3.1重组DNA技术的基本工具课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

我国是棉花的生产和消费大国。在棉花种植过程中常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最常见。 大量施用农药？ × 能不能导入“杀虫基因”到棉花细胞，使棉花自身产生抗虫蛋白来抵抗棉铃虫呢？ 抗虫基因 转基因 基因工程 思考：棉花怎么抵抗虫害呢? 杂交育种？ × 造成农产品和环境污染 同种生物之间进行 诱变育种？ × 不定向 基因工程 指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 操作对象及环境 操作水平 操作原理 结果 基因；生物体外 DNA分子水平 赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 基因重组 意义：定向改造生物遗传特性，能克服远缘杂交不亲和的障碍。 ①DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸） ②都遵循碱基互补配对原则 ③DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构 ①基因是控制生物性状的结构与功能单位 ②遗传信息的传递都遵循中心法则 基因在空间上转移并成功表达 ③生物界共用一套遗传密码。（相同的遗传信息在不同的生物体内表达出相同的蛋白质）。 思考：不同生物的基因为什么能拼接？ 思考：为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？ 理论基础分析 DNA双链 碱基对 环状病毒侵染的番木瓜 番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。 DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。 那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？ 从社会中来 第3章 基因工程 第1节 重组DNA技术的基本工具 基因工程 Genetic engineering 分子工具 “分子运输车”：能将体外重组好的DNA分子导入受 体细胞 “分子手术刀”：能准确切割DNA分子 “分子缝合针”：能将DNA片段再连接起来 限制性内切核酸酶（限制酶） —“分子手术刀” 背景：限制酶就是细菌的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。 1.来源： 主要从原核生物中分离纯化出来 2.种类： 数千种 限制酶不是一种酶，而是一类酶 3.作用： 识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 体现了酶的专一性 EcoR Ⅰ限制酶：专一识别GAATTC的序列，并使G和A之间切开。 Sma Ⅰ限制酶：只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。 3’ 5’ 磷酸 二酯键 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列是由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 第一个字母为属名，用大写； 第二、三字母为种名，用小写； 第四字母为株 用罗马数字表示发现的顺序 EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶； SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。 EcoRI 属 种 株 序 限制酶名字的由来 小资料 A A G T T C C T T A A G G C T T A A A A T T C G 限制性内切核酸酶—“分子手术刀” Restriction Endonuclease——"Molecular Scalpel" EcoR Ⅰ限制酶的切割： 专一识别GAATTC的序列，并使G和A之间切开。 A A G T T C C T T A A G A A T T C G G C T T A A 4.作用结果： 从5’→3’方向的识别序列均为GAATTC，并切断G和A之间的磷酸二酯键 黏性末端 黏性末端 产生黏性末端：AATT 注意：限制酶切割磷酸二酯键后氢键会自动断裂！ C C C G G G G G G C C C 限制性内切核酸酶—“分子手术刀” Restriction Endonuclease——"Molecular Scalpel" Sma Ⅰ限制酶的切割： 只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。 C C C G G G G G G C C C G G G C C C C C C G G G 4.作用结果： 当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。 从5’→3’方向的识别序列均为CCCGGG，并切断C和G之间的磷酸二酯键 产生平末端 1.写出下列限制酶切割形成的末端序列 BamHⅠ EcoRⅠ__________________________ Hind Ⅲ Bgl Ⅱ _________________________ -G -CCTAG -G -CTTAA -A -TTCGA -A -TCTAG or GATCC- G- or AATTC- G- or AGCTT- A- or GATCT- A- 同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？ 不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？ 相同。 可能相同 酶具有专一性，识别的序列相同 （比如BamHⅠ、BglⅡ） 不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？ 同尾酶 切割位点的选择范围扩大 课 堂 检 测 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？ 合作探究 C G G C C G T A T A A T A T G C G C G C T A A T C G T A T A A T A T G C T A T A EcoRI EcoRI EcoRI C G G C C G T T A A A A T T G C G C G C T A A T C G T T A A A A T T G C T A T A C G G C C G T T A A A A T T G C T A T A 会产生相同的黏性末端，可以进行碱基互补配对。 缺口怎么办 DNA连接酶 —“分子缝合针” 1.作用： 2.种类： 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 注意：不是连接氢键，氢键的形成不需要酶的催化 类型 来源 作用 相同点 差别 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 大肠杆菌 T4噬菌体 恢复 磷酸二酯键 连接黏性末端 能连接平末端(效率较低) 既能连接黏性末端 又能连接平末端 5′ 5′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 3′ 3′ 5′ 5′ 5′ 5′ 5′ 5′ T4 DNA连接酶 思考：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？（72页） 作用部位相同：磷酸二酯键 不同：DNA聚合酶连接的是游离的脱氧核苷酸，将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端；DNA连接酶连接的是DNA片段，将两个DNA片段连接成完整的DNA分子。 几种相关酶的比较 作用底物 作用部位 作用结果 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 解旋酶 DNA水解酶 DNA分子 磷酸二酯键 黏性末端或平末端 DNA分子片段 磷酸二酯键 重组DNA分子 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 新的DNA分子 DNA分子 氢键 单链DNA DNA分子 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 知识延伸 2.根据所学知识，完成以下填空： ①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 b a 1.切断a处的酶为_______ 2.连接a处的酶为_______ 3.切断b处的酶为_______ ① ③④ ② a：磷酸二酯键；b：氢键 课 堂 检 测 3.DNA连接酶是基因工程中最常用的工具酶。下列箭头指向处属于DNA连接酶正确连接位点的是（　　） A． B. C. D. C 课 堂 检 测 4.限制酶和DNA连接酶是基因工程中常用的工具酶。下列关于这两类酶的叙述，错误的是（　　） A．限制酶主要从原核生物中分离获得 B．不同限制酶切割DNA产生的末端可能相同 C．DNA连接酶能将两个DNA片段通过磷酸二酯键连接 D．E.coli DNA连接酶可连接黏性末端，不可连接平末端 D 课 堂 检 测 基因进入受体细胞的载体 —“分子运输车” 1.作用： 将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 2.种类： 质粒、噬菌体和动、植物病毒等。 3.常用载体： 质粒 真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子 ） 基因进入受体细胞的载体—“分子运输车” The carrier of a gene into a receptor cell——"Molecular Transporter" 观察图片1-1，思考讨论质粒的特点及相关作用 复制原点 目的基因 插入位点 氨苄青霉素抗性基因 1.能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。 外源DNA片段（目的基因）插入其中 2.有一个至多个限制酶切割位点。 EcoR Ⅰ Sma Ⅰ . . . 便于重组DNA分子的筛选 3.具有标记基因。 除了氨苄青霉素抗体基因外，四环素抗体基因也可作为标记基因。 图1-1 合作探究 4.无毒害作用，避免受体细胞受到伤害。 标记基因的筛选原理 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，导入了载体并成功表达了的受体细胞才能够生存。如图所示： 导入 受体细胞 培养 加入氨苄青霉素 ①导入重组质粒的受体细胞存活并繁殖 ②导入普通载体的体细胞存活并繁殖 含有氨苄青霉素抗性基因载体（如质粒） 目的基因一定成功重组到质粒上了吗？ 知识延伸 请同学找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。 思考•讨论 1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？ 剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。 2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对?如果不能，可能是什么原因造成的？ 如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。 3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？ 不能。 因为基因的长度一般在100个碱基对以上。 请回答： 课堂小结 E.coli DNA连接酶 ③ 有一个至多个限制酶切割位点 质粒、噬菌体、动植物病毒 作用部位： 种类 DNA连 接酶 切开DNA分子的磷酸二酯键 主要存在于原核生物中 具有专一性（能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列） T4 DNA连接酶 ① 对受体细胞无害 ② 能自我复制或整合到宿主DNA上。 ④ 常有特殊的标记基因 运载 工具 条件 种类： 磷酸二酯键 限制酶 作用部位： 来源： 特点： 作用结果： 产生黏性末端或平末端 重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶（限制酶）主要是从原核生物中分离纯化出来的，能够识别双链DNA分子的特定 ，并使每一条链中特定部位的 断裂。 (2)大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，即_________末端和平末端。 (3)DNA连接酶根据来源不同可分为两类，一类是从 中分离得到的E．coliDNA连接酶，另一类是从T4噬菌体细胞中分离得到的T4DNA连接酶。 (4)基因工程中常用的载体除质粒外，还有噬菌体、 等。 (5)作为基因工程的载体，质粒需要具备的条件包括：能在宿主细胞中自我复制并稳定保存；具有一或多个限制酶切点；具有特殊的_________基因，便于重组DNA分子的筛选。 (6)在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过_________的。 核苷酸序列 磷酸二酯键 黏性 大肠杆菌 动植物病毒 标记 人工改造 课 堂 检 测 5.微生物DNA分子中腺嘌呤会被甲基化酶修饰，腺嘌呤的甲基化会影响不同限制酶的切割情况，下表是腺嘌呤甲基化前后某些限制酶切割的情况。下列叙述错误的是（     ） 限制酶 识别序列 甲基化前 甲基化后 TaqⅠ 5'-T↓CGA-3' 切割 不切割 DpnⅠ 5'-GA↓TC-3' 不切割 切割 ClaⅠ 5'-AT↓CGAT-3' 切割 不切割 BamHⅠ 5'-G↓GATCC-3' 切割 切割 A．DNA腺嘌呤的甲基化并不会改变 生物基因的碱基序列 B．限制酶ClaⅠ所识别的酶切位点， 也能被限制酶TaqⅠ识别并切割 C．用表格中四种限制酶分别处理 同一DNA片段，甲基化后可被切割的位点总数，不一定比甲基化前少 D．限制酶切割的特异性由其识别的碱基序列决定，与碱基修饰无关 D 课 堂 检 测 6.（2024·湖南·高考真题）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　） A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 B 课 堂 检 测 探究•实践 DNA的粗提取与鉴定 一、实验原理 细胞内成分复杂，且真核生物的DNA和蛋白质结合形成染色体，难以分离提纯。利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 1.DNA不溶于酒精溶液但某些蛋白质溶于酒精 初步分离DNA和蛋白质 0 0.14 NaCI浓度（mol/L） DNA溶解度 2.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同 用高浓度的盐溶液（2mol/L的NaCl溶液）溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质； 用低浓度的盐溶液（0.14mol/L的NaCl溶液）使DNA析出，能除去溶解在低盐中的杂质。 溶解DNA 取过滤液 取过滤物 3.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 酶——蛋白酶 高温——大多数蛋白质不能忍受60-80℃的高温，但DNA在80℃以上才会变性 洗涤剂——能瓦解细胞膜，但对DNA没有影响 4.在一定温度下（沸水浴），DNA被二苯胺试剂染成蓝色 鉴定DNA 二、材料用具 新鲜洋葱、研磨液、体积分数为95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等 猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核和线粒体，几乎不含DNA，不适合； 鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。 鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。 思考：猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？ DNA的粗提取与鉴定 Rough extraction and identification of DNA DNA的粗提取与鉴定 Rough extraction and identification of DNA 三、实验步骤 1.破碎细胞，获取DNA的滤液 称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。 研磨 注意事项：研磨时间不宜太长，防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量；有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶，研磨效果好（有利于充分研磨）；研磨不宜太用力 思考：若是动物细胞，该如何获取DNA滤液？ 吸水涨破 2.去除滤液中的杂质 a.漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液； b.也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。 （核蛋白、脂质、多糖和RNA等杂质） 思考：过滤的纱布能用滤纸代替吗？ 不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。 思考：上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？ 可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。 3.DNA的析出 DNA滤液+同体积冷却的95%酒精 静置2~3min 白色絮状物 用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。 思考：为什么要沿一个方向搅拌？ 思考：酒精预冷的作用？ ①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； ②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出； ③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。 DNA的粗提取与鉴定 Rough extraction and identification of DNA 4.DNA的鉴定 丝状物或沉淀物+2mol/L的NaCl溶液5mL 二苯胺 加热 冷却后观察颜色变化 实验组 对照组 沸水浴加热 加入4mL二苯胺试剂 加入2mol/L氯化钠溶液 加入丝状物 加入2mol/L氯化钠溶液 不加入丝状物 加入4mL二苯胺试剂 评价结果： （1）DNA纯度：看提取物颜色 （2）DNA的量：看与二苯胺反应颜色的深浅 现配现用！棕色瓶保存 1.为什么要提取出白色丝状物？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？ 3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。 如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。 鉴定结果呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。 ①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。 ②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。 ③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。 DNA的粗提取与鉴定 Rough extraction and identification of DNA 四、结果分析与评价 本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。 2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？ 7.（2014·江苏·高考真题）下列关于“DNA 的粗提取与鉴定”实验叙述,错误的是（ ） A．酵母和菜花均可作为提取 DNA 的材料 B．DNA 既溶于2 mol / L NaCl 溶液也溶于蒸馏水 C．向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌,可见玻璃棒上有白色絮状物 D．DNA 溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热,冷却后变蓝 C 课 堂 检 测 Lavf58.46.101 Lavf58.46.101 $