专题九 课题研习(三) 基因工程的操作工具和技术方法-【新高考方案】2026年高考生物二轮复习专题增分方略配套课件（Ⅱ）

课题研习(三)　基因工程的操作工具和技术方法 1.归纳基因工程的基本工具　 　 2.理清基因工程的主要操作步骤　 3.理清基因表达载体的构建过程 4.明确PCR技术的原理与条件　 5.理清PCR技术的过程 万丈高楼平地起,基础还得靠自己/以下必备基础知识,课下自主记准记牢 目录 任务(一) 限制酶的选取与基因表达载体的构建 课时训练 任务(二) PCR技术及其应用 任务(三) 基因编辑技术及其应用 任务(一)　限制酶的选取与基因表达载体 的构建 √ 1.(2025·江苏高考)[多选]图示人体正常基因A突变为致病基因a及Hind Ⅲ切割位点。Alu Ⅰ限制酶识别序列及切割位点为 ，下列相关叙述正确的有(　　) A.基因A突变为a是一种碱基增添的突变 B.用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同 C.用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致 D.产前诊断时，该致病基因可选用Hind Ⅲ限制酶开展酶切鉴定 √ 解析：由图可知，基因A突变为基因a，是由于T—A被替换成了G—C，属于碱基的替换，A错误；Hind Ⅲ切割后形成的是黏性末端，Alu Ⅰ切割后形成的是平末端，B正确；突变后的基因a中间片段不存在Hind Ⅲ的切割位点，存在Alu Ⅰ的切割位点，基因a分别用Hind Ⅲ和Alu Ⅰ酶切后产生的片段大小不一致，C错误；正常的基因A用Hind Ⅲ酶切后产生4个片段，突变后的基因a用Hind Ⅲ酶切后产生3个片段，D正确。 √ 2.科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果细胞中，成功培育出抗冻千禧果。如图为培育过程中使用的Ti质粒示意图，其中Vir区的基因活化能促进T⁃DNA的加工和转移，下列叙述正确的是 (　　) A.构建基因表达载体时，最好选择限制酶Ⅱ和Ⅲ来切割质粒 B.利用PCR扩增抗冻基因，需提前检测抗冻基因的全部碱基序列 C.Vir区的基因活化促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上 D.利用含卡那霉素的培养基可筛选出成功导入抗冻基因的千禧果细胞 解析：使用限制酶Ⅱ会破坏Vir区的基因，Vir区的基因活化能促进T⁃DNA的加工和转移，不能选限制酶Ⅱ切割质粒，A错误；使用PCR技术扩增抗冻基因，只需要知道抗冻基因两端碱基序列设计引物即可，B错误；农杆菌侵染植物细胞后，Ti质粒上的T⁃DNA能转移到被侵染的细胞并整合到该细胞的染色体DNA上，所以Vir区基因活化可促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上，C正确；为筛选成功导入抗冻基因的千禧果细胞，应在培养基中添加四环素，D错误。 3.(2025·山东高考)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T⁃DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为__________。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaⅠ和__________对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是____________。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶______________进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为____________bp，则一定为正向重组质粒。  复制原点　 XbaⅠ　 DNA聚合酶 　SpeⅠ和SmaⅠ　 550 解析：Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。切割质粒时，选择限制酶BamH Ⅰ会破坏终止子，选择限制酶Pst Ⅰ、Xba Ⅰ均会产生黏性末端，由于需将产生的黏性末端用DNA聚合酶补平，且DNA聚合酶能在DNA的3'端连接脱氧核苷酸，结合限制酶的酶切位点分析可知，选择限制酶Pst Ⅰ会导致形成的黏性末端无法补平，只能选择Sma Ⅰ和Xba Ⅰ对Ti质粒进行完全酶切。如果目的基因正向插入，靠近启动子一侧原先被Xba Ⅰ切割后连接起来的部位不能被Sma Ⅰ切开，靠近终止子一侧原先被Sma Ⅰ切割后连接起来的部位仍然能被Sma Ⅰ切开。选用限制酶Spe Ⅰ和Sma Ⅰ进行完全酶切并电泳检测，较短的条带长度近似为550 bp。 (2)为证明这两个突变体是由T⁃DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T⁃DNA的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为________ (填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶，且T⁃DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段_________，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为________________(填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。  4　 环化　 测序和序列比对 解析：识别序列为4个碱基对的限制酶，在DNA分子中切割位点较多，切割后可以获得更小的DNA片段，便于后续PCR扩增。根据图乙可知，将该片段环化，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。电泳只能判断DNA片段大小，不能确定DNA的碱基序列，不能判断两个同样大小的DNA片段是否为同一基因。要判断2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为测序和序列比对。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，_________ (填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。  解析：转基因生物中检测到野生型基因，但由于野生型基因不一定能够表达，或者表达的产物不一定有生物活性，所以不能确定该植株的表型为野生型。 不能 [思维建模] 　掌握限制酶的选择技巧 1.根据限制酶切割位点的位置确定限制酶的种类 (1)应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 (2)不能选择切割位点位于目的基因和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选择SmaⅠ。 (3)为避免目的基因和质粒的自身环化及随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。 2.根据质粒的特点确定限制酶的种类 3.根据Ti质粒的T⁃DNA片段选择限制酶 图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下： 任务(二)　PCR技术及其应用 1.(2025·黑吉辽蒙高考)香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (1)可从____________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入_________和_________限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用_________________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5 kb(kb为千碱基对)，假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。  序列数据库　 Xho Ⅰ　 Xba Ⅰ　 DNA连接酶 解析：可以从序列数据库中查询某基因的编码序列。为保证目的基因插入质粒的启动子与终止子之间，应用Spe Ⅰ和Xho Ⅰ对质粒进行切割，但由于基因N中存在Spe Ⅰ的切割位点，故在设计引物时不能引入Spe Ⅰ的识别序列，由图1可知，Xba Ⅰ、Spe Ⅰ切割产生的黏性末端相同，故可在引物中引入Xba Ⅰ的识别序列来替代。已知a链为转录模板链，引物与DNA链的3'端结合，故a链的转录方向为从右向左，因此，引物2的5'端应引入Xba Ⅰ的识别序列，引物1的5'端应引入Xho Ⅰ的识别序列。连接DNA片段需要DNA连接酶。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1~4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有__________的污染。初步判断实验组_____ (从“1~4”中选填)的质粒中成功插入了基因N，理由是_____________________________ __________________________________________________________。  外源DNA 1 实验中的重组质粒大小约为9.5 kb，而质粒pYL的大小为7.2 kb，因此目的基因的大小为2.3 kb左右 解析：使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有外源DNA的污染。因为实验中的重组质粒大小约为9.5 kb，而质粒pYL大小为7.2 kb，因此目的基因的大小约为2.3 kb，图2中实验组1的电泳条带数据符合目的基因的大小。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列)，b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有____________。  a：5'⁃…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…⁃3' b：5'⁃…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…⁃3' c：5'⁃…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…⁃3' d：5'⁃…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…⁃3' GCC 解析：结合题中信息，仔细比较b、c、d与a序列，只有c配对的模板与a相同，其中a中的GCA是诱变序列，c中的GCC是诱变序列，即GCC也是丙氨酸的密码子。 (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的_________含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。  解析：转基因成功的酵母菌能表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇，因此进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 香树脂醇 2.(2025·陕晋宁青高考)马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。 限制酶 识别序列及切割位点 Bgl Ⅱ Nde Ⅰ Xho Ⅰ EcoR Ⅰ BamH Ⅰ Sal Ⅰ Xba Ⅰ 续表 (1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、________________、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的_____步骤中起作用。  解析：PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2+的缓冲液、耐高温的DNA聚合酶。PCR反应过程分为变性、复性和延伸三步，在延伸阶段，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 4种脱氧核苷酸　 延伸 (2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的___________ (填“5'端”或“3'端”)添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5'⁃_____________________⁃3'，切割载体时应选用的两种限制酶是________________________。PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。  5'端　 AGATCT　 BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ 解析：DNA复制时，子链的延伸方向为5'端→3'端，故通过PCR扩增S基因时，需在引物的5'端添加限制酶识别序列。结合载体上限制酶切割位点以及S基因上的切割位点分析，可用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ切割载体，又BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ为同尾酶(能切割产生相同的黏性末端)，因此需在S基因上游引物中添加Bgl Ⅱ的识别序列，即5'⁃AGATCT⁃3'。 (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T⁃DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到_____________________ _________，抗性基因————————可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经__________形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。  马铃薯细胞的染色体　 2　 DNA上 再分化 解析：农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染栽培马铃薯愈伤组织时，能将Ti质粒上的T⁃DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。分析载体结构可知，抗性基因2位于T⁃DNA内部，上下游含有启动子和终止子，该基因可以正常表达，而抗性基因1位于T⁃DNA外部，故抗性基因2可用于筛选成功转化的愈伤组织。愈伤组织能重新分化成芽、根等器官，该过程称为再分化。 [思维建模] 　PCR技术应用中的常考点及解题指导 1.PCR原理与操作步骤 (1)必需组分 模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸(或dNTP)、耐高温的DNA聚合酶(或Taq DNA聚合酶)、含Mg2+缓冲液。 (2)三步循环过程 ①变性(90 ℃以上)：双链DNA解旋为单链，无需解旋酶，高温即可实现。 ②复性(50 ℃左右)：引物与模板单链特异性结合。 ③延伸(72 ℃左右)：Taq DNA聚合酶沿引物3'端合成子链。 (3)循环次数与产物数量 ①DNA数=2n(n为循环次数)。 ②共消耗的引物数量=2n+1-2。 ③完整目的基因出现时机：第3轮循环开始生成两条链等长的目的基因片段(前两轮产物不等长)。如三轮循环后，8个DNA分子中含2个完整目的基因，其余为杂合链。 2.引物设计 (1)引物需结合模板链的3'端，子链延伸方向为5'→3'。 (2)限制酶识别序列添加：需在引物的5'端修饰(如添加酶切位点)，而非3'端。常要求根据限制酶的识别序列，写出需添加的5'端碱基序列(如上游引物添加特定酶切位点)。 (3)正反向插入鉴定或某基因鉴定：通过不同引物组合(如F1/R1、F2/R2)扩增并电泳，判断基因插入方向(正向/反向)或是否存在某基因。 3.电泳图谱分析 (1)通过条带位置判断片段大小，对比Marker(标准参照物)确定产物是否符合预期。 (2)异常条带原因：引物二聚体、非特异性结合、模板污染等。 任务(三)　基因编辑技术及其应用 突破点(一)　CRISPR⁃Cas9基因编辑技术及应用 　　[情境应用] 　　CRISPR⁃Cas9是一种源自细菌抵御噬菌体的“免疫系统”。CRISPR是细菌基因组中的一段特殊DNA序列，是存储病毒DNA信息的“基因档案库”；Cas9是一种能够切割DNA双链的内切核酸酶。由此原理发展而来的新技术被称为CRISPR/Cas9基因编辑系统，迅速成为生命科学热门的技术。CRISPR/Cas9基因编辑系统主要由向导RNA(sgRNA)和Cas9蛋白两部分组成，在基因编辑过程中，通过sgRNA将Cas9蛋白引导到目标DNA序列位置，然后Cas9对目标DNA进行切割，其机制如图所示。为研究AtTPST基因在拟南芥中的功能及其对植株发育的影响，科研人员利用CRISPR⁃Cas9基因编辑技术构建敲除载体，通过农杆菌转化法将敲除载体转入拟南芥中，获得靶基因敲除的株系。 　[融通知能] (1)利用CRISPR⁃Cas9技术敲除AtTPST基因的核心工作是____________ __________，该过程需要用到的工具酶有____________________。  (2)CRISPR⁃Cas9基因编辑技术中，科研人员是依据________________的部分序列来设计sgRNA。现已知某sgRNA的局部序列为5'⁃UCCAGAAUC⁃3'，则其识别序列为________________________。  基因表达　 限制酶和DNA连接酶 载体的构建 目标DNA　　 5'⁃GATTCTGGA⁃3' (3)敲除拟南芥AtTPST基因的目的是____________________________ __________________________________________________________。  (4)构建AtTPST基因的敲除载体时的目的基因是________________ ________。  (5)科研人员将Cas9基因和sgRNA基因插入到Ti质粒的____________区域，原因是_____________________________________________ _____________________________。  　 Ti质粒上的T⁃DNA能转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上 T⁃DNA Cas9基因和sgRNA 基因 获得不含AtTPST基因的植株，对照观察该基因在拟南芥中的功能及其对植株发育的影响 (6)CRISPR⁃Cas9基因编辑技术在定点编辑基因时存在一个大的弊端，有很大概率会造成一些非目的基因序列的错误剪接和编辑，请分析其原因可能是_____________________________________________ _________________。  sgRNA序列短导致特异性差，造成sgRNA错误结合而出现脱靶现象 (7)下图为CRISPR⁃Cas9基因编辑技术的应用示意图，下列说法错误的是________ (多选)。  ①sgRNA识别过程中存在A—T、T—A、G—C、C—G的配对 ②图中sgRNA1的碱基序列和sgRNA2的碱基序列通常相同或互补 ③sgRNA会因错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA序列越短，脱靶率越低 ④图中剪下一段DNA片段，可能导致染色体结构变异 ①②③ 1.基因编辑技术的机制 (1)诱导DNA双链断裂→激活修复通路：这一机制是现代基因编辑技术的通用基础，DNA双链断裂会自动激活细胞DNA自主修复功能。 输入你的标题 拓展认知 (2)基因编辑过程中细胞修复的两种类型 ①非同源末端连接：细胞直接连接断裂的DNA末端，无需模板参与。该过程易引入随机插入或缺失，导致基因移码突变或功能丧失，实现基因敲除。 ②同源定向修复 原理：需提供外源修复模板(供体DNA)，细胞以同源序列为参考进行精确修复，实现定点基因敲入或基因修饰。 2.导入受体细胞的基因编辑系统 (1)Cas9基因和sgRNA基因。如“情境素材”中的事例，优点是可持续表达，适合长期编辑或筛选稳定细胞系；缺点是构建周期长，存在基因组随机整合风险。 (2)sgRNA与Cas9蛋白形成复合物直接导入细胞。这种方法的优点是编辑速度快，避免载体整合风险；缺点是作用时间短，适用于瞬时编辑。 突破点(二)　重叠延伸PCR技术在基因编辑中的应用 [情境应用] 　　重叠延伸PCR技术是基因编辑流程中不可或缺的辅助技术，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可用于高效构建编辑所需的定制化DNA元件(如定点突变后的修复模板、构建多个sgRNA串联表达载体)，通过结合CRISPR⁃Cas9等递送系统，可实现精准、灵活的基因编辑。科研人员采用重叠延伸PCR技术，成功构建了突变的IKBA基因(以下称IKBAm)，使IKBA蛋白中第32、36位氨基酸由丝氨酸突变为丙氨酸，阻断了IKBA蛋白的磷酸化，IKBA蛋白磷酸化与哺乳动物组织中广泛存在的某种转录因子的功能有关。获得定点突变基因的原理如图。 [融通知能] (1)利用重叠延伸PCR技术诱变IKBA基因时，将预期的突变碱基设计在PCR的引物3和引物4中，分别进行PCR体系1和PCR体系2的扩增。PCR体系1中加入的引物是_____________。PCR体系1和PCR体系2必须分开进行的原因是___________________________________________ _________________________________________________________________________________________。 引物1和引物3 引物3和引物4存在碱基互补配对片段，置于同一反应体系会导致引物失效(或若将两个体系混合扩增，引物1和引物2同时存在，会扩增出IKBA基因) (2)将PCR体系1、2的产物(图中a、b和c、d)混合后，继续进行下一次PCR反应。在该PCR反应体系中经过高温变性后，当温度下降到55 ℃，能够互补配对的DNA链相互结合，理论上有______种结合的可能，其中能进行进一步延伸的是_____________组合的DNA片段。  4　 a和d (3)PCR体系1、2的产物能够互补配对的DNA链能进行进一步延伸成完整IKBAm_________ (填“需要”或“不需要”)引物，原因是_________ __________________________________________________________。  (4)IKBAm构建完成后，PCR扩增完整的IKBAm需要图中的引物是_______________。  不需要 在DNA聚合酶的作用下，配对的a链和d链分别以彼此为模板延伸成完整IKBAm 引物1和引物2 (5)质粒A上有限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ的识别序列，为将IKBAm与质粒A正确连接，在设计IKBAm的扩增引物时、需在引物_________的5'端分别添加相应的限制酶的识别序列。下表为重叠延伸PCR引物序列表，引物3的①位置上有关的碱基序列是________________。(填写出6个碱基)  1和2 TCGTCT (6)欲利用CRISPR⁃Cas9基因编辑系统构建基因甲和基因乙的2个sgRNA串联表达载体，可采用重叠延伸PCR技术将其连接起来(如图)，下列说法正确的是 (　　) A.基因甲至少经3个循环才能获得含引物P2的双链等长DNA B.不能为提高扩增效率把四种引物同时加入一个扩增体系 C.图中融合PCR第一步的两条链重叠部位可互相作为另一条链的引物 D.经融合PCR获得64个融合基因至少消耗63个引物P4 √ √ 1.重叠延伸PCR的核心机制 通过设计含互补重叠序列的引物，分阶段扩增DNA片段并实现无缝拼接。 2.注意问题 (1)需设计两对引物(左片段：引物1/ 引物3；右片段：引物2/ 引物4)。引物3与引物4部分序列互补。 输入你的标题 拓展认知 (2)分阶段扩增 ①第一阶段：独立扩增左右两个片段，即2个PCR反应体系。 ②第二阶段：片段混合延伸。重叠区互补配对→形成“分子桥”→延伸为完整链(无需额外引物)。 ③全长产物扩增：加入外侧引物1和引物2，扩增拼接后的全长DNA。 (3)重叠延伸PCR仅在试管中进行DNA片段工程化，不涉及细胞内基因组修改。 课时训练 1 3 4 5 6 7 2 一、选择题 1.(2025·青岛二模)DNA因构象不同在电泳时的迁移速率有所差异。超螺旋DNA以超螺旋形式存在，分子体积小；线性DNA分子伸展，在凝胶中移动时受到的摩擦力较大；开环DNA是由环状DNA双链中的一条链发生断裂形成，分子更松散。下列说法正确的是(　　) A.电泳时需要留一个加样孔加入标准参照物 B.电泳时电泳指示剂加在凝胶中，核酸染料与PCR产物混合加入加样孔 C.电泳后的凝胶可直接观察DNA条带 D.三种构象的DNA在不同浓度的凝胶中迁移速率一定不同 √ 1 3 4 5 6 7 2 解析：电泳时需要留一个加样孔加入标准参照物，A正确。配制琼脂糖凝胶时，待琼脂糖熔化稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀；电泳时，将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内，B错误。电泳后的凝胶置于波长为300 nm的紫外灯下，可观察到DNA条带，C错误。DNA的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子的大小和构象有关，三种构象的DNA在不同浓度的凝胶中迁移速率可能相同，D错误。 1 5 6 7 2 3 4 2.(2025·惠州一模)限制性内切核酸酶是基因工程中常用的一种酶。以下是6种不同限制酶的识别序列和切割位点，下列叙述错误的是 (　　) 注：箭头表示识别序列中切断部位。 1 5 6 7 2 3 4 √ A.KpnⅠ和Acc65Ⅰ切割位点不同，但形成的黏性末端是相同的 B.与EcoRⅠ相比，HhaⅠ识别序列较短，该序列在DNA中出现的概率高 C.BamHⅠ切割产生的黏性末端能够与MboⅠ切割成的黏性末端拼接 D.限制酶识别序列大多是沿中心轴回转180°相反重合 解析：由题图可知，KpnⅠ和Acc65Ⅰ切割位点不同，二者形成的黏性末端也不同，A错误；通常识别序列越短，其在DNA中出现的概率越高，B正确；BamHⅠ切割产生的黏性末端与MboⅠ切割成的黏性末端相同，故BamHⅠ切割产生的黏性末端能够与MboⅠ切割成的黏性末端拼接，C正确；大多数限制酶的识别序列具有中心对称性，沿中心轴回转180°相反重合，D正确。 1 5 6 7 3 4 2 3.(2025·河西区三模)根据某基因上游和下游的碱基序列，设计合成了用于该基因PCR的两段引物(单链DNA)。下图是两引物的Tm(引物熔解温度，即50%的引物与其互补序列形成双链DNA分子时的温度)测定结果，以下分析错误的是 (　　) √ A.PCR过程中，复性温度应高于引物的Tm值以提高PCR效率 B.两引物分别与DNA的两条互补单链结合，是子链延伸的起点 C.若两引物的脱氧核苷酸数相同，推测引物2的(G+C)含量较高 D.适当减少引物2的脱氧核苷酸数，可使其Tm值接近引物1 1 5 6 7 3 4 2 解析：PCR过程中，复性温度应低于引物的Tm值以提高PCR效率，A错误；两引物分别与DNA的两条互补单链结合，是子链延伸的起点，B正确；DNA含有的氢键数越多，其热稳定性越高，而A和T碱基对间有两个氢键，C和G碱基对间有三个氢键，曲线图中引物2的Tm高于引物1，说明引物2的热稳定性较高，因此若两引物的脱氧核苷酸数相同，推测引物2的(G+C)含量较高，C正确；适当减少引物2的脱氧核苷酸数，会降低引物2的热稳定性，可使其Tm值接近引物1，D正确。 1 5 6 7 3 4 2 4.(2025·济南二模)单亲二体(UPD)是指体细胞中某对同源染色体来自同一亲本，其他染色体组成正常的个体，其染色体组成是2n。微卫星DNA(STR)的核心序列为2~6个碱基，重复次数和分布个数因染色体而异，可以随染色体稳定地遗传给下一代。可使用STR检测技术对UPD进行诊断：先在各条染色体上找到STR区域，在STR区域的两侧设计PCR引物，每对引物中有一条是带荧光标记的，在同一体系中进行PCR得到带有不同荧光标记的扩增产物，经电泳后被检测到，然后进行比对、确认。下列说法错误的是 (　　) A.同一体系中进行PCR使用的引物的复性温度应大致相同 B.用含有核酸染料的载样缓冲液来鉴定扩增得到的PCR产物 C.UPD现象可能会导致隐性遗传病以显性方式传递 D.检测过程需要分析多个STR位点以确定是否为UPD √ 1 5 6 7 3 4 2 解析：PCR中复性指引物通过碱基互补配对与模板链结合，同一体系中进行PCR使用的引物的复性温度应大致相同，A正确；扩增得到的PCR产物通过电泳鉴定，核酸染料加在稍冷却的琼脂糖溶液中，制成琼脂糖凝胶平板，用于对扩增的DNA染色，含有指示剂的凝胶载样缓冲液与扩增得到的PCR产物混合，加到加样孔，电泳时指示剂的移动可以判断DNA分子的移动情况，B错误；UPD个体的某对同源染色体来自同一亲本，可能会导致UPD个体的某种隐性致病基因都来自同一个亲本，从而表现出病症，故UPD现象可能会导致隐性遗传病以显性方式传递，C正确；微卫星DNA(STR)的核心序列为2~6个碱基，碱基序列短，DNA存在重复，重复次数和分布个数因染色体而异，故检测过程需要分析多个STR位点以确定是否为UPD，D正确。 1 5 6 7 3 4 2 5.(2025·临沂三模)[多选]某研究小组构建了能表达ACTA1⁃GFP融合蛋白的重组质粒，该重组质粒的部分结构如下图。下列叙述错误的是 (　　) √ 注：F1和F2表示上游引物，R1和R2表示下游引物。 A.RNA聚合酶与启动子结合，调控ACTA1基因和GFP基因的表达 B.仅用F2和R1一对引物无法确定ACTA1基因插入方向是否正确 C.ACTA1基因转录的模板链是a链，引物F1与a链的部分序列相同 D.若用引物F2和R2进行PCR，能更好地区分ACTA1⁃GFP基因的纯合子和杂合子 √ 1 5 6 7 3 4 2 解析：据图可知，ACTA1基因和GFP基因位于启动子和终止子之间，故RNA聚合酶与启动子结合，调控ACTA1基因和GFP基因的表达，A正确；据图可知，引物F2与R1结合部位包含ACTA1基因的碱基序列，经PCR后若出现产物则为正向插入，若无产物出现则为反向插入，B错误；ACTA1基因转录的模板链是a链，引物F1与a链的部分序列互补，C错误；若用引物F2和R2进行PCR，可根据电泳条带数目更好地区分ACTA1⁃GFP基因的纯合子和杂合子，D正确。 1 5 6 7 3 4 2 6.(2025·长沙三模)[多选]图甲为培育转基因生物时选用的载体，图乙是含有目的基因的一段DNA序列，图中标注了相关限制酶的酶切位点。下列叙述正确的是 (　　) 1 5 6 7 3 4 2 A.若通过PCR技术提取该目的基因，应该选用引物a和引物c B.构建表达载体时应选用BclⅠ和HindⅢ这两种限制酶 C.图乙中一个DNA分子在PCR仪中经过四轮复制得到所需目的基因的分子数为8个 D.只利用含四环素的培养基就可以直接筛选出成功导入表达载体的受体细胞 √ √ √ 1 5 6 7 3 4 2 解析：PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，根据引物的延伸方向，提取目的基因所用的引物为图乙中引物a和引物c，A正确；根据图甲可知，BamHⅠ会导致两种抗性基因都被破坏，同时为防止目的基因自身环化，应选用BclⅠ和HindⅢ两种限制酶切割，B正确；图乙中一个DNA分子在PCR仪中经过四轮复制可得到16个DNA分子，其中所需目的基因的分子数为2n-2n=24-2×4=8(个)，C正确；由于选择BclⅠ和HindⅢ这两种限制酶，破坏了氨苄青霉素抗性基因，但没有破坏四环素抗性基因，因此应该先用含四环素的培养基筛选出含有重组质粒和普通质粒的受体细胞，再用含氨苄青霉素的培养基筛选含重组质粒的受体细胞，从而筛选出成功导入表达载体的受体细胞，D错误。 1 5 6 7 3 4 2 二、非选择题 7.(2025·西安模拟)研究人员构建了一种新型生物传感器ENWCBs，其核心原理是通过基因工程改造微生物，使其能够特异性识别环境中的目标化学物质苯酚，并通过生物荧光信号实现定量检测。在荧光素酶的催化作用下，荧光素与氧发生化学反应，形成氧化荧光素并且发出荧光。请回答下列问题： 1 5 6 7 3 4 2 (1)图1载体中Phenol⁃P启动子的具体作用是_____________________ _______________________________；  已知Luc基因转录得到的mRNA中缺乏起始密码子AUG，为了保证Luc基因能被限制酶识别并与载体正确连接且能正常表达，应该在引物a的5'端添加的碱基序列为5‘___________________3'。  在苯酚诱导下，被RNA聚合酶识别和结合并启动基因转录 ACTAGTATG 1 5 6 7 3 4 2 解析：启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，所以图1载体中Phenol⁃P启动子的具体作用是在苯酚诱导下，被RNA聚合酶识别和结合并启动基因转录；根据目的基因和载体上限制酶的识别序列可知，应选择SpeⅠ和MfeⅠ两种限制酶，结合图1中模板链的位置，可知引物a应添加SpeⅠ的识别序列SpeⅠ限制酶的识别序列为5'⁃ACTAGT⁃3'，为保证连接后能正常表达(起始密码子在mRNA上，模板链上与之互补)，应该在引物a的5'端添加的碱基序列为5'⁃ACTAGTATG⁃3'。 1 5 6 7 3 4 2 (2)将重组载体导入大肠杆菌，一般需要先用钙离子处理，目的是___________________________________________________。要筛选出导入重组质粒并且成功表达目的基因的目标菌，可以将转化后的大肠杆菌接种到含有_______________________的培养基上，并观察菌落是否有荧光出现。  使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 新霉素、苯酚、荧光素 1 5 6 7 3 4 2 解析：用钙离子处理大肠杆菌，可改变大肠杆菌细胞膜的通透性，使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。图中载体含有新霉素抗性基因(Neor)，重组质粒导入大肠杆菌后，要筛选出导入重组质粒并且成功表达目的基因(Luc基因表达产生荧光)的目标菌，可以将转化后的大肠杆菌接种到含有新霉素、苯酚、荧光素的培养基上，能存活说明导入了质粒，再观察菌落是否有荧光出现，有荧光说明导入了重组质粒且目的基因成功表达。 1 5 6 7 3 4 2 (3)研究人员计划在上述传感器中添加苯酚降解基因(phh/catA)，使大肠杆菌同时具备检测与清除苯酚的功能。若想通过PCR判定融合基因是否准确连接，要求正确连接经PCR后电泳有特定长度的条带，应选择图2中的引物组合是　　　　　　。  引物2和引物4 1 5 6 7 3 4 2 解析：若要通过PCR判定融合基因是否准确连接，要求正确连接经PCR后电泳有特定长度的条带，引物应该分别与融合基因的3'端互补配对。观察图2可知，phh/catA基因的模板链和Luc基因的模板链不同，需考虑正确连接方向。引物2和引物4可以与融合基因的3'端互补配对，从而扩增出融合基因，以此判定融合基因是否准确连接。 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