3.1重组DNA技术的基本工具课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

1944年艾弗里等人证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。 1950年埃特曼发明了一种测定氨基酸序列的方法。 1958年梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。 1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。 1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。 1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。 1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）。 20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。 1972年，伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子。 1973年，证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，基因工程正式问世。 1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。 1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。 1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。 1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。 1985年，穆里斯等人发明了PCR。 1990年，人类基因组计划启动。2003年完成 21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，加速了人们对基因组序列的了解。 2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。 科技探索之路 基因工程的诞生和发展 基因工程是指按照人们的愿望，通过 等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的 和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA 上进行设计和施工的，因此又叫作 。 转基因 新的生物类型 分子水平 重组DNA技术 基因重组 ②操作水平： ⑤操作结果： ①操作原理： DNA分子水平 获得新的生物类型和生物产品 ③操作环境： 生物体外 ④操作对象： 基因 ⑥优 点： 克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状（在育种方面）。 知识梳理 基因工程 Genetic engineering 3-1 重组DNA技术的基本工具 从社会中来 番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。 DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？ 知识梳理 基因工程 Genetic engineering ⑦工具 “分子手术刀”： “分子缝合针”： “分子运输车”： 准确切割DNA分子 将DNA片段连接起来 将体外重组好的DNA分子导入受体细胞 剪切→拼接→导入→表达 ⑧操作过程： 知识梳理 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 1. 来源： 切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称 。 限制酶 主要来自原核生物 思考： 1. 推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？ 原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。 2. 为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子呢？ 通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。 6 知识梳理 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 1. 来源： 切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称 。 数千种 3. 作用： 2. 种类： 限制酶 主要来自原核生物 限制酶不是一种酶，而是一类酶 能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。例如EcoRⅠ限制酶、SmaⅠ限制酶识别的序列； 少数限制酶识别的序列由4个、8个或其他数量核苷酸组成。 7 知识梳理 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 8 知识梳理 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 9 知识梳理 写出下列限制酶切割形成的黏性末端 *思考：你从中发现什么现象了？ 不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端。 同尾酶 10 知识梳理 1. 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？ 可产生几个黏性末端？ 要切两个切口，产生四个黏性末端。 2. 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性末端 3. 限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？ 不能。限制酶只能识别并切开双链DNA分子。 思考： 11 知识梳理 二、DNA连接酶——“分子缝合针“ 1. 作用： 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 2. 种类： 类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 差别 E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的______________ 大肠杆菌 T4噬菌体 磷酸二酯键 12 知识梳理 DNA连接酶和DNA聚合酶的比较 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 DNA复制、基因工程 DNA复制 只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 13 知识梳理 三、基因进入受体细胞的载体——”分子运输车“ 1. 作用： 将目的基因转入受体细胞。 2. 种类： 质粒、噬菌体和动植物病毒等。 种类 用途 不同点 质粒、噬菌体 植物病毒 动物病毒 将外源基因导入大肠杆菌 等受体细胞 将外源基因导入植物细胞 将外源基因导入动物细胞 来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别 14 知识梳理 三、基因进入受体细胞的载体——”分子运输车“ 1. 作用： 将目的基因转入受体细胞。 2. 种类： 质粒、噬菌体和动植物病毒等。 3. 最常用的载体： 质粒 一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 能自我复制：在受体细胞中稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制； 有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。 具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 对受体细胞无毒害。 =筛选目的基因是否导入受体细胞； 15 知识梳理 标记基因的筛选原理 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。 目的基因与运载体结合 知识梳理 用相同的限制酶切割目的基因和运载体，获得相同的末端 用DNA连接酶连接目的基因和运载体，形成重组质粒。 …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… …TCCTAG …AGGATCTTAA GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG AATTCCATAC… GGTATG… GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ DNA的粗提取与鉴定 探究 ∙ 实践 实验原理： 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。材料用具： 知识梳理 DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。 DNA能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液。 在一定温度下，DNA被二苯胺试剂染成蓝色。 初步分离DNA和蛋白质 溶解DNA 鉴定DNA 目的要求： 1. 了解DNA的物理和化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。 2. 学会DNA粗提取的方法以及用二苯胺对DNA进行鉴定。 DNA的粗提取与鉴定 探究 ∙ 实践 材料用具： 知识梳理 富含DNA的材料，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜和猪肝等、研磨液、体积分数为95％的酒精、2 mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。 （2）用具： 烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。 不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。 （1）材料： DNA的粗提取与鉴定 探究 ∙ 实践 方法步骤： 知识梳理 称取约30g 洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL 研磨液，充分研磨。 ①研磨的目的：破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中 ②研磨时间不宜太长：防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量 ③有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶：研磨效果好（有利于充分研磨） ④研磨不宜太用力 研磨液成分 作用 SDS 使蛋白质变性 EDTA 抑制DNA酶 Tris-HCl缓冲液 稳定DNA （1）研磨释放DNA DNA的粗提取与鉴定 探究 ∙ 实践 方法步骤： 知识梳理 在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500 r / min 的转速下离心5 min ，再取上清液放入烧杯中。 （2）过滤获取含DNA的上清液 低温放置几分钟的作用： ①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； ②抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出； ③低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂。 为减少 DNA 的损失，过滤过程一般使用纱布。 DNA的粗提取与鉴定 探究 ∙ 实践 方法步骤： 知识梳理 在上清液中加入体积相等的、预冷的体积分数为95%酒精溶液，静置2~3 min ，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA 。 用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分； 或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000 r / min 的转速下离心5 min ，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA ）晾干。 （3）提取DNA DNA的粗提取与鉴定 探究 ∙ 实践 方法步骤： 知识梳理 （4）DNA的鉴定 取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。 溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关。 DNA的粗提取与鉴定 探究 ∙ 实践 方法步骤： 知识梳理 研磨 过滤 提取 鉴定 知识梳理 1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是( ) A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端 2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ） A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶 C.DNA片段的黏性末端 D. 用来识别特定基因的DNA探针 练习与应用 一、概念检测 C A 26 1. 有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶Spe I进行切割，B片段分别用限制酶Hind Ⅲ、Xba I、EcoR V和Xho I进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 练习与应用 二、拓展应用 （1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的DNA片段相连接?为什么? XbaⅠ。因为XbaI与SpeI切割产生了相同的黏性末端。 27 1. 有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶Spe I进行切割，B片段分别用限制酶Hind Ⅲ、Xba I、EcoR V和Xho I进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 练习与应用 二、拓展应用 （2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？ 识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。 28 $