专题 05 PCR技术及限制酶应用与基因工程操作（期中真题汇编，广东专用）高二生物下学期

专题 05 PCR技术及限制酶应用与基因工程操作 3大高频考点概览 01考点 PCR流程与差异 02考点 将基因导入受体细胞 03 考点 载体构建与检测 地 城 考点01 PCR流程与差异 一、单选题 1．(24-25高二下·广东江门名校·期中)最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中分别加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则。以加入ddATP的体系为例:若配对的为ddATP，则延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），则继续延伸；PCR产物变性后对其进行电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（　　） A．上述PCR反应体系中需要加入Taq酶和解旋酶 B．电泳时，产物的片段沿电泳方向依次增大 C．3′-CTACCCGTGAT-5′为对照个体的一段序列 D．患者该段序列中的氢键数量较突变前减少 2．(24-25高二下·广东江门名校·期中)下列与DNA有关实验的说法，正确的是（　　） A．利用DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精的原理可初步分离DNA和蛋白质 B．PCR缓冲液中Mg²⁺的作用是激活DNA聚合酶，Mg²⁺浓度越高，酶活性越大 C．PCR复性温度应高于模板DNA的解链温度 D．扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液混匀后需要快速注入加样孔 3．(24-25高二下·广东实验中学·期中)检测甲流病毒（遗传物质为RNA）最常见的方法是实时荧光定量PCR，原理是在PCR反应体系中加入与某条模板链片段互补的荧光探针，其两端有荧光分子（R）和淬灭剂（Q）。当探针完整时，R不发出荧光，否则R发出荧光，具体过程见图。下列叙述正确的有几项（　　）    ①该PCR扩增是直接以甲流病毒的遗传物质作为模板进行的 ②此荧光探针是以甲流病毒遗传物质序列合成的短DNA单链，本身不发出荧光 ③荧光探针能与模板链片段互补，起到了引物作用 ④检测到的荧光强度与反应体系中扩增出的DNA分子数成正比 A．3项 B．2项 C．1项 D．0项 4．(24-25高二下·广东广州执信中学·期中)琼脂糖凝胶电泳可以根据DNA片段的大小（常以碱基对数计）对其进行分离，提取某哺乳动物和其母本以及几只可能为其父本的待测定雄性个体的DNA，经处理后进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图所示，其中M代表母本，C代表该哺乳动物，F1~F4代表待测雄性个体。下列相关叙述错误的是（　　） A．PCR扩增技术利用了DNA半保留复制的原理 B．凝胶中DNA的迁移速率与DNA分子的大小和构象有关 C．由结果可知，PCR扩增后的产物中仅有12个DNA片段 D．由结果推测，待测雄性个体中的F2是该哺乳动物的父本 5．(24-25高二下·广东珠海斗门区珠海华中师范大学（珠海）附属中学·期中)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”“DNA片段的电泳鉴定”实验的相关说法，正确的是（    ） A．利用酒精初步分离DNA与蛋白质的原理是DNA溶于酒精 B．提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后即可变为蓝色 C．琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子越大，迁移速率越快 D．凝胶中DNA片段经核酸染料染色，电泳后置紫外灯下观察和照相 6．(24-25高二下·广东石碁中学等部分学校·期中)与哺乳动物睡眠节律调控有关的基因PER2发生突变会导致睡眠紊乱，利用PCR技术可扩增PER2基因。下列相关说法错误的是（    ） A．扩增时要一对能与PER2基因碱基互补配对的单链核苷酸序列为引物 B．当温度上升到72℃时，氢键断裂，双链DNA解聚为单链 C．为了激活耐高温DNA聚合酶的活性，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+ D．扩增产物一般通过琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定 7．(24-25高二下·广东深圳龙岗区布吉高级中学·期中)将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin-Ⅱ导入杨树细胞，培育抗虫杨树。如图表示利用含目的基因的DNA分子和Ti质粒构建基因表达载体的过程，图中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，表示新霉素抗性基因，箭头表示限制酶的酶切位点，相关酶的识别序列如表所示。下列叙述正确的是（　　） A．用PCR扩增目的基因时，应该选择引物2和引物3并在引物3'端添加相应酶切位点 B．为使目的基因与质粒高效重组，选用KpnⅠ和HindⅢ比选用KpnⅠ和SmaⅠ效果更好 C．为将表达载体导入农杆菌，可以使用离心法处理受体细胞 D．成功导入目的基因的杨树细胞既具有氨苄青霉素抗性，又有新霉素抗性 二、解答题 8．(24-25高二下·广东肇庆第六中学·期中)土壤盐渍化会影响水稻生长发育，研究人员将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，其操作流程及可能用到的限制酶如图所示，其中TetR为四环素抗性基因，AmpR为氨苄青霉素抗性基因，①~⑦表示操作过程。回答下列问题： 限制酶 BamHI BclI SmaI Sau3AI 识别位点及切割位点 -G↓GATCC- -T↓GATCA- -CCC↓GGG- -↓GATC- (1)过程①PCR扩增OsMYB56基因时加入的酶催化_____键的形成，还需要添加引物，应选用引物组合_____。 ①5'-CTTGGATGAT-3'②5'-TAAGTTGTCT-3'③5'-TAGTAGGTTC-3'④5'-TCTGTTGAAT-3'⑤5'-ATTCAACAGA-3'⑥5'-ATCATCCAAG-3' (2)为了筛选出含重组质粒的根瘤农杆菌，根瘤农杆菌应在添加_____的选择培养基上培养。 (3)过程③应选用限制酶_____切割质粒，利用所选限制酶进行操作的优势是_____。 (4)在分子检测中，研究人员对转基因水稻DNA进行PCR，再对PCR产物进行_____鉴定。若要鉴定OsMYB56基因是否表达，从分子水平上检测的方法是_____技术。 9．(24-25高二下·广东广州三校·期中)锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。 (1)锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物根部细胞为材料提取并纯化mRNA，通过_______合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。 (2)重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行酶切处理，然后利用________连接，得到的重组表达载体转化大肠杆菌。 (3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行划线分离培养，活化后接种至_______以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。用_______技术检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。 (4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用逐级稀释至OD600为0．06、0．006和0．0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布方法接种在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中对照为______。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是N，依据是_____。    注：波长600nm下的吸光值0D600与菌液浓度呈正相关；空载体为未插入M或N基因的表达载体。 10．(24-25高二下·广东珠海斗门区珠海华中师范大学（珠海）附属中学·期中)生长激素可用于治疗垂体性侏儒症，但人体内含量微少，提取困难。下图是利用大肠杆菌通过基因工程生产人生长激素的过程。请回答问题： (1)图1中过程②是_____；过程③可以利用_____技术大量扩增目的基因A．过程④在基因工程的操作步骤中表示_____，步骤⑤中常先用_____处理大肠杆菌。 (2)由图3可知，扩增目的基因A时需要选择的一对引物是_____。为防止目的基因反向连接，可在目的基因两端添加不同的限制酶识别序列，分析图2和图3可知，在目的基因的上、下游应添加_____（填图2中限制酶名称）的识别序列。 (3)若要利用牛乳腺生物反应器生产人的生长激素，应该把A基因与_____基因的启动子等调控元件重组在一起。 (4)科学家还尝试构建了膀胱生物反应器来生产人生长激素。与乳腺生物反应器相比，利用膀胱生物反应器生产人生长激素的优点是_____（写出1点即可）。 11．(24-25高二下·广东实验中学·期中)人乳铁蛋白（hLTF）是一种铁结合的糖化球蛋白，在人类乳汁中含量较高，具有抑菌、提高免疫力等重要功能。研究者通过转基因技术培育出了能生产人乳铁蛋白的奶牛，从牛奶中进一步分离提纯出人乳铁蛋白。基因表达载体的构建流程如下图所示，回答下列问题： (1)在培育生产人乳铁蛋白的奶牛的过程中，需要将_______基因为目的基因构建基因表达载体，导入性染色体组成为_______的奶牛受精卵中，再培养成转基因奶牛。 (2)PA质粒中CMV序列是驱动真核生物外源基因表达的启动子，但不适于用来生产人乳铁蛋白的奶牛。为消除其对基因表达的影响，CMV序列在_______与质粒连接的过程中被切除。质粒pW2与pW1碱基对数目的差异可表示为_______的长度。 (3)采用小鼠乳清酸蛋白的启动子和终止子以及目的基因序列构建基因表达载体，可使目的基因在牛乳腺中特异性表达。利用PCR获取启动子和终止子序列，至少需要设计_______种引物。目的基因、小鼠乳清酸蛋白的启动子和终止子序列中均无限制酶识别序列，为了将启动子和终止子剪接到质粒中，可在引物序列中增加一段酶切位点序列。由上图可知，启动子两端增加了________限制酶的识别序列，PCR过程中在第________轮循环后可得到等长的含相应酶切位点的目的基因。 (4)使用上述技术路线所生产转基因奶牛时成功率较低，从基因表达载体的构建过程分析可能的原因是：_______（已知基因调控元件效率较高）。 12．(24-25高二下·广东深圳龙岗区布吉高级中学·期中)研究发现人溶菌酶（hLZ）是天然抗生素替代品。科学家培育出转人溶菌酶基因山羊，以大规模生产人溶菌酶（从乳汁中提取），过程如图所示。其中编号①~⑨表示过程；质粒S中的基因Leu通过控制相关酶的合成来影响亮氨酸的合成（亮氨酸是山羊细胞维持生命活动必不可少的一种氨基酸），基因GFP控制合成绿色荧光蛋白。四种限制酶的切割位点见下表。请回答下列问题： 限制酶 BamHⅠ BglⅡ HindⅢ XbaⅠ 识别序列和切割位点 G↓GATCC A↓GATCT A↓AGCTT T↓CTAGA (1)过程①通过PCR技术扩增物质A，需要的酶是______；过程②利用了两种限制酶的优点是_____（答出一点即可）。 (2)为成功筛选出含重组质粒T的成纤维细胞，质粒S中用作标记基因的是______和______。为达到筛选目的，培养基的营养成分中应不含有_______。将成纤维细胞培养一段时间后观察，筛选出_______（填“显示”或“不显示”）绿色荧光的细胞用于过程⑤。 (3)过程④常用_______法。图中早期胚胎的______（填结构）将发育成转基因羊的各种组织。 地 城 考点02 PCR流程与差异 一、单选题 1．(23-24高二下·广东广州第八十九中学·期中)人凝血酶Ⅲ是一种分泌蛋白，可预防和治疗急慢性血栓。重组人凝血酶Ⅲ是世界上首个上市的动物乳腺生物反应器生产的重组蛋白药物。下列相关叙述错误的是（　　） A．可从人细胞中提取RNA后通过逆转录获取目的基因 B．目的基因的上游需连接在乳腺细胞中特异表达基因的启动子 C．用显微注射技术将表达载体导入乳腺细胞来获得转基因动物 D．若用大肠杆菌作为受体细胞难以获得活性高的人凝血酶Ⅲ 2．(2024高二下·广东省深圳市·期中)噬菌体展示技术（如下图所示）可将某些目标蛋白（如抗体、受体等）呈递至噬菌体表面，便于对目标蛋白进行筛选、鉴定。以下对该技术的分析错误的是（    ） A．外源目的基因都能在噬菌体中获得有效的表达和展示 B．构建噬菌体展示库需要用到限制酶和DNA连接酶等工具 C．构建噬菌体展示库需将目标蛋白基因与噬菌体DNA进行重组并转染细菌 D．通过诱变处理及多轮筛选有可能获得与抗原亲和力更强的抗体及其基因 3．(23-24高二下·广东佛山南海区·期中)水稻根部一般没有根瘤菌，在种植时常需要施加氮肥。科学家想利用基因工程技术将相关基因导入水稻细胞中，建立水稻“小型化肥厂”，让水稻直接固氮，减少使用氮肥的成本以及可能造成的环境污染。下列相关叙述正确的是（    ） A．用PCR仪扩增固氮基因时设置90℃以上变性，72℃左右复性，55℃左右延伸 B．将固氮基因导入水稻细胞可以用农杆菌转化法 C．可用PCR技术检测固氮基因在水稻细胞内是否表达 D．若检测到固氮基因表达产物，即说明转基因固氮水稻培育成功 4．(23-24高二下·广东惠州惠东县·期中)用限制酶Spe Ⅰ和Hind Ⅲ切割质粒，用限制酶Hind Ⅲ和Xba Ⅰ切割目的基因，之后连接，构建基因表达载体。下列叙述错误的是（    ） 限制酶 Spe I Hind Ⅲ Xba I 识别序列             A．若该质粒导入微生物中可用感受态转化法 B．构建的基因表达载体除图示组成外，还需有启动子和终止子 C．表中限制酶的种类不能将目的基因剪切并插入质粒中 D．利用PCR技术获取目的基因时，引物的延伸方向是从5’端到3’端 5．(23-24高二下·广东肇庆封开县江口中学·期中)研究人员仿照制备乳腺生物反应器的思路，制备了一种膀胱生物反应器，用其获得人体特殊功能蛋白W的基本过程如下图所示。下列有关叙述正确的是（　　） A．步骤①和步骤③所代表的操作分别是显微注射、胚胎移植 B．步骤③时一般选择发育良好、形态正常的桑葚胚或原肠胚 C．用促性腺激素对供体雌性动物及代孕母体进行同期发情处理 D．膀胱生物反应器将会受到转基因动物的性别和年龄的限制 二、解答题 6．(24-25高二下·广东肇庆第六中学·期中)B基因存在于水稻基因组中，该基因可在体细胞和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，科学家设计并完成了如下实验来获取能够在卵细胞中表达B基因的转基因植株。请回答下列问题： 注：Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光 (1)从水稻体细胞中提取总RNA，在_____酶的催化下构建cDNA文库，进而获得B基因编码蛋白的序列；再与Luc基因组装成融合基因。 (2)融合基因必须连接到T-DNA中的启动子和终止子之间，其中启动子是_____识别并结合的位点。表达载体中卡那霉素抗性基因的作用是_____。 (3)过程①常对农杆菌进行_____溶液处理，使其处于能_____的生理状态。若借助Luc基因的表达产物来完成图中第二次鉴定筛选，则筛选的具体方法是_____。 (4)从转基因水稻植株的未成熟种子中分离出胚，观察到其细胞内仅含一个染色体组，科学家据此判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的。已知正常情形下的水稻卵细胞在未受精时，不能继续发育形成胚；由此说明B基因的表达能使卵细胞_____。实验结果发现该转基因水稻产生的所有卵细胞并不都含有B基因，出现该结果的可能原因是_____。 7．(24-25高二下·广东·期中)某种遗传物质缺陷型模型鼠有较高的科研价值，但自然繁殖率较低，科研人员利用该模型鼠的体细胞转化获得诱导iPS细胞，进而对该模型鼠进行克隆，相关流程如下图所示。请回答下列问题： (1)图中②过程运用了显微注射技术，请列举生物学中运用了显微注射技术的其他操作：_______（答出1点即可）。 (2)从灰鼠的________（填“输卵管”或“子宫”）内可获得双细胞胚，作此判断的依据是_______。 (3)囊胚的内细胞团将来可以发育成胎儿的________。图示克隆仔鼠的体色为________。经③过程后，重构胚会在代孕白鼠的子宫内孵化，孵化指的是_______。 8．(24-25高二下·广东深圳新安中学（集团）高中部·期中)土壤重金属污染会对人类健康造成危害，是严重的环境问题。利用基因工程手段构建重金属富集植物是修复土壤重金属污染的重要方向之一。景天科植物伴矿景天是一种镉富集生物，研究人员将伴矿景天的SpHMA2基因（简称S基因）转入油菜，获得了镉富集转基因油菜。 (1)提取伴矿景天DNA，经PCR扩增S基因，利用凝胶电泳对扩增片段进行鉴定，得到了图1所示的结果（1号泳道为样品，2号泳道为阴性对照）。由于DNA分子片段带负电荷，所以电泳开始前应将_______（正/负）电极插在凝胶板上靠近DNA样品的一端。根据图所示电泳结果，S基因长约________bp，回收S基因。 (2)将S基因导入植物受体细胞常用的方法是农杆菌转化法，因为农杆菌中含有________结构，将构建的农杆菌与野生型油菜外植体共培养，再通过________技术获得转基因油菜植株，该过程中_________两种植物激素的浓度比起着重要作用。 (3)为检测转基因油菜的镉富集能力，将野生型油菜（WT）和三个株系的转基因油菜（S1、S2、S3）种植于含200μM氯化镉的培养液中，10天后分别测定各油菜的镉含量，得到了图2所示的结果（*表示存在显著性差异），该结果说明_________。 (4)科研人员利用人工智能辅助蛋白质结构预测，鉴定得到多种S蛋白，并对其进行改造，获得了镉富集能力更强的S蛋白，请完善下列技术或合成流程：新型S蛋白结构→ ________→新型S蛋白。 9．(24-25高二下·广东广州执信中学·期中)人工开发的智能工程菌可用于简化疾病诊断和精准用药，某慢性疾病会使患者肠道内产生物质S，且生成量与疾病严重程度正相关，科研人员将抗炎蛋白基因与物质S特异性诱导激活的启动子P、终止子等组件连接构成重组基因（如图一），再与图二所示载体连接，构建表达载体。然后其导入大肠杆菌，筛选得到菌株E，饲喂菌株E的患病模型小鼠症状明显缓解。回答下列问题： (1)利用PCR获取抗炎蛋白基因时，需要加入引物，其作用是________；在进行PCR扩增过程中，________阶段温度最高，其目的为________。 (2)先将抗炎蛋白基因插入如图二所示Kanr基因内的sacⅡ位点，抗炎蛋白基因的终止子尾端有一个pstⅠ的酶切位点。为确认抗炎蛋白基因的大小和插入方向，科研人员用限制酶pstⅠ切割重组质粒并进行电泳，结果出现了4.8kb和0.8kb两个片段。据图分析，抗炎蛋白重组基因长度约为________kb；抗炎蛋白基因插入后转录方向与Kanr基因________（填“相同”或“相反”）。 (3)将图一重组基因导入大肠杆菌前，需要用________处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中的DNA分子的生理状态。为筛选转化成功的工程菌，可将大肠杆菌分别接种到青霉素和卡那霉素培养基中，转化成功的菌株E对两种抗生素的抗性情况为________。 (4)该工程菌之所以被称为智能工程菌，从抗炎蛋白基因表达的角度分析，原因可能是________。 10．(24-25高二下·广东佛山S6高质量发展联盟·期中)在植物基因工程中，抗除草剂基因是常用的标记基因之一、但抗除草剂基因存在于转基因植物体内可能会造成生物安全问题。目前科研人员利用Cre/LoxP位点特异性重组系统来解决这一问题，该系统可以在确定目的基因导入成功后，删除转基因植物细胞内的抗除草剂基因，原理如下图：    注：①LoxP是具有特异性序列的小DNA片段，自身不表达，也不影响其他基因表达。②Cre酶特异性识别LoxP上的序列并切开LoxP。③启动子1只能在植物细胞中起作用（具有特种特异性）。 回答下列问题： (1)据图分析，目的基因转录时，_____（填“启动子1”、“启动子2”或“启动子3”）是RNA聚合酶识别、结合的位点。 (2)抗除草剂基因作为标记基因，可以鉴定和选择重组DNA的原因是_____。 (3)Cre酶可以切开LoxP，其功能类似于基因工程中的_____酶。经Cre酶处理后，抗除草剂基因即使存在植物体内也不再表达的原因是_____。 (4)利用农杆菌将图中所示的重组载体导入植物细胞，农杆菌内重组载体上的抗除草剂基因会不会被删除？_____（填“会”或“不会”），原因是_____。 11．(2024高二下·广东省深圳市·期中)B基因存在于水稻基因组中，该基因可在体细胞和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，科学家设计并完成了如下实验来获取能够在卵细胞中表达B基因的转基因植株。请回答下列问题： 注：Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光 (1)从水稻体细胞中提取总RNA，在_____酶的催化下构建cDNA文库，进而获得B基因编码蛋白的序列；再与Luc基因组装成融合基因，构建B-Luc融合基因需要的工具酶有_____。 (2)融合基因必须连接到T-DNA中的启动子和终止子之间，其中启动子是_____识别并结合的位点。表达载体中卡那霉素抗性基因的作用是_____。 (3)过程①常对农杆菌进行_____溶液处理，使其处于能_____的生理状态。若借助Luc基因的表达产物来完成图中第二次鉴定筛选，则筛选的具体方法是_____。 (4)从转基因水稻植株的未成熟种子中分离出胚，观察到其细胞内仅含一个染色体组，科学家据此判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的。已知正常情形下的水稻卵细胞在未受精时，不能继续发育形成胚；由此说明B基因的表达能使卵细胞_____。实验结果发现该转基因水稻产生的所有卵细胞并不都含有B基因，出现该结果的可能原因是_____。 12．(23-24高二下·广东六校联考·期中)肝纤维化与肝细胞癌的发生密切相关，肝纤维化是指肝细胞外基质的病理性沉积，沉积物中I型胶原蛋白是主要成分。研究发现活化的人肝星状细胞会大量合成和分泌I型胶原蛋白沉积在肝小叶的窦间隙，大量产生I型胶原蛋白是肝星状细胞活化的标志之一。I型胶原蛋白由α1和α2两条肽链组成，并分别由COL1Al和COLIA2编码。本研究旨在通过基因工程技术用人COLIA1启动子序列调控增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的表达，在LX-2细胞（永生化的人肝星状细胞）中建立一个人肝星状细胞活化的可视化报告系统。 (1)研究过程中应将LX-2细胞置于含______的气体条件下培养。 (2)研究人员构建了如图1所示的基因表达载体，其中Kozak序列能增强EGFP基因的表达，已知EGFP基因的α链为转录的模板链，则应将图2中EGFP基因的______（“A”或“B”）端与Kozak序列连接，除图1中所示元件外，基因表达载体还应具备______（至少答两点）等元件。    (3)使用慢病毒包装系统将基因表达载体导入LX-2细胞中，并筛选得到了荧光强度最强的细胞株（LX-2-CE）进行扩大培养用于后续研究。为验证LX-2-CE能通过EGFP表达来反映细胞表达COLIA1能力的改变，本研究选取了已知具有潜在抗肝纤维化作用的药物青蒿琥酯对LX-2-CB进行处理。实验分组中，阴性对照组为______，阳性对照组为加10μg/L的TGF-β1诱导处理的LX-2-CE，实验组为加入不同浓度青蒿琥酯与10μg/L的TGF-β1共处理的LX-2-CE。实验结束后，对各组LX-2-CE进行荧光检测。若实验组的荧光强度均_____（“低于”或“高于”）阳性对照组的荧光强度，说明LX-2-CE荧光强度的改变可以反应青蒿琥酯的潜在抗肝纤维化作用。实验中10μg/L的1TGF-β1的作用是______。 (4)系列实验结果表明，外源性COLIA1启动子调控的EGFP的表达能在一定程度上反映内源性COL1Al启动子调控的COLIA1的表达水平的变化。请你推测该人肝星状细胞活化的可视报告系统建立的意义是______。 13．(23-24高二下·广东肇庆第一中学·期中)B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞（2N）和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。 (1)B基因在水稻卵细胞中不转录，推测其可能的原因是卵细胞中______。 A．含B基因的染色体缺失 B．DNA聚合酶失活 C．B基因发生基因突变 D．B基因的启动子无法启动转录 (2)从水稻体细胞或______中提取总RNA，构建cDNA文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因（表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光）连接成融合基因（表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能），然后构建重组表达载体。 (3)在过程①、②转化筛选时，过程______中T-DNA整合到受体细胞染色体DNA上，过程______在培养基中应加入卡那霉素。图中基因表达载体构建与转化的过程中，目标基因共经过______次拼接。 (4)从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明______。 三、实验题 14．(23-24高二下·广东广州第八十九中学·期中)某病毒B对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。请回答： (1)过程①一般采用____法将基因A导入工程菌内。过程②基因A能在工程菌内表达产生蛋白A的原因是____。 (2)过程③处理的目的是____。过程⑤常用____诱导细胞融合。 (3)图中经筛选1得到的杂交瘤细胞具有的特点是____，筛选2的方法是____。 (4)为了得到大量的抗病毒B的单克隆抗体，可将杂交瘤细胞接种到适宜的动物细胞培养液中进行培养，但杂交瘤细胞的接种量会影响单克隆抗体的产量。为了探究培养液中杂交瘤细胞的最佳接种量，请写出实验思路：____。 地 城 考点03 载体构建与检测 一、单选题 1．(24-25高二下·广东肇庆端州中学·期中)小麦和水稻是我国主要粮食作物，其中赖氨酸含量很低，科研人员通过以下操作，将辣椒中的含赖氨酸较高的某蛋白基因转入小麦，流程如下图。下列叙述正确的是（　　） A．逆转录合成DNA的过程需要DNA聚合酶催化 B．通过逆转录获得的cDNA有多种 C．目的基因直接导入小麦就能表达高赖氨酸蛋白 D．T0代转基因植株一定可培育出纯合含高赖氨酸蛋白的植株 2．(24-25高二下·广东肇庆端州中学·期中)基因工程会用到多种限制酶，下列为部分限制酶的识别序列和酶切位点及其在某质粒上的酶切位点。下列叙述错误的是（　　） A．Sau3AⅠ可切割BamHⅠ和Bcl Ⅰ的识别序列，其具有专一性 B．质粒被BamHⅠ和Bcl Ⅰ切割后，并在DNA连接酶的作用下，会发生环化 C．构建重组质粒时，切割该质粒的限制酶只能是BamHⅠ D．分别用Sau3AⅠ和BamHⅠ切割目的基因和质粒，形成的重组质粒能被Sau3A Ⅰ切成4个片段 3．(24-25高二下·广东佛山S6高质量发展联盟·期中)我国科学家成功地将与植物花青素代谢相关的基因（An）导入矮牵牛中，使其花朵呈现出自然界没有的颜色变异，大大提高了其观赏价值。如图为An基因两端的序列和质粒中相关的序列，已知限制酶I的识别序列和切点是-G↓GATCC-，限制酶II的识别序列和切点是-↓GATC-。下列相关叙述错误的是（    ）    A．构建基因表达载体时需要使用限制酶I切割质粒 B．新品种矮牵牛所呈现的颜色变异来源于基因重组 C．An基因在矮牵牛植株的花朵中特异性表达 D．应将启动子、终止子和复制原点分别添加至GeneI、II的上游或下游 4．(24-25高二下·广东肇庆衡立高级中学·期中)图甲、图乙分别表示质粒和外源DNA，其中箭头表示相关限制酶的酶切位点，下列叙述正确的是（　　） A．用质粒和外源DNA构建重组质粒过程中，不能使用SmaⅠ切割 B．用EcoRⅠ、Hind Ⅲ和BamHⅠ中的任意一种酶切割质粒和外源基因都可以 C．为获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入DNA聚合酶 D．图甲所示的质粒分子在经SmaⅠ切割后含有4个游离的磷酸基团 5．(23-24高二下·广东肇庆第一中学·期中)限制酶 MunⅠ和限制酶 EcoRⅠ的识别序列及其切割位点分别如下：—C↓AATTG—和—G↓AATTC—如图表示某目的基因片段与质粒拼接形成重组质粒过程，下列叙述错误的是（　　） A．用限制酶 EcoRⅠ切割目的基因，同时用限制酶 MunⅠ切割质粒 B．构建重组质粒时，会形成不止一种脱氧核苷酸序列（考虑DNA片段两两连接） C．将重组质粒同时用以上2种限制酶切割则会再形成1种长度的 DNA 片段 D．标记基因一般是抗生素抗性基因或荧光标记基因，便于目的基因的筛选 6．(23-24高二下·广东肇庆封开县江口中学·期中)科学家创造了“基因敲除”技术：将外源基因整合到小鼠胚胎干细胞的DNA同源序列中，使某一个基因被取代或破坏而失活，然后将修饰后的胚胎干细胞植入小鼠的早期胚胎，形成嵌合体小鼠。科学家已经利用上述技术成功地把人类囊肿性纤维化病的致病基因移植到小鼠身上，培育出了患囊肿性纤维化病的小鼠。下列有关叙述错误的是（　　） A．通过上述“基因敲除”技术可以定向改变生物体的遗传性状 B．在“基因敲除”中需要用到限制性内切核酸酶、DNA连接酶等 C．这种嵌合体小鼠长大后，体内存在外源基因，但不会遗传给后代 D．“基因敲除”技术有利于人类对某些遗传因素引发的疾病进行研究 7．(23-24高二下·广东佛山S6高质量发展联盟·期中)如图表示某质粒的结构示意图。下列叙述错误的是（　　）   A．构建基因表达载体时目的基因插入在启动子和终止子之间 B．由该质粒的限制酶识别位点可知，可选择EcoRI和HindⅢ切割质粒 C．启动子能与RNA聚合酶结合，驱动相关基因转录出相应的mRNA D．该质粒中标记基因的作用是便于重组DNA分子的筛选 二、实验题 8．(24-25高二下·广东东莞七校联考·期中)研究人员利用基因工程的方法将油料作物紫苏的DGAT1基因导入四尾栅藻（操作过程如下图1所示），获得转基因的产油微藻。利用地热废水培养该藻，在生产生物柴油的同时，还能治理地热废水。请回答下列问题： (1)利用PCR技术扩增DGAT1基因片段时，需要用到的关键酶是______。图2中的引物______（填字母）在PCR反应步骤中的______阶段与DNA单链相应互补序列结合。 (2)将DGAT1基因与pBH21构建基因表达载体时，需在DGAT1基因的两端添加限制酶______的识别序列。 (3)启动子的基本单位是______。启动子往往具有物种特异性，在载体pBH21质粒中插入紫苏DGAT1基因，其上游启动子应选择______（填“紫苏DGAT1基因”“大肠杆菌”或“四尾栅藻”）的启动子。对获得的转基因四尾栅藻进行分子水平检测，可采用的技术有______（答出2种）。 (4)为检测转基因四尾栅藻对地热废水的治理能力，研究人员设计实验并得到相应实验结果如下表。 培养转基因四尾栅藻的地热废水培养基各项指标测定结果 各项指标 总氮/（mg·L-1） 总磷/（mg·L-1） 氟化物/（mg·L-1） 初始 23.2 4.32 4.56 培养转基因四尾栅藻11天后 1.9 0.45 0.84 该实验不能说明转DGAT1基因显著提高了四尾栅藻的去污能力。请进一步完善实验设计：______。 三、解答题 9．(24-25高二下·广东深圳新安中学（集团）高中部·期中)科研人员欲将斑马鱼的vtg基因（图1）插入Luc基因载体（图2），形成vtg-Luc融合基因重组载体并培育转基因斑马鱼。（注：Luc基因缺乏启动子序列，vtg基因内部无图2中的任何限制酶识别序列。TetR为四环素抗性基因，Sau2aI、EcoRⅠ、HindⅢ、BsrGⅠ、Bcl I为限制酶，→表示转录方向） (1)基因工程的核心步骤是________。为使vtg基因与Luc基因载体正向连接，可选用限制酶______进行双酶切Luc基因载体。 (2)通过PCR获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图1、图2信息，推测引物1包含的碱基序列为_________。 A．5’-GAATTCAACTAT-3’ B．5’-GAATTCTTGATA-3’ C．5’-GATCTTGATA-3’ D．5’-AAGCTTAACTAT-3’ (3)筛选导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌，可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉素、四环素的培养基中培养，筛选________（选填“能”或“不能”）在含有氨苄青霉素的培养基中生长但_______（选填“能”或“不能”）在含有四环素的培养基中生长的大肠杆菌即为目的菌。 (4)水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，E蛋白可以激活vtg基因上游的启动子。Luc基因的表达产物是萤火虫荧光素酶，可以催化荧光素氧化产生荧光。请结合上述信息，简述转基因斑马鱼用于检测水体中雌激素污染情况的原理：________。 (5)转基因斑马鱼逃逸可能引发生物安全问题，可考虑采取的措施是_______（答1点）。 10．(23-24高二下·广东广州第八十九中学·期中)土壤盐渍化会影响水稻生长发育，研究人员将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，其操作流程及可能用到的限制酶如图所示，其中TetR为四环素抗性基因，AmpR为氨苄青霉素抗性基因，①~⑦表示操作过程。回答下列问题： 限制酶 BamHⅠ BclⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ 识别位点及切割位点 -G↓GATCC- -T↓GATCA- -CCC↓GGG- -↓GATC- (1)过程①PCR扩增OsMYB56基因时加入的酶催化____键的形成，还需要添加引物，应选用引物组合____。 ①5'-CTTGGATGAT-3' ②5'-TAAGTTGTCT-3' ③5'-TAGTAGGTTC-3' ④5'-TCTGTTGAAT-3' ⑤5'-ATTCAACAGA-3' ⑥5'-ATCATCCAAG-3' (2)Ti质粒中启动子的功能是____。为了筛选出含重组质粒的根瘤农杆菌，根瘤农杆菌应在添加____的选择培养基上培养。 (3)过程③应选用限制酶____切割质粒，利用所选限制酶进行操作的优势是____，切割后需要用____酶（填具体名称）进行连接才能获得重组质粒。 (4)在分子检测中，研究人员对转基因水稻DNA进行PCR，再对PCR产物进行____鉴定。若要鉴定OsMYB56基因是否表达，从分子水平上检测的方法是____技术。 11．(23-24高二下·广东惠州实验中学·期中)图1 中的三个 DNA 片段上依次表示出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和 Sau3A Ⅰ三种限制酶的识别序列与切割位点，图2为某种表达载体的示意图(载体上的 EcoR Ⅰ、Sau3A Ⅰ的切点是唯一的)。 根据基因工程的有关知识，回答下列问题： (1)经 BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被_________酶切后的产物连接，理由是_____________。 (2)若某人利用图2所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图3 所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有_________，不能表达的原因是___________________。 (3)DNA 连接酶是将两个DNA 片段连接起来的酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是______________。 (4)为了检测目的基因是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR 方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的__________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR 模板。 12．(23-24高二下·广东佛山南海区·期中)近年来，生物柴油作为新型能源已经成为世界上应用最广泛、发展迅猛的可再生能源之一。微藻细胞能积累油脂可以用于生产生物柴油。研究人员利用RT—PCR技术（将RNA反转录合成cDNA，再以cDNA为模板，PCR扩增合成目的片段）获得油料作物紫苏DGATI基因，将其导入四尾栅藻，获得转基因产油微藻。操作过程如图1。 注：克隆质粒主要用于目的基因的大量复制；LacZ基因可使细菌利用加入培养基的物质X-gal，从而使菌落显现出蓝色。若无该基因或该基因被破坏，则菌落则呈白色。 (1)RT-PCR过程所需要的酶主要有______和TaqDNA聚合酶，其中TaqDNA聚合酶需要______（离子）的激活，扩增得到DGAT1基因，PCR扩增得到的产物一般通过______鉴定，鉴定的结果显示______条带（填数字）说明扩增成功。 (2)DGAT1基因与克隆质粒pMD19连接，将连接产物导入到经______处理后的大肠杆菌细胞，并接种到添加______的培养基上培养，一段时间后，挑选颜色为______的菌落用液体培养基培养，提取质粒pMD19-DGAT1。 (3)用限制酶切pMD19-DGAT1获得DGAT1基因，并与酶切后的载体pBI121连接得到______，并导入到四尾栅藻。 (4)研究人员培养转基因四尾栅藻并检测其油脂含量，结果如图2。 结果显示：____________。 13．(23-24高二下·广东麻涌，塘厦，七中，济川四校·期中)某科研小组欲用图1所示的质粒构建人胰岛素基因表达载体，让其在大肠杆菌中表达出人胰岛素前体物质，对人胰岛素基因所在的DNA片段进行测序，发现其两端附近无限制酶EcoRI、BamHI的酶切位点。已知人胰岛素基因表达时以②链为模板，且其3'端存在启动子，图1所示质粒上的ampR为氨苄青霉素抗性基因，telR为四环素抗性基因。请回答下列问题： (1)可采用_______来获得人胰岛素基因，这一方法需要先针对人胰岛素基因两端的序列来设计引物对。这一方法获得的产物一般通过______进行鉴定，若鉴定发现其中有许多种相对分子质量比人胰岛素基因小的DNA片段，则原因可能是______（答出一点）。 (2)为保证人胰岛素基因能正确连接到用限制酶EcoRI和BamHI处理的图1所示质粒上，且利用表达载体上的启动子在受体菌中以②链为模板进行转录，则应在配对到①链的引物5'端添加6个碱基，序列为5'-_______-3'。 (3)图1质粒上的ampR和tetR一般充当基因表达载体上的标记基因，其作用是______。利用质粒上的标记基因，结合微生物的培养，可以淘汰只转入质粒的大肠杆菌而获得被成功转入人胰岛素基因表达载体的受体菌，则应将重组载体导入经________处理后的________（填“不抗氨苄青霉素”“不抗四环素”或“不抗氨苄青霉素和四环素”）的受体大肠杆菌中。 14．(23-24高二下·广东肇庆封开县江口中学·期中)应用生物工程技术获得人们需要的生物新品种或新产品。请据图回答下列问题： (1)在培育转人生长激素基因牛过程中，进行基因表达载体构建时，人生长激素基因的上游必须含有______。①过程需要的工具酶是_______，③过程培养到桑葚胚或囊胚阶段，可以采用_____技术，培育出多头相同的转基因犊牛。 (2)prG能激发细胞不断分裂，通过基因工程导入该调控基因来制备单克隆抗体，Ⅱ最可能是______细胞，Ⅲ代表的细胞具有_______的特点。 (3)在抗虫棉培育过程中，⑤过程采用的技术是______。 15．(23-24高二下·广东肇庆肇庆中学·期中)人乳铁蛋白（hLTF）是一种铁结合的糖蛋白、具有抑菌、提高免疫力等重要功能。研究者通过转基因技术培育能生产hLTF的奶牛，从牛奶中分离提纯hLTF，回答下列问题。 (1)从原核生物中获取的质粒不适用于直接构建真核生物的表达载体，其启动子需要进行替换才有可能在真核细胞中表达，主要原因是_____。 (2)研究人员采用小鼠乳清酸蛋白基因的启动子和终止子来替换pA质粒中的部分序列，再拼接hLTF基因，最终形成pW2-hLTF重组质粒，过程如下图：   科学家常用PCR特异性地快速扩增目的基因，其原理是_____。 PCR扩增过程中每次循环一般可分为_____。在扩增小鼠乳清酸蛋白基因的启动子、终止子和hLTF基因时，均需引入限制酶的识别序列和切割位点，以便剪接到质粒的指定位置。据图分析，PCR扩增小鼠乳清酸蛋白基因的启动子所需的两种引物应分别包含_____（限制酶）的识别序列。 (3)构建基因表达载体过程中，将修饰后的hLTF基因插入重组质粒的启动子和终止子之间后，不一定能获得所需要的基因表达载体，原因是_____。 (4)经检测筛选所获得的基因表达载体pW2-hLTF通过_____的方法导入到奶牛的受精卵细胞中，以获得能产生hLTF的转基因奶牛。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题 05 PCR技术及限制酶应用与基因工程操作 3大高频考点概览 01考点 PCR流程与差异 02考点 将基因导入受体细胞 03 考点 载体构建与检测 地 城 考点01 PCR流程与差异 一、单选题 1．(24-25高二下·广东江门名校·期中)最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中分别加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则。以加入ddATP的体系为例:若配对的为ddATP，则延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），则继续延伸；PCR产物变性后对其进行电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（　　） A．上述PCR反应体系中需要加入Taq酶和解旋酶 B．电泳时，产物的片段沿电泳方向依次增大 C．3′-CTACCCGTGAT-5′为对照个体的一段序列 D．患者该段序列中的氢键数量较突变前减少 【答案】D 【分析】双脱氧测序法的原理：在DNA聚合酶、引物、四种单脱氧核苷酸（dNTP）存在的情况下，如果在四管反应系统中再分别加入四种双脱氧核苷三磷酸（ ddNTP），DNA链合成反应过程中 ddNTP与dNTP处于一种竞争状态，即新合成DNA链既可能掺入正常dNTP，也可能掺入ddNTP并使新合成链终止延伸。这样在每个反应系统中形成的产物是一系列长度不等的多核苷酸片段，这些片段具有相同的起点，即引物的5'端，但有不同的ddNTP终端。 在结束反应后，用四个泳道进行电泳，分别分离各组反应体系中不同长度的DNA 片段，检测DNA片段终止末端位置的碱基种类，从自显影图谱中直接读取到与模板相匹配的新的链序。 【详解】A、上述PCR反应体系中需要加入Taq酶，不需要加入解旋酶，加热可使DNA氢键打开，A错误； B、电泳时产物的片段越小，扩散速度越快，因此电泳时，产物片段沿电泳方向依次减小，B错误； C、由于子链延伸方向为5′→3′，结合电泳图判断，5′-CTACCCGTGAT-3′为对照个体的一段序列，C错误； D、A-T之间为2个氢键，G-C之间为3个氢键，患者该段序列中某位点的C替换为T，其氢键数量较突变前减少，D正确。 故选D。 2．(24-25高二下·广东江门名校·期中)下列与DNA有关实验的说法，正确的是（　　） A．利用DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精的原理可初步分离DNA和蛋白质 B．PCR缓冲液中Mg²⁺的作用是激活DNA聚合酶，Mg²⁺浓度越高，酶活性越大 C．PCR复性温度应高于模板DNA的解链温度 D．扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液混匀后需要快速注入加样孔 【答案】A 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性；（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精，可利用这一原理初步分离DNA与蛋白质，A正确； B、Mg²⁺是Taq DNA聚合酶的激活剂，但浓度过高会抑制酶活性，并非浓度越高活性越大，B错误； C、PCR复性温度需低于模板DNA的解链温度（Tm），否则引物无法与单链模板结合，C错误； D、PCR产物与载样缓冲液混匀后应缓慢加入加样孔，避免冲散样品或产生气泡，无需快速注入，D错误。 故选A。 3．(24-25高二下·广东实验中学·期中)检测甲流病毒（遗传物质为RNA）最常见的方法是实时荧光定量PCR，原理是在PCR反应体系中加入与某条模板链片段互补的荧光探针，其两端有荧光分子（R）和淬灭剂（Q）。当探针完整时，R不发出荧光，否则R发出荧光，具体过程见图。下列叙述正确的有几项（　　）    ①该PCR扩增是直接以甲流病毒的遗传物质作为模板进行的 ②此荧光探针是以甲流病毒遗传物质序列合成的短DNA单链，本身不发出荧光 ③荧光探针能与模板链片段互补，起到了引物作用 ④检测到的荧光强度与反应体系中扩增出的DNA分子数成正比 A．3项 B．2项 C．1项 D．0项 【答案】B 【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCR反应过程：变性→复性→延伸。 【详解】①甲流病毒为 RNA 病毒，欲用 PCR 检测需先经逆转录形成 cDNA，再以此为模板进行扩增，不能直接以 RNA 为模板，①错误； ②探针是依据甲流病毒的序列合成的短的DNA单链，结合图示可知，荧光探针含有荧光分子，当探针完整时，R不发出荧光，故该探针本身不发光，②正确； ③探针只是与目标序列结合并在酶切后释放荧光，不充当引物的作用，扩增所需引物另行设计，③错误； ④随着 PCR 产物量的增加，被水解释放的荧光分子也相应增多，荧光强度与扩增出的 DNA 分子数成正比，④正确。 综上所述，②④正确，①③错误。 故选B。 4．(24-25高二下·广东广州执信中学·期中)琼脂糖凝胶电泳可以根据DNA片段的大小（常以碱基对数计）对其进行分离，提取某哺乳动物和其母本以及几只可能为其父本的待测定雄性个体的DNA，经处理后进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图所示，其中M代表母本，C代表该哺乳动物，F1~F4代表待测雄性个体。下列相关叙述错误的是（　　） A．PCR扩增技术利用了DNA半保留复制的原理 B．凝胶中DNA的迁移速率与DNA分子的大小和构象有关 C．由结果可知，PCR扩增后的产物中仅有12个DNA片段 D．由结果推测，待测雄性个体中的F2是该哺乳动物的父本 【答案】C 【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】A、PCR是在体外对DNA进行复制的过程，扩增利用了DNA半保留复制的原理，A正确； B、琼脂糖凝胶电泳可以根据DNA片段的大小对其进行分离，凝胶中DNA的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，B正确； C、由题图可知，每个样本的DNA电泳后都得到2个电泳条带，说明有2种大小不同的DNA片段，不一定只有2个，即PCR扩增后的产物中不一定仅有12个DNA片段，C错误； D、该哺乳动物与F2具有一条相同的电泳条带，根据该结果推测F₂是其父本，D正确。 故选C。 5．(24-25高二下·广东珠海斗门区珠海华中师范大学（珠海）附属中学·期中)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”“DNA片段的电泳鉴定”实验的相关说法，正确的是（    ） A．利用酒精初步分离DNA与蛋白质的原理是DNA溶于酒精 B．提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后即可变为蓝色 C．琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子越大，迁移速率越快 D．凝胶中DNA片段经核酸染料染色，电泳后置紫外灯下观察和照相 【答案】D 【分析】DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理可以初步分离DNA和蛋白质；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/LNaCl溶液中；鉴定DNA时可与二苯胺溶液混合，并在水浴加热条件下呈现蓝色；耐高温的DNA聚合酶在延伸环节时进行子链的合成。 【详解】A、DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离，A错误； B、将提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后，水浴加热条件下才会呈现蓝色，B错误； C、待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率，DNA分子越小，迁移的速率越快，DNA分子越大，迁移速率越慢，C错误； D、常用核酸染料染色后，DNA在紫外光下会发出荧光，便于观察电泳条带并拍照记录，D正确。 故选D。 6．(24-25高二下·广东石碁中学等部分学校·期中)与哺乳动物睡眠节律调控有关的基因PER2发生突变会导致睡眠紊乱，利用PCR技术可扩增PER2基因。下列相关说法错误的是（    ） A．扩增时要一对能与PER2基因碱基互补配对的单链核苷酸序列为引物 B．当温度上升到72℃时，氢键断裂，双链DNA解聚为单链 C．为了激活耐高温DNA聚合酶的活性，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+ D．扩增产物一般通过琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定 【答案】B 【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】A、引物在PCR技术中起着至关重要的作用，引物需与模板链的3，端互补配对，引导DNA聚合酶从特定的起始点开始合成DNA链，因此，扩增时要一对能与PER2基因碱基互补配对的单链核苷酸序列为引物，A正确； B、在PCR技术的过程中包括：高温变性（解链）→低温复性→中温延伸三个步骤，当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，这个过程称为变性‌，温度上升到72℃左右时，与引物结合，子链延伸，B错误； C、PCR 反应的缓冲液中需添加Mg2+，用于激活耐高温的DNA聚合酶的活性，C正确； D、琼脂糖凝胶电泳是一种常用的实验室技术，不同大小的DNA分子在电场中泳动速度不同，从而被分离，故扩增产物一般通过琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定，D正确。 故选B。 7．(24-25高二下·广东深圳龙岗区布吉高级中学·期中)将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin-Ⅱ导入杨树细胞，培育抗虫杨树。如图表示利用含目的基因的DNA分子和Ti质粒构建基因表达载体的过程，图中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，表示新霉素抗性基因，箭头表示限制酶的酶切位点，相关酶的识别序列如表所示。下列叙述正确的是（　　） A．用PCR扩增目的基因时，应该选择引物2和引物3并在引物3'端添加相应酶切位点 B．为使目的基因与质粒高效重组，选用KpnⅠ和HindⅢ比选用KpnⅠ和SmaⅠ效果更好 C．为将表达载体导入农杆菌，可以使用离心法处理受体细胞 D．成功导入目的基因的杨树细胞既具有氨苄青霉素抗性，又有新霉素抗性 【答案】B 【分析】基因工程包括四个基本程序：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细 胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、DNA聚合酶只能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，利用PCR扩增目的基因时，应该选择引物2和引物3，但应该在引物5'端添加相应酶切位点，A错误； B、为使目的基因与质粒高效重组，选用KpnⅠ和HindⅢ比选用KpnⅠ和SmaⅠ效果更好，因为二者切割后均产生粘性末端，可使目的基因定向插入，且DNA连接酶连接效率较高，B正确； C、为将表达载体导入农杆菌，可以使用Ca2+处理受体细胞，使其处于能吸收周围环境中DNA分子的状态，然后再将重组质粒导入其中；而离心法或PEG融合法是诱导植物细胞融合的方法，C错误； D、只有T-DNA区段会导入植物受体细胞，因此氨苄青霉素抗性基因不会导入植物受体细胞中，即成功导入目的基因的杨树细胞只能表现出新霉素抗性，D错误。 故选B。 二、解答题 8．(24-25高二下·广东肇庆第六中学·期中)土壤盐渍化会影响水稻生长发育，研究人员将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，其操作流程及可能用到的限制酶如图所示，其中TetR为四环素抗性基因，AmpR为氨苄青霉素抗性基因，①~⑦表示操作过程。回答下列问题： 限制酶 BamHI BclI SmaI Sau3AI 识别位点及切割位点 -G↓GATCC- -T↓GATCA- -CCC↓GGG- -↓GATC- (1)过程①PCR扩增OsMYB56基因时加入的酶催化_____键的形成，还需要添加引物，应选用引物组合_____。 ①5'-CTTGGATGAT-3'②5'-TAAGTTGTCT-3'③5'-TAGTAGGTTC-3'④5'-TCTGTTGAAT-3'⑤5'-ATTCAACAGA-3'⑥5'-ATCATCCAAG-3' (2)为了筛选出含重组质粒的根瘤农杆菌，根瘤农杆菌应在添加_____的选择培养基上培养。 (3)过程③应选用限制酶_____切割质粒，利用所选限制酶进行操作的优势是_____。 (4)在分子检测中，研究人员对转基因水稻DNA进行PCR，再对PCR产物进行_____鉴定。若要鉴定OsMYB56基因是否表达，从分子水平上检测的方法是_____技术。 【答案】(1) 磷酸二酯 ①④ (2)四环素 (3) BclI和SmaI 防止酶切后的质粒、目的基因自身环化；保证OsMYB56基因和酶切后的质粒定向连接 (4) 琼脂糖凝胶电泳 抗原—抗体杂交 【分析】PCR技术可特异性的扩增DNA片段，关键在于引物可以和特定DNA片段的3'端特异性结合，使耐高温的DNA聚合酶沿引物的3'端延伸子链。基因表达载体一般包括启动子、终止子、目的基因、标记基因、复制原点等元件。 【详解】（1）DNA分子由2条链构成，每一条链都有3'端与5'端，-OH端为3'，磷酸基团的末端为5'，因此OsMYB56基因游离的磷酸基团侧为5'端，羟基端为3'端。过程①PCR扩增OsMYB56基因时加入的酶是Taq,该酶能催化磷酸二酯键的形成。在进行PCR操作时，引物应分别与基因两条链的3'端根据碱基互补配对原则结合，根据图中两端序列，通常选择5′-CTTGGATGAT-3′（上面链的引物）和5′-TCTGTTGAAT-3′（下面链的引物）作为引物对，①④正确。 （2）标记基因可用于重组DNA分子的筛选，质粒上有TetR为四环素抗性基因，AmpR为氨苄青霉素抗性基因标记基因，但AmpR为氨苄青霉素抗性基因被限制酶切割失活，故应在添加四环素的选择培养基上培养。 （3）据图可知，质粒中的两个标记基因TetR和AmpR中都含有限制酶BamHⅠ识别序列，如果用限制酶BamHⅠ，会破坏质粒中的两个标记基因，为防止质粒自身环化，保证OsMYB56和酶切后的质粒定向连接，需要用双酶切，因此过程③可以选择限制酶BclⅠ和SmaⅠ。 （4）PCR的产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，分子水平检测OsMYB56基因是否表达，可以检测基因是否转录形成RNA或翻译成蛋白质，因此方法如下：可以提取细胞的mRNA，逆转录得到cDNA后进行PCR扩增；根据OsMYB56基因设计探针进行核酸分子杂交检测OsMYB56基因或者其转录出的mRNA；通过抗原一抗体杂交技术检测OsMYB56基因表达的蛋白质。 9．(24-25高二下·广东广州三校·期中)锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。 (1)锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物根部细胞为材料提取并纯化mRNA，通过_______合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。 (2)重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行酶切处理，然后利用________连接，得到的重组表达载体转化大肠杆菌。 (3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行划线分离培养，活化后接种至_______以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。用_______技术检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。 (4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用逐级稀释至OD600为0．06、0．006和0．0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布方法接种在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中对照为______。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是N，依据是_____。    注：波长600nm下的吸光值0D600与菌液浓度呈正相关；空载体为未插入M或N基因的表达载体。 【答案】(1)反转录 (2)DNA连接酶 (3) 液体培养基并振荡培养 抗原-抗体杂交技术 (4) 野生型酵母+空载体、锌吸收缺陷型酵母+空载体 转入N基因的这组酵母菌数量多 【分析】基因工程的基本操作程序：（1）目的基因的筛选与获取；（2）基因表达载体的构建；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）由题意可知，锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，所以以该植物的根为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。 （2）内切酶处理后的质粒和目的基因，用DNA连接酶进行连接。 （3）冻存的酵母菌浓度较高，可直接在固体培养基上划线接种后进行培养，进行活化，然后转至液体培养基增殖，培养过程中进行震荡，有利于增加培养液的溶氧量和使酵母菌和培养液充分接触，从而快速增殖。可采用抗原-抗体杂交法检测目的基因在受体细胞中的表达锌转运蛋白。 （4）由题意可知，菌液稀释后OD600为0.06、0.006和0.0006，说明其进行10指数的梯度稀释。由图可知，野生型酵母+空载体和锌吸收缺陷型酵母+空载体为对照组，其余两组是实验组。由图中光谱吸收值可知，转入N基因的这组酵母菌数量多，说明N转运Zn2+能力更强。 10．(24-25高二下·广东珠海斗门区珠海华中师范大学（珠海）附属中学·期中)生长激素可用于治疗垂体性侏儒症，但人体内含量微少，提取困难。下图是利用大肠杆菌通过基因工程生产人生长激素的过程。请回答问题： (1)图1中过程②是_____；过程③可以利用_____技术大量扩增目的基因A．过程④在基因工程的操作步骤中表示_____，步骤⑤中常先用_____处理大肠杆菌。 (2)由图3可知，扩增目的基因A时需要选择的一对引物是_____。为防止目的基因反向连接，可在目的基因两端添加不同的限制酶识别序列，分析图2和图3可知，在目的基因的上、下游应添加_____（填图2中限制酶名称）的识别序列。 (3)若要利用牛乳腺生物反应器生产人的生长激素，应该把A基因与_____基因的启动子等调控元件重组在一起。 (4)科学家还尝试构建了膀胱生物反应器来生产人生长激素。与乳腺生物反应器相比，利用膀胱生物反应器生产人生长激素的优点是_____（写出1点即可）。 【答案】(1) 逆转录 PCR 基因表达载体的构建 Ca²⁺（或氯化钙） (2) 引物2和引物3 AluI、HindⅡ (3)乳腺中特异性表达的 (4)不受性别限制，不受年龄限制，产量更高，收集更方便高效 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）图1中过程②是以生长激素mRNA为模板合成DNA的过程，这一过程是逆转录。PCR技术是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，过程③可以利用PCR（聚合酶链式反应）技术大量扩增目的基A。过程④是将目的基因与运载体结合形成重组DNA分子的过程，在基因工程的操作步骤中表示基因表达载体的构建。步骤⑤是将重组DNA分子导入大肠杆菌细胞，常先用Ca²⁺（或氯化钙）处理大肠杆菌，使大肠杆菌细胞处于感受态，易于吸收外源DNA。 （2）引物与模板的3'端结合，图示-OH端是3'端，故扩增目的基因时需要选择的一对引物是2和3；分析图可知，转录方向是向右的，所以A基因在连接图2载体时，上游应该靠近启动子，下游靠近终止子，而图2中不能选EcoRⅠ酶切割质粒，会破坏复制原点，为了防止目的基因的反向连接，所以应该在目的基因上游添加AluⅠ酶识别序列，下游添加HindⅡ酶识别序列。 （3）目的基因要只在乳腺细胞表达，需要在目的基因上游添加乳腺中特异性表达的启动子，即应该把A基因与乳腺中特异性表达的基因的启动子等调控组件重组在一起。 （4）与乳腺生物反应器相比，利用膀胱生物反应器生产人生长激素的优点是不受性别限制，不受年龄限制，产量更高，收集更方便高效。 11．(24-25高二下·广东实验中学·期中)人乳铁蛋白（hLTF）是一种铁结合的糖化球蛋白，在人类乳汁中含量较高，具有抑菌、提高免疫力等重要功能。研究者通过转基因技术培育出了能生产人乳铁蛋白的奶牛，从牛奶中进一步分离提纯出人乳铁蛋白。基因表达载体的构建流程如下图所示，回答下列问题： (1)在培育生产人乳铁蛋白的奶牛的过程中，需要将_______基因为目的基因构建基因表达载体，导入性染色体组成为_______的奶牛受精卵中，再培养成转基因奶牛。 (2)PA质粒中CMV序列是驱动真核生物外源基因表达的启动子，但不适于用来生产人乳铁蛋白的奶牛。为消除其对基因表达的影响，CMV序列在_______与质粒连接的过程中被切除。质粒pW2与pW1碱基对数目的差异可表示为_______的长度。 (3)采用小鼠乳清酸蛋白的启动子和终止子以及目的基因序列构建基因表达载体，可使目的基因在牛乳腺中特异性表达。利用PCR获取启动子和终止子序列，至少需要设计_______种引物。目的基因、小鼠乳清酸蛋白的启动子和终止子序列中均无限制酶识别序列，为了将启动子和终止子剪接到质粒中，可在引物序列中增加一段酶切位点序列。由上图可知，启动子两端增加了________限制酶的识别序列，PCR过程中在第________轮循环后可得到等长的含相应酶切位点的目的基因。 (4)使用上述技术路线所生产转基因奶牛时成功率较低，从基因表达载体的构建过程分析可能的原因是：_______（已知基因调控元件效率较高）。 【答案】(1) 人乳铁蛋白 XX (2) 终止子 终止子序列减去CMV 序列 (3) 4 NruI 和 MluI 3 (4)大片段外源 DNA 在反复酶切、连接及导入时容易出错，导致转基因效率不高 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）在培育生产人乳铁蛋白的奶牛，需要将hLTF基因作为目的基因构建基因表达载体，需要把人乳铁蛋白基因导入雌性(XX)牛受精卵中，才能在其乳腺中表达并分泌到牛乳中。 （2）为消除其对基因表达的影响，CMV序列在NotI和MluI”酶切与质粒连接的过程中被切除。由图可见，pW2是在pW1的基础上去除了CMV 序列，又加入了鼠乳清酸蛋白基因终止子后得到的，二者大小之差正好对应加上终止子、剪去 CMV所增加的碱基数。 （3）利用PCR获取启动子和终止子序列，至少需要设计4种引物。启动子两端分别增加了 “NruI 和 MluI” 限制酶的识别序列。PCR过程中在第3轮循环后可得到等长的含相应酶切位点的目的基因。 （4）上述技术路线所生产转基因奶牛时成功率较低，从基因表达载体的构建过程分析可能的原因是：大片段外源 DNA 在反复酶切、连接及导入时容易出错，导致转基因效率不高。 12．(24-25高二下·广东深圳龙岗区布吉高级中学·期中)研究发现人溶菌酶（hLZ）是天然抗生素替代品。科学家培育出转人溶菌酶基因山羊，以大规模生产人溶菌酶（从乳汁中提取），过程如图所示。其中编号①~⑨表示过程；质粒S中的基因Leu通过控制相关酶的合成来影响亮氨酸的合成（亮氨酸是山羊细胞维持生命活动必不可少的一种氨基酸），基因GFP控制合成绿色荧光蛋白。四种限制酶的切割位点见下表。请回答下列问题： 限制酶 BamHⅠ BglⅡ HindⅢ XbaⅠ 识别序列和切割位点 G↓GATCC A↓GATCT A↓AGCTT T↓CTAGA (1)过程①通过PCR技术扩增物质A，需要的酶是______；过程②利用了两种限制酶的优点是_____（答出一点即可）。 (2)为成功筛选出含重组质粒T的成纤维细胞，质粒S中用作标记基因的是______和______。为达到筛选目的，培养基的营养成分中应不含有_______。将成纤维细胞培养一段时间后观察，筛选出_______（填“显示”或“不显示”）绿色荧光的细胞用于过程⑤。 (3)过程④常用_______法。图中早期胚胎的______（填结构）将发育成转基因羊的各种组织。 【答案】(1) 耐高温的DNA聚合酶 防止载体和目的基因自身环化；防止目的基因和载体反向拼接 (2) 基因Leu 基因GFP 亮氨酸 不显示 (3) 显微注射 内细胞团 【分析】基因工程技术的基本步骤： 1.目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2.基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3.将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 4.目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）过程①通过PCR技术扩增物质A，该过程中由于需要在高温条件下让模板DNA发生解旋，因此需要的酶是耐高温的DNA聚合酶；过程②通常采用采用双酶切法获取目的基因，这样可以避免载体（质粒）和目的基因的自身环化；防止目的基因和载体反向拼接。 （2）为成功筛选出含重组质粒T的成纤维细胞，质粒S中用作标记基因的是基因Leu和基因GFP，但在重组质粒构建过程中GFP基因被破坏，因此，只能用Leu作为标记基因，即含有该基因的细胞可以在不含亮氨酸的培养基上生存，为达到筛选目的，培养基的营养成分中应不含有亮氨酸。将成纤维细胞培养一段时间后观察，筛选出不显示绿色荧光的细胞用于过程⑤。 （3）过程④表示将重组质粒导入受体细胞的过程，常用显微注射法实现，图中的早期胚胎为囊胚，其中的内细胞团将发育成转基因羊的各种组织，在进行胚胎分割时，注意将内细胞团均等分割。 地 城 考点02 PCR流程与差异 一、单选题 1．(23-24高二下·广东广州第八十九中学·期中)人凝血酶Ⅲ是一种分泌蛋白，可预防和治疗急慢性血栓。重组人凝血酶Ⅲ是世界上首个上市的动物乳腺生物反应器生产的重组蛋白药物。下列相关叙述错误的是（　　） A．可从人细胞中提取RNA后通过逆转录获取目的基因 B．目的基因的上游需连接在乳腺细胞中特异表达基因的启动子 C．用显微注射技术将表达载体导入乳腺细胞来获得转基因动物 D．若用大肠杆菌作为受体细胞难以获得活性高的人凝血酶Ⅲ 【答案】C 【分析】利用基因工程技术，还可以让哺乳动物批量生产药物。科学家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物，这称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。目前，科学家已经在牛、山羊等动物乳腺生物反应器中，获得了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和α-抗胰蛋白酶等重要的医药产品。 【详解】A、可从人细胞中提取RNA后利用逆转录PCR技术获取目的基因，此时获得的目的基因没有启动子、终止子等，A正确； B、动物乳腺生物反应器需要使目的基因在乳腺细胞表达，目的基因的上游需连接在乳腺细胞中特异表达基因的启动子，B正确； C、动物受精卵全能性最高，用显微注射技术将表达载体导入受精卵来获得转基因动物，在乳腺细胞表达特定的基因是启动子的作用，并非将目的基因导入乳腺细胞，C错误； D、大肠杆菌是原核生物，不具有加工分泌蛋白的内质网和高尔基体，若用大肠杆菌作为受体细胞难以获得活性高的人凝血酶Ⅲ，D正确。 故选C。 2．(2024高二下·广东省深圳市·期中)噬菌体展示技术（如下图所示）可将某些目标蛋白（如抗体、受体等）呈递至噬菌体表面，便于对目标蛋白进行筛选、鉴定。以下对该技术的分析错误的是（    ） A．外源目的基因都能在噬菌体中获得有效的表达和展示 B．构建噬菌体展示库需要用到限制酶和DNA连接酶等工具 C．构建噬菌体展示库需将目标蛋白基因与噬菌体DNA进行重组并转染细菌 D．通过诱变处理及多轮筛选有可能获得与抗原亲和力更强的抗体及其基因 【答案】A 【分析】噬菌体属于DNA病毒，是由蛋白质外壳和内部遗传物质构成。题中技术的原理是将目标基因与噬菌体DNA重组，并使目标蛋白表达于外壳上，进行筛选和鉴定。 【详解】A、有些真核细胞蛋白质功能的实现需要复杂的生物膜系统进行折叠、组装、加工等，而噬菌体及其宿主细胞细菌结构简单，很难进行有效表达和展示，A错误； B、建立噬菌体展示库需要切割目的基因和病毒载体，然后将二者连接起来，需限制酶和DNA连接酶等，B正确； C、噬菌体专性寄生在大肠杆菌等细菌细胞内，因此可用细菌作为宿主细胞培养噬菌体，C正确； D、诱变的原理是基因突变，具有不定向性，所以通过图中诱变处理及筛选最终可获得与抗原亲和力更强的抗体及其基因，D正确。 故选A。 3．(23-24高二下·广东佛山南海区·期中)水稻根部一般没有根瘤菌，在种植时常需要施加氮肥。科学家想利用基因工程技术将相关基因导入水稻细胞中，建立水稻“小型化肥厂”，让水稻直接固氮，减少使用氮肥的成本以及可能造成的环境污染。下列相关叙述正确的是（    ） A．用PCR仪扩增固氮基因时设置90℃以上变性，72℃左右复性，55℃左右延伸 B．将固氮基因导入水稻细胞可以用农杆菌转化法 C．可用PCR技术检测固氮基因在水稻细胞内是否表达 D．若检测到固氮基因表达产物，即说明转基因固氮水稻培育成功 【答案】B 【分析】PCR技术的原理是DNA的半保留复制，一个循环包括变性、复性、延伸三个过程。 【详解】A、用PCR仪扩增固氮基因时设置90℃以上变性，50℃左右复性，72℃左右延伸，A错误； B、将目的基因导入植物细胞可以用农杆菌转化法和花粉管通道法，B正确； C、检测固氮基因在水稻细胞内是否表达应用抗原-抗体杂交的方法，C错误； D、若检测到固氮基因表达产物不一定能够固氮，若要检测转基因固氮水稻是否培育成功，应将种子种于缺氮的培养液，若无缺乏症，则可证明转基因成功，D错误。 故选B。 4．(23-24高二下·广东惠州惠东县·期中)用限制酶Spe Ⅰ和Hind Ⅲ切割质粒，用限制酶Hind Ⅲ和Xba Ⅰ切割目的基因，之后连接，构建基因表达载体。下列叙述错误的是（    ） 限制酶 Spe I Hind Ⅲ Xba I 识别序列             A．若该质粒导入微生物中可用感受态转化法 B．构建的基因表达载体除图示组成外，还需有启动子和终止子 C．表中限制酶的种类不能将目的基因剪切并插入质粒中 D．利用PCR技术获取目的基因时，引物的延伸方向是从5’端到3’端 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、若该质粒导入微生物中可用Ca2+处理使其成为感受态，容易吸收周围的DNA分子，A正确； B、构建的基因表达载体除图示抗性基因、复制原点和目的基因外，还需有启动子和终止子，B正确； C、Spe I和Xba I切割后的黏性末端相同，因此可将质粒用Spe I和Hind Ⅲ切割，目的基因用Xba I和Hind Ⅲ切割，并用DNA连接酶连接形成重组DNA，C错误； D、利用PCR技术获取目的基因时，引物的延伸方向是从5’端到3’端，D正确。 故选C。 5．(23-24高二下·广东肇庆封开县江口中学·期中)研究人员仿照制备乳腺生物反应器的思路，制备了一种膀胱生物反应器，用其获得人体特殊功能蛋白W的基本过程如下图所示。下列有关叙述正确的是（　　） A．步骤①和步骤③所代表的操作分别是显微注射、胚胎移植 B．步骤③时一般选择发育良好、形态正常的桑葚胚或原肠胚 C．用促性腺激素对供体雌性动物及代孕母体进行同期发情处理 D．膀胱生物反应器将会受到转基因动物的性别和年龄的限制 【答案】A 【分析】动物乳腺生物反应器是基于转基因技术，使外源基因导入动物基因组中并定位表达于动物乳腺，利用动物乳腺天然、高效合成并分泌蛋白的能力，在动物的乳汁中生产一些具有重要价值产品的转基因动物的总称。动物乳腺生物反应器选择的宿主细胞是雌性个体。 【详解】A、①表示将基因表达载体通过显微注射法导入受精卵，②表示早期胚胎培养，③表示胚胎移植，A正确； B、步骤③属于胚胎移植，一般选择发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚，原肠胚不适合移植，B错误； C、用雌激素对供体雌性动物及代孕母体进行同期发情处理，C错误； D、膀胱生物反应器与转基因动物的年龄相关，但与性别无关，不同性别的生物都有膀胱，D错误。 故选A。 二、解答题 6．(24-25高二下·广东肇庆第六中学·期中)B基因存在于水稻基因组中，该基因可在体细胞和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，科学家设计并完成了如下实验来获取能够在卵细胞中表达B基因的转基因植株。请回答下列问题： 注：Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光 (1)从水稻体细胞中提取总RNA，在_____酶的催化下构建cDNA文库，进而获得B基因编码蛋白的序列；再与Luc基因组装成融合基因。 (2)融合基因必须连接到T-DNA中的启动子和终止子之间，其中启动子是_____识别并结合的位点。表达载体中卡那霉素抗性基因的作用是_____。 (3)过程①常对农杆菌进行_____溶液处理，使其处于能_____的生理状态。若借助Luc基因的表达产物来完成图中第二次鉴定筛选，则筛选的具体方法是_____。 (4)从转基因水稻植株的未成熟种子中分离出胚，观察到其细胞内仅含一个染色体组，科学家据此判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的。已知正常情形下的水稻卵细胞在未受精时，不能继续发育形成胚；由此说明B基因的表达能使卵细胞_____。实验结果发现该转基因水稻产生的所有卵细胞并不都含有B基因，出现该结果的可能原因是_____。 【答案】(1)逆转录 (2) RNA聚合酶 作为标记基因，检测B-Luc融合基因是否成功导入（农杆菌） (3) Ca2+/CaCl2/钙离子/氯化钙 吸收周围环境中的DNA分子 检测加入荧光素的水稻幼苗细胞中是否发出荧光 (4) 不经受精而直接发育成胚 B基因仅整合水稻的一条染色体上，因此减数分裂形成的卵细胞中仅有部分卵细胞含有B基因（或转基因水稻形成卵细胞的过程中B基因发生了突变或丢失） 【分析】1、基因工程的基本操作步骤包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 2、基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、 DNA 连接酶、运载体。 3、基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 【详解】（1）从水稻的体细胞中提取 RNA ，通过逆转录产生DNA，从而构建cDNA文库，该过程需要逆转录酶的催化，进而获得B基因编码蛋白的序列。 （2）启动子是启动转录的序列，含有RNA聚合酶的结合位点。标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，图中卡那霉素抗性基因的作用是作为标记基因，检测B-Luc融合基因是否导入农杆菌细胞。 （3）由图可知，过程①为农杆菌转化法，是将目的基因导入受体细胞中的常用方法，常对农杆菌进行CaCl2处理成感受态细胞，即容易吸收周围环境中DNA分子的状态，便于转化。B 基因与 Luc 基因连接形成 B-Luc融合基因，即可通过 Luc 基因表达，故借助Luc基因的表达产物来完成图中第二次鉴定筛选，则具体方法是检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光。 （4）转基因植株含有促进 B 基因在卵细胞转录的启动子，推测转基因植株分离出的只含一个染色体组的胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而非转基因水稻卵细胞中 B 基因不能转录，卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明 B 基因表达能使卵细胞不经受精作用直接发育成胚。实验结果发现该转基因水稻产生的所有卵细胞并不都含有B基因，出现该结果的可能原因是B基因仅整合水稻的一条染色体上，因此减数分裂形成的卵细胞中仅有部分卵细胞含有B基因（或转基因水稻形成卵细胞的过程中B基因发生了突变或丢失）。 7．(24-25高二下·广东·期中)某种遗传物质缺陷型模型鼠有较高的科研价值，但自然繁殖率较低，科研人员利用该模型鼠的体细胞转化获得诱导iPS细胞，进而对该模型鼠进行克隆，相关流程如下图所示。请回答下列问题： (1)图中②过程运用了显微注射技术，请列举生物学中运用了显微注射技术的其他操作：_______（答出1点即可）。 (2)从灰鼠的________（填“输卵管”或“子宫”）内可获得双细胞胚，作此判断的依据是_______。 (3)囊胚的内细胞团将来可以发育成胎儿的________。图示克隆仔鼠的体色为________。经③过程后，重构胚会在代孕白鼠的子宫内孵化，孵化指的是_______。 【答案】(1)核移植过程中，将供体细胞（核）导入去核的卵母细胞；基因工程中，将目的基因导入动物细胞等（答出任意1点即可） (2) 输卵管 输卵管是受精的场所，也是受精卵最初发育的场所，而受精卵最先发育成双细胞胚 (3) 各种组织 黑色 囊胚进一步扩大，会导致透明带破裂，胚胎从其中伸展出来 【分析】1、科学家通过体外诱导小鼠成纤细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，将它称为多能干细胞（简称iPS细胞）。 2、题图分析：分析图中操作过程，内细胞团细胞被iPS细胞取代，最终形成的克隆仔鼠细胞核来源于黑鼠，其遗传特性与黑鼠相同。 【详解】（1）图中②过程运用了显微注射技术，运用了显微注射技术的实例还有核移植过程中，将供体细胞（核）导入去核的卵母细胞；基因工程中，将目的基因导入动物细胞等。 （2）输卵管是受精的场所，也是受精卵最初发育的场所，受精卵最先发育成双细胞胚，所以从灰鼠的输卵管内可获得双细胞胚。 （3）囊胚的内细胞团可以发育成胎儿的各种组织。图中克隆仔鼠的体色与提供成纤维细胞的黑鼠体色相同。囊胚进一步扩大，会导致透明带破裂，胚胎从其中伸展出来，这一过程称为孵化。 8．(24-25高二下·广东深圳新安中学（集团）高中部·期中)土壤重金属污染会对人类健康造成危害，是严重的环境问题。利用基因工程手段构建重金属富集植物是修复土壤重金属污染的重要方向之一。景天科植物伴矿景天是一种镉富集生物，研究人员将伴矿景天的SpHMA2基因（简称S基因）转入油菜，获得了镉富集转基因油菜。 (1)提取伴矿景天DNA，经PCR扩增S基因，利用凝胶电泳对扩增片段进行鉴定，得到了图1所示的结果（1号泳道为样品，2号泳道为阴性对照）。由于DNA分子片段带负电荷，所以电泳开始前应将_______（正/负）电极插在凝胶板上靠近DNA样品的一端。根据图所示电泳结果，S基因长约________bp，回收S基因。 (2)将S基因导入植物受体细胞常用的方法是农杆菌转化法，因为农杆菌中含有________结构，将构建的农杆菌与野生型油菜外植体共培养，再通过________技术获得转基因油菜植株，该过程中_________两种植物激素的浓度比起着重要作用。 (3)为检测转基因油菜的镉富集能力，将野生型油菜（WT）和三个株系的转基因油菜（S1、S2、S3）种植于含200μM氯化镉的培养液中，10天后分别测定各油菜的镉含量，得到了图2所示的结果（*表示存在显著性差异），该结果说明_________。 (4)科研人员利用人工智能辅助蛋白质结构预测，鉴定得到多种S蛋白，并对其进行改造，获得了镉富集能力更强的S蛋白，请完善下列技术或合成流程：新型S蛋白结构→ ________→新型S蛋白。 【答案】(1) 负 3000 (2) Ti质粒 植物组织培养 细胞分裂素、生长素 (3)与野生型油菜相比，转基因油菜镉富集能力明显提高，且S2株富集能力最强 (4)新型S蛋白氨基酸序列→新型S蛋白基因序列→在受体细胞中转录翻译→ 【分析】PCR扩增：目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此循环多次。 【详解】（1）电泳过程中，在电场的作用下，带电离子会向着与它所带电荷相反的电极移动，由于DNA分子片段带负电荷，所以电泳开始前应将负电极插在凝胶板上靠近DNA样品的一端，然后向正极移动。1号泳道为样品，依据图示电泳结果，S基因长约3000bp，回收S基因。 （2）将S基因导入植物受体细胞常用的方法是农杆菌转化法，因为农杆菌中含有Ti质粒，将构建的农杆菌与野生型油菜外植体共培养，再通过植物组织培养技术获得转基因油菜植株，该过程中生长素和细胞分裂素的浓度比起着重要作用。 （3）依据图2可知，三个株系的转基因油菜（S1、S2、S3）种植于含200μM氯化镉的培养液中，10天后分别测定各油菜的镉含量都比野生型油菜（WT）高，且S2株的含量最多，说明转基因油菜镉富集能力明显提高，且S2株的富集能力相对最强。 （4）蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需要。所以为获得镉富集能力更强的S蛋白，具体流程应为：新型S蛋白结构新型S蛋白氨基酸序列→新型S蛋白基因序列→在受体细胞中转录翻译→新型S蛋白。 9．(24-25高二下·广东广州执信中学·期中)人工开发的智能工程菌可用于简化疾病诊断和精准用药，某慢性疾病会使患者肠道内产生物质S，且生成量与疾病严重程度正相关，科研人员将抗炎蛋白基因与物质S特异性诱导激活的启动子P、终止子等组件连接构成重组基因（如图一），再与图二所示载体连接，构建表达载体。然后其导入大肠杆菌，筛选得到菌株E，饲喂菌株E的患病模型小鼠症状明显缓解。回答下列问题： (1)利用PCR获取抗炎蛋白基因时，需要加入引物，其作用是________；在进行PCR扩增过程中，________阶段温度最高，其目的为________。 (2)先将抗炎蛋白基因插入如图二所示Kanr基因内的sacⅡ位点，抗炎蛋白基因的终止子尾端有一个pstⅠ的酶切位点。为确认抗炎蛋白基因的大小和插入方向，科研人员用限制酶pstⅠ切割重组质粒并进行电泳，结果出现了4.8kb和0.8kb两个片段。据图分析，抗炎蛋白重组基因长度约为________kb；抗炎蛋白基因插入后转录方向与Kanr基因________（填“相同”或“相反”）。 (3)将图一重组基因导入大肠杆菌前，需要用________处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中的DNA分子的生理状态。为筛选转化成功的工程菌，可将大肠杆菌分别接种到青霉素和卡那霉素培养基中，转化成功的菌株E对两种抗生素的抗性情况为________。 (4)该工程菌之所以被称为智能工程菌，从抗炎蛋白基因表达的角度分析，原因可能是________。 【答案】(1) 使DNA聚合酶（Taq酶）能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 变性 破坏双链之间的氢键，使DNA解链变为单链 (2) 2.6 相反 (3) Ca2+ 抗氨苄青霉素，不抗卡那霉素 (4)启动子P仅在该疾病发生时，患者肠道内产生物质S才表达抗炎蛋白，精准治疗疾病 【分析】基因工程的基本操作程序： （1）第一步：目的基因的筛选与获取。 （2）第二步：基因表达载体的构建（核心）。①目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。②组成：启动子+目的基因+终止子+标记基因。       （3）第三步：将目的基因导入受体细胞。            ①转化的概念：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。              ②将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法、花粉管通道法等。            ③将目的基因导入动物细胞的方法：最常用的方法是显微注射技术，方法的受体细胞多是受精卵。              ④将目的基因导入细菌：感受态细胞法：用钙离子处理细胞使细胞处于一种能吸收周围环境DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。        （4）第四步：目的基因的检测与鉴定。              ①首先，要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用PCR或DNA分子杂交技术。             ②其次，还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是采用RT-PCR或分子杂交（DNA-RNA）技术。              ③最后，检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原-抗体杂交技术。 【详解】（1）用PCR技术扩增目的基因时，需要在PCR扩增仪中加入2种引物，其作用是使DNA聚合酶（Taq酶），从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，一开始的变性阶段，利用DNA高温变性的特点加热至90-95℃，破坏双链之间的氢键，使DNA解链变为单链。 （2）由题意可知，加入目的基因后大小为4.8kb+0.8kb=5.6kb，载体大小为3kb，所以抗炎蛋白重组基因长度约为5.6-3=2.6kb。如果插入目的基因与Kanr基因转录方向相同，则两个pstⅠ位点之间大小大于2.6kb，加上载体3kb，与题意不符，所以插入目的基因与Kanr基因转录方向相反。 （3）重组基因导入大肠杆菌前，需要用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中的DNA分子的生理状态。由图可知，卡那霉素基因已经被破坏，所以重组菌株不能在含卡那霉素的培养基生长，但可在含氨苄青霉素的培养基培养。 （4） 构建表达载体时选用抗炎蛋白基因与物质S特异性诱导激活的启动子P，是因为启动子P仅在该疾病发生时，患者肠道内产生物质S时才表达抗炎蛋白且能精准治疗疾病。 10．(24-25高二下·广东佛山S6高质量发展联盟·期中)在植物基因工程中，抗除草剂基因是常用的标记基因之一、但抗除草剂基因存在于转基因植物体内可能会造成生物安全问题。目前科研人员利用Cre/LoxP位点特异性重组系统来解决这一问题，该系统可以在确定目的基因导入成功后，删除转基因植物细胞内的抗除草剂基因，原理如下图：    注：①LoxP是具有特异性序列的小DNA片段，自身不表达，也不影响其他基因表达。②Cre酶特异性识别LoxP上的序列并切开LoxP。③启动子1只能在植物细胞中起作用（具有特种特异性）。 回答下列问题： (1)据图分析，目的基因转录时，_____（填“启动子1”、“启动子2”或“启动子3”）是RNA聚合酶识别、结合的位点。 (2)抗除草剂基因作为标记基因，可以鉴定和选择重组DNA的原因是_____。 (3)Cre酶可以切开LoxP，其功能类似于基因工程中的_____酶。经Cre酶处理后，抗除草剂基因即使存在植物体内也不再表达的原因是_____。 (4)利用农杆菌将图中所示的重组载体导入植物细胞，农杆菌内重组载体上的抗除草剂基因会不会被删除？_____（填“会”或“不会”），原因是_____。 【答案】(1)启动子2 (2)抗除草剂基因和目的基因在同一个质粒上，导入了抗除草剂基因的受体细胞能在含有除草剂的培养液中生长，没有导入抗除草剂基因的受体细胞则会死亡 (3) 限制 抗除草剂基因与其启动子分离，无法驱动基因转录 (4) 不会 启动子1有物种特异性，农杆菌内无Cre酶 【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）启动子是启动自己所关联基因片段的转录，具有方向性。在载体图谱上，启动子指向的基因片段即为该启动子关联基因，所以据题干图示，是启动子2启动了目的基因的转录。即目的基因转录时，启动子2是RNA聚合酶识别、结合的位点。 （2）抗除草剂基因作为标记基因，其功能是鉴定和选择重组DNA。若受体细胞在含有除草剂的培养液中能生长，即可知抗除草剂基因已进入受体细胞。因为目的基因与抗除草剂基因在同一个DNA分子上（重组载体），抗除草剂基因已进入受体细胞，所以目的基因应该也进入了受体细胞，而没有导入抗除草剂基因的受体细胞在含有除草剂的培养液中则会死亡。 （3）Cre酶特异性识别LoxP序列、且在LoxP序列的特定位点切开，跟限制酶的功能是一样的。根据图示，Cre酶在LoxP序列的特定位点切开后，启动子3与抗除草剂基因分离，“不再表达的原因”就是没有启动子，无法驱动基因转录。 （4）启动子1具有物种特异性，所以在农杆菌内，图示重组基因表达载体中的Cre酶基因不会表达产生Cre酶，没有Cre酶存在于农杆菌内，抗除草剂基因不会被删除。 11．(2024高二下·广东省深圳市·期中)B基因存在于水稻基因组中，该基因可在体细胞和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，科学家设计并完成了如下实验来获取能够在卵细胞中表达B基因的转基因植株。请回答下列问题： 注：Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光 (1)从水稻体细胞中提取总RNA，在_____酶的催化下构建cDNA文库，进而获得B基因编码蛋白的序列；再与Luc基因组装成融合基因，构建B-Luc融合基因需要的工具酶有_____。 (2)融合基因必须连接到T-DNA中的启动子和终止子之间，其中启动子是_____识别并结合的位点。表达载体中卡那霉素抗性基因的作用是_____。 (3)过程①常对农杆菌进行_____溶液处理，使其处于能_____的生理状态。若借助Luc基因的表达产物来完成图中第二次鉴定筛选，则筛选的具体方法是_____。 (4)从转基因水稻植株的未成熟种子中分离出胚，观察到其细胞内仅含一个染色体组，科学家据此判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的。已知正常情形下的水稻卵细胞在未受精时，不能继续发育形成胚；由此说明B基因的表达能使卵细胞_____。实验结果发现该转基因水稻产生的所有卵细胞并不都含有B基因，出现该结果的可能原因是_____。 【答案】(1) 逆转录 限制酶、DNA连接酶 (2) RNA聚合酶 作为标记基因，检测B-Luc融合基因是否成功导入（农杆菌） (3) Ca2＋/CaCl2/钙离子/氯化钙 吸收周围环境中的DNA分子 检测加入荧光素的水稻幼苗细胞中是否发出荧光 (4) 不经受精而直接发育成胚 B基因仅整合水稻的一条染色体上，因此减数分裂形成的卵细胞中仅有部分卵细胞含有B基因（或转基因水稻形成卵细胞的过程中B基因发生了突变或丢失） 【分析】基因工程的基本操作步骤包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、 DNA 连接酶、运载体。基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 【详解】（1）从水稻的体细胞中提取 RNA ，通过逆转录产生 DNA ，从而构建 cDNA 文库，该过程需要逆转录酶的催化，进而获得 B 基因编码蛋白的序列。在构建重组表达载体时，即B-Luc融合基因形成过程中，重组常用的工具酶有限制酶和 DNA 连接酶。 （2）启动子是启动转录的序列，含有RNA聚合酶的结合位点。标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，图中卡那霉素抗性基因的作用是作为标记基因，检测B-Luc融合基因是否导入农杆菌细胞。 （3）由图可知，过程①为农杆菌转化法，是将目的基因导入受体细胞中的常用方法，常对农杆菌进行CaCl2处理成感受态细胞，即容易吸收周围环境中DNA分子的状态，便于转化。B 基因与 Luc 基因连接形成 B-Luc融合基因，即可通过 Luc 基因表达，故借助Luc基因的表达产物来完成图中第二次鉴定筛选，则具体方法是检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光。 （4）转基因植株含有促进 B 基因在卵细胞转录的启动子，推测转基因植株分离出的只含一个染色体组的胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而非转基因水稻卵细胞中 B 基因不能转录，卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明 B 基因表达能使卵细胞不经受精作用直接发育成胚。实验结果发现该转基因水稻产生的所有卵细胞并不都含有B基因，出现该结果的可能原因是B基因仅整合水稻的一条染色体上，因此减数分裂形成的卵细胞中仅有部分卵细胞含有B基因（或转基因水稻形成卵细胞的过程中B基因发生了突变或丢失）。 12．(23-24高二下·广东六校联考·期中)肝纤维化与肝细胞癌的发生密切相关，肝纤维化是指肝细胞外基质的病理性沉积，沉积物中I型胶原蛋白是主要成分。研究发现活化的人肝星状细胞会大量合成和分泌I型胶原蛋白沉积在肝小叶的窦间隙，大量产生I型胶原蛋白是肝星状细胞活化的标志之一。I型胶原蛋白由α1和α2两条肽链组成，并分别由COL1Al和COLIA2编码。本研究旨在通过基因工程技术用人COLIA1启动子序列调控增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的表达，在LX-2细胞（永生化的人肝星状细胞）中建立一个人肝星状细胞活化的可视化报告系统。 (1)研究过程中应将LX-2细胞置于含______的气体条件下培养。 (2)研究人员构建了如图1所示的基因表达载体，其中Kozak序列能增强EGFP基因的表达，已知EGFP基因的α链为转录的模板链，则应将图2中EGFP基因的______（“A”或“B”）端与Kozak序列连接，除图1中所示元件外，基因表达载体还应具备______（至少答两点）等元件。    (3)使用慢病毒包装系统将基因表达载体导入LX-2细胞中，并筛选得到了荧光强度最强的细胞株（LX-2-CE）进行扩大培养用于后续研究。为验证LX-2-CE能通过EGFP表达来反映细胞表达COLIA1能力的改变，本研究选取了已知具有潜在抗肝纤维化作用的药物青蒿琥酯对LX-2-CB进行处理。实验分组中，阴性对照组为______，阳性对照组为加10μg/L的TGF-β1诱导处理的LX-2-CE，实验组为加入不同浓度青蒿琥酯与10μg/L的TGF-β1共处理的LX-2-CE。实验结束后，对各组LX-2-CE进行荧光检测。若实验组的荧光强度均_____（“低于”或“高于”）阳性对照组的荧光强度，说明LX-2-CE荧光强度的改变可以反应青蒿琥酯的潜在抗肝纤维化作用。实验中10μg/L的1TGF-β1的作用是______。 (4)系列实验结果表明，外源性COLIA1启动子调控的EGFP的表达能在一定程度上反映内源性COL1Al启动子调控的COLIA1的表达水平的变化。请你推测该人肝星状细胞活化的可视报告系统建立的意义是______。 【答案】(1)95%空气和5%CO2 (2) B 复制原点、标记基因、终止子等 (3) 无诱导处理的LX-2-CE 低于 活化LX-2-CE，模拟人肝纤维化 (4)为抗肝纤维化药物的研究提供新的细胞模型 【分析】1、动物细胞培养需要营养、无菌无毒条件、适宜温度、渗透压、pH，95%空气和5%  CO2等条件。 2、基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。重组质粒应具备目的基因、启动子、终止子、复制远点、标记基因等结构。 【详解】（1）LX-2细胞为动物细胞，动物细胞培养的气体条件为95%空气和5%CO2，其中O2是细胞代谢所必需的，O2的作用是供细胞呼吸利用。 （2）基因表达载体所需要的工具酶为限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶，启动子在基因的上游，紧挨转录的起始位点， α链为转录的模板链，该链在启动子及Kozak序列后的方向应为3'→5'，因此EGFP基因的B端与Kozak序列连接，基因表达载体应具备目的基因、启动子、复制原点、标记基因、终止子等结构。 （3）由于阳性对照组为加10μg/L的TGF-β1诱导处理的LX-2-CE，阴性对照应为无TGF-β1诱导处理的LX-2-CE，基因工程检测基因是否转录出mRNA应该用DNA分子杂交的方法，检测基因是否翻译出蛋白质应该用抗原—抗体杂交技术。根据实验设计分析可知，10 μg/L的TGF-β1可以活化LX-2-CE，模拟人肝纤维化，同时若LX-2-CE荧光强度的改变可以反应青蒿琥酯的潜在抗肝纤维化作用，则实验组的荧光强度应该低于阳性对照组的荧光强度。 （4）根据题干可知该人肝星状细胞活化的可视报告系统建立的意义是为抗肝纤维化药物的研究提供新的细胞模型。 13．(23-24高二下·广东肇庆第一中学·期中)B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞（2N）和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。 (1)B基因在水稻卵细胞中不转录，推测其可能的原因是卵细胞中______。 A．含B基因的染色体缺失 B．DNA聚合酶失活 C．B基因发生基因突变 D．B基因的启动子无法启动转录 (2)从水稻体细胞或______中提取总RNA，构建cDNA文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因（表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光）连接成融合基因（表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能），然后构建重组表达载体。 (3)在过程①、②转化筛选时，过程______中T-DNA整合到受体细胞染色体DNA上，过程______在培养基中应加入卡那霉素。图中基因表达载体构建与转化的过程中，目标基因共经过______次拼接。 (4)从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明______。 【答案】(1)D (2)精子 (3) ② ① 3 (4)B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）A、通过题干信息可知，B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞（2N）和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录，说明含B基因的染色体未缺失，A错误； B、基因表达过程中的转录需要RNA聚合酶，不是DNA聚合酶，B错误； C、通过题干信息可知，B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞（2N）和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录，说明含B基因没有发生突变，C错误； D、B基因在卵细胞中不能转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中不能启动转录，D正确。 故选D。 （2）通过题干信息可知，水稻的体细胞和精子中B基因可表达，故可从水稻的体细胞和精子中提取RNA。通过逆转录产生DNA，从而构建cDNA文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。 （3）图示中过程①表示筛选含有目的基因的重组质粒的农杆菌，图示中质粒有抗卡那霉素标记基因和抗潮霉素标记基因，如果选择培养基中加入的是卡那霉素，起作用的是抗卡那霉素标记基因；过程②表示用含有重组质粒的农杆菌转化水稻细胞的过程，该过程将其T-DNA整合到水稻细胞染色体DNA上；图中基因表达载体构建与转化的过程中，目的基因和Luc基因拼接，再和Ti质粒结合，最后整合到宿主细胞的染色体上，故共有3次拼接。 （4）转基因植株含有促进B基因在卵细胞转录的启动子，推测转基因植株分离出的只含一个染色体组的胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而非转基因水稻卵细胞中B基因不能转录，卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明B基因表达能使卵细胞不经受精作用直接发育成胚。 三、实验题 14．(23-24高二下·广东广州第八十九中学·期中)某病毒B对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。请回答： (1)过程①一般采用____法将基因A导入工程菌内。过程②基因A能在工程菌内表达产生蛋白A的原因是____。 (2)过程③处理的目的是____。过程⑤常用____诱导细胞融合。 (3)图中经筛选1得到的杂交瘤细胞具有的特点是____，筛选2的方法是____。 (4)为了得到大量的抗病毒B的单克隆抗体，可将杂交瘤细胞接种到适宜的动物细胞培养液中进行培养，但杂交瘤细胞的接种量会影响单克隆抗体的产量。为了探究培养液中杂交瘤细胞的最佳接种量，请写出实验思路：____。 【答案】(1) 感受态细胞 生物共用一套遗传密码 (2) 将蛋白A注射到小鼠体内，使之发生免疫反应 灭活病毒诱导法、PEG融合法、电融合法 (3) 既能大量增殖，又能产生足够数量的抗体 抗体检测 (4)将适宜的动物细胞培养液分为体积相同的若干组，在不同组中接种不同量的杂交瘤细胞，一定且相同时间后测定各培养液中的相应抗体含量 【分析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。 【详解】（1）将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。即过程①一般采用感受态细胞法将基因A导入工程菌内。因为生物共用一套遗传密码，所以基因A能在工程菌内表达产生蛋白A。 （2）过程③将蛋白A注射到小鼠体内，使之发生免疫反应；过程⑤诱导动物细胞融合的常用方法有灭活病毒诱导法、PEG融合法、电融合法。 （3）筛选1得到的杂交瘤细胞具有的特点是既能大量增殖，又能产生足够数量的抗体。筛选2的方法是抗体检测，所依据的基本原理是抗原与抗体的反应具有特异性。 （4）为了探究培养液中杂交瘤细胞的最佳接种量，则实验的自变量是杂交瘤细胞的接种量，因变量是抗体的含量，则实验思路如下：将适宜的动物细胞培养液分为体积相同的若干组，在不同组中接种不同量的杂交瘤细胞，一定且相同时间后测定各培养液中的相应抗体含量。 地 城 考点03 载体构建与检测 一、单选题 1．(24-25高二下·广东肇庆端州中学·期中)小麦和水稻是我国主要粮食作物，其中赖氨酸含量很低，科研人员通过以下操作，将辣椒中的含赖氨酸较高的某蛋白基因转入小麦，流程如下图。下列叙述正确的是（　　） A．逆转录合成DNA的过程需要DNA聚合酶催化 B．通过逆转录获得的cDNA有多种 C．目的基因直接导入小麦就能表达高赖氨酸蛋白 D．T0代转基因植株一定可培育出纯合含高赖氨酸蛋白的植株 【答案】B 【详解】A、逆转录是RNA→DNA的过程，该过程合成DNA的过程需要逆转录酶来催化，A错误； B、逆转录是以RNA为模板，在逆转录酶催化作用下合成DNA的过程，因此可能会得到多种cDNA，B正确； C、目的基因需要与载体结合构建基因表达载体才能导入小麦细胞，C错误； D、T0代转基因植株不一定能培育出纯合含高赖氨酸蛋白的植株，还需要经过分子水平和个体水平的检测，D错误。 故选B。 2．(24-25高二下·广东肇庆端州中学·期中)基因工程会用到多种限制酶，下列为部分限制酶的识别序列和酶切位点及其在某质粒上的酶切位点。下列叙述错误的是（　　） A．Sau3AⅠ可切割BamHⅠ和Bcl Ⅰ的识别序列，其具有专一性 B．质粒被BamHⅠ和Bcl Ⅰ切割后，并在DNA连接酶的作用下，会发生环化 C．构建重组质粒时，切割该质粒的限制酶只能是BamHⅠ D．分别用Sau3AⅠ和BamHⅠ切割目的基因和质粒，形成的重组质粒能被Sau3A Ⅰ切成4个片段 【答案】D 【详解】A、Sau3AⅠ可切割BamHⅠ和BclⅠ的识别序列，但其仍是识别特定的序列进行切割，具有专一性，A正确； B、BamHⅠ和BclⅠ切割质粒后，会切出相同且互补的黏性末端，加入DNA连接酶其会发生环化，B正确； C、构建重组质粒时，目的基因要插入在启动子和终止子之间，则可选择BamHⅠ、Sau3AⅠ和HindⅢ三种限制酶，切割该质粒的限制酶如果用Sau3AⅠ则会在质粒上切出多个切口，如果用HindⅢ则会切坏X抗生素的抗性基因，所以只能用BamHⅠ，C正确； D、用Sau3AⅠ切割目的基因，用BamHⅠ切割质粒，则重组质粒能被Sau3AⅠ酶切成5个片段，D错误。 故选D。 3．(24-25高二下·广东佛山S6高质量发展联盟·期中)我国科学家成功地将与植物花青素代谢相关的基因（An）导入矮牵牛中，使其花朵呈现出自然界没有的颜色变异，大大提高了其观赏价值。如图为An基因两端的序列和质粒中相关的序列，已知限制酶I的识别序列和切点是-G↓GATCC-，限制酶II的识别序列和切点是-↓GATC-。下列相关叙述错误的是（    ）    A．构建基因表达载体时需要使用限制酶I切割质粒 B．新品种矮牵牛所呈现的颜色变异来源于基因重组 C．An基因在矮牵牛植株的花朵中特异性表达 D．应将启动子、终止子和复制原点分别添加至GeneI、II的上游或下游 【答案】D 【分析】基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、由题可知，限制酶I的识别序列和切点是-G↓GATCC，限制酶II的识别序列和切点是-↓GATC，限制酶II能识别并切割限制酶I的识别序列，若用限制酶II切割质粒，会破坏质粒上的两个标记基因，没有标记基因会影响重组DNA的筛选，所以切割质粒时，只能用限制酶I，A正确； B、由题可知，我国科学家成功地将与植物花青素代谢相关的基因（An）导入矮牵牛中，属于转基因技术，因此新品种矮牵牛所呈现的颜色变异来源于基因重组，B正确； C、An基因能使矮牵牛其花朵呈现出自然界没有的颜色变异，基因具有选择性表达的特性，因此An基因在矮牵牛植株的花朵中特异性表达，C正确； D、质粒作为运载体，原本存在启动子和终止子，无需添加启动子、终止子等，D错误。 故选D。 4．(24-25高二下·广东肇庆衡立高级中学·期中)图甲、图乙分别表示质粒和外源DNA，其中箭头表示相关限制酶的酶切位点，下列叙述正确的是（　　） A．用质粒和外源DNA构建重组质粒过程中，不能使用SmaⅠ切割 B．用EcoRⅠ、Hind Ⅲ和BamHⅠ中的任意一种酶切割质粒和外源基因都可以 C．为获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入DNA聚合酶 D．图甲所示的质粒分子在经SmaⅠ切割后含有4个游离的磷酸基团 【答案】A 【分析】分析图解：在质粒上存在Sma I、EcoR I、HindⅢ和BamH I等四个酶切位点，但是Sma I的切割位点就在抗生素抗性基因上，该基因为载体的标记基因，因此不可用。在目的基因上，Sma I、EcoR I、HindⅢ和BamH I四种酶也存在酶切位点，若单独使用一种酶的情况下，只有EcoR I具有两个酶切位点，能切割完整的基因。 【详解】A、据图分析，质粒中，SmaI的切割位点位于标记基因（抗生素抗性基因）上，在外源DNA分子中，SmaⅠ的切割位点位于目的基因上，因此用质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，A正确； B、只使用EcoRⅠ，则质粒和目的基因两端的黏性末端相同，用连接酶连接时，会产生质粒和目的基因自身连接物，而利用BamHⅠ或HindⅢ剪切时，在目的基因上只有一个酶切位点，因此不能切割目的基因，B错误； C、为获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入DNA连接酶，C错误； D、图甲所示的质粒分子只有一个SmaⅠ切割位点，所以在经SmaⅠ酶切割后含有2个游离的磷酸基团，D错误。 故选A。 5．(23-24高二下·广东肇庆第一中学·期中)限制酶 MunⅠ和限制酶 EcoRⅠ的识别序列及其切割位点分别如下：—C↓AATTG—和—G↓AATTC—如图表示某目的基因片段与质粒拼接形成重组质粒过程，下列叙述错误的是（　　） A．用限制酶 EcoRⅠ切割目的基因，同时用限制酶 MunⅠ切割质粒 B．构建重组质粒时，会形成不止一种脱氧核苷酸序列（考虑DNA片段两两连接） C．将重组质粒同时用以上2种限制酶切割则会再形成1种长度的 DNA 片段 D．标记基因一般是抗生素抗性基因或荧光标记基因，便于目的基因的筛选 【答案】D 【分析】分析题图：图中质粒上存在两个限制酶的切割位点，而限制酶EcoRⅠ的识别序列存在于标记基因中，使用该种限制酶会导致标记基因失活，因此应选择限制酶MunⅠ切割质粒；目的基因两侧是限制酶EcoRⅠ的识别序列，因此选用限制酶EcoRⅠ切割外源DNA获得目的基因。 【详解】A、由图可知，目的基因两侧都是限制酶EcoRⅠ的切割位点，因此应选用限制酶EcoRⅠ切割含有目的基因的外源DNA分子，质粒中含有限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的切割位点，但EcoRⅠ的切割位点位于标记基因中，用其切割会破坏标记基因，因此为保证重组质粒表达载体的准确构建，应选用限制酶MunⅠ切割质粒，A正确； B、DNA拼接时最多考虑DNA片段两两连接时，可能形成不拼接两种核苷酸序列，目的基因与目的基因同方向拼接和不同方向拼接两种，质粒与质粒同方向拼接和不同方向拼接两种，质粒与目的基因同方向拼接和不同方向拼接两种，共8种，B正确； C、限制酶MunⅠ切割质粒后与目的基因连接形成重组质粒，连接处形成—CAATTC—和—GAATTG—的新序列，都不能被 2 种限制酶识别、切割，但EcoRⅠ能识别标记基因的相应序列并切割， 使环状重组质粒断裂形成1种长度的DNA片段，C正确； D、标记基因一般是抗生素抗性基因或荧光标记基因，便于目的基因的筛选，D错误。 故选D。 6．(23-24高二下·广东肇庆封开县江口中学·期中)科学家创造了“基因敲除”技术：将外源基因整合到小鼠胚胎干细胞的DNA同源序列中，使某一个基因被取代或破坏而失活，然后将修饰后的胚胎干细胞植入小鼠的早期胚胎，形成嵌合体小鼠。科学家已经利用上述技术成功地把人类囊肿性纤维化病的致病基因移植到小鼠身上，培育出了患囊肿性纤维化病的小鼠。下列有关叙述错误的是（　　） A．通过上述“基因敲除”技术可以定向改变生物体的遗传性状 B．在“基因敲除”中需要用到限制性内切核酸酶、DNA连接酶等 C．这种嵌合体小鼠长大后，体内存在外源基因，但不会遗传给后代 D．“基因敲除”技术有利于人类对某些遗传因素引发的疾病进行研究 【答案】C 【分析】根据题干信息，“基因敲除”技术用外源基因整合到小鼠胚胎干细胞的DNA同源序列中，实质采用基因工程的技术，原理是基因重组，涉及到限制酶和DNA连接酶。 【详解】A、依题干信息可知，“基因敲除”实质上是用外源基因取代或破坏DNA同源序列中的某一个基因，导致其失活，可以定向改变生物体的某一基因，定向改变生物体的遗传性状，A正确； B、根据题干信息“用外源基因整合到小鼠胚胎干细胞的DNA同源序列中”，则需要限制酶和DNA连接酶，B正确； C、这种嵌合体小鼠长大后，体内存在人类囊肿性纤维化病的致病基因，属于杂合体，可能会遗传给后代，C错误； D、“基因敲除”技术成功的培育出了患囊肿性纤维化病的小鼠，可作为实验材料利于人类对遗传病进行研究，D正确。 故选C。 7．(23-24高二下·广东佛山S6高质量发展联盟·期中)如图表示某质粒的结构示意图。下列叙述错误的是（　　）   A．构建基因表达载体时目的基因插入在启动子和终止子之间 B．由该质粒的限制酶识别位点可知，可选择EcoRI和HindⅢ切割质粒 C．启动子能与RNA聚合酶结合，驱动相关基因转录出相应的mRNA D．该质粒中标记基因的作用是便于重组DNA分子的筛选 【答案】B 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】A、构建基因表达载体时目的基因插入在启动子和终止子之间，才能进行转录，A正确； B、由该质粒的限制酶识别位点可知，用EcoRI切割质粒时会破坏复制原点，因此应选择AluI和HindⅢ切割质粒，B错误； C、启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动相关基因转录出相应的mRNA，C正确； D、该质粒中的标记基因的作用是可用于目的基因的检测与鉴定，鉴定和选择出含有目的基因的受体细胞，D正确。 故选B。 二、实验题 8．(24-25高二下·广东东莞七校联考·期中)研究人员利用基因工程的方法将油料作物紫苏的DGAT1基因导入四尾栅藻（操作过程如下图1所示），获得转基因的产油微藻。利用地热废水培养该藻，在生产生物柴油的同时，还能治理地热废水。请回答下列问题： (1)利用PCR技术扩增DGAT1基因片段时，需要用到的关键酶是______。图2中的引物______（填字母）在PCR反应步骤中的______阶段与DNA单链相应互补序列结合。 (2)将DGAT1基因与pBH21构建基因表达载体时，需在DGAT1基因的两端添加限制酶______的识别序列。 (3)启动子的基本单位是______。启动子往往具有物种特异性，在载体pBH21质粒中插入紫苏DGAT1基因，其上游启动子应选择______（填“紫苏DGAT1基因”“大肠杆菌”或“四尾栅藻”）的启动子。对获得的转基因四尾栅藻进行分子水平检测，可采用的技术有______（答出2种）。 (4)为检测转基因四尾栅藻对地热废水的治理能力，研究人员设计实验并得到相应实验结果如下表。 培养转基因四尾栅藻的地热废水培养基各项指标测定结果 各项指标 总氮/（mg·L-1） 总磷/（mg·L-1） 氟化物/（mg·L-1） 初始 23.2 4.32 4.56 培养转基因四尾栅藻11天后 1.9 0.45 0.84 该实验不能说明转DGAT1基因显著提高了四尾栅藻的去污能力。请进一步完善实验设计：______。 【答案】(1) 耐高温DNA聚合酶（Taq酶） B、C 复性 (2)BamHⅠ和XbaⅠ (3) 脱氧核苷酸 四尾栅藻 PCR、PCR和电泳、分子杂交技术、抗原一抗体杂交技术 (4)应添加对照组：用相同废水培养基培养等量非转基因四尾栅藻（其余条件相同），11天后检测对照组总氮、总磷和氟化物的含量并与实验组进行比较 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）利用PCR技术扩增目的基因片段时，需要耐高温的DNA聚合酶，即Tag酶，催化游离的脱氧核苷酸接到引物的3'端，从而催化DNA复制。DNA聚合酶从引物的3'端的开始延伸DNA链，因此要扩增目的基因，应选用如图中的B和C作为引物。PCR反应每次循环的步骤是变性→复性→延伸。复性阶段目的基因DNA受热变性后解旋为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在热稳定DNA聚合酶作用下进行延伸。 （2）基因表达载体的构建需要将目的基因插入启动子和终止子之间，且不能破坏卡那霉素抗性基因。观察质粒pBH21的酶切位点，只有BamHⅠ和XbaⅠ能满足在不破坏关键元件的情况下插入目的基因，所以将DGAT1基因与pBH21构建基因表达载体时，需在DGAT1基因的两端添加限制酶BamHⅠ和XbaⅠ的识别序列。 （3）启动子是一端特殊的DNA序列，其基本单位是脱氧核苷酸，是RNA聚合酶识别和结合的位点，可驱动基因的 转录，故要达到让紫苏DGAT1基因在四尾栅藻细胞中表达的目的，应该添加四尾栅藻启动子；对获得的转基因四尾栅藻进行分子水平的检测，通过PCR等技术检测四尾栅藻的染色体DNA上是否插入了DGATI基因（或DGATI基因是否转录出了mRNA）；用抗DGATl的抗体与从转基因四尾栅藻中提取的蛋白质进行抗原—抗体杂交以检测DGAT1基因是否翻译出蛋白质。 （4）要想证明转DGAT1基因显著提高了四尾栅藻的去污能力，应增加非转基因四尾栅藻对废水的去污能力，将转基因四尾栅藻与非转基因组结果进行比较，即应添加对照组，废水培养非转基因四尾栅藻11天后，检测总氮、总磷和氟化物的含量。 三、解答题 9．(24-25高二下·广东深圳新安中学（集团）高中部·期中)科研人员欲将斑马鱼的vtg基因（图1）插入Luc基因载体（图2），形成vtg-Luc融合基因重组载体并培育转基因斑马鱼。（注：Luc基因缺乏启动子序列，vtg基因内部无图2中的任何限制酶识别序列。TetR为四环素抗性基因，Sau2aI、EcoRⅠ、HindⅢ、BsrGⅠ、Bcl I为限制酶，→表示转录方向） (1)基因工程的核心步骤是________。为使vtg基因与Luc基因载体正向连接，可选用限制酶______进行双酶切Luc基因载体。 (2)通过PCR获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图1、图2信息，推测引物1包含的碱基序列为_________。 A．5’-GAATTCAACTAT-3’ B．5’-GAATTCTTGATA-3’ C．5’-GATCTTGATA-3’ D．5’-AAGCTTAACTAT-3’ (3)筛选导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌，可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉素、四环素的培养基中培养，筛选________（选填“能”或“不能”）在含有氨苄青霉素的培养基中生长但_______（选填“能”或“不能”）在含有四环素的培养基中生长的大肠杆菌即为目的菌。 (4)水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，E蛋白可以激活vtg基因上游的启动子。Luc基因的表达产物是萤火虫荧光素酶，可以催化荧光素氧化产生荧光。请结合上述信息，简述转基因斑马鱼用于检测水体中雌激素污染情况的原理：________。 (5)转基因斑马鱼逃逸可能引发生物安全问题，可考虑采取的措施是_______（答1点）。 【答案】(1) 构建基因表达载体 EcoR I、Hind Ⅲ (2)A (3) 能 不能 (4)斑马鱼的vtg基因在正常情况下不表达，当水体中有雌激素存在时，斑马鱼vtg基因的启动子被激活，表达Vtg-Luc融合蛋白。在水样中添加荧光素后，Luc催化其产生荧光，根据荧光强度可判断雌激素污染情况 (5)导入不育基因、导入仅导致生殖细胞凋亡的基因等 【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样； 4、目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】（1）基因工程的核心步骤是构建基因表达载体。要使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体并降低“空载”概率，应选用两种不同的限制酶进行双酶切。已知“Luc基因缺乏启动子序列，而vtg基因内部含有启动子序列”，故应将vtg插入Luc的上游，观察图2，EcoR I和Hind Ⅲ的酶切位点分别位于Luc基因载体的不同位置，用这两种酶双酶切可以满足要求。 （2）通过PCR获取vtg基因时，引物需要与模板链互补配对，从图1和图2分析，引物1要与vtg基因的特定区域结合，且要引入与载体酶切位点互补的序列，EcoR Ⅰ的识别序列是5'-GAATTC-3'，观察图中vtg基因的方向和序列，引物1应包含5'-GAATTCAACTAT-3'，这样既能与vtg基因结合，又能在后续与用EcoR Ⅰ酶切后的载体连接，A正确，BCD错误。 故选A。 （3）重组载体中含有氨苄青霉素抗性基因，而四环素抗性基因因酶切被破坏，所以导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌能在含有氨苄青霉素的培养基中生长，不能在含有四环素的培养基中生长，筛选能在氨苄青霉素培养基中生长，不能在四环素培养基中生长的大肠杆菌即为目的菌。 （4）因为水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，E蛋白可以激活vtg基因上游的启动子，而Luc基因与vtg基因形成融合基因。当水体中有雌激素存在时，斑马鱼vtg基因的启动子被激活，表达Vtg-Luc融合蛋白。在水样中添加荧光素后，Luc催化其产生荧光，根据荧光强度可判断雌激素污染情况，荧光越强，说明水体中雌激素污染越严重 。 （5）转基因斑马鱼逃逸可能引发生物安全问题，可考虑采取的措施是导入不育基因、导入仅导致生殖细胞凋亡的基因等，使其高度不育，这样即使逃逸到自然环境中，也不会与野生型斑马鱼杂交导致基因扩散 。 10．(23-24高二下·广东广州第八十九中学·期中)土壤盐渍化会影响水稻生长发育，研究人员将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，其操作流程及可能用到的限制酶如图所示，其中TetR为四环素抗性基因，AmpR为氨苄青霉素抗性基因，①~⑦表示操作过程。回答下列问题： 限制酶 BamHⅠ BclⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ 识别位点及切割位点 -G↓GATCC- -T↓GATCA- -CCC↓GGG- -↓GATC- (1)过程①PCR扩增OsMYB56基因时加入的酶催化____键的形成，还需要添加引物，应选用引物组合____。 ①5'-CTTGGATGAT-3' ②5'-TAAGTTGTCT-3' ③5'-TAGTAGGTTC-3' ④5'-TCTGTTGAAT-3' ⑤5'-ATTCAACAGA-3' ⑥5'-ATCATCCAAG-3' (2)Ti质粒中启动子的功能是____。为了筛选出含重组质粒的根瘤农杆菌，根瘤农杆菌应在添加____的选择培养基上培养。 (3)过程③应选用限制酶____切割质粒，利用所选限制酶进行操作的优势是____，切割后需要用____酶（填具体名称）进行连接才能获得重组质粒。 (4)在分子检测中，研究人员对转基因水稻DNA进行PCR，再对PCR产物进行____鉴定。若要鉴定OsMYB56基因是否表达，从分子水平上检测的方法是____技术。 【答案】(1) 磷酸二酯 ①④ (2) RNA聚合酶识别和结合的位点，驱动转录 四环素 (3) BclⅠ和SmaⅠ 防止酶切后的质粒、目的基因自身环化；保证OsMYB56基因和酶切后的质粒定向连接 T4DNA连接酶 (4) 琼脂糖凝胶电泳 抗原一抗体杂交 【分析】PCR技术可特异性的扩增DNA片段，关键在于引物可以和特定DNA片段的3'端特异性结合，使耐高温的DNA聚合酶沿引物的3'端延伸子链。基因表达载体一般包括启动子、终止子、目的基因、标记基因、复制原点等元件。 【详解】（1）DNA分子由2条链构成，每一条链都有3'端与5'端，-OH端为3'，磷酸基团的末端为5'，因此OsMYB56基因游离的磷酸基团侧为5'端，羟基端为3'端。过程①PCR扩增OsMYB56基因时加入的酶是Taq,该酶能催化磷酸二酯键的形成。在进行PCR操作时，引物应分别与基因两条链的3'端根据碱基互补配对原则结合，根据图中两端序列，通常选择5′-CTTGGATGAT-3′（上面链的引物）和5′-TCTGTTGAAT-3′（下面链的引物）作为引物对，①④正确。 （2）启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，驱动转录。标记基因可用于重组DNA分子的筛选，质粒上有TetR为四环素抗性基因，AmpR为氨苄青霉素抗性基因标记基因，但AmpR为氨苄青霉素抗性基因被限制酶切割失活，故应在添加四环素的选择培养基上培养。 （3）据图可知，质粒中的两个标记基因TetR和AmpR中都含有限制酶BamHⅠ识别序列，如果用限制酶BamHⅠ，会破坏质粒中的两个标记基因，为防止质粒自身环化，保证OsMYB56和酶切后的质粒定向连接，需要用双酶切，因此过程③可以选择限制酶BclⅠ和SmaⅠ。酶切后的质粒和目的基因片段，通过T4DNA连接酶作用后获得重组质粒。 （4）PCR的产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，分子水平检测OsMYB56基因是否表达，可以检测基因是否转录形成RNA或翻译成蛋白质，因此方法如下;可以提取细胞的mRNA，逆转录得到cDNA后进行PCR扩增；根据OsMYB56基因设计探针进行核酸分子杂交检测OsMYB56基因或者其转录出的mRNA；通过抗原一抗体杂交技术检测OsMYB56基因表达的蛋白质。 11．(23-24高二下·广东惠州实验中学·期中)图1 中的三个 DNA 片段上依次表示出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和 Sau3A Ⅰ三种限制酶的识别序列与切割位点，图2为某种表达载体的示意图(载体上的 EcoR Ⅰ、Sau3A Ⅰ的切点是唯一的)。 根据基因工程的有关知识，回答下列问题： (1)经 BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被_________酶切后的产物连接，理由是_____________。 (2)若某人利用图2所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图3 所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有_________，不能表达的原因是___________________。 (3)DNA 连接酶是将两个DNA 片段连接起来的酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是______________。 (4)为了检测目的基因是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR 方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的__________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR 模板。 【答案】(1) Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 (2) 甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录 (3)T4DNA连接酶 (4)核DNA 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）分析图解可知，限制酶Sau3AⅠ和BamHⅠ酶切割后形成的黏性末端相同，因此经BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。 （2）在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，这样的基因才能表达；图中甲和丙均不符合，甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，所以不能在宿主细胞中表达目的基因产物。 （3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。 （4）PCR是多聚酶链式反应的缩写，是一种在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，核DNA位于染色体上，若利用PCR方法检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，则应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。 12．(23-24高二下·广东佛山南海区·期中)近年来，生物柴油作为新型能源已经成为世界上应用最广泛、发展迅猛的可再生能源之一。微藻细胞能积累油脂可以用于生产生物柴油。研究人员利用RT—PCR技术（将RNA反转录合成cDNA，再以cDNA为模板，PCR扩增合成目的片段）获得油料作物紫苏DGATI基因，将其导入四尾栅藻，获得转基因产油微藻。操作过程如图1。 注：克隆质粒主要用于目的基因的大量复制；LacZ基因可使细菌利用加入培养基的物质X-gal，从而使菌落显现出蓝色。若无该基因或该基因被破坏，则菌落则呈白色。 (1)RT-PCR过程所需要的酶主要有______和TaqDNA聚合酶，其中TaqDNA聚合酶需要______（离子）的激活，扩增得到DGAT1基因，PCR扩增得到的产物一般通过______鉴定，鉴定的结果显示______条带（填数字）说明扩增成功。 (2)DGAT1基因与克隆质粒pMD19连接，将连接产物导入到经______处理后的大肠杆菌细胞，并接种到添加______的培养基上培养，一段时间后，挑选颜色为______的菌落用液体培养基培养，提取质粒pMD19-DGAT1。 (3)用限制酶切pMD19-DGAT1获得DGAT1基因，并与酶切后的载体pBI121连接得到______，并导入到四尾栅藻。 (4)研究人员培养转基因四尾栅藻并检测其油脂含量，结果如图2。 结果显示：____________。 【答案】(1) 逆转录酶/反转录酶 Mg2+ 琼脂糖凝胶电泳 1 (2) Ca2+ 氨苄青霉素和X-gal 白色 (3)重组质粒 (4)转DGAT1基因的四尾栅藻油脂含量显著高于非转基因组 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）RT-PCR过程是将RNA反转录合成cDNA，再以cDNA为模板，PCR扩增合成目的片段的过程，所需要的酶主要有逆转录酶（催化RNA→cDNA过程）和TaqDNA聚合酶（耐高温）；其中TaqDNA聚合酶需要Mg2+的激活，扩增得到DGAT1基因，PCR扩增得到的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳鉴定；扩增时需要加入特异性的引物，若能扩增出目的基因，则鉴定的结果显示1条带。 （2）DGAT1基因与克隆质粒pMD19连接，将连接产物导入到经 Ca2+处理后的大肠杆菌细胞，此时大肠杆菌处于容易吸收外周围DNA的状态；同时接种到添加氨苄青霉素（重组质粒上含有该标记基因）和X-gal的培养基上培养，若质粒上插入了目的基因，则LacZ基因被破坏，由题干信息可知，LacZ基因可使细菌利用加入培养基的物质X-gal，从而使菌落显现出蓝色，若无该基因或该基因被破坏，则菌落则呈白色，所以一段时间后，挑选颜色为白色的菌落用液体培养基培养，提取质粒pMD19-DGAT1。 （3）用限制酶切pMD19-DGAT1获得DGAT1基因，并与酶切后的载体pBI121连接得到重组质粒，并导入到四尾栅藻。 （4）研究人员培养转基因四尾栅藻并检测其油脂含量，图示自变量是四尾栅藻类型，因变量是油脂含量，结果显示转DGAT1基因的四尾栅藻油脂含量显著高于非转基因组。 13．(23-24高二下·广东麻涌，塘厦，七中，济川四校·期中)某科研小组欲用图1所示的质粒构建人胰岛素基因表达载体，让其在大肠杆菌中表达出人胰岛素前体物质，对人胰岛素基因所在的DNA片段进行测序，发现其两端附近无限制酶EcoRI、BamHI的酶切位点。已知人胰岛素基因表达时以②链为模板，且其3'端存在启动子，图1所示质粒上的ampR为氨苄青霉素抗性基因，telR为四环素抗性基因。请回答下列问题： (1)可采用_______来获得人胰岛素基因，这一方法需要先针对人胰岛素基因两端的序列来设计引物对。这一方法获得的产物一般通过______进行鉴定，若鉴定发现其中有许多种相对分子质量比人胰岛素基因小的DNA片段，则原因可能是______（答出一点）。 (2)为保证人胰岛素基因能正确连接到用限制酶EcoRI和BamHI处理的图1所示质粒上，且利用表达载体上的启动子在受体菌中以②链为模板进行转录，则应在配对到①链的引物5'端添加6个碱基，序列为5'-_______-3'。 (3)图1质粒上的ampR和tetR一般充当基因表达载体上的标记基因，其作用是______。利用质粒上的标记基因，结合微生物的培养，可以淘汰只转入质粒的大肠杆菌而获得被成功转入人胰岛素基因表达载体的受体菌，则应将重组载体导入经________处理后的________（填“不抗氨苄青霉素”“不抗四环素”或“不抗氨苄青霉素和四环素”）的受体大肠杆菌中。 【答案】(1) PCR技术 琼脂糖凝胶电泳 胰岛素基因纯度不够 (2)GGATCC (3) 用以检测目的基因是否导入受体细胞 Ca2+ 不抗氨苄青霉素和四环素 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）可采用PCR技术来获得人胰岛素基因，这一方法需要先针对人胰岛素基因两端的序列来设计引物对。这一方法获得的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，若鉴定发现其中有许多种相对分子质量比人胰岛素基因小的DNA片段，则可能是胰岛素基因纯度不够，PCR扩增时形成了非目的片段。 （2）人胰岛素基因表达时以②链为模板，且其3'端存在启动子，图1所示质粒上的ampR为氨苄青霉素抗性基因，telR为四环素抗性基因，为保证人胰岛素基因能正确连接到用限制酶EcoRI和BamHI处理的图1所示质粒上，且利用表达载体上的启动子在受体菌中以②链为模板进行转录，应在配对到①链的引物5'端添加BamHI识别序列，添加的6个碱基序列为5'-GGATCC-3'。 （3）图1质粒上的ampR和tetR一般充当基因表达载体上的标记基因，其作用是用以检测目的基因是否导入受体细胞。利用质粒上的标记基因，结合微生物的培养，可以淘汰只转入质粒的大肠杆菌而获得被成功转入人胰岛素基因表达载体的受体菌，则应将重组载体导入经钙离子处理后的不抗氨苄青霉素和四环素的受体大肠杆菌中，以利用质粒上的标记基因筛选得到导入成功的受体细胞。 14．(23-24高二下·广东肇庆封开县江口中学·期中)应用生物工程技术获得人们需要的生物新品种或新产品。请据图回答下列问题： (1)在培育转人生长激素基因牛过程中，进行基因表达载体构建时，人生长激素基因的上游必须含有______。①过程需要的工具酶是_______，③过程培养到桑葚胚或囊胚阶段，可以采用_____技术，培育出多头相同的转基因犊牛。 (2)prG能激发细胞不断分裂，通过基因工程导入该调控基因来制备单克隆抗体，Ⅱ最可能是______细胞，Ⅲ代表的细胞具有_______的特点。 (3)在抗虫棉培育过程中，⑤过程采用的技术是______。 【答案】(1) 启动子 限制酶和DNA连接酶 胚胎分割 (2) 浆 既能无限增殖又能产生特定抗体的特点 (3)植物组织培养 【分析】分析题图：图示①表示基因表达载体的构建；②表示利用显微注射法将目的基因导入动物细胞的受精卵中；③表示目的基因的检测与鉴定；④表示目的基因导入植物细胞；⑤表示植物的组织培养技术。 【详解】（1）进行基因表达载体构建时，人生长激素基因，也就是目的基因的上游必须含有启动子，下游含有终止子。①过程表示基因表达载体的构建，该过程需要的工具酶是限制酶和DNA连接酶。③过程包含早期胚胎培养和胚胎移植等，为了培育出多头相同的转基因犊牛，可以将培养到桑椹胚/桑葚胚或囊胚阶段的胚胎进行胚胎分割，在移植到多头受体母牛体内完成后期发育。 （2）能分泌抗体的是浆细胞，所以Ⅱ最可能是浆细胞；Ⅲ代表的细胞具有既能无限增殖又能产生特定抗体的特点。 （3）在抗虫棉培育过程中，⑤过程用到的技术是植物组织培养，该技术的原理是利用植物细胞的全能性，首先经过脱分化形成愈伤组织，再经过再分化过程产生胚状体或丛芽，最终培育出完整的转基因抗虫棉植株。 15．(23-24高二下·广东肇庆肇庆中学·期中)人乳铁蛋白（hLTF）是一种铁结合的糖蛋白、具有抑菌、提高免疫力等重要功能。研究者通过转基因技术培育能生产hLTF的奶牛，从牛奶中分离提纯hLTF，回答下列问题。 (1)从原核生物中获取的质粒不适用于直接构建真核生物的表达载体，其启动子需要进行替换才有可能在真核细胞中表达，主要原因是_____。 (2)研究人员采用小鼠乳清酸蛋白基因的启动子和终止子来替换pA质粒中的部分序列，再拼接hLTF基因，最终形成pW2-hLTF重组质粒，过程如下图：   科学家常用PCR特异性地快速扩增目的基因，其原理是_____。 PCR扩增过程中每次循环一般可分为_____。在扩增小鼠乳清酸蛋白基因的启动子、终止子和hLTF基因时，均需引入限制酶的识别序列和切割位点，以便剪接到质粒的指定位置。据图分析，PCR扩增小鼠乳清酸蛋白基因的启动子所需的两种引物应分别包含_____（限制酶）的识别序列。 (3)构建基因表达载体过程中，将修饰后的hLTF基因插入重组质粒的启动子和终止子之间后，不一定能获得所需要的基因表达载体，原因是_____。 (4)经检测筛选所获得的基因表达载体pW2-hLTF通过_____的方法导入到奶牛的受精卵细胞中，以获得能产生hLTF的转基因奶牛。 【答案】(1)原核生物和真核生物的RNA聚合酶所识别和结合的启动子有所不同 (2) 体外DNA复制 变性——复性——延伸三个基本步骤 NruⅠ和MluⅠ (3)hLTF基因两端被同一种限制酶切割成相同的末端，可能会反向连接到质粒上 (4)显微注射 【分析】因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术； 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）由于原核生物和真核生物的RNA聚合酶所识别和结合的启动子有所不同，因此从原核生物中获取的质粒不适用于直接构建真核生物的表达载体，其启动子需要进行替换才有可能在真核细胞中表达； （2）PCR特异性地快速扩增目的基因，其原理是体外DNA复制， PCR扩增过程中每次循环一般可分为变性——复性——延伸三个基本步骤；启动子插入了NruⅠ和MluⅠ序列之间，因此PCR扩增小鼠乳清酸蛋白基因的启动子所需的两种引物应分别包含NruⅠ和MluⅠ的识别序列； （3）从图中看出，hLTF基因和表达载体均采用MluⅠ切割，hLTF基因两端被同一种限制酶切割成相同的末端，可能会反向连接到质粒上，因此将修饰后的hLTF基因插入重组质粒的启动子和终止子之间后，不一定能获得所需要的基因表达载体； （4）将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 因此经检测筛选所获得的基因表达载体pW2-hLTF通过显微注射的方法导入到奶牛的受精卵细胞中，以获得能产生hLTF的转基因奶牛。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $