3.1重组DNA技术的基本工具课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

人教版高中生物学 选择性必修3《生物技术与工程》 第3章 第1节 重组DNA技术的基本工具 1、阐明重组DNA技术所需的三种基本工具的作用 2、认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新 3、进行DNA的粗提取与鉴定 教学目标 基因工程 原理：基因重组 基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 优点：定向改造生物体的性状； 克服远缘杂交不亲和障碍 问题1：基因工程的原理和优点？ 基因工程 问题2：基因工程的理论基础？ 理论基础 1.DNA的基本组成单位相同(都是四种脱氧核苷酸) 2.都遵循碱基互补配对原则 3.DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构 理论基础 1.基因是控制生物性状的结构与功能单位 2.遗传信息传递都遵循中心法则 3.生物界几乎共用一套遗传密码 基因工程 基因：具有遗传效应的DNA片段或RNA片段 问题3：什么是基因？ 能够被转录（DNA→RNA）或能够调节转录的DNA片段 基因是DNA片段，DNA片段不一定是基因 问题4：原核细胞的基因和真核细胞的基因结构异同？ DNA片段 基因1 基因2 基因3 放大 终止子 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 启动子 转录 RNA聚合酶识别和结合位点 结束转录 mRNA 翻译 蛋白质 基因的结构 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点 启动子 终止子 ①不编码蛋白质。 ：编码蛋白质 ,连续不间断 编码区 非编码区 原核细胞的基因结构 ②调控遗传信息表达,上游有启动子，下游有终止子 原核细胞的基因结构 编码区 非编码区 非编码区 与RNA聚合酶 结合位点 内含子 外显子 启动子 终止子 编码区上游 编码区下游 真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列 ：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子 非编码序列： 包括非编码区和内含子 真核细胞的基因结构 对比 启动子 起始密码子 终止子 终止密码子 所在位置 DNA mRNA DNA mRNA 作用 RNA聚合酶的结合位点，转录的起始点。 翻译的起始点 AUG(甲硫氨酸） GUG（缬氨酸） 转录的终点 翻译的终点 （UAA、UGA、UAG) 基因的结构 脱氧核糖核苷酸 核糖核苷酸 胞嘧啶 腺嘌呤 鸟嘌呤 胸腺嘧啶 A G C T 胞嘧啶 腺嘌呤 鸟嘌呤 尿嘧啶 A G C U 核酸 初步水解 彻底水解 核苷酸(基本单位) 磷酸 五碳糖 含氮碱基 DNA的结构 DNA RNA 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 2’ 10 3’, 5’—磷酸二酯键 3’ 5’ 双螺旋结构 氢键 A=T G≡C（碱基互补配对原则） 反向平行 5’ 3’ 3’ 5’ DNA的结构 资料一：萤火虫之所以能发光，是因为萤火虫发光细胞中的荧光素酶基因可指导合成荧光素酶，荧光素在ATP供能时会被激活，被激活的荧光素在荧光素酶的催化下发出荧光。 思考1：如何获取荧光素酶基因？ 1970年，史密斯等人首次从大肠杆菌中提取出了一种限制性内切核酸酶。这种内切核酸酶能够识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特异性的位点上把双链DNA分子“切割”开。 限制酶——“分子手术刀” 限制酶——“分子手术刀” 来源： 种类： 主要是从原核生物中分离纯化出来的 数千种——现在已经从约300种微生物种分离出了约4000种限制酶 粘质沙雷式杆菌（Serratia marcescens） Sma Ⅰ 大肠杆菌（Escherichia coli R） EcoR Ⅰ 属名首字母 种加词头两个字母 菌株型号 数字表示分离出来的第几种限制酶 思考2：限制性内切核酸酶的识别序列有什么特点 切点 一种限制酶一般只能识别一种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 一般由6个核苷酸组成 （回文序列） 限制酶——“分子手术刀” EcoR Ⅰ (在G与A之间切割) 中轴线 黏性末端 平末端 Sam Ⅰ (在G与C之间切割) 限制酶——“分子手术刀” 学生活动一：用剪刀模拟限制酶酶切过程。 写出下列限制酶切割形成的黏性末端 BamHⅠ________ EcoRⅠ________ HindⅢ________ BglⅡ ________ 5’-GATC-3’ 5’-AATT-3’ 5’-AGCT-3’ 5’-GATC-3’ 思考3：你从中发现了什么现象？ 不同的限制酶切割形成的黏性末端一般不同；但也可能相同 5’ 3’ 3’ 5’ 同尾酶 限制酶——“分子手术刀” 请判断：以下黏性末端是否由同一种限制酶作用产生的。 × GAATTC CAATTG GTTAAC 限制酶——“分子手术刀” 思考4.推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？ 思考5.为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ 原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。 ①细菌自身的DNA分子本不具备该限制酶的识别序列 ②细菌自身DNA经过相应的化学修饰(如甲基化等） 限制酶——“分子手术刀” 思考6.限制酶切割DNA时，每切割1次，会形成几个切口？会形成几个黏性末端？可断开几个磷酸二酯键？消耗几分子水？产生多少个游离的磷酸基团？ 一个切口; 两个黏性末端; 两个磷酸二酯键； 两分子水； 两个游离的磷酸基团 限制酶——“分子手术刀” 思考7.若用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段中某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？ 思考8.如果想把上图切下的DNA片段连接到下图DNA分子上，如何操作？ 两个切口; 四个黏性末端; 用能产生相同的黏性末端的限制酶切割该DNA分子 限制酶——“分子手术刀” 学生活动二：用剪刀模拟限制性内切核酸酶获取荧光素酶基因。 思考9：剪切后的两组序列是否能够拼接起来？ 为什么？ 如何拼接？ 限制酶——“分子手术刀” 1967年，科学家们发现了一种能够将两个DNA片段连接起来的酶，可以用它来修复DNA链的断裂口，并把这种酶叫做DNA连接酶。 DNA连接酶——“分子缝合针” DNA连接酶的作用：将双链 DNA双链片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 从大肠杆菌中分离得到 链接互补的 黏性末端 从T4噬菌体中分离得到 黏性末端与平末端均可连接，但连接平末端的效率相对比较低。 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 DNA连接酶与DNA聚合酶的比较 DNA连接酶——“分子缝合针” 酶1 酶2 酶4 酶3 酶5 酶1:限制酶 酶2:DNA连接酶 酶3:解旋酶 酶4:DNA聚合酶 酶5:DNA酶 与DNA相关的五种酶的比较 名称 作用部位 作用结果 限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段 DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 解旋酶 碱基对之间 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 DNA连接酶——“分子缝合针” 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 资料二：真核细胞在自然状态下往往难以接受外源DNA分子，即使吸收外源DNA也难以将其整合到自身的基因组上，还会将其降解。 资料三：1967年，科学家发现一种独立于细菌拟核DNA之外且可以进行自我复制的环状DNA分子——质粒，其可以在细菌之间转移，是基因转移的运载工具。 资料四：1967年科学家在酵母菌内第一次发现了真核细胞内的质粒，1977和1978年又相继在玉米和一种丝状真菌细胞内发现了质粒。 思考10：要使外源基因与载体连接，载体需要满足哪些条件？ 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 作用: ①将目的基因转移到受体细胞中去 ②利用运载体在受体细胞内对目的基因进行大量复制 载体需具备的条件 ①在受体细胞中稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制； ②有一个至多个限制酶切割位点，便于插入（携带）目的基因； ③具有标记基因，便于筛选含有重组DNA分子的细胞； ④对受体细胞无害、易分离。 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 载体上标记基因的标记原理 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。 将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。 在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 3.常用运载体： 质粒 动植物病毒 噬菌体 种类： 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 质粒来源于细菌、霉菌和酵母菌等的细胞质，对细胞的正常生活几乎没有影响，最常用的是大肠杆菌质粒。 拟核 质粒 大肠杆菌 氨苄青霉素抗性基因 目的基因 复制起点 DNA分子的粗提取和鉴定 1、实验原理（提取原理、鉴定原理） 2、材料用具 ①选材： DNA含量相对较高的生物组织 不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。 ②试剂： 试剂 作用 研磨液 体积分数为95%的酒精 2mol/L 的NaCl溶液 二苯胺试剂 析出DNA 溶解DNA 鉴定DNA，要现配现用 溶解并提取DNA 研磨 加酒精析出 溶解与鉴定 提取上清液 使DNA分子从细胞核中释放出来。 方法：过滤或离心 不可以用滤纸，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。 离心后：可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。 沿一个方向搅拌：避免破坏DNA。 析出DNA 蛋白质溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。 DNA分子的粗提取和鉴定 实验组 对照组 水浴加热 2mol/L的NaCl+二苯胺 2mol/L的NaCl+丝状物+二苯胺 1.如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？ 2.有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？ 3.有时会反复利用不同浓度的NaCl溶液来溶解、析出DNA，试猜想该操作的目的？ 将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液。 利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开。 进一步纯化DNA——用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。 DNA分子的粗提取和鉴定 已知某种限制酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指。如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是（ ） A.3 B.4 C.9 D.12 a、b、c、d ab、bc、cd、 abc、bcd、 C 习题巩固 已知某限制性内切酶在一环状DNA分子上有3个酶切位点，如下图所示，现有多个上述环状DNA分子，如果每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，从理论上分析，产生不同长度的DNA片段最多有( )A.6种 B.7种 C. 8种 D.9种 B a、b、c ab、bc、ca、 链状abc a b c 习题巩固 下图甲是一个DNA片段，箭头处代表不同限制酶的切点， 据图回答： （1）用EcoR Ⅰ 酶切，能得到 种DNA片段； （2）用Pst Ⅰ 完全酶切，能得到 种DNA片段； （3）同时用Sma Ⅰ 和Pst Ⅰ 完全酶切，能得到 种DNA片段； （4）只用Pst Ⅰ 酶切，最多能得到 种DNA片段。 2 3 5 5 习题巩固 腺病毒载体疫苗 Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) Content Adaptive Encoding 3.1 Lavf58.29.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $