专题04 基因工程的基本工具和PCR（期中真题汇编，山东专用）高二生物下学期

专题04 基因工程的基本工具和PCR 一、单选题 1．（24-25高二下·山东聊城·期中）下列关于重组DNA技术的基本工具的叙述，错误的是（    ） A．E．coliDNA连接酶既能“缝合”黏性末端，也能“缝合”平末端 B．限制性内切核酸酶主要来自原核生物，一般不切割自身DNA C．载体上要有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入 D．DNA连接酶能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 2．（24-25高二下·山东菏泽·期中）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的说法，正确的是（    ） A．以洋葱为实验材料进行该实验必须在无菌条件下进行 B．对研磨液进行离心是为了加速DNA的沉淀 C．与家兔血相比，洋葱更适合用于DNA的粗提取与鉴定 D．加入预冷酒精溶液后离心，取上清液备用 3．（24-25高二下·山东日照·期中）某同学利用菜花进行“DNA的粗提取与鉴定”实验，相关叙述正确的是（    ） A．实验中可进行两次离心，都是取上清液备用 B．向上清液中加入预冷酒精的目的是析出其中的杂质 C．向上清液中加入木瓜蛋白酶有利于去除其中的蛋白质 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 4．（24-25高二下·山东枣庄·期中）下列有关基因工程工具的叙述，正确的是（    ） A．一种限制酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列 B．T4DNA连接酶只能将具有平末端的DNA片段连接 C．限制酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶 D．RNA病毒一般不可以作为基因工程的载体 5．（24-25高二下·山东枣庄·期中）某同学利用洋葱为实验材料，进行DNA粗提取和鉴定实验。下列叙述错误的是（    ） A．也可以选择菜花、香蕉、鸡血等作为实验材料，提取方法可能稍有不同 B．向DNA提取液中加入体积分数为95%的冷酒精后，出现的白色丝状物为粗提取的DNA C．将洋葱研磨液过滤后，置于4℃冰箱中几分钟后，DNA出现在沉淀物中 D．鉴定时，先将丝状物溶于2molLNaCl溶液，再加入二苯胺并进行沸水浴加热 6．（24-25高二下·山东菏泽·期中）科研人员利用转基因技术将酵母菌的YCF1（镉转运蛋白）基因整合到杨树染色体上，培育能富集镉的转基因杨树。下列说法错误的是（    ） 限制酶 BamHI XmaI BclI SmaI 识别序列及切割位点 -G↓GATCC- -C↓CCGGG- -T↓GATCA- -CCC↓GGG- A．利用PCR技术获取并克隆YCF1基因时，需设计2种引物 B．启动子的作用是为YCF1基因的转录提供起始密码子 C．若用BclI切割质粒，会破坏质粒中的氨苄青霉素抗性基因 D．构建重组质粒时，为保留标记基因，应选择Smal和Bcll切割质粒 7．（24-25高二下·山东菏泽·期中）1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉，下列关于用Bt基因培育转基因抗虫棉四个主要步骤的说法，正确的是（　　） A．这四个步骤中均可用到碱基互补配对的原则 B．基因表达载体中的终止密码子能够使基因停止转录 C．若利用PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA，则不能根据目的基因的启动子和终止子序列设计引物 D．成功将两个Bt基因转入棉花的染色体DNA中，则自交后代一定具有抗虫特性 8．（24-25高二下·山东青岛·期中）DNA分子杂交时，常需要大量的单链DNA探针。不对称PCR是一种常见的单链DNA探针制备方法，其原理是反应体系中加入一对数量不相等的引物。假设在PCR反应的早期10个循环中，扩增产物是双链DNA，当较少的限制性引物耗尽后，数量较多的非限制性引物将引导合成大量目标DNA单链。下列说法错误的是（    ） A．若A链为所需的DNA分子探针，则非限制性引物应选用引物Ⅳ B．进行最初10个循环的目的是将限制性引物消耗完，以保证合成大量单链DNA探针 C．设计较短限制性引物与较长非限制性引物，便于后期通过提高温度来控制产物量 D．若体系中原DNA数量为a，进行20次循环，则最终获得的单链探针数为10×210a 9．（24-25高二下·山东菏泽·期中）双脱氧链终止法主要用于DNA基因分析，是应用最多的核酸测序技术。该方法是利用PCR技术在酶、模板、引物、四种脱氧核苷酸存在的情况下，在四管反应系统中按比例分别加入四种双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP），则当双脱氧核苷三磷酸被加入到链末端时，这一链就会停止伸长，而单脱氧核苷三磷酸链末端的片段还可以继续延伸。在结束反应后，用四个泳道进行电泳，结果如下图所示，下列说法错误的是（　　） A．每管反应系统中均需加入2种引物 B．待测模板链的碱基序列为3'-GATGGACACTA-5' C．反应体系中加入的酶只有耐高温的DNA聚合酶 D．结束反应后需将产物进行变性再电泳 二、不定项选择题 10．（24-25高二下·山东聊城·期中）研究发现，大豆GmNF-YA19基因在干旱胁迫中有响应。科研人员利用PCR扩增GmNF-YA19基因，构建GmNF-YA19基因表达载体并转化烟草。含GmNF-YA19基因的DNA片段和载体的结构分别如图1、2所示。下列叙述正确的是（    ） A．PCR扩增GmNF-YA19基因所需的两种引物的碱基序列一般不同 B．为获得能正确表达目的基因的重组质粒，应选用限制酶KpnI、EcoRI进行切割 C．终止子为一段DNA序列，其作用是使翻译在所需要的地方停下来 D．重组质粒转化烟草后，可使用含氨苄青霉素的培养基来筛选受体细胞 11．（24-25高二下·山东日照·期中）Ti质粒上的TDNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将被侵染植物的DNA片段（如下图所示）连接成环，并以此环为模板，利用PCR技术扩增出TDNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定TDNA插入的具体位置。下列说法正确的是（    ） A．PCR扩增的依据是DNA热变性的原理 B．进行PCR扩增需要解旋酶、引物、四种脱氧核苷酸等 C．利用引物②③组合可扩增出T-DNA两侧的未知序列 D．经过3轮扩增可得到含有未知序列的等长的DNA片段 12．（24-25高二下·山东德州·期中）琼脂糖凝胶电泳是用来鉴定PCR产物的常用方法。下列说法正确的是（　　） A．配制的琼脂糖溶液浓度较高时，大分子DNA片段不易分离 B．PCR扩增时，引物特异性较弱会使电泳出现多条条带 C．配制琼脂糖溶液时加入的指示剂可用于监测电泳进程 D．向两个加样孔内加相同分子大小的DNA样品，得到的电泳条带位置可能不同 三、非选择题 13．（24-25高二下·山东聊城·期中）为筛选出能与SARS病毒的S蛋白特异性结合的受体蛋白，研究人员在S蛋白末端添加TAP标签（能特异性地与人和哺乳动物体内IgG类抗体结合），再利用该标签在病毒敏感细胞中快速纯化出S蛋白及其相互作用的蛋白质，部分过程如图。回答下列问题。 注：XhoI、SmaI、EcoRI、BamHI表示限制酶；PCMV、T7表示启动子：Kozak序列是调控基因表达的重要序列且不含限制酶识别序列；Ampr表示氨苄青霉素抗性基因；ori表示复制原点。 (1)为成功构建pcDNA3．1-S-TAP重组质粒，在利用PCR扩增S基因时，应该在S基因的5'端引入Kozak序列和_______限制酶识别序列，并删除S基因3'端的________编码序列；缓冲液中Mg2+的作用是______。 (2)S基因和TAP基因的扩增产物通常用________进行初步鉴定，结果显示两个片段均得到扩增再经测序证实正确后，将这两个片段经限制酶切割并通过_______酶连接导入质粒pcDNA3．1。在重组质粒中，T7的作用是_______。 (3)为检测转染细胞中是否表达出了S-TAP融合蛋白，科研人员将转染24h的细胞置于载玻片，洗涤、固定后，滴加带有荧光标记的_____稀释液，荧光显微镜下观察。若出现荧光标记，则说明转染细胞中表达出了S-TAP融合蛋白。 14．（24-25高二下·山东菏泽·期中）重叠延伸PCR技术通过设计含变异碱基的互补引物，分别与引物a和d进行PCR，产生含变异且重叠的产物，再经重组PCR获得诱变产物（图1），实现定点诱变。图2为利用定向进化策略改造纤维素酶的过程。 (1)PCR技术中，引物的作用是______。PCR与体内DNA的复制相比，不需要________酶的参与。PCR扩增DNA的过程中，引物a、b、c、d中，PCR1应选择图1中引物________，重叠延伸时不需要引物的原因______。 (2)图2中步骤②属于基因工程基本操作中的核心步骤，即_______；步骤③将随机质粒导入大肠杆菌，需先用_______处理大肠杆菌，使其处于感受态。 (3)若利用电泳技术检测PCR1产物AB和PCR2产物CD，已知AB比CD短。由于DNA带负电，在电场中向正极移动，且DNA分子越小，电泳时移动速度________，则电泳结果中AB的条带会位于CD条带的_______（填“前沿”或“滞后”）位置。 (4)用定向进化策略改造纤维素酶，下列说法正确的是_______（填序号）。 A．步骤①中易错PCR等方法引入突变，原理是基因重组 B．步骤④在平板上筛选时，能高效分解纤维素的菌落应具有优良特性的酶 C．定向进化策略获得的纤维素酶的基因序列在筛选前是已知的 D．通过化学诱变剂可定向修饰酶活性中心，使其适应高温环境 一、单选题 1．（24-25高二下·山东菏泽·期中）下列关于“DNA粗提取与鉴定”、“DNA片段的扩增及电泳鉴定”的实验，说法正确的是（　　） A．DNA粗提取与鉴定过程中至少要用到一次离心 B．利用二苯胺试剂鉴定DNA时，需要在沸水加热过程中观察颜色变化 C．电泳结束后可直接观察DNA条带的分布和粗细程度来评价扩增效果 D．凝胶载样缓冲液中的指示剂无法用来观察PCR产物的位置 2．（23-24高二下·山东济南·期中）野生型草莓一般是二倍体，而平常食用的草莓是八倍体。某生物兴趣小组选用八倍体草莓进行了“DNA粗提取与鉴定”实验。下列有关说法错误的是（　　） A．八倍体草莓细胞中的DNA含量高于野生型草莓细胞 B．研磨液用滤纸过滤后，于4℃冰箱中静置后再取上清液 C．向上清液中加入体积分数为95%的冷酒精，利于DNA析出 D．用二苯胺试剂鉴定DNA时，需进行沸水浴加热并冷却处理 3．（24-25高二下·山东菏泽·期中）DNA探针是一段带有检测标记，且顺序已知的、与目的基因互补的DNA序列。为获得荧光标记的DNA探针，在反应体系中加入酶、缓冲液、H2O、4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）和适量序列为5'-TAGACCCAATTGGG-3'的单链DNA。下列说法正确的是（　　） A．该反应体系中加入ATP为子链的延伸提供能量 B．缓冲溶液中一般要添加Ca2+用于激活DNA聚合酶 C．该反应体系中因缺乏引物而无法扩增出产物 D．利用该反应体系可获得两种荧光标记的探针 4．（24-25高二下·山东青岛·期中）科研人员通过基因编辑技术将绿色荧光蛋白（GFP）基因整合到斑马鱼的DNA，最终筛选获得纯合G品系斑马鱼。为研究GFP基因插入的位置，依据插入位点的上下游序列设计了引物1、2，依据GFP基因上下游序列设计了引物3、4，各引物的位置如图1所示。将杂合G品系斑马鱼相互交配，提取子代所有个体的DNA，选取不同的引物组合进行PCR并电泳，得到电泳结果的类型如图2或图3所示。下列说法正确的是（    ） A．图2的电泳结果是选择了引物3、4得到的 B．为验证GFP基因插入方向是否正确可以选择引物1、3 C．图3的电泳结果是选择了引物1、3或引物2、4得到的 D．图2中代表纯合野生型个体的是1，图3中代表纯合G品系个体的是3 5．（24-25高二下·山东泰安·期中）在基因工程中可利用PCR进行体外DNA片段的扩增，PCR 产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。下列说法错误的是（    ） A．琼脂糖凝胶中的DNA 扩增引物分子被核酸染料染色后可在紫外灯下被检测出来 B．耐高温的DNA聚合酶需要激活，PCR 反应缓冲液中需要添加Mg2+ C．电泳时DNA分子会向它所带电荷相反的电极移动，迁移速率与凝胶浓度、DNA分子大小和构象有关 D．PCR利用DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚及与引物的结合 6．（24-25高二下·山东枣庄·期中）组织纤维溶酶原激活物（t-PA）能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药。临床使用发现t-PA有诱发颅内出血的副作用，为此研究人员利用重叠延伸PCR技术对t-PA基因进行改造，过程如图所示。下列说法错误的是（    ） A．PCR1和PCR2不能在同一体系中同时进行 B．至少需要经过3轮PCR2扩增才能得到产物2 C．PCR3需要利用引物a和引物d D．产物1上链和产物2下链形成产物3不需要引物 7．（24-25高二下·山东潍坊·期中）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（    ） A．提取DNA可选用新鲜的菠菜、洋葱、猪肝等作为实验材料 B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构发生改变 D．仅设置一个对照组即可排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 二、不定项选择题 8．（24-25高二下·山东青岛·期中）采用CTAB法可获得高纯度的DNA，CTAB易溶于乙醇，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，该复合物在高盐（>0.7mol/LNaCl）浓度下可溶。具体步骤：①将植物叶片研磨成粉末，加入CTAB提取液和NaCl，离心后取上清液；②上清液中加入氯仿、异戊醇混合液，混匀，离心取上清液；③加入异丙醇，离心取沉淀；④再加入RNA酶、冷却的95%的乙醇，卷起丝状物备用。下列说法错误的是（    ） A．向CTAB-核酸复合物依次加入2mol/LNaCl溶液、乙醇可使核酸和CTAB分离 B．CTAB可通过加速解聚核蛋白用于提取叶绿体中DNA和质粒DNA C．②上清液中加入氯仿、异戊醇混合液的目的可能是除去蛋白质等杂质 D．提取的DNA可在一定温度下利用二苯胺溶液鉴定DNA的纯度 9．（24-25高二下·山东菏泽·期中）下图为Bt-Bar融合基因的结构示意图，科研人员利用基因编辑技术将Bar基因切除，并利用农杆菌转化法将切除后的基因导入到烟草植物细胞，成功获得转基因烟草植株。为检测该转基因烟草植株的Bar基因是否被成功敲除同时未影响Bt基因的正常表达，可用PCR技术进行扩增，再用琼脂糖凝胶电泳。下列关于该鉴定过程及结果，正确的是（　　） A．应取转基因烟草植株细胞的染色体DNA进行PCR检测 B．选择引物1和引物2进行PCR可检测Bar基因是否被成功敲除 C．为增加实验的严谨性，需增加一组未进行敲除处理的转基因烟草植株 D．选用引物3和引物4，若实验组没有条带产生，则可说明敲除成功 10．（24-25高二下·山东·期中）关于“PCR扩增”和“琼脂糖凝胶电泳”实验，下列说法不正确的是（　　） A．PCR实验中，微量离心管、枪头和移液器等在使用前均须消毒处理 B．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察 C．DNA电泳鉴定实验中，DNA的迁移速率与其分子量（大小）成正比 D．DNA电泳鉴定实验中，具有相同碱基数量的环状DNA和链状DNA迁移速率不同 三、非选择题 11．（24-25高二下·山东菏泽·期中）研究人员通过PCR扩增质粒pDNR-LIB中的sacB基因（蔗糖敏感基因，其表达产物会在含有蔗糖的平板上抑制细菌的生长），并将其插入质粒pAH162中，构建重组质粒pAH162-sacB。该质粒导入大肠杆菌后，需验证其双重选择作用。限制酶位点及质粒结构如图所示。 (1)基因工程操作中用到的工具有________，其中限制酶可以使双链DNA分子每一条链中特定部位的______键断开。由构建的pAH162-sacB可推测，sacB基因上下游分别含有限制酶________、_______的识别序列。 (2)sacB基因在筛选重组质粒中的作用是______。 (3)若需在分子水平上检测sacB基因是否成功导入受体细胞，可采用_______等技术；若需检测CAR蛋白是否表达，可采用___________技术。 (4)若要通过设计引物在sacB基因两侧添加限制酶的识别序列，应该添加在引物的________（填“3′端”或“5′端”）。 12．（24-25高二下·山东潍坊·期中）3-磷酸甘油脱氢酶(CPD)是酵母细胞中甘油合成的关键酶。某假丝酵母菌株具有高活性的CPD,目前已测得其基因部分基序列如图1为获取该CPD基因可进行以下操作：先用限制酶PstI处理基因组DNA后，连接形成环形DNA,再依据已知序列设计一对引物，通过PCR扩增出该基因的两侧序列，最后进行测序并拼接获得完整基因的序列。 (1)为激活TaqDNA聚合酶，需要在PCR反应体系中添加__________。PCR过程中变性、复性、延伸三步骤所需温度最低的是________________________。 (2)通过PCR扩增两侧序列应选择图1中的引物是________________，PCR得到的目标序列与环形模板DNA碱基数目不同，原因是_______________________。 (3)获得GPD基因后，将其编码区与图2中的质粒连接，构建重组质粒：为保证正确连接，应在GPD基因编码区上下游引物的5'端分别添加_________________的限制酶识别序列。 A．②③ B．①② C．③② D．①③ (4)现将高活性GPD基因整合到酿酒酵母的染色体DNA上，请写出用PCR技术检测该基因是否转录出mRNA的实验思路________________。 13．（24-25高二下·山东青岛·期中）In-Fusion技术被称为无缝克隆技术，操作流程是：对质粒进行PCR获得线性化载体，通过PCR在目的基因两端插入与线性化载体两端相同的碱基序列，然后将两者PCR产物混合，在In-Fusion酶的作用下，从线性化DNA的3'端起始切除15个核苷酸，进而暴露出互补的黏性末端，最终促使目的基因与载体实现连接，过程如图所示。 (1)PCR技术需要的DNA聚合酶与人体的DNA聚合酶不同之处是_______。图中的同源序列A、C与B、D中的碱基序列一般不同，原因是______。 (2)质粒线性化前后所含有的游离磷酸基团的个数分别为______个和______个。对质粒进行PCR扩增获得线性化载体时，引物应选______。 A．5'CTAGCTGACTCTAGAT3'            B．5'ATCGCCTGACTAGGGA3' C．3'TAGCGGACTGATCCCT5'            D．3'GATCGACTGAGATCTA5' (3)由图可知，目的基因的______（填“a”或“b”）链是转录的模板链。③过程需要使用_________酶，构建稳定的重组质粒。 14．（24-25高二下·山东聊城·期中）小麦的D1b基因是调控光周期的重要基因，当小麦细胞接受足够时长的短日照刺激后，细胞中的A 蛋白就会与D1b基因启动子区中的光周期响应序列结合，进而启动该基因的表达，小麦表现为延迟开花。 (1)与D1b基因相比，D1a 基因的启动子区缺失了含光周期响应序列的片段（长度约2089bp），但其他序列相同，因此D1a基因会使小麦表现为提前开花。欲利用PCR 扩增出D1b和D1a基因的启动子区，科研人员设计了图1中的引物DF 和DR，引物的作用是________。若D1a基因启动子区扩增产物为 709bp，D1b基因启动子区扩增产物为2518bp，则光周期响应序列片段的长度为________ bp。 (2)为找到光周期响应序列的位置，将通过引物F1~F9扩增得到的9种片段、D1b启动子区和D1a启动子区分别与报告基因连接成基因表达载体，如图2 所示。为正确构建基因表达载体，引物DR 的序列应为5‘-___________3’（,写出10个碱基）。将构建成功的11组基因表达载体分别转入拟南芥后，用短日照处理，检测不同组的报告基因开始表达的时间。当实验结果为________时，说明光周期响应序列位于引物F7~F8结合的DNA片段之间。 (3)为找到小麦细胞中的A蛋白，科研人员利用组氨酸和亮氨酸双营养缺陷型酵母菌为受体菌，进行了两次转化实验得到双转化的酵母菌，如图3所示。 ①将含光周期响应序列的诱导型启动子与组氨酸合成酶基因连接，构建成诱饵载体，用该载体转化酵母菌后，其会自主整合到酵母菌基因组中。 ②提取小麦总mRNA，通过_________得到不同的cDNA，以这些 cDNA 片段为目的基因，以亮氨酸合成酶基因为________基因，构建成猎物载体转化上述酵母菌。 ③将双转化后的酵母菌接种到________的选择培养基上培养，若________，则说明该组酵母菌中 cDNA 指导合成的是 A 蛋白。 15．（24-25高二下·山东·期中）干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。下列为部分限制酶的识别序列和酶切位点及某质粒上的酶切位点，科研人员利用大肠杆菌构建工程菌生产干扰素，流程如图所示。请回答下列问题： (1)通过PCR技术扩增干扰素基因，需要设计______种引物，引物作用是______。在PCR扩增完成以后，常采用______来鉴定PCR的产物。 (2)为保证干扰素基因与质粒正确连接，需要选用限制酶______切割干扰素基因，选用限制酶______切割质粒，切割干扰素基因后形成的黏性末端序列应为5'-______-3'和5'-______-3'。 (3)研究发现，通过大肠杆菌获得的干扰素活性较低，从蛋白质的合成及结构角度分析，造成这种结果的原因可能是______。 一、单选题 1．（24-25高二下·山东潍坊·期中）将突变基因导入拟南芥的染色体DNA时，可出现三种结果：仍为野生型（导入失败）、突变杂合子(在一对同源染色体上只导入1个突变基因)及突变纯合子。研究人员进行了如图1转基因操作后，用引物LP、RP和BP对拟南芥DNAPCR扩增并进行电泳检测，得到结果如图2。不考虑突变基因插入染色体的其他位置。下列说法错误的是（    ） A．乙组、丙组分别为突变纯合子、突变杂合子 B．由LP+RP组电泳结果可知，加样孔位于电泳条带上方 C．模板链过长导致使用引物BP+LP无法产生PCR产物 D．甲与乙杂交后代的DNA利用上述引物PCR扩增后，电泳结果与丙相同 2．（24-25高二下·山东德州·期中）以新鲜洋葱为材料进行“DNA粗提取与鉴定”实验时，所用研磨液的成分主要有Tris（缓冲作用）、SDS（去污剂，可使蛋白质线性化）、EDTA（蛋白质变性剂）、NaCl等。下列说法错误的是（　　） A．Tris可维持研磨液的pH，防止DNA被破坏 B．SDS可破坏细胞膜的结构，使研磨更充分 C．EDTA可抑制DNA酶的活性，防止研磨过程中DNA被水解 D．研磨后过滤得到的上清液中含有DNA，用玻璃棒搅拌即可析出DNA 3．（24-25高二下·山东·期中）某生物实验小组利用菜花进行“DNA粗提取与鉴定”实验。下列操作正确的是（　　） A．利用酒精初步分离DNA与蛋白质的原理是DNA更易溶于酒精 B．将菜花研磨液倒入放有滤纸的漏斗中，以获取含大量DNA的滤液 C．将析出的丝状物加入2mol·L⁻¹的NaCl溶液溶解DNA以去除杂质 D．用二苯胺对DNA进行鉴定时需在沸水中进行，且需要对照实验 4．（24-25高二下·山东德州·期中）CpG岛主要位于基因的启动子和外显子区域，是富含CpG二核苷酸的一些区域，长度为300～3000个碱基对。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。甲基化特异PCR的基本原理是DNA经重亚硫酸盐处理后，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，以处理后的产物作为模板，加入特异性结合甲基化模板链的引物（primerI）或特异性结合非甲基化模板链的引物（primerII），进行扩增，只有引物与模板链完全结合才能得到扩增产物。据此分析，下列说法正确的是（　　） A．CpG岛的一条单链中C和G之间形成三个氢键 B．甲基化的DNA无法与DNA聚合酶结合，从而影响DNA的复制 C．设计引物时，primerI中含有碱基G，primerII中不含碱基G D．若用primerI得不到扩增产物，用primerII能得到扩增产物，则说明DNA发生甲基化 二、不定项选择题 5．（24-25高二下·山东潍坊·期中）细菌中的蛋白激酶Y能感受外界环境变化从而调控细菌的生长。研究人员欲利用无缝连接技术将Y基因（编码蛋白激酶Y)与绿色荧光蛋白(GFP)基因拼接成Y-GFP融合基因，并表达出Y-GFP融合蛋白，以分析蛋白激酶Y的功能。图1为无缝连接技术，T5核酸外切酶能沿5'→3'方向降解DNA单链；图2为Y基因、GFP基因及Y-GFP融合基因示意图。下列说法错误的是（    ） A．T5核酸外切酶可破坏DNA中的磷酸二酯键 B．图1中③过程所需酶是DNA聚合酶、DNA连接酶 C．为完成Y基因、GFP基因的连接需在引物P2、P3的5'端添加对应的碱基序列 D．去掉Y基因的终止子，融合基因即可表达出Y-GFP融合蛋白 三、非选择题 6．（24-25高二下·山东菏泽·期中）桥接RNA-重组酶是一种突破了以往基因编辑中目标片段大小的限制，更加精准有效的用于基因组编辑的技术。桥接RNA由S基因上游的非编码区转录而来，其中第二、三茎环分别与可插入目标片段的靶标序列、含有目标片段的供体序列结合，使二者在空间上相互靠近，其结构如图1所示。重组酶是由S基因编码而来，其可以识别并切割靶标序列和供体序列的特定部位，将供体序列中的目标片段插入靶标序列中，实现基因重组，作用过程如图2、图3所示。 (1)重组酶在基因编辑中过程中充当了基因工程工具中_____的功能，该过程涉及_______（填化学键）的变动。 (2)结合上述研究，对桥接RNA的第二、三茎环进行人工设计，即可用以结合和重组不同的DNA片段。设计桥接RNA茎环中的结合序列时，需要依据________的碱基序列，然后通过人工合成的方法获取与桥接RNA对应的特定DNA序列，再利用_____技术扩增。 (3)研究发现某大肠杆菌中质粒A上的卡那霉素抗性基因因缺乏启动子而无法表达，利用上述方法在质粒A中插入甲醇诱导型启动子，实验流程为：对大肠杆菌另一质粒B进行编辑，包含______→将该质粒转入大肠杆菌→使用含有______的培养基筛选→获取基因编辑成功的菌株。 (4)科研人员设计了绿色荧光蛋白（GFP）报告系统，结构如下图所示，经重组酶-桥接RNA复合物处理可使其从无荧光变为能发出绿色荧光。 该报告系统可证明，重组酶-桥接RNA复合物除能实现DNA片段插入外，还能实现DNA片段_____。据此，重组酶-桥接RNA基因编辑技术可用于降低器官移植时免疫排斥的发生，推测其原理是________。 7．（24-25高二下·山东日照·期中）某种能以甲醇为唯一碳源的酵母菌可作为生产抗原蛋白的工程菌。研究人员以图1所示质粒为载体，构建含乙型肝炎病毒表面抗原蛋白（HBsAg）基因的重组质粒，将重组质粒导入组氨酸缺陷型大肠杆菌（在缺失组氨酸的培养基中无法生存）中进行扩增，再经酶切后导入酵母菌，经同源重组整合到其染色体DNA上。 (1)科研人员构建HBsAg基因表达载体的目的是__________________。为防止HBsAg基因与质粒自身环化和反向连接，最好选用_________酶对质粒进行酶切处理，并使用E.coliDNA连接酶高效连接HBsAg基因。 (2)5'-CGCTACTCATTGCTGCG……CGGATGAGCGCGTAGAT-3'为HBsAg基因a链的部分序列。利用PCR技术获取HBsAg基因时，引物M与_________（填“a链”或“b链”）的部分序列互补。某同学设计了如下的4种引物，引物N对应的序列为_________。   A．5'-GGATCCATCTACGCGCTCATCCG-3' B．5'-CCCGGGCGCTACTCATTGCTGCG-3' C．5'-CGCAGCAATGAGTAGCGGGGCCC-3' D．5'-CGGATGAGCGCGTAGATGGATCC-3' (3)将重组质粒导入大肠杆菌的目的是__________，将重组质粒导入大肠杆菌时应在_________和含有氨苄青霉素的培养基上进行筛选。 (4)转化的酵母菌在培养基上培养时，需向其中加入甲醇，目的是___________。 8．（24-25高二下·山东枣庄·期中）人血清白蛋白（HSA）是由肝脏细胞合成的，具有重要的医用价值，原本只能从血清中提取，现利用基因工程的方法生产HSA。图1为HSA基因（仅列出部分序列），图2为构建的基因表达载体，甲、乙、丙表示引物，其碱基分别与相近的核苷酸链互补配对。 (1)利用PCR扩增技术获取HSA基因，需要的酶是________，该技术每次循环需要_______三步。在PCR扩增仪中完成反应后，常采用_________来鉴定PCR的产物。 (2)根据HSA基因的已知序列，应选用引物________进行PCR扩增。 A．5'-CTGTATGCG-3'  B．5'-TACGCGTTA-3' C．5'-GACATACGC-3'  D．5′-ATGCGCAAT-3' 经过4轮扩增，扩增产物中含有的符合要求的HSA基因的数量为________。 (3)为了检测HSA基因是否正确连接在质粒上，应选择图2中的引物_______对构建的载体进行PCR扩增，理论上出现________bp的条带表明HSA正确连接在了载体上。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题04 基因工程的基本工具和PCR 一、单选题 1．（24-25高二下·山东聊城·期中）下列关于重组DNA技术的基本工具的叙述，错误的是（    ） A．E．coliDNA连接酶既能“缝合”黏性末端，也能“缝合”平末端 B．限制性内切核酸酶主要来自原核生物，一般不切割自身DNA C．载体上要有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入 D．DNA连接酶能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 【答案】D 【分析】DNA连接酶：（1）根据酶的来源不同分为两类：E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。（2）DNA连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。（3）DNA连接酶和DNA聚合酶的区别：①DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯键；②DNA连接酶是同时连接双链的切口，而DNA聚合酶只是在单链上将一个个脱氧核苷酸连接起来；③DNA连接酶不需要模板，而DNA聚合酶需要模板。 【详解】A、E.coli DNA连接酶能连接具有互补黏性末端的DNA片段，也能“缝合”平末端，A正确； B、限制性内切核酸酶主要来自原核生物，一般不切割自身DNA，B正确； C、载体上要有一个至多个限制酶切割位点，便于切割后与外源DNA片段进行连接，C正确； D、DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键，D错误。 故选D。 2．（24-25高二下·山东菏泽·期中）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的说法，正确的是（    ） A．以洋葱为实验材料进行该实验必须在无菌条件下进行 B．对研磨液进行离心是为了加速DNA的沉淀 C．与家兔血相比，洋葱更适合用于DNA的粗提取与鉴定 D．加入预冷酒精溶液后离心，取上清液备用 【答案】C 【分析】DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的。 【详解】A、细胞生物中都含有DNA，DNA的粗提取不需要在无菌条件下进行，A错误； B、离心研磨液的目的是加速沉淀，离心能够加速细胞膜、细胞器、一些较大杂质的沉淀，而不是DNA的沉淀，B错误； C、家兔为哺乳动物，成熟红细胞不含细胞核和细胞器，而洋葱中DNA含量较高，因此与家兔血相比，洋葱更适合用于DNA的粗提取与鉴定，C正确； D、DNA不溶于体积分数为95%的冷酒精，因此加入预冷酒精溶液后静置2-3分钟，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA，D错误。 故选C。 3．（24-25高二下·山东日照·期中）某同学利用菜花进行“DNA的粗提取与鉴定”实验，相关叙述正确的是（    ） A．实验中可进行两次离心，都是取上清液备用 B．向上清液中加入预冷酒精的目的是析出其中的杂质 C．向上清液中加入木瓜蛋白酶有利于去除其中的蛋白质 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 【答案】C 【分析】实验原理：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。DNA在不同浓度的氯化钠溶液中溶解度不同，在0.14mol/L的氯化钠溶液中溶解度最低；DNA不溶于酒精，而细胞中某些蛋白质则溶于酒精。 【详解】A、实验中可进行两次离心，第一次离心是为了沉淀细胞核，取沉淀物备用；第二次离心是为了沉淀蛋白，取上清液备用，A错误； B、向上清液中加入预冷酒精的目的是析出DNA，B错误； C、木瓜蛋白酶可分解蛋白质，且不破坏DNA。加入木瓜蛋白酶能有效去除溶液中的蛋白质杂质，提高DNA纯度，C正确； D、实验中仅需设置未加DNA的对照组（加热），若其不变蓝而实验组变蓝，即可证明DNA存在，D错误。 故选C。 4．（24-25高二下·山东枣庄·期中）下列有关基因工程工具的叙述，正确的是（    ） A．一种限制酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列 B．T4DNA连接酶只能将具有平末端的DNA片段连接 C．限制酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶 D．RNA病毒一般不可以作为基因工程的载体 【答案】D 【分析】1、基因工程的工具：（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。（2）DNA连接酶：根据酶的来源不同分为两类：E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。这二者都能连接黏性末端和平末端。（3）载体：常用的载体有质粒、噬菌体、动植物病毒等。 2、作为载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因）；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。 【详解】A、每种限制酶只能识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特定位点进行切割，体现了酶的专一性，A错误； B、根据酶的来源不同，DNA连接酶分为两类：E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，这二者都能连接黏性末端核和平末端，B错误； C、限制酶、DNA连接酶和质粒是基因工程常用的工具，其中限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，C错误； D、常用的运载体有质粒、噬菌体、动植物病毒等，但RNA病毒为遗传物质是RNA，为单链结构，一般不作为基因工程的载体，D正确。 故选D。 5．（24-25高二下·山东枣庄·期中）某同学利用洋葱为实验材料，进行DNA粗提取和鉴定实验。下列叙述错误的是（    ） A．也可以选择菜花、香蕉、鸡血等作为实验材料，提取方法可能稍有不同 B．向DNA提取液中加入体积分数为95%的冷酒精后，出现的白色丝状物为粗提取的DNA C．将洋葱研磨液过滤后，置于4℃冰箱中几分钟后，DNA出现在沉淀物中 D．鉴定时，先将丝状物溶于2molLNaCl溶液，再加入二苯胺并进行沸水浴加热 【答案】C 【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是： ①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的； ②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离； ③在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色； 【详解】A、不同类型的生物材料（如菜花、香蕉、鸡血等）中DNA的提取过程虽有相似之处，但也存在差异。例如，使用鸡血作为实验材料时，通常利用红细胞破裂释放出的DNA进行提取，而不需要研磨和去除细胞壁的过程，A正确； B、在DNA提取过程中，加入体积分数为95%的冷酒精后，DNA会因不溶于酒精而析出，形成白色的絮状或丝状沉淀，这就是粗提取得到的DNA，B正确； C、将洋葱研磨液过滤后，置于4℃冰箱中几分钟后，DNA出现在上清液中，C错误； D、鉴定DNA时，常用的方法之一就是二苯胺试剂显色反应，先将丝状物溶于2molLNaCl溶液，再加入二苯胺试剂并进行沸水浴加热，反应液会变为蓝色，D正确。 故选C。 6．（24-25高二下·山东菏泽·期中）科研人员利用转基因技术将酵母菌的YCF1（镉转运蛋白）基因整合到杨树染色体上，培育能富集镉的转基因杨树。下列说法错误的是（    ） 限制酶 BamHI XmaI BclI SmaI 识别序列及切割位点 -G↓GATCC- -C↓CCGGG- -T↓GATCA- -CCC↓GGG- A．利用PCR技术获取并克隆YCF1基因时，需设计2种引物 B．启动子的作用是为YCF1基因的转录提供起始密码子 C．若用BclI切割质粒，会破坏质粒中的氨苄青霉素抗性基因 D．构建重组质粒时，为保留标记基因，应选择Smal和Bcll切割质粒 【答案】B 【分析】PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR过程要设计引物，引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20〜30个核苷酸。PCR过程还需要而高温的DNA聚合酶，真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要 Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。 【详解】A、PCR反应时DNA两条链都可以作模板，每条模板链都需要引物，故若要利用PCR技术获取并克隆YCF1基因，需要设计2种引物，A正确； B、启动子位于基因的首端，而起始密码子位于mRNA上，启动子使RNA聚合酶识别和结合的位点，B错误； C、据图可知，氨苄青霉素抗性基因中含有BclI的切割位点，因此若用BclI切割质粒，会破坏质粒中的氨苄青霉素抗性基因，C正确； D、据图可知，限制酶切割的YCF1基因一边为平末端，一边为黏性末端。XmaⅠ切割质粒形成黏性末端，SmaⅠ能切割XmaⅠ识别的核苷酸序列并形成平末端，故要选择SmaⅠ。BclⅠ与BamHⅠ切割质粒形成的黏性末端均为－CTAG，但选择BamHⅠ会破坏质粒中的两个标记基因，故应选择BclⅠ。因此切割质粒需用到的限制酶是SmaⅠ和BclⅠ，D正确。 故选B。 7．（24-25高二下·山东菏泽·期中）1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉，下列关于用Bt基因培育转基因抗虫棉四个主要步骤的说法，正确的是（　　） A．这四个步骤中均可用到碱基互补配对的原则 B．基因表达载体中的终止密码子能够使基因停止转录 C．若利用PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA，则不能根据目的基因的启动子和终止子序列设计引物 D．成功将两个Bt基因转入棉花的染色体DNA中，则自交后代一定具有抗虫特性 【答案】C 【分析】基因工程基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取，②基因表达载体的构建，③将目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定。其中核心步骤为基因表达载体的构建，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。 【详解】A、基因工程的四个步骤中不都用到碱基互补配对的原则，如将目的基因导入到受体细胞不会涉及碱基互补配对原则，A错误； B、基因表达载体中的终止子能够使基因停止转录，B错误； C、当使用PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA时，通常是通过逆转录PCR进行的。需以mRNA为模板，通过逆转录酶合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，则引物的设计需要根据cDNA的两端设计，cDNA不包含目的基因的启动子和终止子序列，C正确； D、若两个基因插入同一条染色体上，则该转基因棉花相当于杂合子，其自交后代会出现分离，因而自交后代未必一定具有抗虫特性，D错误。 故选C。 8．（24-25高二下·山东青岛·期中）DNA分子杂交时，常需要大量的单链DNA探针。不对称PCR是一种常见的单链DNA探针制备方法，其原理是反应体系中加入一对数量不相等的引物。假设在PCR反应的早期10个循环中，扩增产物是双链DNA，当较少的限制性引物耗尽后，数量较多的非限制性引物将引导合成大量目标DNA单链。下列说法错误的是（    ） A．若A链为所需的DNA分子探针，则非限制性引物应选用引物Ⅳ B．进行最初10个循环的目的是将限制性引物消耗完，以保证合成大量单链DNA探针 C．设计较短限制性引物与较长非限制性引物，便于后期通过提高温度来控制产物量 D．若体系中原DNA数量为a，进行20次循环，则最终获得的单链探针数为10×210a 【答案】B 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。 【详解】A、由于DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链，引物Ⅱ和Ⅲ不能作为扩增探针序列的引物，据题干信息“数量较多的非限制性引物将引导合成大量目标DNA 单链”可知，若A链为所需的DNA分子探针，即目标DNA单链，则非限制性引物应选用引物Ⅳ，A正确； B、 进行最初10个循环的目的是增加模板DNA的量，以便后期更快得到较多数量的目标DNA单链（单链DNA探针），B错误； C、引物越短，复性时可与模板链形成的氢键数越少，越容易被高温破坏，因此可设计较短的限制性引物与较长的非限制性引物，适当提高复性温度以避免残留限制性引物与模板结合，从而提高产物生成量，C正确； D、如果体系中原模板DNA的数量为a，最初10次循环产物为双链DNA分子为210×a个，其中有B链为210×a个，以这些链为模板，利用引物又进行了10次循环，每次循环生成的都是A链，不改变B链的数目，即B每次循环开始都是210×a个，10次循环每次生成A也是210×a个，故最终获得的单链探针数共为10×210×a个，D正确。 故选B。 9．（24-25高二下·山东菏泽·期中）双脱氧链终止法主要用于DNA基因分析，是应用最多的核酸测序技术。该方法是利用PCR技术在酶、模板、引物、四种脱氧核苷酸存在的情况下，在四管反应系统中按比例分别加入四种双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP），则当双脱氧核苷三磷酸被加入到链末端时，这一链就会停止伸长，而单脱氧核苷三磷酸链末端的片段还可以继续延伸。在结束反应后，用四个泳道进行电泳，结果如下图所示，下列说法错误的是（　　） A．每管反应系统中均需加入2种引物 B．待测模板链的碱基序列为3'-GATGGACACTA-5' C．反应体系中加入的酶只有耐高温的DNA聚合酶 D．结束反应后需将产物进行变性再电泳 【答案】A 【分析】双脱氧测序法的原理：在DNA聚合酶、引物、四种单脱氧核苷酸（dNTP）存在的情况下，如果在四管反应系统中再分别加入四种双脱氧核苷三磷酸（ ddNTP），DNA链合成反应过程中 ddNTP与dNTP处于一种竞争状态，即新合成DNA链既可能掺入正常dNTP，也可能掺入ddNTP并使新合成链终止延伸。这样在每个反应系统中形成的产物是一系列长度不等的多核苷酸片段，这些片段具有相同的起点，即引物的5'端，但有不同的ddNTP终端。 在结束反应后，用四个泳道进行电泳，分别分离各组反应体系中不同长度的DNA 片段，检测DNA片段终止末端位置的碱基种类，从自显影图谱中直接读取到与模板相匹配的新的链序。 【详解】A、利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A错误； B、依据题中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA片段）的3'终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带（DNA片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3'，根据碱基互补配对原则可知，待测模板链的碱基序列为3'-GATGGACACTA-5'，B正确； C、反应体系中加入的酶只有耐高温的DNA聚合酶，该酶能催化游离的脱氧核苷酸依次连接到引物的3’端，C正确； D、结束反应后需将产物进行变性获得单链后再电泳，D正确。 故选A。 二、不定项选择题 10．（24-25高二下·山东聊城·期中）研究发现，大豆GmNF-YA19基因在干旱胁迫中有响应。科研人员利用PCR扩增GmNF-YA19基因，构建GmNF-YA19基因表达载体并转化烟草。含GmNF-YA19基因的DNA片段和载体的结构分别如图1、2所示。下列叙述正确的是（    ） A．PCR扩增GmNF-YA19基因所需的两种引物的碱基序列一般不同 B．为获得能正确表达目的基因的重组质粒，应选用限制酶KpnI、EcoRI进行切割 C．终止子为一段DNA序列，其作用是使翻译在所需要的地方停下来 D．重组质粒转化烟草后，可使用含氨苄青霉素的培养基来筛选受体细胞 【答案】AD 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：PCR技术扩增等。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、PCR扩增GmNF-YA19基因的前提是根据已知核苷酸序列合成两种引物，因为子链的延伸方向是在引物的3’端连接脱氧核苷酸，因此PCR扩增GmNF-YA19基因所需的两种引物的碱基序列一般不同，A正确； B、根据图中信息，在质粒的启动子和终止子中间含有的限制酶为Pvu Ⅱ、Kpn I 和EcoR I三种限制酶切割位点，由于Kpn I在质粒中不只一个识别位点，用其切割会丢失终止子，因此最好选用Pvu Ⅱ和EcoR I进行切割。且在目的基因的两端也存在着两种酶的识别位点，即选用Pvu Ⅱ和EcoR I两种限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体，这样可以保证目的基因和质粒正向连接，避免它们发生自身环化，B错误； C、终止子是位于基因末端的一段特殊的DNA序列，其作用是使转录过程在所需要的地方停下来，C错误； D、重组质粒转化烟草后，重组质粒中含有抗氨苄青霉素的基因，该基因可作为标记基因，因而使用含氨苄青霉素的培养基来筛选成功导入重组质粒的目的细胞，D正确。 故选AD。 11．（24-25高二下·山东日照·期中）Ti质粒上的TDNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将被侵染植物的DNA片段（如下图所示）连接成环，并以此环为模板，利用PCR技术扩增出TDNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定TDNA插入的具体位置。下列说法正确的是（    ） A．PCR扩增的依据是DNA热变性的原理 B．进行PCR扩增需要解旋酶、引物、四种脱氧核苷酸等 C．利用引物②③组合可扩增出T-DNA两侧的未知序列 D．经过3轮扩增可得到含有未知序列的等长的DNA片段 【答案】AD 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端至3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】A、PCR扩增的依据是DNA热变性的原理，A正确； B、进行PCR扩增不需要解旋酶，DNA分子经过加热即可解旋，B错误； C、由于DNA的两条链反向平行，且子链从引物的3′端开始延伸，故利用图中的引物①、④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误； D、PCR扩增可得到含有未知序列的等长的DNA数目为2n-2n，所以经过3轮扩增可得到2个含有未知序列的等长的DNA片段，D正确。 故选AD。 12．（24-25高二下·山东德州·期中）琼脂糖凝胶电泳是用来鉴定PCR产物的常用方法。下列说法正确的是（　　） A．配制的琼脂糖溶液浓度较高时，大分子DNA片段不易分离 B．PCR扩增时，引物特异性较弱会使电泳出现多条条带 C．配制琼脂糖溶液时加入的指示剂可用于监测电泳进程 D．向两个加样孔内加相同分子大小的DNA样品，得到的电泳条带位置可能不同 【答案】ABD 【分析】PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 【详解】A、配制的琼脂糖溶液浓度较高时，大分子DNA片段在凝胶中迁移速率较慢，因此不易分离，A正确； B、PCR扩增时，引物特异性较弱会存在多种不同的扩增片段，因此会导致电泳出现多条条带，B正确； C、琼脂糖凝胶电泳中，指示剂是添加到上样缓冲液中，而不是直接添加到琼脂糖溶液中，C错误； D、在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，所以向两个加样孔内加相同分子大小的DNA样品，得到的电泳条带位置可能不同，D正确。 故选ABD。 三、非选择题 13．（24-25高二下·山东聊城·期中）为筛选出能与SARS病毒的S蛋白特异性结合的受体蛋白，研究人员在S蛋白末端添加TAP标签（能特异性地与人和哺乳动物体内IgG类抗体结合），再利用该标签在病毒敏感细胞中快速纯化出S蛋白及其相互作用的蛋白质，部分过程如图。回答下列问题。 注：XhoI、SmaI、EcoRI、BamHI表示限制酶；PCMV、T7表示启动子：Kozak序列是调控基因表达的重要序列且不含限制酶识别序列；Ampr表示氨苄青霉素抗性基因；ori表示复制原点。 (1)为成功构建pcDNA3．1-S-TAP重组质粒，在利用PCR扩增S基因时，应该在S基因的5'端引入Kozak序列和_______限制酶识别序列，并删除S基因3'端的________编码序列；缓冲液中Mg2+的作用是______。 (2)S基因和TAP基因的扩增产物通常用________进行初步鉴定，结果显示两个片段均得到扩增再经测序证实正确后，将这两个片段经限制酶切割并通过_______酶连接导入质粒pcDNA3．1。在重组质粒中，T7的作用是_______。 (3)为检测转染细胞中是否表达出了S-TAP融合蛋白，科研人员将转染24h的细胞置于载玻片，洗涤、固定后，滴加带有荧光标记的_____稀释液，荧光显微镜下观察。若出现荧光标记，则说明转染细胞中表达出了S-TAP融合蛋白。 【答案】(1) SmaI 终止密码子 激活TaqDNA聚合酶 (2) 琼脂糖凝胶电泳 DNA连接 是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA (3)IgG类抗体 【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）构建重组质粒时，要将S基因与含TAP基因的载体连接，从图中可知载体上S基因插入位点一侧有XhoI限制酶识别序列，所以在利用PCR扩增S基因时，应该在S基因的5'端引入Kozak序列和SmaI限制酶识别序列。因为要构建S-TAP融合蛋白，所以需删除S基因3'端的终止密码子序列，这样才能使S基因和TAP基因编码的蛋白连接起来。缓冲液中Mg2+的作用是作为Taq酶的激活剂，维持Taq酶的活性。 （2）S基因和TAP基因的扩增产物通常用琼脂糖凝胶电泳进行初步鉴定，通过电泳可根据片段的迁移速率等判断是否扩增成功。将这两个片段经限制酶切割后，通过DNA连接酶连接导入质粒DNA3.1。在重组质粒中，T7是启动子，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 （3）因为TAP标签能特异性地与人或哺乳动物体内IgG类抗体结合，所以为检测转染细胞中是否表达出了S-TAP融合蛋白，科研人员将转染24h的细胞置于载玻片，洗涤、固定后，滴加带有荧光标记的IgG类抗体稀释液，若出现荧光标记，则说明转染细胞中表达出了S-TAP融合蛋白。 14．（24-25高二下·山东菏泽·期中）重叠延伸PCR技术通过设计含变异碱基的互补引物，分别与引物a和d进行PCR，产生含变异且重叠的产物，再经重组PCR获得诱变产物（图1），实现定点诱变。图2为利用定向进化策略改造纤维素酶的过程。 (1)PCR技术中，引物的作用是______。PCR与体内DNA的复制相比，不需要________酶的参与。PCR扩增DNA的过程中，引物a、b、c、d中，PCR1应选择图1中引物________，重叠延伸时不需要引物的原因______。 (2)图2中步骤②属于基因工程基本操作中的核心步骤，即_______；步骤③将随机质粒导入大肠杆菌，需先用_______处理大肠杆菌，使其处于感受态。 (3)若利用电泳技术检测PCR1产物AB和PCR2产物CD，已知AB比CD短。由于DNA带负电，在电场中向正极移动，且DNA分子越小，电泳时移动速度________，则电泳结果中AB的条带会位于CD条带的_______（填“前沿”或“滞后”）位置。 (4)用定向进化策略改造纤维素酶，下列说法正确的是_______（填序号）。 A．步骤①中易错PCR等方法引入突变，原理是基因重组 B．步骤④在平板上筛选时，能高效分解纤维素的菌落应具有优良特性的酶 C．定向进化策略获得的纤维素酶的基因序列在筛选前是已知的 D．通过化学诱变剂可定向修饰酶活性中心，使其适应高温环境 【答案】(1) 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 解旋酶（DNA连接酶） a和b 可以分别以AB上链和CD下链为引物进行延伸 (2) 基因表达载体的构建 Ca2+（或CaCl2） (3) 越快 前沿 (4)B 【分析】PCR技术进行的条件有：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定性的DNA聚合酶，所运用的原理为DNA分子的复制，遵循碱基互补配对原则。 【详解】（1）PCR技术中，引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。PCR技术是利用高温使DNA变性，双链打开，与体内DNA复制相比，PCR技术不需要解旋酶。PCR扩增DNA的过程中，新合成的两条单链延伸方向相反，PCR1应选择引物a和b，重叠延伸时，可以分别以AB上链和CD下链为引物进行延伸，所以不需要引物。 （2）图2中步骤②属于基因工程基本操作中的核心步骤，即基因表达载体的构建，在基因工程中，将基因表达载体导入大肠杆菌前，先用Ca2+（或CaCl2）处理，使之成为感受态细胞。 （3）由于DNA带负电，在电场中向正极移动，且DNA分子越小，电泳时移动速度越快，由于AB比CD短，所以AB的移动速度比CD快，在电泳结果中，AB条带位于CD条带的前沿。 （4）A、易错PCR引入突变的原理是碱基的错误配对，而非基因重组，A错误； B、步骤④的筛选依据是菌落对纤维素的高效分解能力，说明其表达的纤维素酶具有优良特性，B正确； C、定向进化的关键是通过随机突变和筛选获得改良酶，筛选前基因序列未知，突变是随机的，C错误； D、化学诱变剂的作用是随机诱发突变，无法定向修饰特定区域，定向修饰需理性设计，D错误。 故选B。 一、单选题 1．（24-25高二下·山东菏泽·期中）下列关于“DNA粗提取与鉴定”、“DNA片段的扩增及电泳鉴定”的实验，说法正确的是（　　） A．DNA粗提取与鉴定过程中至少要用到一次离心 B．利用二苯胺试剂鉴定DNA时，需要在沸水加热过程中观察颜色变化 C．电泳结束后可直接观察DNA条带的分布和粗细程度来评价扩增效果 D．凝胶载样缓冲液中的指示剂无法用来观察PCR产物的位置 【答案】D 【分析】DNA的粗提取和鉴定的原理：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA和蛋白质。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液中。在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 【详解】A、在DNA粗提取过程中，可用其它方式代替离心过程，如采用4 ℃冰箱冷置获取上清液来代替离心获取上清液，A错误； B、利用二苯胺试剂鉴定DNA时，在沸水浴的条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色，需要在沸水浴冷却后再观察颜色变化，而不是在沸水加热过程中观察，B错误； C、电泳结束后，需经染色后才能观察到DNA条带的分布和粗细程度，以此来评价扩增效果，而不是直接观察，C错误； D、凝胶载样缓冲液中通常含有一种或多种荧光指示剂（如溴酚蓝、二甲苯青FF等）。这些指示剂在电场作用下会随着DNA一起迁移，但它们的迁移速度是已知的，并且通常比大多数DNA片段快。通过观察指示剂在凝胶中的位置，可以大致判断DNA片段在电泳过程中迁移了多远，从而间接了解PCR产物的迁移位置和电泳的进程，D正确。 故选D。 2．（23-24高二下·山东济南·期中）野生型草莓一般是二倍体，而平常食用的草莓是八倍体。某生物兴趣小组选用八倍体草莓进行了“DNA粗提取与鉴定”实验。下列有关说法错误的是（　　） A．八倍体草莓细胞中的DNA含量高于野生型草莓细胞 B．研磨液用滤纸过滤后，于4℃冰箱中静置后再取上清液 C．向上清液中加入体积分数为95%的冷酒精，利于DNA析出 D．用二苯胺试剂鉴定DNA时，需进行沸水浴加热并冷却处理 【答案】B 【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是：①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的；②DNA不容于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离；③DNA对于酶、高温和洗涤剂的耐受性，蛋白酶能水解蛋白质，但是不能水解DNA，蛋白质不能耐受较高温度，DNA能耐受较高温度洗涤剂能瓦解细胞膜，但是对DNA没有影响；④在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。 【详解】A、DNA位于染色体上，八倍体草莓的细胞中含有八个染色体组，其DNA含量高于野生型二倍体草莓细胞，A正确； B、研磨液用纱布过滤后，于4℃冰箱中静置后再取上清液，B错误； C、向上清液中加入体积分数为95%的冷酒精，DNA会因不溶于酒精而析出，形成白色的絮状或丝状沉淀，C正确； D、在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，需沸水浴加热冷却后再观察颜色变化，D正确。 故选B。 3．（24-25高二下·山东菏泽·期中）DNA探针是一段带有检测标记，且顺序已知的、与目的基因互补的DNA序列。为获得荧光标记的DNA探针，在反应体系中加入酶、缓冲液、H2O、4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）和适量序列为5'-TAGACCCAATTGGG-3'的单链DNA。下列说法正确的是（　　） A．该反应体系中加入ATP为子链的延伸提供能量 B．缓冲溶液中一般要添加Ca2+用于激活DNA聚合酶 C．该反应体系中因缺乏引物而无法扩增出产物 D．利用该反应体系可获得两种荧光标记的探针 【答案】C 【分析】PCR反应体系需要耐高温的DNA聚合酶、扩增缓冲液、水等，还需要引物。 【详解】A、该反应体系中加入dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP为子链的延伸提供能量，A错误； B、缓冲溶液中一般要添加Mg2+用于激活DNA聚合酶，B错误； C、DNA聚合酶不能从头合成DNA，必须在模板上存在引物才能启动链延伸，该反应体系中因缺乏引物而无法扩增出产物，C正确； D、反应体系中只有一个单链DNA模板（5’-TAGACCCAATTGGG-3’），只能合成一种与其互补的DNA链（序列为5’-CCCAATTGGGTCTA-3’）。使用荧光标记的dATP后，新合成的链会被荧光标记，但仅产生一种探针（即互补链）。模板本身未标记，且序列无自身互补性，不会产生第二种探针，D错误。 故选C。 4．（24-25高二下·山东青岛·期中）科研人员通过基因编辑技术将绿色荧光蛋白（GFP）基因整合到斑马鱼的DNA，最终筛选获得纯合G品系斑马鱼。为研究GFP基因插入的位置，依据插入位点的上下游序列设计了引物1、2，依据GFP基因上下游序列设计了引物3、4，各引物的位置如图1所示。将杂合G品系斑马鱼相互交配，提取子代所有个体的DNA，选取不同的引物组合进行PCR并电泳，得到电泳结果的类型如图2或图3所示。下列说法正确的是（    ） A．图2的电泳结果是选择了引物3、4得到的 B．为验证GFP基因插入方向是否正确可以选择引物1、3 C．图3的电泳结果是选择了引物1、3或引物2、4得到的 D．图2中代表纯合野生型个体的是1，图3中代表纯合G品系个体的是3 【答案】B 【分析】PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 【详解】A、若选择引物3、4进行PCR，由于GFP基因已整合到斑马鱼DNA中，纯合G品系斑马鱼有两个GFP基因，会扩增出两条大小相同的条带，杂合G品系斑马鱼有一个GFP基因，会扩增出一条条带，纯合野生型个体无GFP基因，无条带。图2中1无条带，2、3有一条条带，符合选择引物1、2对杂合G品系斑马鱼相互交配子代进行PCR的结果，而不是引物3、4，A错误； B、 如果选择引物1、3，若GFP基因插入方向正确，能进行PCR扩增得到条带；若插入方向错误，引物1和3无法正常结合到DNA上进行扩增，无条带，所以可以验证GFP基因插入方向是否正确，B正确； C、若选择引物1、3或引物2、4，对于纯合G品系斑马鱼会扩增出两条不同大小的条带，杂合G品系斑马鱼会扩增出三条条带（两条不同大小的来自插入GFP基因的片段，一条来自未插入的片段），纯合野生型个体有一条条带。图3中1有一条条带，2有三条条带，3有两条条带，不符合引物1、3或引物2、4的扩增结果，C错误； D、由前面分析可知，图2中1无条带，代表纯合野生型个体；图3中3有两条条带，代表杂合G品系个体，纯合G品系个体应是有两条相同大小条带的情况，图3中无符合的，D错误。 故选B。 5．（24-25高二下·山东泰安·期中）在基因工程中可利用PCR进行体外DNA片段的扩增，PCR 产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。下列说法错误的是（    ） A．琼脂糖凝胶中的DNA 扩增引物分子被核酸染料染色后可在紫外灯下被检测出来 B．耐高温的DNA聚合酶需要激活，PCR 反应缓冲液中需要添加Mg2+ C．电泳时DNA分子会向它所带电荷相反的电极移动，迁移速率与凝胶浓度、DNA分子大小和构象有关 D．PCR利用DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚及与引物的结合 【答案】A 【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】A、核酸染料主要与双链DNA结合，并在紫外灯下发出荧光。引物是短的单链DNA片段（通常为寡核苷酸），核酸染料对其结合效率极低，因此无法被有效染色和检测。在琼脂糖凝胶电泳中，被染色和检测的是双链的PCR产物，而非引物本身，A错误； B、耐高温的DNA聚合酶（如Taq酶）在PCR中不需要额外激活（可直接发挥活性），但Mg2+是其必需的辅因子，参与催化DNA合成。PCR反应缓冲液中通常添加Mg2+以维持酶活性，B正确； C、DNA分子带负电荷，在电场中向阳极（正极）移动。迁移速率受凝胶浓度（影响凝胶孔径，浓度越高迁移越慢）、DNA分子大小（分子越大迁移越慢）和构象（如超螺旋DNA比线状或开环DNA迁移更快）的影响，C正确； D、PCR基于DNA热变性原理，通过温度循环控制：高温（约95°C）使DNA双链解聚（变性），降温（约50-65°C）使引物与模板结合（复性），中温（约72°C）进行DNA合成（延伸），D正确。 故选A。 6．（24-25高二下·山东枣庄·期中）组织纤维溶酶原激活物（t-PA）能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药。临床使用发现t-PA有诱发颅内出血的副作用，为此研究人员利用重叠延伸PCR技术对t-PA基因进行改造，过程如图所示。下列说法错误的是（    ） A．PCR1和PCR2不能在同一体系中同时进行 B．至少需要经过3轮PCR2扩增才能得到产物2 C．PCR3需要利用引物a和引物d D．产物1上链和产物2下链形成产物3不需要引物 【答案】B 【分析】PCR过程的每次循环可分为变性、复性和延伸三步，且需要耐高温的DNA聚合酶来催化。 【详解】A、PCR1和PCR2不能在同一体系中同时进行，因为诱变引物b和c会发生碱基互补配对，A正确； B、由于引物d与模板DNA的一端相配对，第一轮PCR扩增能得到含有引物c的DNA片段，第二轮PCR扩增以含有引物c的DNA片段为模板就能得到产物2，B错误； C、PCR3过程需要获得带有定点突变的目标DNA，因而需要利用的引物是引物a和引物d，C正确； D、产物1上链和产物2下链存在互补关系，能重叠延伸（即复制），因而在形成产物3的过程中不需要引物，D正确。 故选B。 7．（24-25高二下·山东潍坊·期中）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（    ） A．提取DNA可选用新鲜的菠菜、洋葱、猪肝等作为实验材料 B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构发生改变 D．仅设置一个对照组即可排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 【答案】B 【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是： ①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同 浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可 以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出， 从而达到分离的目的; ②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离; ③在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。 【详解】A、新鲜的菠菜、洋葱、猪肝等富含DNA，适宜作为提取DNA的材料，A正确； B、离心研磨液是为了加速不溶物的沉淀，DNA位于上清中，B错误； C、加入二苯胺试剂后要进行沸水浴处理，鉴定过程中DNA双螺旋结构发生改变，C正确； D、加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D正确。 故选B。 二、不定项选择题 8．（24-25高二下·山东青岛·期中）采用CTAB法可获得高纯度的DNA，CTAB易溶于乙醇，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，该复合物在高盐（>0.7mol/LNaCl）浓度下可溶。具体步骤：①将植物叶片研磨成粉末，加入CTAB提取液和NaCl，离心后取上清液；②上清液中加入氯仿、异戊醇混合液，混匀，离心取上清液；③加入异丙醇，离心取沉淀；④再加入RNA酶、冷却的95%的乙醇，卷起丝状物备用。下列说法错误的是（    ） A．向CTAB-核酸复合物依次加入2mol/LNaCl溶液、乙醇可使核酸和CTAB分离 B．CTAB可通过加速解聚核蛋白用于提取叶绿体中DNA和质粒DNA C．②上清液中加入氯仿、异戊醇混合液的目的可能是除去蛋白质等杂质 D．提取的DNA可在一定温度下利用二苯胺溶液鉴定DNA的纯度 【答案】BD 【分析】DNA 粗提取与鉴定的实验原理 1、DNA 溶解性：DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，在0.14mol/L NaCl 溶液中溶解度最低（可析出），高于/低于此浓度时溶解度高（能溶解）；DNA不溶于酒精，而蛋白质等杂质溶于酒精，用冷却的体积分数 95% 的酒精可析出DNA、除去杂质。 2、DNA 鉴定：在沸水浴条件下，DNA与二苯胺试剂反应呈蓝色。 【详解】A、CTAB-核酸复合物在高盐（如2mol/L NaCl）中溶解，CTAB溶于乙醇，加入乙醇后核酸析出，CTAB仍溶解，可实现二者分离，A正确； B、CTAB作用是溶解细胞膜、与核酸形成复合物，无“加速解聚核蛋白”功能，且质DNA（如线粒体DNA）与叶绿体DNA提取不依赖CTAB解聚核蛋白，B错误； C、氯仿、异戊醇混合液可使蛋白质变性并溶于有机相，从而去除蛋白质等杂质，C正确； D、二苯胺试剂主要用于鉴定DNA 的存在或者粗略定量分析DNA，而非直接鉴定DNA的纯度，D错误。 故选BD。 9．（24-25高二下·山东菏泽·期中）下图为Bt-Bar融合基因的结构示意图，科研人员利用基因编辑技术将Bar基因切除，并利用农杆菌转化法将切除后的基因导入到烟草植物细胞，成功获得转基因烟草植株。为检测该转基因烟草植株的Bar基因是否被成功敲除同时未影响Bt基因的正常表达，可用PCR技术进行扩增，再用琼脂糖凝胶电泳。下列关于该鉴定过程及结果，正确的是（　　） A．应取转基因烟草植株细胞的染色体DNA进行PCR检测 B．选择引物1和引物2进行PCR可检测Bar基因是否被成功敲除 C．为增加实验的严谨性，需增加一组未进行敲除处理的转基因烟草植株 D．选用引物3和引物4，若实验组没有条带产生，则可说明敲除成功 【答案】CD 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、实验目的是为检测该转基因烟草植株的Bar基因是否被成功敲除同时未影响Bt基因的正常表达，所以选择提取RNA，再逆转录成DNA，进行PCR，A错误； B、选择引物1和引物2扩增Bt基因，不能检测Bar基因是否被成功敲除，应该选择引物3和引物4，B错误； C、为增加实验的严谨性，需增加一组未进行敲除处理的转基因烟草植株作为对照，C正确； D、选用引物3和引物4，若实验组没有条带产生，则可说明敲除成功，D正确。 故选CD。 10．（24-25高二下·山东·期中）关于“PCR扩增”和“琼脂糖凝胶电泳”实验，下列说法不正确的是（　　） A．PCR实验中，微量离心管、枪头和移液器等在使用前均须消毒处理 B．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察 C．DNA电泳鉴定实验中，DNA的迁移速率与其分子量（大小）成正比 D．DNA电泳鉴定实验中，具有相同碱基数量的环状DNA和链状DNA迁移速率不同 【答案】ABC 【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 【详解】A、在PCR实验中，微量离心管、枪头等在使用前均须进行高压蒸汽灭菌处理，而不是消毒处理，A错误； B、稍冷却的琼脂糖溶液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，在波长为300nm的紫外灯下可以被检测出来，凝胶载样缓冲液中加入的是指示剂，B错误； C、DNA分子的电泳鉴定实验中，决定DNA分子迁移速率的因素有凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象，DNA分子越小，迁移的速率越快，DNA分子越大，迁移速率越慢，C错误； D、DNA的环状和链状属于DNA构象，相同长度的环状DNA和链状DNA迁移速率不同，D正确。 故选ABC。 三、非选择题 11．（24-25高二下·山东菏泽·期中）研究人员通过PCR扩增质粒pDNR-LIB中的sacB基因（蔗糖敏感基因，其表达产物会在含有蔗糖的平板上抑制细菌的生长），并将其插入质粒pAH162中，构建重组质粒pAH162-sacB。该质粒导入大肠杆菌后，需验证其双重选择作用。限制酶位点及质粒结构如图所示。 (1)基因工程操作中用到的工具有________，其中限制酶可以使双链DNA分子每一条链中特定部位的______键断开。由构建的pAH162-sacB可推测，sacB基因上下游分别含有限制酶________、_______的识别序列。 (2)sacB基因在筛选重组质粒中的作用是______。 (3)若需在分子水平上检测sacB基因是否成功导入受体细胞，可采用_______等技术；若需检测CAR蛋白是否表达，可采用___________技术。 (4)若要通过设计引物在sacB基因两侧添加限制酶的识别序列，应该添加在引物的________（填“3′端”或“5′端”）。 【答案】(1) 限制酶（限制性内切核酸酶）、DNA连接酶、载体 磷酸二酯 BamH I EcoR I (2)在蔗糖存在时抑制菌落生长，用于筛选成功插入外源基因的重组质粒 (3) PCR技术 抗原-抗体杂交 (4)5'端 【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）基因工程操作中用到的工具有限制酶（限制性内切核酸酶）、DNA连接酶、载体，其中限制酶可以使双链DNA分子每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。由构建的pAH162-sacB可推测，sacB基因上下游分别含有限制酶BamH I和EcoR I。 （2）sacB基因是蔗糖敏感基因，其表达产物会在含有蔗糖的平板上抑制细菌的生长，故sacB基因在筛选重组质粒中的作用是在蔗糖存在时抑制菌落生长，用于筛选成功插入外源基因的重组质粒。 （3）若需在分子水平上检测sacB基因是否成功导入受体细胞，可采用PCR技术等技术；若需检测CAR蛋白是否表达，可采用抗原-抗体杂交技术。 （4）若要通过设计引物在sacB基因两侧添加限制酶的识别序列，应该添加在引物的5'端。 12．（24-25高二下·山东潍坊·期中）3-磷酸甘油脱氢酶(CPD)是酵母细胞中甘油合成的关键酶。某假丝酵母菌株具有高活性的CPD,目前已测得其基因部分基序列如图1为获取该CPD基因可进行以下操作：先用限制酶PstI处理基因组DNA后，连接形成环形DNA,再依据已知序列设计一对引物，通过PCR扩增出该基因的两侧序列，最后进行测序并拼接获得完整基因的序列。 (1)为激活TaqDNA聚合酶，需要在PCR反应体系中添加__________。PCR过程中变性、复性、延伸三步骤所需温度最低的是________________________。 (2)通过PCR扩增两侧序列应选择图1中的引物是________________，PCR得到的目标序列与环形模板DNA碱基数目不同，原因是_______________________。 (3)获得GPD基因后，将其编码区与图2中的质粒连接，构建重组质粒：为保证正确连接，应在GPD基因编码区上下游引物的5'端分别添加_________________的限制酶识别序列。 A．②③ B．①② C．③② D．①③ (4)现将高活性GPD基因整合到酿酒酵母的染色体DNA上，请写出用PCR技术检测该基因是否转录出mRNA的实验思路________________。 【答案】(1) Mg2+ 复性 (2) P1和P4 已知序列中引物P1和引物P4之间的序列未被扩增 (3)C (4)提取酿酒酵母mRNA，逆转录成cDNA，利用根据高活性GPD基因设计的引物进行PCR扩增，产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定，观察是否出现条带 【分析】基因工程技术的基本步骤：(1) 目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；(2) 基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、复制原点和标记基因等；(3) 将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；(4) 目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目 的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质一抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）镁离子可以激活TaqDNA聚合酶，常加在PCR反应体系中；标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，其中变性需要高温使DNA解螺旋，故为94℃，而复性是在较低温度下，两种引物和DNA单链相结合，故温度为55℃，延伸是在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链，温度应为DNA聚合酶的最适温度72℃，因此变性、复性、延伸三步骤所需温度最低的是复性。 （2）引物与模板链的3，端结合，因此扩增两侧序列，可以先用相同的限制酶对两侧进行酶切，再用DNA连接酶将两侧进行连接，连接后充当PCR的模板，则应选择的引物是P1和P4；由于已知序列中引物P1和引物P4之间的序列未被扩增，因此PCR得到的目标序列与环形模板DNA碱基数目不同。 （3）为保证正确连接，通常在目的基因的两侧添加两种酶的序列，且切割完的黏性末端不同，①与③切割后的黏性末端相同，因此选择②①或③②添加在编码区上下游引物的5'端。 故选C。 （4）用PCR技术检测该基因是否转录出mRNA，可提取酿酒酵母mRNA，逆转录成cDNA，利用根据高活性GPD基因设计的引物进行PCR扩增，产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定，观察是否出现条带。若转录成功，则有相应的mRNA，会出现相应的条带。 13．（24-25高二下·山东青岛·期中）In-Fusion技术被称为无缝克隆技术，操作流程是：对质粒进行PCR获得线性化载体，通过PCR在目的基因两端插入与线性化载体两端相同的碱基序列，然后将两者PCR产物混合，在In-Fusion酶的作用下，从线性化DNA的3'端起始切除15个核苷酸，进而暴露出互补的黏性末端，最终促使目的基因与载体实现连接，过程如图所示。 (1)PCR技术需要的DNA聚合酶与人体的DNA聚合酶不同之处是_______。图中的同源序列A、C与B、D中的碱基序列一般不同，原因是______。 (2)质粒线性化前后所含有的游离磷酸基团的个数分别为______个和______个。对质粒进行PCR扩增获得线性化载体时，引物应选______。 A．5'CTAGCTGACTCTAGAT3'            B．5'ATCGCCTGACTAGGGA3' C．3'TAGCGGACTGATCCCT5'            D．3'GATCGACTGAGATCTA5' (3)由图可知，目的基因的______（填“a”或“b”）链是转录的模板链。③过程需要使用_________酶，构建稳定的重组质粒。 【答案】(1) PCR技术中的DNA聚合酶耐高温，而人体内中的DNA聚合酶不耐高温 防止目的基因或线性化质粒自身环化；防止目的基因反向连接 (2) 0 2 BD (3) b In-Fusion酶和DNA连接酶 【分析】PCR技术：是一种体外扩增DNA的技术，需要热稳定DNA聚合酶（如Taq酶），能在较高温度下保持活性，用于以DNA为模板合成新的DNA链。 【详解】（1）PCR技术使用的DNA聚合酶耐高温，而人体DNA聚合酶不耐高温。PCR过程需高温变性步骤，因此所用酶（如Taq酶）必须耐高温；人体DNA聚合酶在高温下会失活。若同源序列A、C与B、D相同，载体两端会互补配对，导致自身环化，无法与目的基因正确连接，故图中的同源序列A、C与B、D中的碱基序列一般不同，原因是防止目的基因或线性化质粒自身环化；防止目的基因反向连接。 （2）质粒为环状DNA，无线性末端，无游离磷酸基团。线性化后成为链状DNA，两端各有1个游离磷酸基团，共含2个游离磷酸基团。对质粒进行PCR扩增获得线性化载体时，引物需与模板链互补，且沿5’→3’延伸。分析图示序列，B（5'ATCGCCTGACTAGGGA3'）和D（3’GATCGACTGAGATCTA5’，实际引物书写为5’→3’方向，需确认互补配对）符合与模板链结合的要求，确保PCR扩增出正确的线性化载体。 （3）根据重组质粒中目的基因的插入方向及转录模板链的特性，b链为转录的模板链。构建过程需连接目的基因与载体要使用In-Fusion酶和DNA连接酶，，在In-Fusion酶的作用下，从线性化DNA的3'端起始切除15个核苷酸，进而暴露出互补的黏性末端，DNA连接酶催化磷酸二酯键形成，构建稳定的重组质粒。 14．（24-25高二下·山东聊城·期中）小麦的D1b基因是调控光周期的重要基因，当小麦细胞接受足够时长的短日照刺激后，细胞中的A 蛋白就会与D1b基因启动子区中的光周期响应序列结合，进而启动该基因的表达，小麦表现为延迟开花。 (1)与D1b基因相比，D1a 基因的启动子区缺失了含光周期响应序列的片段（长度约2089bp），但其他序列相同，因此D1a基因会使小麦表现为提前开花。欲利用PCR 扩增出D1b和D1a基因的启动子区，科研人员设计了图1中的引物DF 和DR，引物的作用是________。若D1a基因启动子区扩增产物为 709bp，D1b基因启动子区扩增产物为2518bp，则光周期响应序列片段的长度为________ bp。 (2)为找到光周期响应序列的位置，将通过引物F1~F9扩增得到的9种片段、D1b启动子区和D1a启动子区分别与报告基因连接成基因表达载体，如图2 所示。为正确构建基因表达载体，引物DR 的序列应为5‘-___________3’（,写出10个碱基）。将构建成功的11组基因表达载体分别转入拟南芥后，用短日照处理，检测不同组的报告基因开始表达的时间。当实验结果为________时，说明光周期响应序列位于引物F7~F8结合的DNA片段之间。 (3)为找到小麦细胞中的A蛋白，科研人员利用组氨酸和亮氨酸双营养缺陷型酵母菌为受体菌，进行了两次转化实验得到双转化的酵母菌，如图3所示。 ①将含光周期响应序列的诱导型启动子与组氨酸合成酶基因连接，构建成诱饵载体，用该载体转化酵母菌后，其会自主整合到酵母菌基因组中。 ②提取小麦总mRNA，通过_________得到不同的cDNA，以这些 cDNA 片段为目的基因，以亮氨酸合成酶基因为________基因，构建成猎物载体转化上述酵母菌。 ③将双转化后的酵母菌接种到________的选择培养基上培养，若________，则说明该组酵母菌中 cDNA 指导合成的是 A 蛋白。 【答案】(1) 使DNA聚合酶能够从引物端开始连接脱氧核苷酸 1809 (2) GGATCCCATG 引物F1-F7组，报告基因表达，引物F8，F9组，报告基因不表达 (3) 逆转录/反转录 标记 不含亮氨酸和组氨酸 有菌落出现 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）引物是一段与模板链碱基互补配对的短、单核苷酸序列，其作用是使DNA聚合酶能够从引物端开始连接脱氧核苷酸；依据题干信息，与D1b基因相比，Dla基因的启动子缺失了含光周期响应序列的片段，但其他序列相同，若Dla基因启动子扩增产物为709bp，D1b基因启动子扩增产物为2518bp，故光周期响应序列片段长度为（2518-709）bp=1809bp。 （2）结合题意及题图可知，为正确构建基因表达载体，需要在引物DR的5'端添加限制酶的识别序列，根据转录的方向需要在引物DR的5'端添加BamH Ⅰ的识别序列，此后根据碱基互补配对得出引物DR的部分序列为5'CATGA3'，故引物DR的序列应为5'GGATCCCATG3'；D1b启动子区与报告基因连接成基因表达载体，因其中含有光周期序列，将其转入拟南芥后，用短日照处理，检测到拟南芥表现出延迟开花，D1a启动子区与报告基因连接成基因表达载体，因其中不含有光周期序列，将其转入拟南芥后，用短日照处理，检测到拟南芥表现出提前开花：若光周期响应序列位于引物F7~F8结合的DNA片段之间，则F1~F7结合的DNA片段上含光周期序列，因此将F1~F7结合的DNA片段与报告基因构建的基因表达载体转入拟南芥后，用短日照处理，F1到F7为引物时，报告基因表达，F8、F9为引物时，报告基因不表达。 （3）②以RNA为模板合成DNA的过程为逆转录（反转录）；基因表达载体的组成有目的基因、标记基因、启动子和终止子，由图可知，该猎物载体中有启动子、终止子，目的基因（cDNA），还缺少标记基因，因此亮氨酸合成酶基因应为标记基因。 ③若该组酵母菌中的cDNA指导合成的是A蛋白，则A蛋白能和光周期相应序列结合，进而启动基因的表达，即能启动组氨酸合成酶基因的表达，则该酵母菌能利用组氨酸，故应将转化后的酵母菌接种到不含亮氨酸和组氨酸的选择培养基上培养，若培养基中出现菌落，则说明该组酵母菌中cDNA指导合成的是A蛋白。 15．（24-25高二下·山东·期中）干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。下列为部分限制酶的识别序列和酶切位点及某质粒上的酶切位点，科研人员利用大肠杆菌构建工程菌生产干扰素，流程如图所示。请回答下列问题： (1)通过PCR技术扩增干扰素基因，需要设计______种引物，引物作用是______。在PCR扩增完成以后，常采用______来鉴定PCR的产物。 (2)为保证干扰素基因与质粒正确连接，需要选用限制酶______切割干扰素基因，选用限制酶______切割质粒，切割干扰素基因后形成的黏性末端序列应为5'-______-3'和5'-______-3'。 (3)研究发现，通过大肠杆菌获得的干扰素活性较低，从蛋白质的合成及结构角度分析，造成这种结果的原因可能是______。 【答案】(1) 2 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 琼脂糖凝胶电泳 (2) BamHI、HaeⅢ BcⅡ、HaeⅢ GATC 平末端 (3)大肠杆菌没有生物膜系统（或内质网，高尔基体），缺乏完善的蛋白质加工修饰功能，产生的干扰素和真核细胞的干扰素在结构上不完全一样 【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 【详解】（1）基因的PCR扩增技术，需要两个引物与目的基因的两端配对，所以需要两种引物。引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。PCR扩增以后常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 （2）如果选用BcⅡ切目的基因，会破坏目的基因，要想保证干扰素基因与质粒的正确连接，通常使用两种酶，结合质粒上的酶的种类，对目的基因选用的是产生黏性末端的BamHI和产生平末端的HaeⅢ；因为质粒的复制原点上有BamHI的识别位点，切割质粒的时候不能选用BamHI，但还需要产生与BamHI处理后相同的黏性末端，所以选用BcⅡ和HaeⅢ这两种限制酶。使用BamHI切割干扰素基因后形成的黏性末端序列应为5'-GATC-3'，使用HaeⅢ切割干扰素基因后形成的是平末端。 （3）干扰素是真核基因控制的。干扰素的合成过程当中需要内质网，高尔基体的修饰加工。大肠杆菌内没有内质网，高尔基体修饰加工的具体过程不一样。所以大肠杆菌产生的干扰素和真核细胞产生的干扰素有所区别。 一、单选题 1．（24-25高二下·山东潍坊·期中）将突变基因导入拟南芥的染色体DNA时，可出现三种结果：仍为野生型（导入失败）、突变杂合子(在一对同源染色体上只导入1个突变基因)及突变纯合子。研究人员进行了如图1转基因操作后，用引物LP、RP和BP对拟南芥DNAPCR扩增并进行电泳检测，得到结果如图2。不考虑突变基因插入染色体的其他位置。下列说法错误的是（    ） A．乙组、丙组分别为突变纯合子、突变杂合子 B．由LP+RP组电泳结果可知，加样孔位于电泳条带上方 C．模板链过长导致使用引物BP+LP无法产生PCR产物 D．甲与乙杂交后代的DNA利用上述引物PCR扩增后，电泳结果与丙相同 【答案】C 【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按 碱基互补配对的原则结合，再调 温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶 沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 【详解】AB、乙组LP+RP组只有一条带，说明导入了外源基因或为野生型，丙组LP+RP组有一条带，说明丙为杂合子，即既有野生型条带又有插入后的条带，且插入后条带分子量更大，移动更慢，靠近加样孔，因此加样孔位于电泳条带上方，且乙为突变纯合子，AB正确； C、引物BP+LP均与同一条链结合，不能扩增出条带，C错误； D、甲为野生型，乙为突变纯合子，甲与乙杂交后代为杂合子，与丙相同，因此利用上述引物PCR扩增后，电泳结果与丙相同，D正确。 故选C。 2．（24-25高二下·山东德州·期中）以新鲜洋葱为材料进行“DNA粗提取与鉴定”实验时，所用研磨液的成分主要有Tris（缓冲作用）、SDS（去污剂，可使蛋白质线性化）、EDTA（蛋白质变性剂）、NaCl等。下列说法错误的是（　　） A．Tris可维持研磨液的pH，防止DNA被破坏 B．SDS可破坏细胞膜的结构，使研磨更充分 C．EDTA可抑制DNA酶的活性，防止研磨过程中DNA被水解 D．研磨后过滤得到的上清液中含有DNA，用玻璃棒搅拌即可析出DNA 【答案】D 【分析】提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 【详解】A、Tris是缓冲剂，可调节溶液中的pH，防止DNA被破坏，A正确； B、SDS是蛋白质变性剂，可破坏细胞膜的结构，使研磨更充分，B正确； C、EDTA是DNA酶抑制剂，可以防止DNA水解成脱氧核苷酸，C正确； D、将充分研磨后过滤得到的上清液，加入预冷酒精，由于DNA不溶于酒精溶液，可以析出DNA分子，D错误。 故选D。 3．（24-25高二下·山东·期中）某生物实验小组利用菜花进行“DNA粗提取与鉴定”实验。下列操作正确的是（　　） A．利用酒精初步分离DNA与蛋白质的原理是DNA更易溶于酒精 B．将菜花研磨液倒入放有滤纸的漏斗中，以获取含大量DNA的滤液 C．将析出的丝状物加入2mol·L⁻¹的NaCl溶液溶解DNA以去除杂质 D．用二苯胺对DNA进行鉴定时需在沸水中进行，且需要对照实验 【答案】D 【分析】DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离的目的。此外，DNA不溶于酒精溶液，细胞中某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离。 【详解】A、DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质分离，A错误； B、用纱布过滤以获取含DNA的过滤液，若用滤纸过滤，会因DNA会吸附于滤纸导致过滤液中的DNA含量极少，B错误； C、丝状物溶于2mol·L-1的NaCl溶液，与二苯胺充分混合以检测DNA，C错误； D、用二苯胺检测DNA需要沸水浴条件，待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化，故需要做对照试验，D正确。 故选D。 4．（24-25高二下·山东德州·期中）CpG岛主要位于基因的启动子和外显子区域，是富含CpG二核苷酸的一些区域，长度为300～3000个碱基对。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。甲基化特异PCR的基本原理是DNA经重亚硫酸盐处理后，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，以处理后的产物作为模板，加入特异性结合甲基化模板链的引物（primerI）或特异性结合非甲基化模板链的引物（primerII），进行扩增，只有引物与模板链完全结合才能得到扩增产物。据此分析，下列说法正确的是（　　） A．CpG岛的一条单链中C和G之间形成三个氢键 B．甲基化的DNA无法与DNA聚合酶结合，从而影响DNA的复制 C．设计引物时，primerI中含有碱基G，primerII中不含碱基G D．若用primerI得不到扩增产物，用primerII能得到扩增产物，则说明DNA发生甲基化 【答案】C 【分析】表观遗传是指生物体基因的碱基序列保持不变，但基因表达和表型发生可遗传变化的现象。 【详解】A、DNA一条链中的G和C是通过脱氧核糖-磷酸-脱氧核糖相连的，不形成氢键，A错误； B、甲基化发生子启动子区域，启动子是与RNA聚合酶结合部位，影响转录，B错误； C、若DNA未发生甲基化，亚硫酸盐处理后，CpG岛中的C全部变为U，设计引物时不含有G，若DNA发生甲基化，则甲基化部位依然为C，设计引物时需含有G，C正确； D、用primerI得不到扩增产物，primerII得到扩增产物，说明未发生甲基化，D错误。 故选B。 二、不定项选择题 5．（24-25高二下·山东潍坊·期中）细菌中的蛋白激酶Y能感受外界环境变化从而调控细菌的生长。研究人员欲利用无缝连接技术将Y基因（编码蛋白激酶Y)与绿色荧光蛋白(GFP)基因拼接成Y-GFP融合基因，并表达出Y-GFP融合蛋白，以分析蛋白激酶Y的功能。图1为无缝连接技术，T5核酸外切酶能沿5'→3'方向降解DNA单链；图2为Y基因、GFP基因及Y-GFP融合基因示意图。下列说法错误的是（    ） A．T5核酸外切酶可破坏DNA中的磷酸二酯键 B．图1中③过程所需酶是DNA聚合酶、DNA连接酶 C．为完成Y基因、GFP基因的连接需在引物P2、P3的5'端添加对应的碱基序列 D．去掉Y基因的终止子，融合基因即可表达出Y-GFP融合蛋白 【答案】CD 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的筛选和获取 （2）基因表达载体的构建 （3）将目的基因导入受体细胞 （4）目的基因的检测与鉴定 【详解】A、根据题意可知T5核酸外切酶能沿5'→3'方向降解DNA单链，所以可推测T5核酸外切酶可破坏DNA中的磷酸二酯键，A正确； B、图1中③过程中有DNA链的延伸，也存在DNA链的连接过程，所需酶是DNA聚合酶、DNA连接酶，B正确； C、DNA扩增过程中，Y基因的模板链是图示Y基因的下链，所以应以P1为引物，GFP基因的模板链是图示GFP基因的上链，所以应以P4为引物，所以为完成Y基因、GFP基因的连接需在引物P1、P4的5'端添加对应的碱基序列，C错误； D、从构建好的重组质粒上看，GFP基因位于目的基因下游，若构建Y基因与GFP基因的融合基因时Y基因可以编码终止密码子，核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，蛋白GFP也就不能被翻译出来，所以构建Y基因与GFP基因的融合基因时，也应将Y基因中编码终止密码子的序列删除，D错误。 故选CD。 三、非选择题 6．（24-25高二下·山东菏泽·期中）桥接RNA-重组酶是一种突破了以往基因编辑中目标片段大小的限制，更加精准有效的用于基因组编辑的技术。桥接RNA由S基因上游的非编码区转录而来，其中第二、三茎环分别与可插入目标片段的靶标序列、含有目标片段的供体序列结合，使二者在空间上相互靠近，其结构如图1所示。重组酶是由S基因编码而来，其可以识别并切割靶标序列和供体序列的特定部位，将供体序列中的目标片段插入靶标序列中，实现基因重组，作用过程如图2、图3所示。 (1)重组酶在基因编辑中过程中充当了基因工程工具中_____的功能，该过程涉及_______（填化学键）的变动。 (2)结合上述研究，对桥接RNA的第二、三茎环进行人工设计，即可用以结合和重组不同的DNA片段。设计桥接RNA茎环中的结合序列时，需要依据________的碱基序列，然后通过人工合成的方法获取与桥接RNA对应的特定DNA序列，再利用_____技术扩增。 (3)研究发现某大肠杆菌中质粒A上的卡那霉素抗性基因因缺乏启动子而无法表达，利用上述方法在质粒A中插入甲醇诱导型启动子，实验流程为：对大肠杆菌另一质粒B进行编辑，包含______→将该质粒转入大肠杆菌→使用含有______的培养基筛选→获取基因编辑成功的菌株。 (4)科研人员设计了绿色荧光蛋白（GFP）报告系统，结构如下图所示，经重组酶-桥接RNA复合物处理可使其从无荧光变为能发出绿色荧光。 该报告系统可证明，重组酶-桥接RNA复合物除能实现DNA片段插入外，还能实现DNA片段_____。据此，重组酶-桥接RNA基因编辑技术可用于降低器官移植时免疫排斥的发生，推测其原理是________。 【答案】(1) 限制酶和DNA连接酶 磷酸二酯键 (2) 靶标序列和供体序列 PCR (3) 待插入的甲醇诱导型启动子、编码重组酶的S基因序列和转录桥接RNA的序列 卡那霉素和甲醇 (4) 切除 利用该系统切除相关抗原决定基因，使移植器官无法产生抗原，从而不能引起免疫排斥反应 【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 4、目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：（1）检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；（2）检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）重组酶能识别并切割特定DNA序列，还能将供体序列中的目标片段插入靶标序列中，相当于基因工程工具中限制酶和DNA连接酶的功能，限制酶切割DNA，DNA连接酶连接DNA片段。该过程涉及磷酸二酯键的变动，切割DNA和连接DNA片段都会改变磷酸二酯键。 （2）桥接RNA的第二、三茎环要与可插入目标片段的靶标序列、含有目标片段的供体序列结合，所以设计结合序列时，需要依据靶标序列和供体序列的碱基序列，保证互补配对。获取特定DNA序列后，利用PCR技术扩增，PCR可在体外大量扩增 DNA 片段。 （3）要在质粒A中插入甲醇诱导型启动子，需对质粒B编辑，包含待插入的甲醇诱导型启动子、编码重组酶的S基因序列和转录桥接RNA的序列，通过该系统实现启动子插入。质粒A上卡那霉素抗性基因因缺乏启动子无法表达，插入启动子后可表达，所以用含卡那霉素和甲醇的培养基筛选，能存活的菌株是基因编辑成功的菌株。 （4）从报告系统看，重组酶-桥接RNA复合物处理前无荧光，处理后有荧光，说明原本 GFP 基因因结构（如被终止子等阻断 ）无法表达，处理后实现了 DNA 片段切除（或去除终止子等阻碍序列），使GFP基因表达。重组酶-桥接RNA基因编辑技术可用于降低器官移植时免疫排斥的发生的原理是利用该系统切除相关抗原决定基因，使移植器官无法产生抗原，从而不能引起免疫排斥反应。 7．（24-25高二下·山东日照·期中）某种能以甲醇为唯一碳源的酵母菌可作为生产抗原蛋白的工程菌。研究人员以图1所示质粒为载体，构建含乙型肝炎病毒表面抗原蛋白（HBsAg）基因的重组质粒，将重组质粒导入组氨酸缺陷型大肠杆菌（在缺失组氨酸的培养基中无法生存）中进行扩增，再经酶切后导入酵母菌，经同源重组整合到其染色体DNA上。 (1)科研人员构建HBsAg基因表达载体的目的是__________________。为防止HBsAg基因与质粒自身环化和反向连接，最好选用_________酶对质粒进行酶切处理，并使用E.coliDNA连接酶高效连接HBsAg基因。 (2)5'-CGCTACTCATTGCTGCG……CGGATGAGCGCGTAGAT-3'为HBsAg基因a链的部分序列。利用PCR技术获取HBsAg基因时，引物M与_________（填“a链”或“b链”）的部分序列互补。某同学设计了如下的4种引物，引物N对应的序列为_________。   A．5'-GGATCCATCTACGCGCTCATCCG-3' B．5'-CCCGGGCGCTACTCATTGCTGCG-3' C．5'-CGCAGCAATGAGTAGCGGGGCCC-3' D．5'-CGGATGAGCGCGTAGATGGATCC-3' (3)将重组质粒导入大肠杆菌的目的是__________，将重组质粒导入大肠杆菌时应在_________和含有氨苄青霉素的培养基上进行筛选。 (4)转化的酵母菌在培养基上培养时，需向其中加入甲醇，目的是___________。 【答案】(1) 使HBsAg基因在酵母菌中稳定存在并遗传，同时使HBsAg基因能够表达和发挥作用 XmaⅠ、BclⅠ (2) a链 A (3) 大量扩增重组质粒 缺失组氨酸 (4)诱导HBsAg基因表达 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）基因表达载体是由目的基因和运载体构成的，科研人员构建HBsAg基因表达载体的目的是使HBsAg基因在酵母菌中稳定存在并遗传，同时使HBsAg基因能够表达和发挥作用；分析题意及题图，BamHI与BclI是同尾酶，两者切割可形成相同的黏性末端，在构建重组DNA分子时，为避免目的基因和标记基因都被破坏，质粒用XmaⅠ酶切，与目的基因用XmaⅠ酶切获得的黏性末端一侧相连，二质粒用BclⅠ酶切获得的黏性末端和目的基因用BamHⅠ酶切获得的黏性末端相连，故以防止目的基因、载体自身环化或目的基因反向连接，因此科研人员利用限制酶XmaⅠ、BclⅠ对质粒进行酶切处理。 （2）在PCR技术获取HBsAg基因时，引物是与模板链的3'端结合，故引物M结合的单链是b链，部分序列与a链相同；在PCR扩增过程中应在5'端添加相应的酶切位点，利用PCR扩增目的基因时，引物需要与模板的3'端（b链的左边）结合，并遵循碱基互补配对原则，同时在引物的5'端添加限制酶酶切位点引物N与a链的3’端结合互补配对，引物N的前六个碱基是在引物N的5’端加上了限制酶序列GGATCC，即5′−GGATCCATCTACGCGCTCATCCG−3′。 故选A。 （3）将重组质粒导入大肠杆菌的目的是大量扩增重组质粒；据图可知，重组质粒含有氨苄青霉素抗性基因，且重组质粒导入组氨酸缺陷型大肠杆菌（在缺失组氨酸的培养基中无法生存）中进行扩增，，故将重组载体导入大肠杆菌时，应在含有氨苄青霉素、不含组氨酸的培养基上进行筛选，能存活下来的大肠杆菌是导入了重组质粒的大肠杆菌。 （4）将大肠杆菌中获取的HBsAg基因导入酵母后，转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇，加入甲醇的作用有两点除能够提供碳源，促进酵母菌的生长和代谢外，关键可以诱导HBsAg基因表达。 8．（24-25高二下·山东枣庄·期中）人血清白蛋白（HSA）是由肝脏细胞合成的，具有重要的医用价值，原本只能从血清中提取，现利用基因工程的方法生产HSA。图1为HSA基因（仅列出部分序列），图2为构建的基因表达载体，甲、乙、丙表示引物，其碱基分别与相近的核苷酸链互补配对。 (1)利用PCR扩增技术获取HSA基因，需要的酶是________，该技术每次循环需要_______三步。在PCR扩增仪中完成反应后，常采用_________来鉴定PCR的产物。 (2)根据HSA基因的已知序列，应选用引物________进行PCR扩增。 A．5'-CTGTATGCG-3'  B．5'-TACGCGTTA-3' C．5'-GACATACGC-3'  D．5′-ATGCGCAAT-3' 经过4轮扩增，扩增产物中含有的符合要求的HSA基因的数量为________。 (3)为了检测HSA基因是否正确连接在质粒上，应选择图2中的引物_______对构建的载体进行PCR扩增，理论上出现________bp的条带表明HSA正确连接在了载体上。 【答案】(1) 耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶） 变性、复性、延伸 琼脂糖凝胶电泳 (2) AD 8 (3) 乙、丙 350 【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； 4、目的基因的检测与鉴定： （1）分子水平上的检测： ①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因：DNA分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA：分子杂交技术； ③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原—抗体杂交技术； （2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，由于该过程在较高温度下进行，所以需要耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）；PCR每次循环一般可以分为变性、复性、延伸三步。变性是指在高温下，DNA双链解开成为单链；复性是指当温度降低时，引物与单链DNA模板结合；延伸是指在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的3'端开始延伸合成新的DNA链；在PCR扩增仪中完成反应后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。不同大小的DNA片段在凝胶中的迁移速率不同，通过与标准DNA分子量进行比较，可以判断PCR产物的大小和纯度等。 （2）PCR扩增时，引物应与模板链的3'端互补配对，根据图1中HSA基因的序列，应选用引物A（5'-CTGTATGCG-3'）和D（5'-ATGCGCAAT-3'），因为它们的碱基序列与HSA基因两端的部分序列互补；PCR技术的原理是DNA的半保留复制。第一轮扩增得到2个DNA分子；第二轮扩增得到22 =4个DNA分子；第三轮扩增得到23=8个DNA分子；第四轮扩增得到24=16个DNA分子。其中，前两轮扩增得到的DNA分子一端是引物，另一端是原始模板的延伸，不符合两端都是引物的要求；从第三轮开始出现符合要求的HSA基因（即两端都是引物的DNA分子），第三轮产生2个，第四轮产生22= 4个，所以经过4轮扩增，扩增产物中含有的符合要求的HSA基因的数量为8个。 （3）为了检测HSA基因是否正确连接在质粒上，应选择图2中的引物乙和丙对构建的载体进行PCR扩增。因为乙和丙分别位于HSA基因插入位点的两侧，若HSA基因正确连接，以重组质粒为模板能扩增出相应片段。由图可知，HSA基因长度为300bp，加上引物丙结合区域的长度（假设引物结合区域长度忽略不计），理论上出现350bp的条带表明HSA正确连接在了载体上。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题04 基因工程的基本工具和PCR 一、单选题 1．D 2．C 3．C 4．D 5．C 6．B 7．C 8．B 9．A 二、不定项选择题 10．AD 11．AD 12．ABD 三、非选择题 13．【答案】(1) SmaI 终止密码子 激活TaqDNA聚合酶 (2) 琼脂糖凝胶电泳 DNA连接 是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA (3)IgG类抗体 14．【答案】(1) 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 解旋酶（DNA连接酶） a和b 可以分别以AB上链和CD下链为引物进行延伸 (2) 基因表达载体的构建 Ca2+（或CaCl2） (3) 越快 前沿 (4)B 一、单选题 1．D 2．B 3．C 4．B 5．A 6．B 7．B 二、不定项选择题 8．BD 9．CD 10．ABC 三、非选择题 11．【答案】(1) 限制酶（限制性内切核酸酶）、DNA连接酶、载体 磷酸二酯 BamH I EcoR I (2)在蔗糖存在时抑制菌落生长，用于筛选成功插入外源基因的重组质粒 (3) PCR技术 抗原-抗体杂交 (4)5'端 12．【答案】(1) Mg2+ 复性 (2) P1和P4 已知序列中引物P1和引物P4之间的序列未被扩增 (3)C (4)提取酿酒酵母mRNA，逆转录成cDNA，利用根据高活性GPD基因设计的引物进行PCR扩增，产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定，观察是否出现条带 13．【答案】(1) PCR技术中的DNA聚合酶耐高温，而人体内中的DNA聚合酶不耐高温 防止目的基因或线性化质粒自身环化；防止目的基因反向连接 (2) 0 2 BD (3) b In-Fusion酶和DNA连接酶 14．【答案】(1) 使DNA聚合酶能够从引物端开始连接脱氧核苷酸 1809 (2) GGATCCCATG 引物F1-F7组，报告基因表达，引物F8，F9组，报告基因不表达 (3) 逆转录/反转录 标记 不含亮氨酸和组氨酸 有菌落出现 15．【答案】(1) 2 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 琼脂糖凝胶电泳 (2) BamHI、HaeⅢ BcⅡ、HaeⅢ GATC 平末端 (3)大肠杆菌没有生物膜系统（或内质网，高尔基体），缺乏完善的蛋白质加工修饰功能，产生的干扰素和真核细胞的干扰素在结构上不完全一样 一、单选题 1．C 2．D 3．D 4．C 二、不定项选择题 5．CD 三、非选择题 6．【答案】(1) 限制酶和DNA连接酶 磷酸二酯键 (2) 靶标序列和供体序列 PCR (3) 待插入的甲醇诱导型启动子、编码重组酶的S基因序列和转录桥接RNA的序列 卡那霉素和甲醇 (4) 切除 利用该系统切除相关抗原决定基因，使移植器官无法产生抗原，从而不能引起免疫排斥反应 7．【答案】(1) 使HBsAg基因在酵母菌中稳定存在并遗传，同时使HBsAg基因能够表达和发挥作用 XmaⅠ、BclⅠ (2) a链 A (3) 大量扩增重组质粒 缺失组氨酸 (4)诱导HBsAg基因表达 8．【答案】(1) 耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶） 变性、复性、延伸 琼脂糖凝胶电泳 (2) AD 8 (3) 乙、丙 350 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $