦的灿稻新品种的过程。下列相关叙述错误的是（　　） A．构建基因表达载体时，应将CP4基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA中 B．将重组Ti质粒导入农杆菌前，用处理农杆菌可提高转化率 C．若检测出粒稻的染色体DNA上插入了CP4基因，则该抗草甘膦新品种培育成功 D．在喷洒除草剂的农田中，种植抗草甘膦籼稻新品种对提高作物产量有重要意义 【答案】C 【知识点】基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用、基因工程的操作程序综合 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、T-DNA可转移到植物细胞中，并能整合到染色体DNA上，所以构建基因表达载体时，应将CP4基因插人农杆菌Ti质粒的T-DNA中，A正确； B、用 Ca2+ 处理农杆菌使其处于感受态，易于接受重组质粒，B正确； C、若检测出粒稻的染色体DNA上插入了CP4基因，但是该基因不一定表达，则该抗草甘膦新品种培育不一定成功，需要在分子水平和个体水平进行检测，C错误； D、抗草甘膦籼稻新品种可抵抗除草剂的毒害作用，所以在喷洒除草剂的农田中，种植抗草甘膦籼稻新品种对提高作物产量有重要意义，D正确。 故选C。 4．（21-22高二下·湖南长沙·期中）苏云金芽孢杆菌会合成Bt蛋白，在棉铃虫的碱性肠道环境中，Bt蛋白在特定的酶作用下产生毒性，导致棉铃虫死亡。我国科学家利用农杆菌转化法培育转Bt蛋白基因的抗虫棉。下列说法错误的是（    ） A．可根据苏云金杆菌的DNA特定序列设计引物，用PCR技术扩增获得Bt基因 B．需要将Bt基因整合到Ti质粒的T-DNA上，从而构建基因表达载体 C．Bt基因可以整合到棉花染色体上，抗虫棉自交后代不会发生性状分离 D．Bt毒蛋白具有高度专一性，对害虫天敌、人畜均无毒性，在环境中易分解 【答案】C 【知识点】目的基因的筛选、获取、将目的基因导入受体细胞、基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用 【解析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、苏云金芽孢杆菌会合成Bt蛋白，所以可以根据苏云金杆菌的DNA特定序列设计引物，用PCR技术扩增获得Bt基因，A正确； B、培养抗虫棉需要将Bt基因整合到Ti质粒的T-DNA（可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的DNA）上，B正确； C、Bt基因可以整合到棉花染色体上，由于只有1条染色体上含有抗虫基因，因此抗虫棉自交后代会发生性状分离，C错误； D、Bt毒蛋白在特定的酶作用下产生毒性，具有高度专一性，对害虫天敌、人畜均无毒性，其本质是蛋白质，所以在环境中易分解，D正确。 故选C。 5．（22-23高二下·湖南邵阳·期中）植物生物反应器主要以整株植物、植物组织或植物悬浮细胞为加工场所，生产药物蛋白。叶绿体遗传转化体系是近年发展起来的一种新的植物生物反应器。叶绿体转化是以同源重组原理将外源目的基因整合到目标叶绿体基因组中的种方式，是一种高表达、安全性极高的遗传转化方法。下列相关叙述不正确的是（    ） A．植物生物反应器涉及的现代生物学技术是基因工程和植物细胞工程 B．构建的基因表达载体中含有叶绿体特异启动子，使得目的基因只能在叶绿体中表达 C．植物叶绿体表达体系可以防止转基因作物的目的基因通过花粉在自然界中扩散 D．把目的基因导入叶绿体DNA中，将来产生的配子一定含有此目的基因 【答案】D 【知识点】基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用、植物组织培养技术综合 【分析】由于精子中几乎不含细胞质，故叶绿体内的基因一般不会通过花粉传播，将目的基因整合到叶绿体基因中，安全性较高。 【详解】A、植物生物反应器首先需要用基因工程技术将目的基因导入植物细胞，其次需要采用植物细胞工程技术将转基因植物细胞培育成转基因植株或转基因植物组织或转基因植物悬浮细胞，因此涉及基因工程和细胞工程技术，A正确； B、要使得目的基因只能在叶绿体中表达，则构建的基因表达载体中要含有叶绿体特异性启动子，B正确； C、由于受精卵中的细胞质几乎全部来自卵细胞，因此植物叶绿体表达体系可以防止转基因作物的目的基因通过花粉在自然界中扩散，C正确； D、把该基因导入叶绿体DNA中，叶绿体DNA存在于细胞质中，在配子产生过程中随机进入子细胞，所以将来产生的配子中不一定含有抗病基因，D错误。 故选D。 二、不定向选择题 6．（24-25高二下·湖南邵阳·期中）科学家发现栽种含有抗除草剂基因的农作物后，会使附近的与其亲缘关系较近的野生植物也获得抗除草剂基因。下列说法正确的是（    ） A．野生植物通过自然杂交获得抗除草剂基因 B．野生植物发生了基因重组 C．基因工程不会导致基因污染 D．转基因生物会危及生物圈的稳定 【答案】ABD 【知识点】基因重组、基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用、转基因生物安全性 【分析】转基因生物的安全性问题：食物安全（滞后效应、过敏源、营养成分改变）、生物安全（对生物多样性的影响）、环境安全（对生态系统稳定性的影响）。 生物安全：①转基因植物扩散到种植区外变成野生种或杂草，②转基因植物竞争能力强，可能成为“入侵的外来物种”，③转基因植物的外源基因与细菌或病毒杂交，重组出有害的病原体，④可能使杂草成为有抗除草剂基因的“超级杂草”。 【详解】A、栽种含有抗除草剂基因的农作物后，会使附近的、与其亲缘关系较近的野生植物也获得抗除草剂基因，可见野生植物可通过自然杂交获得抗除草剂基因，A正确； B、野生植物获得抗除草剂基因，该过程中发生了基因重组，B正确； C、野生植物也获得抗除草剂基因会传递到野生植物，这说明基因工程会导致基因污染，C错误； D栽种含有抗除草剂基因的农作物后，会使野生植物也获得抗除草剂基因，进而危及生态系统的稳定，D正确。 ​故选ABD。 7．（24-25高二下·湖南常德·期中）蜘蛛丝（丝蛋白）被称为“生物钢”，有着超强的抗张强度，可制成防弹背心、降落伞绳等。蜘蛛丝还可被制成人造韧带和人造肌腱。科学家研究出集中生产蜘蛛丝的方法——培育转基因羊作为乳腺生物反应器。下列有关乳腺生物反应器的说法正确的是（    ） A．从转基因羊乳汁中提取的丝蛋白在自然界中是可以找到的 B．将丝蛋白基因直接导入羊乳腺细胞中即可获得乳腺生物反应器 C．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别等限制，受体来源更广泛 D．人们可以利用乳腺生物反应器生产所需要的药物 【答案】ACD 【知识点】基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用 【分析】将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物，这称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。 【详解】A、根据题干信息“蜘蛛丝（丝蛋白）被称为“生物钢”，该过程通过转基因技术获得，可以推测，丝蛋白在自然界中是可以找到的，A正确； B、丝蛋白基因要先和载体构建基因表达载体后才导入羊受精卵中获得乳腺生物反应器，B错误； C、乳腺生物反应器必须是雌性个体，膀胱生物反应器不限性别限制，故受体来源更广泛，C正确； D、在转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需的药物，这称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器，D正确。 故选ACD。 三、非选择题 8．（22-23高二下·湖南长沙·期中）科研人员为获得可用于生产基因工程的疫苗，将病毒外壳蛋白基因导入猪细胞中，然后通过核移植技术培育转基因猪，具体操作过程如图所示。回答下列问题： (1)在收集A细胞时需要用_____处理1号猪，选用该细胞的优点是_____（答两点）。为了使胚胎能够成功移植到2号猪子宫内，需要对2号猪进行_____处理。 (2)过程②体现了细胞膜的_____性，该转基因猪的培育过程运用了_____等技术。 (3)3号猪与1号猪相比，不同点主要是_____。 【答案】(1) 促性腺激素 营养物质丰富；体积大，易操作；含有激发细胞核全能性表达的物质 同期发情 (2) （一定的）流动 动物细胞核移植技术、早期胚胎培养、胚胎移植、转基因 (3)3号猪能够产生病毒外壳蛋白 【知识点】基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用、动物体细胞核移植技术和克隆、动物的体外受精、胚胎移植技术 【分析】胚胎工程是指对生殖细胞、受精卵或早期胚胎细胞进行多种显微操作和处理，然后将获得的胚胎移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。胚胎工程包括体外受精、胚胎移植和胚胎分割等技术。 【详解】（1）A细胞为卵细胞，为了获得更多的卵细胞，一般需要用促性腺激素处理1号猪，使其超数排卵。卵母细胞的营养物质丰富、体积大易操作，且含有激发细胞核全能性表达的物质，因此选择卵母细胞。为了使胚胎能够成功移植到2号猪子宫内，需要对2号猪进行同期发情处理，这为胚胎移入受体提供了相同的生理环境。 （2）过程②为细胞融合的过程，体现了细胞膜具有（一定的）流动性。由图可知，该转基因猪的培育过程运用了动物细胞核移植技术、早期胚胎培养、胚胎移植、转基因等技术。 （3）3号猪与1号猪相比，由于3号猪转入了病毒外壳蛋白基因，所以不同点主要是3号猪能够产生病毒外壳蛋白。 9．（21-22高二下·湖南·期中）生物柴油作为新型能源已经成为世界上应用最广泛、发展迅猛的可再生能源之一、研究人员利用基因工程的方法，将油料作物紫苏的产油基因DGAT1与含有氨苄青霉素抗性基因的PMD克隆质粒构建PMD一DGAT1重组质粒，然后导入大肠杆菌扩大培养；再提取出扩增的pMD-DGAT1克隆质粒，与pBI121空载体同时用Xbal，BamHI两种酶酶切，构建pB121一DGAT1表达载体：最后将表达载体导入四尾栅藻获得产油微藻，利用地热废水培养产油微藻不仅能生产生物柴油，还能治理地热废水。回答下列问题： (1)提取紫苏组织细胞RNA经过_____得到cDNA，再利用PCR技术扩增得到DGATI基因。在PCR扩增之前，对DGAT1基因进行一次预变性的目的是_____。 (2)在配制培养大肠杆菌的培养基时，要在培养基灭菌并冷却到30℃左右后，加入用无菌水配制的适宜浓度的氨苄青霉素溶液，氨苄青霉素不能与培养基一同灭菌的原因可能是_____。 (3)基因工程技术中的转化是指_____。将DGAT1基因插入到pBI121空载体的启动子与终止子之间的目的是_____。若用DGAT1基因探针检测产油微藻，能检测到细胞中的_____。判断产油微藻细胞中DGAT1基因是否成功表达，需要加入_____排行检测。 (4)为检测产油微藻对地热废水的去污能力，研究人员设计实验并得到相应实验结果如下表： 指标 总氮（mg/L） 总磷（mg/L） 氟化物（mg/L） 废水培养基 23．2 4．32 4．56 培养转基因产油微藻11天后 1．9 0．45 0．84 该实验不能说明产油微藻显著提高了去污能力。请进一步完善实验设计_____。 【答案】(1) 逆转录 提高DGAT1基因的变性概率 (2)高温会破坏氨苄青霉素的结构而导致失效 (3) 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程 保证DGAT1基因能在产油微藻细胞中表达 DGAT1基因及其转录出的mRNA DGAT1抗体 (4)添加用地热废水培养四尾栅藻的对照组，11天后检测总氮、总磷和氟化物的含量 【知识点】无菌技术、PCR扩增的原理与过程、基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用、基因工程的操作程序综合 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因，DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA，分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质，抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）以RNA为模板产生cDNA的过程是逆转录；在PCR扩增之前，需要对DGAT1基因进行一次预变性的目的是破坏其中可能存在的较难破坏的二级结构，提高DGAT1基因的变性概率。 （2）氨苄青霉素不耐高温，高压灭菌会破坏氨苄青霉素的结构而导致失效。 （3）基因工程技术中的转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定并表达的过程。基因的表达需要启动子和终止子，启动子与RNA聚合酶结合驱动转录发生，终止子：DNA分子上(基因末端)的转录停止信号序列，具有使RNA聚合酶停止合成R和释放RNA链的作用。所以将DGAT1基因插入到pBI121空载体的启动子与终止子之间的目的是保证DGAT1基因能在产油微藻细胞中表达。 DGAT1基因探针能与DGAT1基因及其转录出的mRNA形成杂交带，所以可以检测到DGAT1基因及其转录出的mRNA；检测目的基因是否翻译成蛋白质，用抗原-抗体杂交技术，需要加入DGAT1抗体检测。 （4）实验缺少对照组，不能让确定是不是受体四尾栅藻本身有去污能力，所以需要增加一组实验，即添加用地热废水培养四尾栅藻的对照组，11天后检测总氮、总磷和氟化物的含量，如果11天后检测总氮、总磷和氟化物的含量比培养转基因产油微藻11天后数据高，说明培养转基因产油微藻有去污能力。 地 城 考点04 蛋白质工程的原理和应用 一、单项选择题 1．（24-25高二下·湖南长沙·期中）下列关于蛋白质工程的说法，错误的是（　　） A．蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子结构 B．蛋白质工程能定向改造蛋白质分子的结构，使之更加符合人类需要 C．蛋白质工程能产生自然界中不曾存在的新型蛋白质分子 D．蛋白质工程的操作起点是从预期的蛋白质功能出发，设计出相应的基因，并借助基因工程实现 【答案】A 【知识点】蛋白质工程原理及操作流程 【分析】1、蛋白质工程指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要。 2、蛋白质工程的过程：（1）根据中心法则逆推以确定目的基因的碱基序列：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。（2）最终还是回到基因工程上来解决蛋白质的合成。 【详解】A、基因的结构决定蛋白质的结构，因此，要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造基因来完成，而不是直接对蛋白质分子进行操作，A错误； B、蛋白质工程能按照人们的意愿定向改造蛋白质分子的结构，使之更加符合人类需要，B正确； C、蛋白质工程能产生出自然界中不曾存在过的新型蛋白质分子，C正确； D、蛋白质工程是在分子水平上对基因直接进行操作，进而改变蛋白质的分子结构，故蛋白质工程的操作起点是从预期的蛋白质功能出发，设计出相应的基因，并借助基因工程实现，D正确。 故选A。 2．（24-25高二下·湖南长沙·期中）多氯联苯（PCBs）是一类典型的具有持久性、蓄积性和高毒性特点的有机污染物，常大量吸附于土壤。科学家通过蛋白质工程改造微生物体内的相关酶来应对PCBs污染。下列关于此过程的叙述，正确的是（　　） A．改造后的酶只能在微生物体内发挥催化PCBs降解的作用 B．该工程的基础是氨基酸分子的结构规律及其与生物功能之间的关系 C．改造后的酶提高了对PCBs的降解速率，其最适温度也会大幅升高 D．将改造后的酶的基因导入合适的微生物宿主，构建的工程菌与原微生物相比，可更高效降解土壤中的PCBs 【答案】D 【知识点】蛋白质工程原理及操作流程、蛋白质工程的应用及实例分析 【分析】蛋白质工程：指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）。 【详解】A、改造后的酶可在适宜环境（如pH、温度）下发挥作用，不一定局限于微生物体内，若酶被分泌到胞外，则可在体外降解PCBs，A错误； B、蛋白质工程的基础是蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系，再通过对基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，B错误； C、改造后的酶可能提高催化效率（如降低反应活化能），但最适温度由酶的空间结构决定，大幅改变需结构重大调整，题干未提及温度变化，C错误； D、通过基因工程将改造后的酶基因导入宿主微生物，使其高效表达，工程菌降解PCBs的能力显著提升，符合蛋白质工程目的，D正确。 故选D。 3．（24-25高二下·湖南·期中）T4溶菌酶是一种重要的工业用酶，但在温度较高时易失去活性，科学家研究发现，若将其第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，可在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成一个二硫键，提高T4溶菌酶的耐热性。对T4溶菌酶基因进行改造，导入酵母菌细胞内，可持续获得耐热T4溶菌酶。下列有关叙述不合理的是（    ） A．T4溶菌酶是否耐热取决于蛋白质的空间结构 B．通过改造基因获得耐热T4溶菌酶，属于蛋白质工程 C．改造T4溶菌酶基因需用到基因定点突变技术来进行碱基替换 D．基因工程和蛋白质工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质 【答案】D 【知识点】蛋白质工程的应用及实例分析、蛋白质工程原理及操作流程 【分析】分析题意可知，科学家利用蛋白质工程技术，对编码T4溶菌酶的基因进行改造，从而改造了 T4溶菌酶的结构，获得了耐热性高的T4溶菌酶。 【详解】A、蛋白质的结构决定功能，T4溶菌酶是否耐热取决于蛋白质的空间结构，A正确； B、若将T4溶菌酶第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，可在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成一个二硫键，提高T4溶菌酶的耐热性，属于蛋白质工程范畴，B正确； C、改造T4溶菌酶基因需用到基因定点突变技术来进行碱基替换，这样可以定点改变蛋白质的氨基酸序列，C正确； D、基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，而蛋白质工程可以产生自然界没有的蛋白质，D错误。 故选D。 4．（24-25高二下·湖南邵阳·期中）新型蛋白质进化模型EVOLVEpro可以利用氨基酸序列，仅通过少量学习和最低限度的实验测试来预测蛋白质空间结构，从而获得新型高活性蛋白质改造方案。下列有关说法正确的是（　　） A．通过EVOLVEpro得到的蛋白质还需要进行进一步的功能检测实验才可以投入生产 B．预测蛋白质结构需要依据肽链中肽键的结构、氨基酸的物理性质与结构 C．氨基酸是蛋白质的基本单位，氨基酸发生替换一定使蛋白质的结构和功能发生改变 D．EVOLVEpro在蛋白质工程广泛应用后将不再需要借助基因工程手段改造蛋白质 【答案】A 【知识点】蛋白质的结构及多样性、蛋白质工程原理及操作流程 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或者制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产生活需求。 【详解】A、通过EVOLVEpro得到的蛋白质还需要进行进一步的功能检测实验才可以投入生产，确保对人体安全没有副作用，A正确； B、对蛋白质进行分子设计应从预期的蛋白质功能出发，对蛋白质的空间结构进行设计，不是肽键的结构和氨基酸的物理性质与结构，B错误； C、氨基酸是蛋白质的基本单位，氨基酸发生替换后蛋白质的结构和功能可能没有发生改变，尤其个别氨基酸的改变可能没有影响，C错误； D、新型蛋白质进化模型EVOLVEpro可以利用氨基酸序列，蛋白质工程仍需要基因修饰或基因合成等手段，EVOLVEpro在蛋白质工程广泛应用后将还需要借助基因工程手段改造蛋白质，使得产品更优良，D错误。 故选A。 5．（22-23高二下·湖南长沙·期中）生物工程应用广泛，成果丰硕，下列对应工程技术应用正确的是（    ） A．利用乳腺反应器生产药物，属于基因工程与动物细胞工程 B．制造一种能降解石油的“超级细菌”属于发酵工程 C．利用苏云金芽孢杆菌制成生物农药属于基因工程 D．人工生产牛胰岛素属于蛋白质工程 【答案】C 【知识点】基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用、蛋白质工程的应用及实例分析、动物细胞的培养和核移植技术、发酵工程的应用 【分析】动物基因工程的应用：培育快速生长的转基因动物，如转基因绵羊、转基因鲤鱼；改善畜产品品质的转基因动物，如乳汁中含乳糖较少的转基因牛；生产药物的转基因动物，如利用乳腺生物反应器生产药物；作器官移植供体的转基因动物，如无免疫排斥的转基因猪。 【详解】A、科学家们将药用蛋白基因导入动物的受精卵中，培养出转基因动物，让药用蛋白基因只在乳腺细胞中表达，利用乳腺生物反应器生产药物，这属于动物基因工程的应用，A错误； B、野生型的假单胞杆菌只能分解石油中的一种烃类，科学家利用基因工程技术，制造出一种能分解石油中3种烃类的“超级细菌”，提高了石油的降解速率，这属于基因工程的应用，B错误； C、我国科学家将苏云金芽孢杆菌中能够产生杀虫毒素的基因转移到棉花体内，成功培育了一系列抗虫棉品种，该项生物技术属于基因工程，C正确； D、将人的基因导入大肠杆菌体内，使其产生大量胰岛素属于基因工程，D错误。 故选C。 6．（24-25高二下·湖南常德·期中）纤维素合酶（CesA）定位于质膜上，催化纤维素的合成。通过实验发现，改变CesA的第540位天冬氨酸、第742位天冬氨酸、第784位色氨酸会导致CesA活性明显降低，影响棉花的产量。下列叙述错误的是（　　） A．由葡萄糖组成的纤维素是植物细胞壁的组成成分 B．第540、742、784位氨基酸改变不会影响CesA的空间结构 C．氨基酸分子在核糖体上脱水缩合，形成CesA的肽链结构 D．可通过蛋白质工程提高CesA的活性，提高棉花纤维的品质 【答案】B 【知识点】蛋白质的基本组成单位--氨基酸、蛋白质的结构及多样性、蛋白质工程原理及操作流程、糖类的种类及分布 【分析】蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造或制造新蛋白质，以满足人类生产和生活需求的生物技术。从预期功能出发，设计蛋白质结构，再反向推导基因序列，最终通过基因工程实现蛋白质改造（即“中心法则”的逆过程）。 【详解】A、纤维素是由葡萄糖聚合而成的多糖，植物细胞壁主要由纤维素和果胶组成，所以由葡萄糖组成的纤维素是植物细胞壁的组成成分，A正确； B、蛋白质的结构决定功能，改变CesA的第540位天冬氨酸、第742位天冬氨酸、第784位色氨酸会导致CesA活性明显降低，说明这些氨基酸的改变影响了CesA的空间结构，进而影响其功能，B错误； C、蛋白质的合成场所是核糖体，氨基酸在核糖体上通过脱水缩合形成肽链，CesA作为一种蛋白质，其肽链结构也是在核糖体上由氨基酸脱水缩合形成的，C正确； D、蛋白质工程可以通过对基因进行改造来生产符合人们需求的蛋白质，所以可通过蛋白质工程提高CesA的活性，从而提高棉花纤维的品质，D正确。 故选B。 7．（23-24高二下·湖南长沙·期中）AK、DHDPS是玉米中合成赖氨酸的两种关键酶，赖氨酸达到一定浓度就会与两种酶结合抑制它们的活性，如图所示，因此玉米中赖氨酸含量比较低。将AK中第352位苏氨酸变成异亮氨酸，DHDPS中第104位天冬酰胺变成异亮氨酸，该变化影响了其与赖氨酸的结合，使玉米叶片和种子内游离的赖氨酸分别提高5倍和2倍。下列有关分析错误的是（    ） A．玉米中赖氨酸含量比较低与负反馈调节密切相关 B．要替换AK、DHDPS中的氨基酸需要通过改造相应基因来实现 C．改造后的AK和DHDPS 活性提高，导致玉米合成赖氨酸的能力增强 D．改造后的AK和DHDPS空间结构改变，与赖氨酸结合的能力降低 【答案】C 【知识点】酶促反应的因素及实验、蛋白质工程原理及操作流程 【分析】据图分析，物质X在天冬氨酸激酶（AK）和二氢吡啶二羧酸合成酶（DHDPS）作用下，形成赖氨酸；当赖氨酸含量高时，抑制天冬氨酸激酶（AK）和二氢吡啶二羧酸合成酶（DHDPS）的活性。 【详解】A、由题可知，赖氨酸与AK、DHDPS结合，抑制它们的活性从而使反应速率下降，属于负反馈调节，A正确； B、根据题意“将AK中第352位苏氨酸变成异亮氨酸，DHDPS中第104位天冬酰胺变成异亮氨酸”，可知上述操作为蛋白质工程，蛋白质工程的实质是改造相应基因来实现，B正确； CD、将AK中第352位苏氨酸变成异亮氨酸，DHDPS中第104位天冬酰胺变成异亮氨酸，会导致改造后的AK和DHDPS的空间结构改变，与赖氨酸结合的能力降低，但改造后的AK和DHDPS的活性基本不变，C错误；D正确。 故选C。 二、不定向选择题 8．（22-23高二下·湖南益阳·期中）腈水合酶（N0）广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1）。下列有关叙述正确的是（    ）。 A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一 B．加入连接肽需要通过改造基因来实现 C．获得N1的过程需要进行转录和翻译 D．自然界中的酶都可以通过蛋白质工程进行改造 【答案】ABC 【知识点】蛋白质的结构及多样性、酶的特性、蛋白质工程的应用及实例分析 【分析】蛋白质工程：以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 【详解】A、利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1），N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一，A正确； B、加入连接肽需要利用蛋白质工程，通过改造基因实现，B正确； C、基因控制蛋白质的合成，获得N1蛋白质的过程需要进行转录和翻译，C正确； D、一些酶的化学本质是RNA，它们并不能通过蛋白质工程进行改造，D错误。 故选ABC。 9．（21-22高二下·湖南长沙·期中）蛋白酶应用于洗涤剂、制革及丝绸工业。某研究小组利用蛋白质工程将该蛋白酶中第188位丙氨酸替换为脯氨酸、第239位谷氨酰胺替换为精氨酸、第262位缬氨酸替换为亮氨酸，结果发现该酶的催化活性大幅度提高。下列叙述正确的是（    ） A．对枯草杆菌蛋白酶进行改造通过直接改造蛋白酶的分子结构来实现 B．通过基因工程和蛋白质工程生产的枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列相同 C．改造后的枯草杆菌蛋白酶可能使空间结构发生改变导致其催化活性提高 D．对枯草杆菌蛋白酶进行分子设计必须从预期蛋白酶的功能特点入手 【答案】CD 【知识点】蛋白质工程原理及操作流程、基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或者制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产生活需求。 【详解】A、对枯草杆菌蛋白酶进行改造通过基因来实现，A错误； B、基因工程生产的蛋白质是自然界已有的蛋白质，而蛋白质工程能生产出自然界中不存在的新型蛋白质分子，两者的氨基酸序列不同，B错误； C、该蛋白酶中第188位丙氨酸替换为脯氨酸、第239位谷氨酰胺替换为精氨酸、第262位缬氨酸替换为亮氨酸，结果发现该酶的催化活性大幅度提高，其原因可能是改变了蛋白酶的空间结构，提高了酶与底物的亲和力，C正确； D、对蛋白质进行分子设计应从预期的蛋白质功能出发，对蛋白质的结构进行设计，D正确。 故选CD。 三、非选择题 10．（23-24高二下·湖南株洲·期中）脂肪酶在食品工业中有着广泛的应用，食品生产常需要在高温条件下进行，天然脂肪酶难以满足生产需求。科学家对已知氨基酸序列的脂肪酶进行改造，获得了耐高温的脂肪酶，提高了食品工业的生产效率。回答下列问题。 (1)根据耐高温脂肪酶的结构特点，推测其氨基酸序列，然后重新设计新脂肪酶的基因序列，获得耐高温的脂肪酶的技术称为___。一般来说，新的脂肪酶基因脱氧核苷酸序列会有多种可能，其原因是__。 (2)在设计出耐高温的脂肪酶基因后，对其进行PCR扩增的过程包括_____、复性和延伸。延伸过程中由于DNA聚合酶的特性，子链延伸的方向为________。 (3)利用质粒将改造后的耐高温脂肪酶基因导入大肠杆菌，构建基因工程菌甲，若要检测工程菌甲中的耐高温脂肪酶基因是否成功表达，则需利用到___杂交技术，若出现杂交带，则说明基因能在工程菌内正常表达。 (4)利用工程菌甲生产耐高温脂肪酶的过程中，传代多次后，生产条件未变，但某子代菌株不再产生耐高温脂肪酶。分析可能的原因是___(答出两点即可)。 【答案】(1) 蛋白质工程 密码子的简并性 (2) 变性 5'端→3'端 (3)抗原-抗体 (4)耐高温脂肪酶基因突变、缺失或丢失；工程菌甲在分裂过程中质粒丢失，未遗传给下一代 【知识点】PCR扩增的原理与过程、目的基因的检测与鉴定、基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用、蛋白质工程原理及操作流程 【分析】题干信息：科学家对已知氨基酸序列的脂肪酶进行改造，获得耐高温的脂肪酶，由此可知该过程属于蛋白质工程。蛋白质工程流程：首先要建立蛋白质功能与结构的联系，然后依据所需蛋白质的功能，设计改造天然蛋白质的空间结构，推测出其氨基酸的序列，并根据“中心法则”逆推出基因的核苷酸序列，进而利用基因工程技术改变DNA上特定位点的核苷酸序列，最终将改造了的基因导入受体细胞后进行表达。可见，蛋白质工程是通过设计和改造编 码蛋白质的基因获得特定功能的蛋白质。 【详解】（1）蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质或者制造一种新的蛋白质的过程，因此题干获得耐高温的脂肪酶的技术称蛋白质工程。由于密码子具有简并性，所以新的脂肪酶基因脱氧核苷酸序列会有多种可能。 （2）目的基因通过PCR扩增，其过程包括变性，复性和延伸三个步骤；由于DNA聚合酶只能将脱氧核苷酸连在子链的3'端，故子链的延伸方向为5'→3'。 （3）基因表达的产物为蛋白质，检测蛋白质的方法为抗原-抗体杂交。 （4）利用工程菌甲生产耐高温脂肪酶的过程中，传代多次后，生产条件未变，但某子代菌株不再产生耐高温脂肪酶，说明该菌种可能没有该基因，因此子代菌株不再产生耐高温脂肪酶的原因可能是耐高温脂肪酶基因突变、缺失或丢失或工程菌甲在分裂过程中质粒丢失，未遗传给下一代。 11．（24-25高二下·湖南常德·期中）绿色荧光蛋白（GFP）是由一条肽链组成的蛋白质，通过蛋白质工程技术可获得增强型荧光蛋白。某研究人员设计引物，通过3次PCR反应（一次PCR反应包括多轮循环）将一对突变碱基引入编码GFP的DNA片段（片段甲），获得了编码增强型荧光蛋白的DNA片段（目的基因）。实验过程如图所示，图中a、b、c、d表示引物，→表示5＇→3＇方向，■代表突变碱基。 回答下列问题。 (1)以片段甲为模板，通过两次独立的PCR反应（步骤①和步骤②在不同的试管中进行）分别获得DNA片段乙和丙，步骤①和步骤②所用的引物对分别是________、________。 (2)步骤③是将纯化的DNA片段乙和丙混合，经热变性、退火，得到产物X和Y；步骤④是在DNA聚合酶的催化下进行的延伸反应。步骤③的产物中能形成DNA片段丁的是________，原因是________。 (3)以DNA片段丁为模板，通过PCR反应扩增目的基因时，所选用的PCR引物为________。 (4)上述获得增强型荧光蛋白的过程利用了蛋白质工程技术，其基本思路是从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→________→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或________→获得所需要的蛋白质。 【答案】(1) a和c b和d (2) Y DNA聚合酶只能从有模板的3＇端延伸DNA链 (3)a和d (4) 推测应有的氨基酸序列 合成新的基因 【知识点】PCR扩增的原理与过程、蛋白质工程原理及操作流程 【分析】PCR技术，需要一对引物，三个步骤循环主要控制的是温度，控制温度的目的是为了控制解旋、复性、延伸过程，以及保证酶活性。 【详解】（1）DNA子链的延伸方向为5＇→3＇，DNA聚合酶从引物的3＇方向开始连接脱氧核苷酸，以片段甲为模板，通过两次独立的PCR反应，若经步骤①获得乙片段，则需要在步骤①时加入引物说明a和c，若惊步骤②获得片段丙，则需要在步骤②时加入引物b和d。 （2）DNA聚合酶只能从引物的3＇方向开始连接脱氧核苷酸，即DNA聚合酶只能从有模板的3＇端延伸DNA链，对比X和Y的方向可知，DNA聚合酶能从Y的右侧继续催化延伸子链形成DNA片段丁。 （3）以DNA片段丁为模板，通过PCR反应扩增目的基因（与丁相同）时，应选用a和d作为PCR引物才能扩增出完整的丁片段。 （4）蛋白质工程技术的基本思路是从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质，蛋白质工程又被称为“第二代基因工程”。 地 城 考点05 基因工程的综合 一、不定向选择题 1．（22-23高二下·湖南益阳·期中）下图为利用生物技术获得生物新品种的过程，有关说法正确的是（    ） A．A→B过程中用到的原料有4种，加入的引物有2种 B．A→B过程利用了DNA半保留复制原理，需要使用耐高温的DNA聚合酶 C．B→C为转基因绵羊的培育过程，常选用的受体细胞是卵母细胞 D．B→D为转基因植物的培育过程，其中④过程常用的方法是农杆菌转化法 【答案】ABD 【知识点】PCR扩增的原理与过程、动物体细胞核移植技术和克隆、基因工程的操作程序综合 【分析】基因工程中获取并扩增目的基因的方法——PCR技术：原理：DNA双链复制原理；物质条件：一段已知核苷酸序列的引物，含目的基因的DNA模板，四种原料即dATP、dTTP、dGTP、dCTP和具有热稳定性的DNA聚合酶；过程：高温解旋 →引物与模板结合 →子链延伸 →反复循环→…… 【详解】A、分析题图可以看出，图中A→B过程为利用PCR技术扩增目的基因，原料是四种脱氧核苷酸，需要两种引物，A正确； B、PCR技术的原理是DNA半保留复制，需要耐高温的DNA聚合酶，B正确； C、B→C为转基因绵羊的培育过程，培育转基因动物时，常用受精卵作为受体细胞，C错误； D、培育转基因植物时，常用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，D正确。 故选ABD。 二、非选择题 2．（24-25高二下·湖南永州·期中）下图所示为科学家采用不同方法培育良种牛的过程，为操作过程请据图回答有关问题。 (1)图中c操作的名称是_____，d、f操作的名称是_____。 (2)图中用到的激素是_____，其目的是获得更多的卵母细胞，卵母细胞受精后发育可得到早期胚胎；图中的早期胚胎处于胚胎发育的_____阶段，其中胚胎干细胞来源于_____（填数字标号）。 (3)过程常用的方法是_____。 【答案】(1)胚胎分割 胚胎移植 (2) 促性腺激素 囊胚 ③ (3)显微注射法 【知识点】将目的基因导入受体细胞、动物的体外受精、胚胎移植技术、胚胎分割技术 【分析】分析题图：图示是科学家采用不同方法培育良种牛的过程，其中a为体外受精过程；b为早期胚胎发育过程；c为胚胎分割技术；d、f均为胚胎移植过程；h表示采用基因工程技术将外源基因导入受体细胞．图中①为滋养层细胞，②为囊胚腔；③为内细胞团。 【详解】（1）分析可知，a过程是体外受精，b过程是早期胚胎培养，c操作是胚胎分割，d、f操作是胚胎移植。 （2）用促性腺激素处理良种奶牛，可促使其超数排卵，可获得更多的卵母细胞，卵母细胞受精后发育可得到早期胚胎；胚胎移植时宜选用桑葚胚或囊胚，囊胚的内细胞团细胞具有全能性，胚胎干细胞来源于③内细胞团。 （3）常用显微注射法将外源基因导入动物受体细胞。 3．（24-25高二下·湖南长沙·期中）苦荞中含有的黄酮类化合物具有降血糖、降血脂等功效。CHS是合成黄酮类化合物的关键酶。把经修饰过的CHS基因导入苦荞细胞中，培育高产黄酮苦荞品系。据图回答下列问题： (1)重组Ti质粒中启动子的作用是_________________________。 (2)图中的①过程常用Ca2+处理农杆菌，使其成为感受态细胞，即细胞处于一种_________________________的生理状态。 (3)若要检测修饰后的CHS基因是否插入苦荞细胞的DNA上，可以采用__________等技术。为了防止转基因作物的目的基因通过花粉转移到自然界的其他植物中，可设法将目的基因整合到受体细胞的_______________（填结构）中。 (4)某种苦荞因为受到病毒感染而减产，现需要以该苦荞为材料获得脱毒苗，宜选用其茎尖作为外植体，理由是________________________________________。 【答案】(1)RNA聚合酶的识别和结合位点，驱动转录出mRNA (2)容易吸收周围环境中DNA分子 (3) PCR 细胞质（叶绿体） (4)植物顶端分生区附近（如茎尖）的病毒极少，甚至无病毒 【知识点】植物细胞工程的实际应用、基因工程的操作程序综合 【分析】基因工程的步骤：目的基因的筛选和获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）启动子位于基因上，其作用是RNA聚合酶的识别和结合位点，驱动启动子后的基因序列转录出mRNA。 （2）用Ca2+处理农杆菌，使其成为感受态细胞，即细胞处于一种容易吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 （3）检测修饰后的CHS基因是否插入苦荞细胞的DNA上，可以采用PCR等技术；如果将目的基因整合到细胞核中，则会随着花粉转移到自然界的其他植物中，若将目的基因整合到细胞质（叶绿体）中，则目的基因不会在花粉中出现。 （4）获得脱毒苗，宜选用茎尖作为外植体，是因为植物顶端分生区附近（如茎尖）的病毒极少，甚至无病毒。 4．（24-25高二下·湖南长沙·期中）大米中铁含量极低，科研人员通过基因工程、植物组织培养等现代生物技术，培育出了铁含量比普通大米高60%的转基因水稻，改良了稻米的营养品质。如图为培育转基因水稻过程示意图，其中①～⑥为过程，EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ为限制酶。 (1)该转基因水稻培育过程中选取的目的基因是____________________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是__________。PCR反应体系的成分中能够决定复制特定DNA片段的是__________（填“模板”“引物”或“Taq DNA聚合酶”）；从引物设计的角度考虑，如果目的基因两侧没有酶切位点，用PCR技术__________（填“可以”或“不可以”）为目的基因设置酶切位点。 (2)完成图中①过程需选用__________限制酶处理Ti质粒和含目的基因的DNA。为了筛检成功导入重组质粒的农杆菌，1号培养基需要加入__________。诱导组织细胞失去分化的是__________号培养基。 (3)图中④⑤⑥过程，属于__________技术，该技术依据的基本原理（理论基础）是__________。 【答案】(1) 铁合蛋白基因 加热至90～95℃ 引物 可以 (2) HindⅢ、BamHⅠ 潮霉素 2 (3) 植物组织培养 植物细胞的全能性 【知识点】植物组织的培养及基本过程、基因工程的操作程序综合 【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法常用农杆菌转化法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 4、目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质，抗原抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）实验是培育铁含量比普通大米高60%的转基因水稻，所以目的基因是铁合蛋白基因。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，加热至90～95℃引起模板DNA解链为单链，上述两个解链过程均破坏了DNA分子双链间的氢键。PCR反应体系的成分中，能够决定复制特定DNA片段的是引物，因为引物是DNA聚合酶的结合位点；获得目的基因后一般需要将目的基因连接到质粒载体上，在引物上加酶切位点可以使后续的连接过程简单、可控，因此如果目的基因两侧没有酶切位点，用PCR技术可以为目的基因设置酶切位点。 （2）构建基因表达载体时，若选用EcoRI，会破坏目的基因；由于目的基因两侧的酶切位点被HindⅢ、BamHⅠ识别，且质粒中也存在同样的酶切位点，则所选用的限制酶为BamHⅠ和HindⅢ。 质粒中的标记基因是潮霉素抗性基因，所以成功导入重组质粒的农杆菌能够抗潮霉素，则需要在1号培养基加入潮霉素进行筛检。3号培养基中培养的为愈伤组织，其为脱分化的结果，则诱导组织细胞失去分化的是2号培养基。 （3）据图分析，④⑤⑥过程属于植物组织培养，依据的原理是植物细胞的全能性。5．（24-25高二下·湖南长沙·期中）转基因植物中标记基因的剔除可有效防止基因污染，常用分离剔除法和重组剔除法进行剔除。分离剔除法是在转基因时将目的基因和标记基因分别构建在两个Ti质粒上，通过共转化得到转基因植物后让其自交得到不含标记基因的转基因个体；重组剔除法利用Cre/LoxP重组酶系统，Cre酶能有效剔除重组载体中含有标记基因的序列，只留下一个LoxP位点。回答下列问题： 说明：▲代表GOI基因，◆代表SMG基因 (1)分离剔除法中，将目的基因和标记基因分别构建在两个Ti质粒上，且都要插入Ti质粒的T-DNA序列内部，这是因为T-DNA具有__________的特性，从而确保目的基因和标记基因能够______。 (2)在分离剔除法中，得到共转化的转基因植物后进行自交，进而筛选出不含标记基因的转基因个体，该过程中发生的变异类型为________。从遗传角度分析，该过程与孟德尔______实验原理相似。 (3)重组剔除法利用Cre/LoxP重组酶系统，Cre酶能特异性地识别LoxP位点并剔除标记基因序列，仅留下一个LoxP位点。该种情况处理后的标记基因（见图2）在受体细胞中也无法表达，其原因是_________。该方法相较于分离剔除法，优势在于_______。 【答案】(1) 可转移至受体细胞，并且转移到受体细胞染色体DNA上 成功整合到受体细胞染色体DNA上 (2) 基因重组 自由组合 (3) 经重组剔除后的标记基因没有启动子，而启动子的作用是驱动转录，故经重组剔除后的标记基因无法启动基因的转录 无需自交筛选，直接在转化后的植株中通过Cre/LoxP系统剔除标记基因，效率更高且节省时间 【知识点】基因自由组合定律的实质和应用、基因重组、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞 【分析】Ti质粒的T-DNA序列可转移至受体细胞，并且转移到受体细胞染色体DNA上。 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录；终止子是RNA聚合酶脱离的部位，终止转录。 【详解】（1）Ti质粒的T-DNA序列可转移至受体细胞，并且转移到受体细胞染色体DNA上，所以利用分离剔除法时，目的基因和标记基因都应插到Ti质粒的T-DNA序列内部，进而成功整合到受体细胞染色体DNA上。 （2）通过自交筛选不含标记基因的个体，本质上是基因重组（同源染色体交换导致目的基因和标记基因独立分离）。该过程类似于孟德尔的自由组合定律（目的基因和标记基因在减数分裂时独立分配）。 （3）由图可知，经重组剔除后的标记基因没有启动子，而启动子的作用是驱动转录，故经重组剔除后的标记基因无法启动基因的转录，在受体细胞中也无法表达。相较于分离剔除法，重组剔除法无需自交筛选，直接在转化后的植株中通过Cre/LoxP系统剔除标记基因，效率更高且节省时间。 6．（24-25高二下·湖南·期中）引起人类肺炎的一种冠状病毒（nCoV）是一种单链RNA病毒，其包膜糖蛋白（GP）是该病毒侵染宿主细胞的关键蛋白，科学家利用大肠杆菌作为工程菌批量生产GP以制备疫苗，流程图如下。回答下列问题： 注：图中为四环素抗性基因；LacZ基因的表达产物能分解X－gal，使白色的大肠杆菌菌落变成蓝色。 (1)从nCoV基因组中分离的GP基因不能直接与质粒重组，其原因是______。过程①所需的原料及酶是______。 (2)构建的基因表达载体除目的基因、标记基因、复制原点外，还必须含有______等。过程③之前，先用处理大肠杆菌，目的是______。 (3)为筛选导入重组质粒的大肠杆菌，应在培养基中加入______和X－gal，筛选______（填“蓝色”或“白色”）菌落。 (4)利用抗原—抗体杂交技术检测大肠杆菌是否表达出目标产物时，应提取______，再用______进行抗原—抗体杂交。 (5)利用大肠杆菌生产疫苗的优点有______（答出2点）。 【答案】(1) nCoV-GP 基因为单链RNA，不能直接与双链DNA 相连 四种脱氧核苷酸和逆转录酶 (2)启动子、终止子 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 (3)四环素 白色 (4) GP 抗GP的抗体 (5)繁殖速度快，目的蛋白易获得，可大量生成 【知识点】基因工程的操作程序综合 【分析】由图可知，图中①表示将mRNA逆转录为cDNA再进行PCR扩增获取目的基因，②表示表达载体的构建。 【详解】（1）nCoV-GP 基因为单链RNA，从nCoV基因组中分离出的nCoV-GP基因不能直接与质粒重组，需逆转录得到DNA后才能进行重组。逆转录的产物的DNA，故需要原料是四种脱氧核苷酸，需要逆转录酶。 （2）构建的基因表达载体除目的基因、标记基因、复制原点外，还必须含有启动子和终止子；过程③（导入受体细胞）之前，先用Ca2+处理大肠杆菌，目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 （3）Tetr为四环素抗性基因，若要利用 Tetr基因筛选导入重组质粒的大肠杆菌，应在培养基中加入四环素，从而筛选出含有Tetr的大肠杆菌，即导入空载质粒和导入重组质粒的大肠杆菌。 LacZt基因的表达产物能使白色的大肠杆菌菌落变成蓝色，由于LacZt基因在构建重组质粒是被破坏，所以在添加四环素的培养基上筛选出呈白色的菌落即为重组质粒。 （4）GP蛋白作为抗原，与抗GP蛋白的抗体发生特异性结合，检测大肠杆菌是否表达出目标产物。故应提取GP，再用抗GP蛋白的抗体进行抗原-抗体杂交。 （5）利用大肠杆菌生产疫苗的优点有：繁殖速度快，目的蛋白易获得，可大量生成。 7．（24-25高二下·湖南邵阳·期中）番茄在运输和储藏过程中，会由于过早成熟而易腐烂。应用基因工程技术抑制某种促进果实成熟的激素的合成，可使番茄储藏时间延长，培育成耐储藏的番茄新品种。请回答下列问题。 (1)促进果实成熟的重要激素是___________。 (2)在培育转基因番茄的操作中，所用的“分子手术刀”是___________，基因的“分子缝合针”是_________，基因的“分子运输车”是___________。 (3)与杂交育种、诱变育种相比，通过基因工程来培育新品种的主要优点是____________，育种周期短，能克服远缘杂交不亲和的障碍。 【答案】(1)乙烯 (2) 限制性内切核酸酶（或限制酶） DNA连接酶 载体 (3)能定向改变生物性状 【知识点】其他植物激素的产生、分布和功能、DNA重组技术的基本工具、基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用 【分析】基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。 【详解】（1）乙烯主要作用是促进果实成熟，此外，还有促进老叶等器官脱落的作用。植物体各部位都能合成乙烯。 （2）基因工程中，所用的基因的“分子手术刀”是限制性内切酶，基因的“针线”是DNA连接酶，基因的“运输工具”是运载体。 （3）与杂交育种、诱变育种相比，通过基因工程来培育新品种的主要优点是目的性强、育种周期短和克服远源杂交的障碍。 8．（24-25高二下·湖南长沙·期中）炎症性肠病（IBD）是一种易导致结肠癌的慢性疾病，患者肠道内会产生硫代硫酸盐，且生成量与疾病严重程度呈正相关。为简化疾病诊断和精确用药，科研人员开发了智能工程菌。 (1)科研人员将抗炎蛋白基因与硫代硫酸盐特异性诱导激活的启动子P连接，构建出图1所示表达载体。先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于________的生理状态，再将表达载体导入其中，筛选得到菌株E。饲喂菌株E的IBD小鼠症状明显缓解。选用启动子P的优点是仅在IBD发生时才表达抗炎蛋白且表达量与________呈正相关，能精准治疗IBD． (2)科研人员拟向菌株E中导入新元件，得到菌株Ec，以通过观察饲喂菌株Ec的小鼠粪便中的荧光情况来诊断IBD严重程度。制备新元件有图2所示两种方案。 ①与方案1相比，方案2的主要优势是排除不同的小鼠粪便样品中_________对诊断结果的影响。 A．Ec菌数量差异    B．EC菌活性差异    C．硫代硫酸盐含量 ②利用方案2所获得的EC菌饲喂IBD小鼠后，若粪便样品中仅发红色荧光的菌为x个，同时发红色和绿色荧光的菌为y个，则反映IBD发病程度的数学表达式为_______。 (3)硫代硫酸盐易被分解，因此EC菌荧光情况的观察只能反映观察时刻的情况。为了让曾经患过IBD的情况被记录下来，科研人员继续向菌株EC中导入含图3所示元件的表达载体，得到智能工程菌R。正常的LacZ基因编码的蛋白可使大肠杆菌菌落在含X-gal（无色）的培养基上呈现蓝色。突变基因A-LacZ无法表达LacZi酶，B-sgRNA能使突变基因A-LacZ恢复正常序列。 给小鼠饲喂智能工程菌R后，收集小鼠粪便中的工程菌R，将工程菌R涂布在含____________的平板上，若________，则说明小鼠曾患IBD． 【答案】(1) 能吸收周围环境中DNA分子 IBD程度 (2) AB y/（x+y） (3) X-gal 出现蓝色菌落 【知识点】目的基因的检测与鉴定、将目的基因导入受体细胞、基因表达载体的构建 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）利用Ca2+处理大肠杆菌细胞，可以使细胞处于一种能够吸收周围环境DNA分子的生理状态，从而将重组的基因表达载体导入其中；由图1可知，启动子P是硫代硫酸盐特异性诱导激活的启动子，因此，只有小鼠患IBD，菌株E中的抗炎蛋白基因才会表达且精准治疗IBD，所以其表达量与IBD程度呈正相关。 （2）①由图2可知，方案1中的诱导型启动子只有在IBD发生时才会表达绿色荧光蛋白基因，绿色荧光蛋白的数量受EC菌株数量和IBD发病程度的影响。故选AB。 ②方案2中，因为有持续表达启动子Pc，在未受到IBD诱导的时候，菌株EC表达红色荧光蛋白基因，当受到IBD诱导时，EC既表达红色荧光蛋白基因，也表达绿色荧光蛋白基因，如此，IBD的患病程度就可以利用同时发红色和绿色荧光的工程菌的数量与所有发荧光的工程菌的数量之比表示，即y/(x+y)。 （3）由图3可知，当小鼠患IBD时，启动子P会让B-sgRNA基因表达，从而使突变基因A-LacZ恢复正常序列，即LacZ基因会编码蛋白质使大肠杆菌菌落在含X-gal（无色）的培养基上呈现蓝色（出现蓝色菌落），从而记录下曾经患过IBD的情况。 9．（24-25高二下·湖南长沙·期中）P蛋白是植物逆境响应过程中的重要物质，在对该蛋白研究的过程中，科研团队利用无缝克隆技术将P蛋白基因与GUS基因（一种报告基因，基因工程中用来指示外源基因的表达情况）融合，通过农杆菌转化法导入其他作物进行研究，相关过程如图所示。    (1)无缝克隆时，利用T5核酸外切酶水解DNA，其目的是形成_______。无缝克隆时所需的酶除T5核酸外切酶外还有_______。用无缝克隆技术构建GUS-P融合基因的关键是引物R2的5＇端序列与引物_________互补。 (2)为了利用农杆菌转化法将GUS-P融合基因导入植物细胞，需要先将融合基因插入Ti质粒的________中。 (3)Ti质粒的结构如下图所示，若GUS-P融合基因拼接处存在XbaⅠ的识别序列，为使融合基因和Ti质粒高效连接，且使P基因、GUS基因和M基因都正确表达，应用__________两种限制酶对Ti质粒进行酶切，并在GUS-P融合基因两端添加________两种限制酶的识别序列。    【答案】(1) 黏性末端 DNA聚合酶和DNA连接酶 F1 (2)T-DNA (3) Xba I、EcoR I Spe I、EcoR I 【知识点】基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。 【详解】（1）由图可知，利用无缝克隆技术将P蛋白基因与GUS基因融合，利用T5核酸外切酶水解DNA，其目的是形成黏性末端，便于连接，该过程所需的酶除T5核酸外切酶外还有DNA聚合酶和DNA连接酶。 DNA的两条链是反向平行的，用无缝克隆技术构建GUS-P融合基因的关键是R2引物5'端序列与F1（或P基因左侧序列）3'互补，这样可以实现基因的融合。 （2）为了利用农杆菌转化法将GUS-P融合基因导入植物细胞，需要先将融合基因插入Ti质粒的T-DNA中，因为T-DNA能整合到受体细胞的染色体DNA上。 （3）Ti质粒的结构如下图所示，若GUS-P融合基因拼接处存在XbaI的识别序列，则不能选择限制酶XbaI切割融合基因，但限制酶XbaI和SpeI识别序列不同，但有相同的黏性末端，为使融合基因和Ti质粒高效连接，且使P基因、GUS基因和M基因都正确表达，则需要用双酶切，应在GUS-P融合基因两端添加SpeI、EcoRI两种限制酶的识别序列，不选择BamHI的原因是该酶能将M基因切割，SmaI产生的是平末端；同时需要用XbaI、EcoRI两种限制酶对Ti质粒进行酶切，这样在质粒中和融合基因的两端可以出现分别相同的黏性末端。 10．（23-24高二下·湖南常德·期中）2019年新冠疫情爆发以来，疫情防控成为社会关注的热点问题。下图所示某科研团队运用基因工程研制新冠病毒疫苗的过程。质粒中lacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。回答下列问题： (1)获取目的基因时，首先提取新冠病毒的RNA，再通过逆转录过程获得cDNA，该过程需要的酶是_____。 (2)图中过程①有两种限制酶选择方案（注：图中几种限制酶切割产生的末端不同）：方案一：选用1种限制酶；方案二：选用2种限制酶，最佳选择是________________________________ ；方案二优于方案一的原因是________________________________。 (3)需要用一定浓度的________处理大肠杆菌，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将重组质粒导入其中。筛选含重组质粒的大肠杆菌时，须在培养大肠杆菌的通用培养基中加入_____________________，培养一段时间后，挑选出______色的菌落进一步培养获得大量目的菌。 (4)利用PCR技术获取目的基因时，PCR扩增仪中要加入缓冲液、目的基因、引物、___________、_________等。据下图分析，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的____________________。 【答案】(1)逆转录酶、耐高温的DNA聚合酶 (2) 方案二 既防止了目的基因和质粒的自身环化，又能保证目的基因和质粒的正向连接 (3) Ca2+ 青霉素和X-gal 白 (4) 耐高温的DNA聚合酶 原料 乙、丙 【知识点】目的基因的检测与鉴定、将目的基因导入受体细胞、基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）首先提取新冠病毒的RNA，再通过逆转录过程获得cDNA，PCR的原理是DNA半保留复制，其中逆转录需要的酶是逆转录酶，PCR需要耐高温的DNA聚合酶。 （2）如果用一种限制酶，可能切割后的目的基因会自身环化，同时会使目的基因反接在质粒上。为避免目的基因在质粒反向连接，可选用两种不同的限制酶切割，既防止了目的基因和质粒的自身环化，又能保证目的基因和质粒的正向连接。 （3）将重组质粒导入大肠杆菌之前，需要用一定浓度的Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，便于重组DNA导入。将重组质粒导入双子叶植物细胞和裸子植物，常用的方法是农杆菌转化法。目的基因拼接在质粒的lacZ基因上，打破了lacZ基因的序列，故筛选含重组质粒的大肠杆菌时，须在培养大肠杆菌的通用培养基中加入青霉素（检测抗性基因）和X-gal（检测是否导入目的基因）培养一段时间后，挑选出白色（若导入目的基因，lacZ基因被破坏，不能分解X-gal而呈白色）的菌落进一步培养获得大量目的菌。 （4）用PCR技术在体外扩增外源基因时，PCR扩增仪中要加入缓冲液、目的基因、耐高温的DNA聚合酶、原料、引物等。PCR时，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的，因此，据如图分析，利用PCR技术获取目的基因时，应选择乙、丙作为引物。 11．（23-24高二下·湖南·期中）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。    (1)基因工程中，为了防止插入片段的反向连接，对载体一般采用__________（填“单酶切”或“双酶切”）。将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成除使用上述限制酶外，还需使用________酶。 (2)基因表达载体必须含有的组分是________，将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是________________。 (3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于________________。 【答案】(1) 双酶切 SalI Taq酶、限制酶EcoR Ⅰ 、限制酶Mun Ⅰ 、限制酶Xho Ⅰ 、DNA连接酶 (2) 启动子、目的基因、终止子、标记基因、复制原点 F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达 (3)引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 【知识点】基因表达载体的构建、DNA重组技术的基本工具、PCR扩增的原理与过程 【分析】1、据题意可知，科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，据图中注释可知，F1~F7以及R位置均为引物，故扩增的序列分别是引物F1和引物R之间的序列，引物F2和引物R之间的序列，引物F3和引物R之间的序列，引物F4和引物R之间的序列，引物F5和引物R之间的序列，引物F6和引物R之间的序列，引物F7和引物R之间的序列； 2、据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，限制酶Xho Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶Sal Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同。 【详解】（1）若质粒和目的基因两端的黏性末端相同，可能会出现质粒和目的基因自身环化以及反向连接的现象，为了防止插入片段的反向连接，对载体一般采用双酶切的方法，形成不同的黏性末端。据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶Mun Ⅰ 识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有Mun Ⅰ 和 Xho Ⅰ 的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 所识别，故应该选用添加限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，故 R 末端添加的序列所对应的限制酶是EcoR Ⅰ ，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是Sal Ⅰ ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoR Ⅰ 的识别位点，故对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割。综上所述，对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割，对扩增后的产物用限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Taq酶、限制酶EcoR Ⅰ 、限制酶Sal Ⅰ、限制酶Mun Ⅰ 、限制酶Xho Ⅰ 、DNA连接酶。 （2）基因表达载体必须含有的组分是启动子、目的基因、终止子、标记基因、复制原点，受体细胞中已经除去 BCL11A 基因，故扩增产物中的 BCL11A 蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。 （3）向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生 BCL11A 蛋白， BCL11A 蛋白与BCL11A 蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F4与引物R之间的序列上；含 F5～F6 与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上。 12．（22-23高二下·湖南益阳·期中）如图是将乙肝病毒表面主蛋白基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程图。巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母，能将甲醇作为其唯一碳源。该酵母菌体内无天然质粒，科学家改造出了图中所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。已知当甲醇作为唯一碳源时，该酵母菌中AOX1基因受到诱导而表达[5′AOX1和3′AOX1（TT）分别是AOX1基因的启动子和终止子]。请分析回答下列问题： (1)为实现HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该选择____________切割质粒，并在HBsAg基因两侧的A和B位置接上_______________，这样设计的优点是___________。 (2)酶切获取HBsAg基因后，需用____________将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取____________。 (3)步骤3中应选用限制酶____________来切割重组质粒以获得重组DNA，然后再将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。 (4)为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入________以便筛选；若要检测转化后的细胞中是否含有HBsAg基因转录产物，可以用________技术进行检测。 【答案】(1) SnaBⅠ、AvrⅡ 相应的限制酶识别序列 确保定向连接（避免质粒和目的基因自身环化及目的基因和质粒反向连接） (2) DNA连接酶 大量重组质粒 (3)BglⅡ (4) 卡拉霉素 PCR 【知识点】目的基因的检测与鉴定、基因表达载体的构建 【分析】分析题图：图中质粒含有SnaBⅠ、AvrⅡ、BglⅡ和SacI限制酶切割位点，其中SacI位于启动子上，BglⅡ位于终止子上。要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，只能用限制酶SnaBⅠ和AvrⅡ切割质粒，要获取含有5′AOX1--3′AOX1段基因，应选用限制酶BglⅡ来切割。 【详解】（1）图中质粒含有SnaBⅠ、AvrⅡ、BglⅡ和SacI限制酶切割位点，其中SacI位于启动子上，BglⅡ位于终止子上。如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，只能用限制酶SnaBⅠ和AvrⅡ切割质粒，所以应在HBsAg基因两侧的A和B位置接上SnaBⅠ、AvrⅡ限制酶识别序列。这两种酶切割产生的黏性末端不同，这样可以避免质粒和目的基因自身环化，还可以防止目的基因和质粒反向连接。 （2）获取目的基因后，需要用DNA连接酶将目的基因和载体连接形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取大量重组质粒。 （3）步骤3是要获取含有5′AOX1……3′AOX1段基因，应选用限制酶BglⅡ来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。 （4）5′AOX1……3′AOX1段基因含有卡拉霉素抗性基因，因此在培养基中加入卡拉霉素以便筛选导入重组质粒的目的菌。若要检测转化后的细胞中是否含有HBsAg基因转录产物，可以用分子杂交方法进行检测，先用PCR技术扩增目的基因，再与转录产物mRNA杂交。 13．（22-23高二下·湖南邵阳·期中）人的血清白蛋白（HSA）在临床上需求量很大，通常从人血中提取。但由于艾滋病病毒（HIV）等人类感染性病原体造成的威胁与日俱增，使人们对血液制品顾虑重重，图一是以基因工程技术获取HSA的两条途径，其中报告基因表达的产物能催化无色物质K呈现蓝色。图二为HSA基因两侧的核苷酸序列。图三为相关限制酶的识别序列和切割位点。据图回答下列问题：        (1)基因工程的核心步骤是____________。 (2)采用PCR技术扩增HSA基因，根据图二分析，需选择的一对引物序列是______ A．引物Ⅰ是5′-AATGGATCCTTC-3′，引物Ⅱ是5′-GAGAATTGAATG-3′ B．引物Ⅰ是5′-AATGGATCCTTC-3′；引物Ⅱ是5′-CATTCAATTCTC-3′ C．引物Ⅰ是5′-GAAGGATCCATT-3′，引物Ⅱ是5′-GTAAGTTAAGAG-3′ D．引物Ⅰ是5′-GAAGGATCCATT-3′，引物Ⅱ是5′-GAGAATTGAATG-3′ (3)依据图一、图二和图三分析，切割含HSA基因的DNA片段选用的限制酶是________________________；切割质粒应选用的限制酶是______________________________。 (4)图一过程①中需将植物细胞与______混合后共同培养，旨在让______整合到植物细胞染色体DNA上，除尽农杆菌后，还须转接到含______的培养基上筛选出转化的植物细胞。 【答案】(1)基因表达载体的构建 (2)A (3) 酶B和酶C 酶B和A (4) 农杆菌 T-DNA 物质K 【知识点】筛选、获取合适的目的基因、目的基因的检测与鉴定、基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【分析】1、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。 2、用核移植的方法得到的动物是克隆动物。用体外受精技术获得的动物是试管动物。 【详解】（1）基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。 （2）PCR中需要一对特异性的引物，该引物能与目的基因需要碱基互补配对，子链延伸时是从引物的5′向3′端延伸，根据图2中目的基因HSA处于中间位置，所以符合条件的引物Ⅰ是5'-AATGGATCCTTC-3'，引物Ⅱ是5'- GTAAGTTAAGAG-3′。 故选A。 （3）图2目的基因所在DNA中只有酶B和酶C的识别序列，可以用限制酶B和C进行切割，质粒的T-DNA在酶A和酶B之间，所以切割质粒时用酶A和酶B切割。 （4）图一过程①中需将植物细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让T-DNA整合到植物细胞染色体DNA上；除尽农杆菌后，为筛选出转化的植物细胞，利用重组质粒上的报告基因表达产物能催化无色物质K呈蓝色的特性。 14．（22-23高二下·湖南怀化·期中）甘蓝型油菜中，抑制PEP基因的表达可提高油菜籽的含油量。通过基因工程将PEP基因反向连接在启动子后，构建转反义PEP基因油菜是提高油菜籽含油量的常用技术路径。请回答下列问题： (1)为将PEP基因反向连接在启动子后，构建反义PEP基因，需要将限制酶酶切位点设计在引物上，PEP基因的上游引物和下游引物中应分别引入________酶切位点。 (2)用激光照射油菜愈伤组织时，可在细胞膜上打出一个穿孔，转反义PEP基因表达载体由此小孔进入油菜细胞，几秒钟后小孔封闭，该过程体现了细胞膜具有____________。目的基因表达载体进入细胞后，Ti质粒上的T－DNA区段可转移到油菜细胞的基因组中。 (3)筛选时，需在油菜愈伤组织培养基中加入__________进行初步选择。在激光照射下，存活的细胞一般会发出______________。为检测反义PEP基因是否整合到染色体上，研究者通常检测细胞中是否存在ntp基因，而不检测PEP基因。不直接检测PEP基因的原因是________________。 【答案】(1)ScaⅠ、HamHⅠ (2)流动性 (3)新霉素 绿色荧光 油菜细胞的基因组中本身有PEP基因 【知识点】生物膜的结构特点、目的基因的检测与鉴定、基因表达载体的构建 【分析】细胞膜的结构特性是具有一定的流动性，功能特性是选择透过性。 基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建。（3）将目的基因导入受体细胞。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）为将PEP基因反向连接在启动子后，构建反义PEP基因，根据图中启动子和终止子的位置以及质粒上的限制酶种类分析，若要构成反义PEP基因表达载体，需要将限制酶切位点设计在引物上，PEP 基因的上游引物和下游引物中应分别引入Sca Ⅰ、HamH Ⅰ酶切位点。 （2）在细胞膜上打出一个穿孔，转反义PEP基因表达载体由此小孔进入油菜细胞，几秒种后小孔封闭，该过程依赖细胞膜具有一定的流动性来实现。 （3） 由图可知，Ti质粒上的标记基因是新霉素抗性基因，故筛选时，需在油菜愈伤组织培养基中加入新霉素进行初步选择。在激光照射下，存活的细胞一般会发出绿色荧光，因为目的基因与新霉素抗性基因以及绿色荧光蛋白基因同时进行了转移从而能检测目的基因是否进行了成功导入。由题干可知，油菜细胞的基因组中本身有PEP基因，而没有ntp基因，而ntp基因的存在能说明目的基因成功导入，故为检测反义PEP基因是否整合到染色体上，研究者通常检测细胞中是否存在ntp基因，而不检测PEP基因。 15．（22-23高二下·湖南怀化·期中）回答下列利用转基因动物生产药物的问题： (1)家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力。将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可提取干扰素用于制药。为使干扰素基因在家蚕细胞中高效表达，需要把干扰素基因片段正确插入表达载体的__________和___________之间。采用__________技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。 (2)若要获得含有人干扰素基因的转基因牛，将基因表达载体导入受体细胞。导入并培养成功后，该基因在________（填“任意体细胞”或“乳腺细胞”）中表达。构建基因工程表达载体时，若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生______（填“相同”或“不同”）黏性末端的限制酶。 【答案】(1)启动子 终止子 PCR (2) 乳腺细胞 相同 【知识点】基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程 【分析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原抗体杂交技术。④个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定等。 【详解】（1） 在基因工程中，构建表达载体时，需要将目的基因插入启动子和终止子之间，以使目的基因得到高效表达。PCR技术可验证干扰素基因（目的基因）是否已经导入家蚕细胞（受体细胞）。 （2）干扰素是一种蛋白质，其干扰素基因只能在乳腺细胞中表达。构建基因工程表达载体时，若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生相同黏性末端的限制酶。利用碱基互补配对，目的基因和质粒便可以直接进行连接。 16．（22-23高二下·湖南长沙·期中）人乳头瘤病毒HPV是双链DNA病毒，可以引起人皮肤黏膜上皮增生。HPV病毒的DNA分子与健康细胞的细胞核结合，利用细胞产生出两种蛋白E6、E7，它们会附着在抑癌基因p53和pRb上，并关闭它们的功能。默沙东九价HPV疫苗是利用酿酒酵母菌进行生产。 (1)相较于其他模式生物而言，酵母菌具有___________________________等特点，能更快获得工程目标。 (2)下图为重组质粒构建的过程，其中AvrⅡ的酶切序列与位点是C↓CTAGG；SnaBI的酶切序列与位点是TAC↓GTA；SacI 的酶切序列与位点是GAGCT↓C；BglII 的酶切序列与位点是 A↓GATCT。在对HPV的DNA进行PCR扩增时，需要设计两种引物以保证目的基因和质粒有相同的限制酶识别序列，根据选择的质粒及各限制酶识别序列，引物中需要有序列___________________。将得到的重组质粒置于含有Ca2+的酿酒酵母培养液中，酵母菌吸收后，接种到___________________培养基上进行初步筛选，得到含有该质粒的酵母菌，挑取菌落转移到96孔板上培养，利用___________________技术鉴定筛选确实表达了HPV的E6、E7蛋白质的酿酒酵母，再进行扩大培养。 (3)在宫颈癌筛查中有HPV检查，取病宫颈组织和局部粘液、分泌物进行HPV-DNA检测。病毒DNA的检测一般采取Real-time PCR技术即实时荧光测序（如下图所示），需要的物质有___________________、4种脱氧核苷酸、患者的组织或分泌物、水、缓冲液、两种引物 。探针序列含有HPV的特定序列，随着PCR循环次数的增加，很快就检测到了荧光，说明该患者___________________（有\没有）HPV病毒。 【答案】(1)繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 (2) CTAGG-和-TAC（或-GGATC和-ATG） 含有氨苄青霉素 抗原-抗体杂交 (3) 耐高温的DNA聚合酶 有 【知识点】PCR扩增的原理与过程、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）酵母菌属于单细胞生物，具有繁殖快、传物质相对较少等特点，可更快获得工程目标，故常用酵母菌做受体细胞。 （2）分析题意可知 ，在对HPV的DNA进行PCR扩增时，需要设计两种引物以保证目的基因和质粒有相同的限制酶识别序列，据图可知，SacI 和BglII 会破坏启动子，而SnaBI和AvrⅡ位于启动子和终止子之间，故可选择这两种酶进行切割，故引物中需要有-CTAGG-和-TAC（或-GGATC和-ATG）的识别序列；据图可知，质粒中含有氨苄青霉素抗性基因，故可在含有氨苄青霉素的培养基上进行初步筛选；抗原与抗体的结合具有特异性，且E6、E7属于蛋白质，故可利用抗原-抗体杂交技术鉴定筛选确实表达了HPV的E6、E7蛋白质的酿酒酵母。 （3）PCR是一项体外扩增DNA的技术，该过程主要通过控制温度实现，由于温度可高达90℃以上，故该反应体系中需要有耐高温的DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸、患者的组织或分泌物、水、缓冲液、两种引物；分析题意，探针序列含有HPV的特定序列，若随着PCR循环次数的增加，很快就检测到了荧光，说明该患者含有相应的能与HPV互补配对的碱基序列，即有HPV病毒。 17．（22-23高二下·湖南·期中）下图是获得转基因动物和植物的流程图，请据图回答： (1)培育转基因动物和植物的核心工作是__________。 (2)图示获得大量目的基因的方法是__________，若模板双链DNA的数量为n个，经过32次循环需要消耗的引物数量是__________。 (3)图中过程③使用的激素是__________。过程⑥常用的方法是__________。 (4)研究人员按照上图所示将白羊草的抗旱基因转入莴苣细胞中，培育出转基因莴苣，欲进一步确定白羊草的抗旱基因与转基因莴苣的抗旱性是否有关，请写出简要的实验设计思路。__________。 【答案】(1)基因表达载体的构建 (2) PCR（扩增技术） 2n（232-1） (3) 促性腺激素 农杆菌转化法 (4)将转基因莴苣与非转基因莴苣（野生型莴苣）分别置于干旱环境中培养，一段时间后观察比较两组莴苣的生长状况 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 【分析】获得大量目的基因的方法是PCR技术，可以大量扩增目的基因；基因工程的核心是基因表达载体的构建；将目的基因导入受体动物细胞最常用的方法是显微注射法，用促性腺激素处理良种奶牛，促其排卵用于体外受精；而对于受体奶牛则需要用激素对其进行同期发情处理；构建重组Ti质粒的过程⑤属于基因工程，则用到的工具酶为限制酶和DNA连接酶。过程⑥导入到莴苣的体细胞方法是农杆菌转化法，发育成完整的转基因莴苣，则需要通过植物组织培养技术才能获得转基因莴苣，该技术的原理是植物细胞的全能性。 【详解】（1）基因工程的核心工作是基因表达载体的构建。 （2）图示94℃变性、55℃复性、72℃延伸，获得大量目的基因的方法是PCR（扩增技术）。每合成一条新的子链消耗一个引物，一个DNA分子经过32次循环新合成的子链条数是2（232-1），所以n个DNA分子经过32次循环需要消耗的引物数量是2n（232-1）。 （3）图中过程③超数排卵使用的激素是促性腺激素，过程将重组Ti质粒导入莴苣体细胞常用的方法是农杆菌转化法。 （4）要进一步确定白羊草的抗旱基因与转基因莴苣的抗旱性是否有关，需要在个体水平进行抗性实验，实验思路为：将转基因莴苣与非转基因莴苣（野生型莴苣）分别置于干旱环境中培养，一段时间后观察比较两组莴苣的生长状况。 18．（22-23高二下·湖南·期中）某种病毒可通过其S蛋白和RBD蛋白与人体细胞表面的受体结合而进入细胞，是宿主抗体的重要作用位点。下图是科研人员利用该病毒S蛋白基因和RBD蛋白基因，研制该病毒双抗原疫苗的技术路线。 (1)PCR扩增时，需在______催化下，在两种引物的______端进行DNA链的延伸，获得扩增产物。 (2)为使S-RBD基因能与pX质粒相连接，并在工程菌中表达时先合成S蛋白，则PCR过程中，应在引物1的5′端添加的限制酶序列是______。 (3)将重组pX质粒导入工程菌前，需用钙离子处理工程菌，使其处于一种______的生理状态，便于重组质粒的导入。 (4)在工程菌的筛选时，可先后用两种抗生素进行影印培养实验（即先将工程菌接种到培养基A上，待长出菌落后使用无菌的绒毡布压在培养基A的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B上），则培养基A上应添加的抗生素为______（填“青霉素”或“四环素”）。若培养基B中有存活的菌落，则这些菌落的细胞内______（填“含”或“不含”）S-RBD基因。鉴定pX质粒和重组pX质粒是否导入工程菌还可以采用的方法是______。 【答案】(1)耐高温DNA聚合酶（Taq酶） 3’ (2)5’AAGCTT3’ (3)能吸收周围环境中DNA分子 (4)青霉素 不含 观察菌落是否具有荧光 【知识点】PCR扩增的原理与过程、目的基因的检测与鉴定 【分析】基因工程的步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）PCR是体外扩增DNA的技术，PCR扩增时，需在耐高温的DNA聚合酶（即Taq聚合酶）的催化下，又由于子链合成的方向是从5'端到3'端，故在引物的3’端进行DNA链的延伸。 （2）工程菌中表达时先合成S蛋白，则S基因需处于靠近启动子位置，而启动子后为HindⅢ的识别位点，故S基因位置的引物1需接上HindⅢ的识别序列。则PCR过程中，应在引物1的5′端添加的限制酶序列是5’AAGCTT3’。 （3）将重组质粒导入微生物时，需用钙离子处理微生物，使其处于一种能从周围环境中吸收DNA分子的生理状态，即感受态。 （4）在工程菌的筛选时，由于重组质粒中存在抗青霉素基因且抗四环素基因被目的基因破坏，故在影印培养实验中，应先接种到青霉素培养基中，故培养基A上应添加青霉素，若长出菌落，则说明质粒成功导入。再用无菌的绒毡布压在培养基A的菌落上，带出少许菌种，平移并压在含四环素的培养基B上，若有菌落出现，则说明抗四环素基因存在，目的基因没有成功导入，则这些菌落的细胞内不含S-RBD基因；鉴定pX质粒是否导入工程菌还可以采用的方法是观察菌落是否具有荧光，有荧光的则含有pX质粒或重组pX质粒。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $