2026届高三生物二轮复习课件专题10 生物技术与工程

泡菜(乳酸菌) 果酒(酵母菌) 果醋(醋酸菌) 灼烧灭菌法 干热灭菌法 湿热灭菌法 无菌 技术 消毒 灭菌 平板划线法 稀释涂布平板法 显微镜直接计数法 生物技术与工程 植物细胞工程 膜的流动性 细胞的全能性 动物细胞工程 胚胎 工程 精子获能;卵母细胞培养到M 中期; 透明带反应;卵细胞膜反应 桑葚胚;囊胚;原肠胚 注意: 细胞工程 发酵工程 细胞增殖 碳源、氮源、水、无机盐等 细胞的全能性 膜的流动性 动物体细胞核的全能性 桑葚胚、囊胚 将囊胚的内细胞团均等分割 应用 培养 培养基 接种 计数 原理: 核心过程: 原理: 核心过程: 原理: 核心过程: 原理: 原理: 动物细胞培养 动物细胞融合 单克隆 抗体制备 核移植 植物组织培养 植物体细 胞杂交 原理: 核心过程: 受精 胚胎早期发育: 胚胎移植 胚胎分割 准备: 过程: 实质: 最佳时期: 基因工程 煮沸消毒法 巴氏消毒法 化学药剂消毒法 紫外线消毒法 脱分化、再分化 细胞融合、组织培养 原代培养、传代培养 细胞融合、动物细胞培养 1 动物细胞培养时,血清是在灭菌后加入。 血清中含有丰富的蛋白质、生长因子等营养物质,但这些成分大多对高温敏感,若与培养基一起灭菌,会导致其活性丧失,无法发挥应有的作用。所以通常是先将培养基灭菌,待冷却后再在无菌条件下加入经过滤除菌的血清,以保证血清的活性和细胞培养环境的无菌性。 问题1:动物细胞培养时,加血清是在灭菌前还是灭菌后? 例.(2022湖北.T6)某兴趣小组开展小鼠原代神经元培养的研究,结果发现其培养的原代神经元生长缓慢,其原因不可能的是( ) A.实验材料取自小鼠胚胎的脑组织 B.为了防止污染将培养瓶瓶口密封 C.血清经过高温处理后加入培养基 D.所使用的培养基呈弱酸性 A 有丰富的原代神经元,细胞分裂能力强 细胞无氧呼吸造成供能不足,可能使细胞生长慢 活性成分变性失活,失去原有功能,无法满足细胞生长所需 牛肉膏蛋白胨培养基灭菌后蛋白质仍有作用。 虽然高压蒸汽灭菌过程中的高温会使蛋白质变性,其空间结构被破坏,但蛋白质的基本组成单位氨基酸等依然存在。在微生物培养中,变性后的蛋白质可以被微生物分泌的蛋白酶进一步分解为氨基酸等小分子物质,为微生物的生长提供氮源和碳源等营养物质,满足微生物生长繁殖的需求。所以,即使经过灭菌处理,牛肉膏蛋白胨培养基中的蛋白质仍然能够发挥重要的营养作用。 问题2:牛肉膏蛋白胨培养基灭菌后蛋白质还有作用吗? 例.(2022湖北.T4)灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是( ) A. 动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行 B. 微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染 C. 为防止蛋白质变性,不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌 D. 可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌 D A、动、植物细胞DNA的提取不需要在无菌条件下进行,A错误; A..动物细胞培养需添加抗生素以防止污染,保证无菌环境,微生物培养不能加抗生素 C、一般用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌,以防止杂菌污染,C错误; D、可用湿热灭菌法对微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌,以防止杂菌污染,D正确。 二.PCR扩增 4.温度控制: 1)变性的温度由GC含量决定。GC含量越高,DNA结构越稳定,则变性温度越高; 2)复性温度由引物的长度和GC含量决定。引物越长、GC含量越高,越容易结合到模板DNA上,复性温度越高;如果复性温度偏低,会导致非特异性结合增加 3)延伸的温度是Taq酶的最适温度,由Taq酶的种类决定,常见的Taq酶最适温度是72 延伸时间与产物的特异性及产量有关 ①变性(90 以上):高温使DNA氢键断裂从而变性 ②复性(50 左右):引物5′端与DNA模板链的3′端结合,形成局部双链 ③延伸(72 左右):Taq酶从引物起始合成互补链,使子链由5′ 3′端延伸 1.过程: 2.条件: DNA模板,四种脱氧核苷酸dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP),耐高温的DNA聚合酶(Taq酶),引物(2种),稳定的缓冲溶液(一般添加Mg2+) 3.PCR反应中的引物: ①引物需位于目的基因的两侧,且能顺利扩增出目的基因,决定扩增片段的起点和终点; ②引物的3′端为TaqDNA聚合酶提供结合位点,是基因转录的起点; ③为便于扩增的DNA片段与表达载体的连接,可以在引物的5′端添加限制酶的识别序列。 两种引物上设计不同的酶切位点,以确保目的基因与载体的正向连接。 4.PCR时间: 变性(30s)和复性时间(30s)往往固定,延伸时间由子代DNA长度决定,DNA越长,则延伸的时间越长。 5.启动子:位于基因的上游,是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA。按表达模式分类如下: ⑴组成型启动子:持续活跃、不受环境或细胞状态影响,基因持续表达,用于需要稳定表达的基因(如标记基因)。 ⑵诱导型启动子:需要特定诱导剂(化学物质、光、温度等)激活,实现基因表达的精准调控,可控表达有毒蛋白或动态调控代谢通路。 ⑶组织/时空特异性启动子:仅在特定组织或发育阶段激活,应用于基因治疗、农业育种(如仅在根或种子中表达)。 1.图1表示某种DNA分子上的多种限制酶切割位点,图2表示 EcoR 、BamH 、Sau3A 三种限制酶识别序列和切割位点,下列相关叙述错误的是( ) A.获取该目的基因可采用 EcoR 和 BamH 进行酶切 B.限制酶使特定碱基序列的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开 C.Sau3A 和 BamH 酶切该 DNA 分子,产生不同黏性末端 D.能被 Sau3A 切割的序列不一定能被 BamH 切 C 2.下图是某质粒示意图,其中ori为质粒复制所必需的核苷酸序列,amp为氨苄青霉素抗性基因,tet为四环素抗性基因,箭头表示目的基因插入位点。受体大肠杆菌细胞内原来不含有这两种抗生素抗性基因。下列有关叙述正确的是( ) A.amp 和 tet 是一对等位基因,常作为基因工程的标记基因 B.ori 是重组质粒得以顺利导入受体细胞所必需的 C.将重组质粒 2、4 导入不同大肠杆菌,大肠杆菌都不能在含四环素的培养基上分裂生长 D.将重组质粒 1、3 导入不同大肠杆菌,大肠杆菌都不能在含氨苄青霉素的培养基上分裂、生长 D 无菌 技术 消毒 灭菌 生物技术与工程 植物细胞工程 动物细胞工程 胚胎工程 细胞工程 发酵工程 应用 动物细胞培养 动物细胞融合 单克隆抗体制备 核移植 植物组织培养 植物体细胞杂交 受精 胚胎早期发育: 胚胎移植 胚胎分割 培养 转基因产品的安全性 关注生殖性克隆人 生物武器包括致病菌 、病毒、生化毒剂 限制酶、DNA连接酶、载体 改造现有蛋白质或 创造新的蛋白质 生物技术的安全性 与伦理问题 操作对象: 结果: 基因 目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 工具: 原理: 操作 程序 基因重组 基因工程 蛋白质工程 8 发酵工程—传统发酵技术 项目 毛霉 乳酸菌 酵母菌 醋酸菌 生物分类 真核生物 原核生物 真核生物 原核生物 代谢类型 异养需氧型 异养厌氧型 异养兼性厌氧型 异养需氧型 发酵条件 需氧 无氧 前期需氧,后期不需氧 一直需氧 原理 发酵温度 15~18 18~20 28 左右 30~35 生产应用 制作腐乳 酸奶、泡菜 酿酒、发面 酿醋 蛋白质 多肽+氨基酸 蛋白酶 肽酶 脂肪 甘油+脂肪酸 脂肪酶 ① 有氧条件下,酵母菌有氧呼吸快速繁殖 ② 无氧条件下,酵母菌无氧呼吸产生酒精 ① 氧气、糖源充足时,醋酸菌将葡萄糖分解成醋酸;② 缺少糖源、氧气充足时,醋酸菌将乙醇变为乙醛,乙醛变为醋酸 C6H12O6+6O2+6H2O 6CO2+12H2O+能量 酶 C6H12O6 2C2H5OH+2CO2+能量 酶 酵母菌代谢过程:① 有氧条件下: ② 无氧条件下: 酵母菌代谢过程:① 氧气、糖源充足时: ② 缺少糖源、氧气充足时: C6H12O6+2O2 2CH3COOH+2CO2+2H2O+能量 酶 酶 C2H5OH+O2 CH3COOH(醋酸)+H2O+能量 无氧呼吸 产生乳酸 无菌技术 获得纯净微生物培养物的关键是防止杂菌污染。包括消毒和灭菌。 条件 结果 常用方法 具体操作 应用范围 消毒 较为温和的物理、化学或生物等方法 仅杀死物体表面或内部一部分微生物(不包括芽孢和孢子) 煮沸消毒法 100 煮沸5-6min 日常用品 巴氏消毒法 62-65 消毒30min或80-90 处理30s-1min 不耐高温的液体 (牛奶等) 化学药物消毒法 用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源 紫外线消毒法 照射前配合喷洒石炭酸或煤酚皂等消毒液可加强消毒效果 接种室、接种箱、超净工作台 灭菌 强烈的理化方法 杀死物体内外所有的微生物,包括芽孢和孢子 灼烧灭菌法 酒精灯外焰充分燃烧 接种工具 干热灭菌法 160-170 热空气中2-3h 玻璃器皿、金属用具 湿热灭菌 (高压蒸汽灭菌法) 100kpa,121 ,15-30min 培养基及容器的灭菌 微生物的基本培养技术 微生物的基本培养技术 微生物的纯培养 微生物纯培养包括:配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。 酵母菌的纯培养: 制备培养基 (配制培养基、灭菌、倒平板) 接种和分离酵母菌 培养酵母菌 (将接种后的平板和一个未接种 的平板倒置、培养) 设置培养基空白实验目的:对照,检测培养基是否被杂菌污染。 注意点: ①培养基冷却至50 左右在酒精灯附近倒平板,边倒边轻微晃动。 ②平板冷凝后,要将平板倒置,原因是:可以防止皿盖上的水珠落入培养基,造成污染;避免培养基水分过快挥发。 ③平板划线法在作第二次以及其后的划线操作时,总是从上一次划线的末端开始划线,原因是:第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始,能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少,最终得到由单个微生物繁殖形成的纯培养物。 ④在接种酵母菌的培养基上,观察到了不同形态的菌落,说明菌种不纯或无菌操作不规范,有杂菌污染。 ⑤灼烧接种环,待其冷却后才能伸入菌液,以免温度太高杀死菌种。 接种方法: 平板划线法(不能计数) 和稀释涂布平板法; 比较项目 平板划线法 稀释涂布平板法 原理 通过接种环在固体培养基表面连续划线,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。数次划线后培养,可分离得到单菌落。 将不同稀释度的菌液均匀涂布到固体培养基中进行培养,计数菌落数。当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个单菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。 注意事项 每次划线前后均需灼烧接种环 稀释度要足够高 优点 可根据菌落特点分离获得某种微生物的单细胞菌落 既可获得单细胞菌落,又能对微生物计数 缺点 不能对微生物计数 操作复杂,需要涂布多个平板 一.常用微生物分离方法比较 1.显微镜直接计数法:不能区分死菌与活菌(调查数值偏大); 公式:1mL培养液中细胞数:=小方格中细胞数量的平均值 400 104 稀释倍数 2.稀释涂布平板法(间接计数法):当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是1个菌落,因此统计结果往往比活菌的实际数目少 (1)计数依据:① 一般选菌落数为30~300且差异不大的平板计数。 ② 同一稀释度下,应至少对3个平板重复计数,求平均值。 (2)公式:每毫升原液含菌株数=平均菌落数/所用涂布液体积 稀释倍数 二.微生物的数量测定 发酵工程基本环节 选育菌种: 从自然界筛选或诱变育种或基因工程 扩大培养: 接种: 发酵罐内发酵: 分离提纯产物 获得产品 配制 培养基 灭菌 用液体培养基,目的是增加菌体数量 代谢产物:根据产物的性质提取、分离和纯化 菌体本身:过滤、沉淀 单细胞蛋白是以淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液等为原料,通过发酵获得的大量的微生物菌体。 对培养基和发酵设备灭菌, 目的是防止杂菌污染 无菌条件 是发酵工程的中心环节。 要严格控制 发酵条件:温度、pH、溶解氧、通气量与转速等 及时添加 必需的营养物质,随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度 以尿素为唯一氮源的培养基可分离尿素分解菌:它合成的脲酶能催化尿素分解产生NH3,NH3可作为细菌生长的氮源。①培养基中以尿素为唯一氮源,分离的微生物不一定是尿素分解菌,可能是硝化细菌,需加入酚红指示剂鉴别,如指示剂变红,则该菌可分解尿素。 ②培养基中无氮源,可分离固氮微生物。 例.产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株,科研人员开展了相关研究。请回答下列问题: (1)常规微生物实验中,下列物品及其灭菌方法错误的是_(填编号)。 编号 ① ② ③ ④ 物品 培养基 接种环 培养皿 涂布器 灭菌方法 高压蒸汽 火焰灼烧 干热 臭氧 ④ (2)称取1.0 g某土壤样品,转入99 mL无菌水中,制备成菌悬液,经_后,获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0.1 mL菌悬液涂布在固体培养基上,其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落,则该样本中每克土壤约含酵母菌_个 梯度稀释 4.6 105 (3)为了进一步提高酵母菌产酶能力,对分离所得的菌株,采用射线辐照进行_育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以_为唯一碳源的固体培养基上,培养一段时间后,按照菌落直径大小进行初筛,选择直径_的菌落,纯化后获得A、B两突变菌株。 诱变 脂肪 较大 植物组织培养 植物体细胞杂交: 植物细胞工程 原理: 关键激素: 原理: 意义: 遗传物质变化: 高尔基体 植物细胞的全能性,细胞内含有本物种全套遗传信息。 生长素与细胞分裂素影响细胞发育的方向。(脱分化和再分化时的比例不同) 诱导愈伤组织期间不需要光照 细胞膜的流动性,植物细胞的全能性; 打破生殖隔离,实现远缘杂交育种,培育植物新品种。 杂交后的新植株应为异源四倍体,体细胞中染色体数为(2x+2y)条,4个染色体组,发生了染色体数目变异。 取材、消毒 ①用流水充分冲洗外植体(幼嫩的茎段);酒精擦拭双手和超净工作台;②外植体的消毒:用体积分数70%酒精消毒30 s,然后立即用无菌水清洗2~3次;再用次氯酸钠溶液处理30 min后,立即用无菌水清洗2~3次;③用解剖刀将外植体切成0.5~1 cm长的小段 接种 将外植体的1/3~1/2插入诱导愈伤组织的培养基(勿倒插),诱导脱分化,长出愈伤组织(不需光照) 转接 ①将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上;②长出芽后再转接到诱导生根的培养基上,进一步诱导形成试管苗(需光照,诱导叶绿素的形成) 移栽 将试管苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中,待其长壮后再移栽入土 愈伤组织:在一定的激素和营养等条件的诱导下,已经分化的细胞可以经过脱分化,即失去其特有的结构和功能,转变成未分化的细胞,进而形成不定形的薄壁组织团块。 关键激素:植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键 操作步骤: 菊花的组织培养(实验) 试管苗、次生代谢产物的培养: 1、微型繁殖优点:高效、快速实现种苗的大量繁殖,保证优良品种的遗传特性。 2、作物脱毒取材:植物顶端(茎尖)分生区,原因:病毒极少或无病毒。不代表有抗毒性。 3、单倍体育种 过程:花药离体培养获得单倍体幼苗,经秋水仙素人工诱导染色体加倍,获得正常植株。 优点:极大缩短了育种年限。 4、诱变育种:可选愈伤组织进行人工诱变 原因:愈伤组织细胞不断分裂,DNA复制时易发生基因突变。 5、人工种子 以植物组织培养得到的胚状体,不定芽、顶芽和腋芽等做为材料,包上人造种皮。 6、细胞产物的工厂化生产 次生代谢产物的生产,通常在愈伤组织阶段培养。 植物细胞工程的利用: 动物细胞培养 2.动物细胞培养条件: ①营养成分:除糖类、氨基酸、无机盐和维生素等营养物质外,通常还需加动物血清 ②无菌、无毒的环境:需定期更换培养液以便清除代谢物,防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。 ③适宜的温度、pH和渗透压 ④气体环境:95%空气+ 5% CO2(维持培养液的pH)。 动物细胞工程 1.原理:细胞增殖 3.原代培养和传代培养区分:是否分瓶培养 离心收集 4.细胞分裂受阻原因:①细胞密度过大,有害代谢物积累过多,培养液中营养物质不足。 ②贴壁生长的细胞接触抑制。 胚胎干细胞(ES细胞):存在于早期胚胎(桑椹胚和囊胚期的内细胞团),具有全能性。 成体干细胞:存在于成体组织或器官内(造血干细胞等),具有组织特异性,无全能性。 诱导多能干细胞(iPS):由体细胞经体外诱导分化形成,类似于胚胎干细胞。 例:由病人自身体细胞诱导分化的ips细胞在器官移植时不会发生免疫排斥反应 干细胞种类 5.通常选取成纤维细胞或干细胞原因:分裂能力强,易于培养。 原代培养的细胞为10代以内的细胞,保持了正常的二倍体核型。 动物细胞融合技术与单克隆抗体制备 克隆化培养和 (1)原理: (2)方法: (3)结果: (4)意义: 步骤 技术方法 原理 取材 从已免疫的小鼠脾脏中获取B淋巴细胞,体外培养骨髓瘤细胞 动物细胞 培养 细胞增殖 融合 通过灭活病毒诱导B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合 动物细胞 融合 细胞膜的流动性 选择 第一次要从融合形成的杂交细胞中筛选出杂交瘤细胞 选择培养基 — 选择 第二次要从杂交瘤细胞中获得能产生所需抗体的杂交瘤细胞 克隆化培养、抗体检测 抗原—抗体特异性结合 培养 在小鼠腹腔体内培养,或在装有细胞培养液的培养基中进行体外培养 动物细胞培养 细胞增殖 杂交瘤细胞特点:既能无限增殖,又能产生专一抗体 2.单克隆抗体制备 1.动物细胞融合 细胞膜具有一定的流动性; PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等; 形成杂交细胞; 突破了有性杂交方法的局限,使远缘杂交成为可能;为制造单克隆抗体开辟了新途径。 动物体细胞核移植: 受精过程: 获能 M 期 卵细胞膜 雌雄原核形成 判断卵子是否受精的标志: 观察到两个极体或者雌、雄原核 需要电刺激等方法激活重构胚 动物体细胞核移植技术和动物克隆 1.原理: 胚胎工程 包括:体外受精、胚胎移植、胚胎分割 体细胞核移植难于卵细胞核移植原因: (1)过程: (2)意义: 体外受精 动物体细胞核具有全能性。 体细胞分化程度大,恢复全能性较难。 卵母细胞的采集(培养至M 期),精子的获取(要在体外获能处理) ,受精 体外受精技术是提高动物繁殖能力的有效措施,还可以为胚胎移植提供可用的胚胎。 胚胎早期发育过程: 胚胎移植: 2.桑葚胚:细胞没有分化,有全能性; 3.囊胚期:开始细胞分化,但囊胚的内细胞团仍具有全能性。 胚胎分割:(无性生殖) 4.设计试管婴儿比试管婴儿多出的是基因检测。 1.卵裂期:受精卵有丝分裂,胚胎内有机物不断减少,DNA增加,细胞数目增多,细胞体积减小。 观点 克隆人 理由 多数人 反对 ①克隆人“有违人类尊严”,其家庭地位难以认定。强制一个人共享另一个人的DNA,将使人类尊严丧失 ②克隆人冲击了现有的婚姻、家庭和两性关系的伦理道德观念; ③克隆人是制造在心理和社会地位上都不健全的人,严重违反人类伦理道德; (4)克隆技术尚不成熟,可能克隆出有严重生理缺陷的孩子 少数人 支持 ①技术问题可以通过胚胎分割,基因诊断和染色体检查等方法得到解决; ②克隆人是一项科学研究,既然是科学,就应该允许研究克隆人 ③人的观念是可以改变的。 中国政府 不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人,但不反对治疗性克隆 试管婴儿 设计试管婴儿 设计完美婴儿 技术手段 无需进行 基因检测 胚胎移植前需进行基因检测。 进行基因编辑(基因敲除或插入),有目的地改造特定基因,胚胎移植前需进行遗传诊断。 应用 解决不孕不育问题 治疗白血病、贫血等疾病 用于设计完美婴儿。 相同 都是体外受精,早期胚胎在体外发育,然后胚胎移植,都属于有性生殖。 22 ①所有生物共用一套遗传密码; ②基因是控制生物性状的结构与功能单位; ③遗传信息的传递都遵循中心法则; 2.一种生物的基因在另一种生物细胞内表达的基础: 1.不同生物基因拼接的基础: 基因工程理论基础: ①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸; ②都遵循碱基互补配对原则; ③DNA的空间结构都是规则的双螺旋结构 一).限制酶:主要来源于原核生物,断开两个核苷酸之间的磷酸二酯键,产生平末端和黏性末端,具有专一性(识别双链DNA 特定核苷酸序列,只能在特定位点切割DNA) 1)获取目的基因和切割载体时, 常用同种限制酶,目的是_ 2)该方法缺点: 3)双酶切: 4)原则: 基因工程的3种基本工具: 产生相同的黏性末端,便于连接 目的基因自身环化,质粒重新环化,质粒与目的基因反向连接 确保目的基因与质粒的定向连接 ①不破坏目的基因原则;②保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则;③在启动子和终止子之间,确保出现相同黏性末端原则。 5).限制酶存在于原核生物中的主要作用: 6).限制酶不切割细菌本身DNA,原因: 切割外源DNA、使之失效,以保证自身安全 原核生物中不存在该限制酶的识别序列或识别序 图解限制酶的选择原则 (1)不破坏目的基因原则:如图甲中可选择Pst ,而不选择Sma 。 (2)保留标记基因原则:质粒作为载体必须具备标记基因,所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如图乙中不选择Sma 。 (3)确保出现相同黏性末端原则:通常选择与切割目的基因相同的限制酶,如图甲中Pst ;为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择Pst 和EcoR 两种限制酶。 1. E.coli DNA连接酶:来源于大肠杆菌,只能连接黏性末端 2. T4 DNA连接酶:来源于T4噬菌体,既可连接黏性末端,又连接平末端,但连接平末端效率较低。 (二). DNA连接酶 ——“分子缝合针” 三).载体——分子运输车 1.作用:①作运载工具,将目的基因导入受体细胞中 ②在受体细胞内对目的基因进行大量复制 2.条件: ①能在宿主细胞内稳定保存并自我复制。 ②有一至多个限制酶切点,以便目的基因插入到载体中 ③有标记基因,以便重组DNA的鉴定和筛选 ④载体DNA必需是安全的,对受体细胞无害,或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。 3.种类: ①质粒:真核细胞或原核细胞细胞质中的小型环状双链DNA分子 ②噬菌体、动植物病毒等。 4.真正被用作载体的质粒,都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 特点:不具有特异性 基因工程操作步骤 (一)目的基因的筛选与获取 1.从基因文库中获取目的基因; 2.人工合成法:目的基因碱基序列已知 3.利用PCR获取和扩增目的基因(DNA体外复制) (1)条件:DNA模板,四种脱氧核苷酸dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP),耐高温的DNA聚合酶(Taq酶),引物(2种),稳定的缓冲溶液(一般添加Mg2+) (2)过程: 变性:90 以上,DNA双链解开 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 复性:50 以上,引物与DNA结合 3’ 5’ 延伸:72 左右,DNA从5’ 端到3’端延伸 3’ 5’ 5’ 5’ 1个模板DNA分子经过n轮PCR,可以扩增出 个DNA片段,共需要引物数量为 _。 2n 2n+1-2 1.DNA扩增:PCR利用DNA热变性原理,通过调节温度控制DNA双链的解聚与结合 2.琼脂糖凝胶电泳 ①带电粒子:DNA分子有可解离的基团,一定pH下,这些基团可带正电荷或负电荷。 ②迁移动力与方向:在电场作用下,带电分子向与它所带电荷相反的电极移动; ③迁移速率:凝胶中DNA的迁移速率与凝胶的浓度、DNA的大小和构象有关。 ④检测:凝胶中的DNA通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 ①为避免外源DNA等因素污染,微量离心管、枪头和蒸馏水等使用前必须高压灭菌处理。 ②缓冲液和酶应在-20 储存。使用前,将所需试剂从冰箱拿出,放在冰块上缓慢融化。 ③PCR扩增不能随意加大试剂用量。 ④每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换。 二.注意事项 1.未出现扩增条带的主要原因:①TaqDNA聚合酶失活; ②Mg2+浓度过低; ③引物出现质量问题; ④变性时的温度低,变性时间短。2.出现非特异性扩增条带的主要原因: ①模板DNA出现污染; ②Mg2+浓度过高; ③引物特异性不强或形成引物二聚体; ④复性时的温度过低等。 三. 结果分析: 最终电泳条带的宽度、亮度与 PCR 起始状态的模板DNA含量呈正相关 琼脂糖凝胶电泳:分离、鉴定DNA ①复性的温度过高会破坏引物与模板这间的碱基配对。引物与模板复性所需的温度取决于引物的长度、碱基组成及其浓度。引物长度越长,引物中G+C的含量越高,复性所需温度越高,扩增特异性强。 引物的作用 1、引物是: 2、引物的作用: 3.注意事项 一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 使Taq酶能够从其3’端开始连接脱氧核苷酸 ②引物自身 不应存在互补配对 序列;两条引物之间 不应存在互补配对 序列。 1.(2021湖北卷T16)某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生,以下措施中有效的是( )A. 增加模板DNA的量 B. 延长热变性的时间C. 延长延伸的时间 D. 提高复性的温度 D 2.(2023湖北卷T4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( ) A.若用Hind 酶切,目的基因转录的产物可能不同 B.若用Pvu 酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因 C.若用Sph 酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用Sph 酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 D (2023湖北卷T22)(16分)某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体,以期快速检测该病毒,其主要技术路线如图所示。 (1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前,已免疫的脾细胞(含浆细胞)_(填“需要”或“不需要”)通过原代培养扩大细胞数量;添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合,该过程中PEG对细胞膜的作用是_ (2)在杂交瘤细胞筛选过程中,常使用特定的选择培养基(如HAT培养基),该培养基对_和_生长具有抑制作用。 (3)单克隆抗体筛选中,将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交,其目的是_ (4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是_ 不需要 使细胞接触处的磷脂分子重新排布,细胞膜打开,细胞发生融合 未融合的亲本细胞 融合的具有同种核的细胞 通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞 ④ 启动子:在基因编码区上游,是RNA聚合酶识别和结合的部位;驱动基因转录出mRNA 目的基因:应插入启动子和终止子之间 终止子:在基因编码区下游,是转录终止的信号 标记基因:用来鉴别或筛选含有重组DNA分子的细胞 复制原点:DNA聚合酶结合位点,是DNA复制的起始点 3.诱导型启动子:诱导物作用于诱导型启动子,激活或抑制目的基因表达 1.基因表达载体的作用 -基因工程的核心 ①使目的基因在受体细胞中稳定存在,且可以遗传给下一代; ②使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。 2.基因表达载体的组成 (二).基因表达载体的构建 (三).将目的基因导入受体细胞 生物 植物 动物 微生物 方法 农杆菌转化法、_ 显微注射法 处理法 受体 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 转化 过程 将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中 农杆菌 导入植物细胞 整合到受体细胞的染色体DNA上 表达 将含目的基因的表达载体提纯 显微注射法导入 受精卵 获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞 细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(感受态细胞) 基因表达载体导入 花粉管通道法 Ca2+ (四).目的基因的检测与鉴定 检测水平 检测目的 检测方法 分子水平 目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上 PCR、分子杂交技术 目的基因是否转录出了mRNA 目的基因是否翻译出蛋白质 抗原—抗体杂交 个体水平 转基因生物是否表现出相应的特性及表现程度 抗虫、抗病的接种实验 乳腺生物反应器: 将药用蛋白基因与乳腺中特异性表达的基因的启动子等调控元件重组,通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中。该转基因动物进入泌乳期后,可通过分泌乳汁来生产所需要的药物。 蛋白质工程: 基因工程和蛋白质工程应用 基因修饰或合成 DNA粗提取与鉴定 DNA片段的扩增及电泳鉴定 是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的有效方法,小分子由于扩散进入凝胶颗粒内部,迁移路径长,后流出色谱柱;大分子蛋白质不容易进入凝胶内部,路程短,移动的速度快,先流出色谱柱,实现分离。 ①凝胶浓度越小,筛孔越大,DNA分子迁移速率就越高; ②当凝胶浓度相同时,较大的分子因体积大,穿过凝胶孔隙时会遇到的阻力大,迁移速率低。DNA的迁移速度与其相对分子量成反比。电泳一段时间后,较大的DNA迁移距离小,离加样孔近。相同大小的DNA分子则会聚集在凝胶同一特定的位置上。 ③由于DNA本身没有颜色,需将DNA染色后在波长为300 nm 的紫外灯下被检测出来。 琼脂糖凝胶电泳:分离、鉴定DNA 1.琼脂糖凝胶是一种带孔的筛网状多聚物,由多糖组成。 DNA 的迁移速率与凝胶的浓度、 DNA 的大小和构象等有关。 凝胶色谱法: $