专题03 基因工程（期中真题汇编，天津专用）高二生物下学期

专题03 基因工程 4大高频考点概览 考点01 重组DNA技术的基本工具 考点02 基因工程的基本操作程序 考点03 基因工程的应用 考点04 蛋白质工程的原理和应用 地 城 考点01 重组DNA技术的基本工具 一、单选题 1．（24-25高二下·天津滨海新·期中）用限制酶EcoRⅤ单独切割某普通质粒，可产生14kb（1kb即1000个碱基对）的长链，而同时用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ联合切割该质粒，可得到三种长度的DNA片段，见下图（其中*表示EcoRⅤ限制酶切割后的一个黏性末端）。 若用MboⅠ限制酶单独切割该普通质粒，则产生的DNA片段的长度为（    ） A．6和8 B．2.5和11.5 C．14 D．5.5和8.5 【答案】A 【分析】题图分析，用限制酶EcoRⅤ单独切割某普通质粒，可产生14kb(1kb即1000个碱基对)的长链，说明质粒中含有1个EcoRⅤ切点；同时用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ联合切割该质粒，可得到三种长度的DNA片段，说明质粒中含有2个MboⅠ切点。 【详解】用限制酶EcoRⅤ单独切割某普通质粒，可产生14kb(1kb即1000个碱基对)的长链，说明质粒中含有1个EcoRⅤ切点；同时用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ联合切割该质粒，可得到三种长度的DNA片段，说明质粒中含有2个MboⅠ切点。即质粒中含有1个EcoRⅤ切点，2个MboⅠ切点。且根据星号可知，EcoRⅤ限制酶将8kb的片段分割成两段，分别为2.5和5.5kb，据此可推测，若用MboⅠ限制酶单独切割该普通质粒，则产生的DNA片段为2种，应该是6和8kb，A正确。 故选A。 2．（24-25高二下·天津滨海新·期中）下图为不同限制酶的识别序列及切割位点（↓表示切割位点），下列叙述错误的是（    ） A．用EcoRⅠ切割DNA分子中部获得一个目的基因时，需断开的磷酸二酯键有2个 B．图示4种限制酶均不能够识别和切割RNA分子内的核苷酸序列 C．用BglⅡ切出的目的基因与BamHⅠ切割的质粒重组后，则不能再被这两种酶切开 D．酶切时需要控制好温度、酶浓度、PH等因素 【答案】A 【分析】限制性核酸内切酶是基因工程中切割DNA分子的工具，能识别双链DNA分子的特定序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 【详解】A、用EcoRⅠ切割DNA分子中部获得一个目的基因时，需要切割目的基因的两侧，断开4个磷酸二酯键，A错误； B、限制酶识别特定的DNA序列，并在特定位点将其切开，所以均不能够识别和切割RNA分子内的核苷酸序列，B正确； C、酶BglⅡ切出的目的基因与酶BamHⅠ切割的质粒重组后，重组DNA分子序列为。6个脱氧核苷酸序列既不能被限制酶BglⅡ识别，也不能被BamHⅠ识别，所以不可能被这两种酶切开，C正确； D、酶的作用需要再适宜的条件下进行，所以酶切时需要控制好温度、酶浓度、PH等因素，D正确。 故选A。 3．（24-25高二下·天津滨海新·期中）下图为四种不同限制性核酸内切酶识别的序列及切割位置图示，下列叙述错误的是（    ） A．若DNA上的碱基随机排列，理论上每4096个碱基对会有一个BamHⅠ限制酶识别位点 B．作为优质的基因工程的通用载体，质粒上应具有同种限制酶的多个酶切位点 C．BamHⅠ限制酶切割得到的目的基因可以与BglⅡ限制酶切割后的质粒相连 D．若DNA上的碱基随机排列，NotⅠ限制酶切割位点出现频率低于其他三种限制酶 【答案】B 【分析】作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。 【详解】A、若DNA上的碱基随机排列，出现GGATCC碱基排列序列的概率为（1/4）6=1/4096，因此理论上每4096个碱基对会有一个BamHⅠ限制酶识别位点，A正确； B、作为运载体的质粒，应有多个限制性酶的切割位点，不一定要相同，以便插入目的基因，B错误； C、BamHⅠ限制性核酸内切酶切割后的末端与BglⅡ切割的末端是相同的，故用BamHⅠ限制性核酸内切酶切割后的DNA能够连接到用BglⅡ切割的载体DNA中，C正确； D、EcoRⅠ、BamHⅠ、BglⅡ都是由六个碱基对构成，而NotⅠ由8个碱基对构成，若DNA上的碱基随机排列，NotⅠ限制性核酸内切酶切割位点出现频率低于其他三种限制性核酸内切酶，D正确。 故选B。 4．（24-25高二下·天津滨海新·期中）下列关于DNA重组技术基本工具的说法，正确的是（    ） A．DNA连接酶可催化脱氧核苷酸链间形成氢键 B．限制酶切割DNA后一定能产生黏性末端 C．质粒是基因工程中唯一的载体 D．微生物中的限制性核酸内切酶对自身DNA无损害作用 【答案】D 【分析】基因工程的工具：（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端和平末端两种。（2）DNA连接酶：据酶的来源不同分为两类：E．coliDNA连接酶、T4DNA连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。（3）运载体：常用的运载体有质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒等。 【详解】A、DNA连接酶的作用是催化两个DNA片段的磷酸二酯键连接，而非形成氢键（氢键是互补碱基通过氢键自动配对形成），A错误； B、限制酶切割DNA可能产生黏性末端（如EcoRⅠ）或平末端（如SmaⅠ），因此“一定能产生黏性末端”的表述错误，B错误； C、基因工程载体除质粒外，还包括噬菌体衍生物、动植物病毒等，因此“唯一”的表述错误，C错误； D、微生物的限制酶通过切割特定序列保护自身，其自身DNA因甲基化修饰不被切割，因此对自身DNA无损害，D正确。 故选D。 5．（24-25高二下·天津·期中）下表是几种限制酶的识别序列及切割位点。据表分析，下列相关叙述错误的是（　　） 限制酶 HindII AluI BamHI Sau3AI 识别序列及切割位点 5'-GTY↓RAC-3' 5'-AG↓CT-3' 5'-G↓GATCC-3' 5'-↓GATC-3' （注：Y表示C或T，R表示A或G） A．限制酶作用于磷酸二酯键 B．一种限制酶可识别不只一种核苷酸序列 C．AluI切割后的DNA片段可用T4DNA连接酶连接 D．将BamHI和Sau3AI切割形成的片段连接后，一定能被这两种酶识别并切割 【答案】D 【分析】限制酶的特点：作用于DNA链的磷酸二酯键，识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特定的位点进行切割，切割后可能形成黏性末端或平末端。 【详解】A、限制酶作用于DNA链的磷酸二酯键，切割后形成黏性末端或平末端，A正确； B、HindII的识别序列为GTY↓RAC（Y为C或T，R为A或G），可识别多种序列（如GTCGAC、GTTAGA等），B正确； C、AluI切割后产生平末端，T4DNA连接酶既能连接黏性末端也能连接平末端，C正确； D、BamHI切割后产生黏性末端GATCC，Sau3AI切割后产生GATC。两者连接可能形成新序列（如GATCGATC），但该序列可能不包含BamHI的完整识别位点（GGATCC），故将BamHI和Sau3AI切割形成的片段连接后，不能被BamHI识别并切割，D错误。 故选D。 6．（24-25高二下·天津·期中）下列有关基因工程的说法，正确的是（　　） A．基因工程常以抗生素抗性基因作为目的基因 B．限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸 C．质粒是基因工程最常用的载体，从生物体内获取后可直接使用 D．限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA 【答案】B 【分析】基因工程最基本的工具：①基因的"剪刀”---限制性核酸内切酶（简称限制酶）；②基因的"针线”--DNA连接酶；③基因的运载体---质粒、噬 菌体、动植物病毒等。 【详解】A、抗生素抗性基因常用作标记基因，用于筛选含有重组质粒的宿主细胞，而非目的基因。目的基因是需导入的特定基因（如胰岛素基因），A错误； B、限制酶识别并切割双链DNA的特定位点，而烟草花叶病毒的核酸是单链RNA，无法被限制酶切割，B正确； C、天然质粒需经人工改造（如添加酶切位点、标记基因等）后才能作为载体使用，不可直接使用，C错误； D、原核生物通过甲基化酶修饰自身DNA，避免被限制酶剪切，因此限制酶不会切割自身DNA，D错误。 故选B。 7．（24-25高二下·天津·期中）下列有关基因工程的工具，正确的是（    ） A．重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和运载体 B．用限制酶剪切获得一个目的基因时得到两个切口，有两个磷酸二酯键被断开 C．限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大 D．序列  和  被限制酶切出的黏性末端碱基数相同 【答案】C 【分析】限制酶主要从原核生物中分离纯化出来。能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。经过限制酶切割后获得的DNA片段可形成黏性末端或平末端。 【详解】A、重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶，运载体是转运工具，A错误； B、用限制酶剪切获得一个目的基因时得到两个切口，有四个磷酸二酯键被断开，B错误； C、限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大，则DNA被该限制酶切割的几率就越大，C正确； D、序列  和  序列被限制酶切出的黏性末端碱基数不同，前者是4个，后者是2个，D错误。 故选C。 8．（24-25高二下·天津南开·期中）从图1酶切结果分析，图2中的目的基因（长度为2.0kb）插入方向正确的重组质粒序号和作出该判断所用的限制酶是（    ） A．①,BamHI B．①,EcoRⅠ和HindⅢ C．②,EcoR I D．②,EcoRI和 HindⅢ 【答案】B 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】分析图1可知，重组质粒被EcoRⅠ酶切后，得到5.8kb的片段，说明重组质粒中只有一个EcoRⅠ的酶切位点；重组质粒被BamHⅠ酶切后产生3.8kb和2.0kb两种片段，说明重组质粒中有2个BamHⅠ的酶切位点；重组质粒被EcoRⅠ和HindⅢ酶切后，产生4.5kb和1.3kb两种片段，说明重组质粒中有EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位点，且二种酶切位点之间的片段为4.5kb和1.3kb。结合图2分析可知，重组质粒①符合上述分析的结果，所有的限制酶是EcoRⅠ和HindⅢ，重组质粒②中EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点之间的片段为2.3kb和3.5kb，不符合图1酶切的结果。综上所述，B正确，ACD错误。 故选B。 9．（24-25高二下·天津东丽·期中）用A和B两种限制酶同时和分别处理同一DNA片段，限制酶对应切点一定能切开。两种酶切位点及酶切产物电泳分离结果如图1和图2所示。下列叙述错误的（　　） A．用A和B两种限制酶同时处理同一DNA片段所得产物含8个游离磷酸基团 B．图1中X代表的碱基对数为4500，Y是限制酶B的酶切位点 C．电泳凝胶中DNA分子迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子大小和构象等有关 D．凝胶中的DNA分子通过染色，可以在紫外灯下被检测出来 【答案】B 【分析】限制性核酸内切酶酶切，是一项基于DNA限制性核酸内切酶的基因工程技术，其基本原理是利用限制性核酸内切酶对DNA上特定序列的识别，来确定切割位点并实现切割，从而获得所需的特定序列。 【详解】A、由图2可知，用限制酶A和B同时切割DNA分子，会形成4种长度的片段（3500、4500、1500、500），因此所得产物含8个游离磷酸基团，A正确； B、由图1可知，用限制酶A和B同时切割DNA分子，会形成4种长度的片段（3500、X、1500、500）；所以图1中X代表的碱基对数为4500，由图1中显示用限制酶B切割后应形成8000、2000两种长度的片段，与图2中②处电泳相符，所以②处是由限制酶B切割后电泳形成的，该DNA分子上只有一个限制酶B的切割位点；①为限制酶A切割形成的片段（6000、3500、500），所以Y处应为限制酶A的切割位点，B错误； C、DNA分子在凝胶中的迁移速率除了与DNA分子大小、构象等有关外，还与凝胶的浓度有关，C正确； D、凝胶中的DNA分子经染色后，对波长为300nm的紫外光吸收性强，可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D正确。 故选B。 10．（24-25高二下·天津·期中）以鸡血细胞为材料粗提取DNA的流程图如下，下列各项叙述错误的是（    ） 提取血细胞中的核物质→溶解核内DNA→析出并滤出含DNA的黏稠物→再溶解DNA黏稠物→过滤→提取DNA A．溶解核内DNA和再溶解DNA黏稠物都用2mol/L的NaCl溶液，作用原理相同 B．提取血细胞中的核物质和析出含DNA黏稠物都需加蒸馏水，蒸馏水的作用原理相同 C．提取血细胞中的核物质和提取DNA前的过滤都用纱布，目的都是获得滤液 D．析出含DNA的黏稠物和提取DNA时都需玻璃棒搅拌，目的都是获得DNA分子 【答案】B 【分析】DNA的粗提取实验中有三次过滤：①过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液；②过滤含黏稠物的0.14mol/LNaCl溶液；③过滤溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液。 【详解】A、溶解核内DNA和再溶解DNA黏稠物均使用2mol/L NaCl溶液，利用DNA在该浓度下溶解度最高的特性，作用原理相同，A正确； B、提取血细胞核物质时加蒸馏水是为了使细胞吸水涨破（渗透作用原理），而析出DNA时加蒸馏水是为了降低NaCl浓度至0.14mol/L（盐析原理），两者作用原理不同，B错误； C、提取核物质后的过滤（用纱布）是为了去除细胞碎片，获得含DNA的滤液；再溶解后的过滤（同样用纱布）是为了去除杂质，获得较纯的DNA溶液，两次均以获取滤液为目的，C正确； D、析出DNA时搅拌是为了促进DNA聚集析出，而提取DNA时搅拌是为了用玻璃棒卷取已析出的DNA，目的都是获得DNA，D正确。 故选B。 11．（24-25高二下·天津·期中）关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”的实验操作，下列说法错误的是（　　） A．取洋葱研磨液的上清液倒入离心管中经离心后，管底的沉淀物为粗提取的DNA B．将提取的白色丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加二苯胺试剂并进行沸水浴，用于鉴定DNA C．PCR反应过程可以在PCR扩增仪中自动完成，而后常用琼脂凝胶电泳来鉴定 D．电泳时，接通电源后，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 【答案】A 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、取洋葱研磨液的上清液倒入离心管中经离心后，管底的沉淀物主要是杂质，含有粗提取 DNA 的是上清液，A错误； B、DNA 溶于 2mol/L 的 NaCl 溶液，二苯胺试剂可用于鉴定 DNA，在沸水浴条件下会呈现蓝色，B正确； C、PCR 反应过程能够在 PCR 扩增仪中自动完成，琼脂凝胶电泳可以用来鉴定 PCR 产物，C正确； D、电泳时，当接通电源后，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳，这样能保证较好的电泳效果，D正确。 故选A。 12．（24-25高二下·天津南开·期中）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”（实验Ⅰ）和“DNA的粗提取与鉴定”（实验Ⅱ）的实验操作，下列相关叙述正确的是（    ） A．实验Ⅰ中，PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理 B．实验Ⅰ中，PCR反应中设置不同的温度是为了使DNA聚合酶催化不同的反应 C．实验Ⅱ中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA D．实验Ⅱ中，将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴，用于鉴定DNA 【答案】C 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、实验Ⅰ中，PCR实验所需的枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理，移液器不需要进行高压蒸汽灭菌处理，A错误； B、实验Ⅰ中，PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链，B错误； C、实验Ⅱ中，取洋葱研磨液的上清液，由于DNA不溶于酒精溶液，加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA，C正确； D、实验Ⅱ中，将丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液后加入二苯胺试剂，在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，用于鉴定DNA，D错误。 故选C。 13．（24-25高二下·天津·期中）下表是几种限制酶的识别序列及切割位点（Y=C或T，R=A或G）。下列相关叙述正确的是（    ） 限制酶 HindII AluI BamHI Sau3AI 识别序列及切割位点 5'-GTY↓RAC-3' 5'-AG↓CT-3' 5'-G↓GATCC-3' 5'-↓GATC-3' A．限制酶切割一次需切断2个磷酸二酯键，增加4个游离的磷酸基团 B．由上表可知一种限制酶只能识别一种核苷酸序列，并在特定位点切割 C．AluI切割后的DNA片段可用E.coliDNA连接酶或T4连接酶连接 D．BamHI和Sau3AI切割形成的片段进行重组后，BamHI和Sau3AI均不能识别并切割 【答案】C 【分析】限制酶的特点：识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特定的位点进行切割，切割后可能形成黏性末端或平末端。 【详解】A、限制酶切割一次需切断2个磷酸二酯键，形成2个新的游离的磷酸基团，A错误； B、一种限制酶不一定只识别一种核苷酸序列，如HindⅡ，B错误； C、AluI切割后形成的是平末端， E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端，也可以连接平末端，C正确； D、BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组后，BamHⅠ不能识别并切割重组片段，而Sau3AⅠ可识别并切割重组片段，D错误。 故选C。 14．（23-24高二下·天津滨海新·期中）下列相关叙述，哪一项不是基因工程中的载体所必需具备的特征（    ） A．具有多种限制酶切割位点，以便目的基因的插入 B．能在受体细胞中稳定保存，使目的基因能在受体细胞中稳定保存 C．对受体细胞无害，且易从供体细胞分离出来 D．必需要有青霉素抗性基团，以便对重组DNA进行筛选 【答案】D 【分析】作为运载体必须具备的条件： ①要具有限制酶的切割位点； ②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选； ③能在宿主细胞中稳定存在并复制； ④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。 【详解】A、作为基因工程的运载体要具有一个至多个限制酶切点，以便与外源基因连接，A不符合题意； B、作为基因工程的运载体要能在宿主细胞中复制并保存，从而保证目的基因能在宿主细胞中稳定存在并表达，B不符合题意； C、作为基因工程的运载体应该对受体细胞无害，且容易从供体细胞中分离出来，这样有利于基因工程的实现，C不符合题意； D、作为基因工程的运载体要具有标记基因，便于进行筛选，但不一定是青霉素抗性基因，如荧光蛋白基因也可以作为标记基因，D符合题意。 故选D。 15．（23-24高二上·天津滨海新区·期中）在重组DNA技术中，将外源基因导入受体细胞，通常是利用质粒作为载体。下列关于质粒的叙述，正确的是（　　） A．质粒是一种结构简单的环状RNA分子 B．质粒的复制和表达过程都遵循中心法则和碱基互补配对原则 C．目的基因只有通过质粒整合到受体细胞的DNA中才能表达 D．大多数天然质粒都不需要人工改造，可以直接作为载体使用 【答案】B 【分析】1、常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒，（质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外并具有自我复制能力的双链环状DNA分子）。 2、作为运载体必须具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存；②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入；③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。 3、天然的质粒不能直接作为载体，基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 【详解】A、质粒存在于许多细菌以及酵母菌（真核细胞）中的有自主复制能力的小型环状DNA分子，A错误； B、质粒的复制和表达都遵循中心法则，也遵循碱基互补配对原则，B正确； C、只需要将含有目的基因的质粒导入受体细胞，无需整合到受体细胞的DNA中也能表达，C错误； D、天然的质粒不能直接作为载体，基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，D错误。 故选B。 地 城 考点02 基因工程的基本操作程序 一、单选题 1．（24-25高二下·天津和平·期中）图1表示某重组质粒的构建过程，质粒P0具有四环素抗性基因（Tetr）和氨苄青霉素抗性基因（Ampr），并且含有限制性内切核酸酶EcoRV的酶切位点。为筛选出含有重组质粒P1的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到甲、乙、丙三类菌落，三类菌落形态相同，其生长情况如图2。下列叙述正确的是（    ） A．甲类菌落可能同时导入了P0和P1质粒 B．乙类菌落扩大培养后即可用于生产 C．丙类菌落可能导入了P0质粒 D．用玻璃刮刀将无抗生素平板上的菌落按位置接种到其他三个平板上 【答案】A 【分析】1、从图中看出，添加了氨苄青霉素后，丙菌落无法生长，添加四环素后，乙菌落无法生长，同时见天氨苄青霉素和四环素，只有甲才能生长，说明丙没有抵抗抗生素的能量，乙不抗四环素但抗氨苄青霉素，而甲既抗氨苄青霉素又抗四环素。 2、图中限制性核酸内切酶EcoR V将有四环素抗基因进行切割，所以形成的P1质粒（含有目的基因）将不抗四环素，P0质粒既抗四环素，又抗青霉素。 【详解】A、根据分析：甲既抗氨苄青霉素，又抗四环素，可能转入了P0和P1质粒，也可能只转入了P0质粒，A正确； B、乙类菌落不抗四环素，但抗氨苄青霉素，转入了P1质粒，但还需要进一步的鉴定，例如抗原抗体杂交后，才能进行扩大培养进行生产，B错误； C、丙类菌落既不抗四环素，也不抗氨苄青霉素，不含质粒，C错误； D、应该用接种环将菌落接种到其他平板上，D错误。 故选A。 （24-25高二下·天津·期中）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因（基因序列如图1）融合表达，运用重组酶技术构建质粒，重组酶通过识别两个DNA片段上的特定相同序列，将不同DNA片段连接，从而实现DNA重组，如下图2所示。构建好的环化质粒再导入大肠杆菌中并利用抗生素筛选。之后为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板：用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1-P4的扩增产物电泳结果如图3.根据下图回答下列小题。 2．分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中需加入的不同物质是（　　） A．酶和原料 B．引物和酶 C．引物和模板 D．原料和模板 3．引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用（　　） ① 5’ATGGTG------CAACCA3’ ② 5’TGGTTG---CACCAT3’ ③ 5’GACGAG---CTGCAG3’ ④ 5’ CTGCAG------CTCGTC3’ A．①③ B．②③ C．②④ D．③④ 4．根据图3中结果判断，可以舍弃的质粒有（　　） A．P1和P3 B．P2和P4 C．P3和P4 D．P1和P2 【答案】2．C 3．D 4．C 【分析】1、PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 2、PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 【详解】(1) PCR反应所需物质：一定的缓冲溶液、DNA模板、分别与两条模板链结合的引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。由于F1和F2是不同的DNA片段，而引物是与目的基因两条模板链结合的，所以分别进行PCR扩增片段 F1与片段F2时，配制的两个反应体系中需加入的不同物质是引物和模板，相同的物质有：4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、缓冲液等，C正确，ABD错误。故选C。 (2)引物与模板链的3’端结合，根据图中信息，F2-F、F1-R的碱基序列一部分序列能与F1片段（EGFP基因）右侧互补、一部分序列能与F2片段（AnB1基因）左侧互补，且F2-F、F1-R两种引物的碱基应能互补配对，这样经PCR扩增后F1和F2片段中才能出现特定的相同序列，在重组酶的作用下可以将F1和F2连接在一起，实现DNA重组。①②③④4种引物中①与②互补、③与④互补，只能从这两种组合中进行选择，但引物① 5’ATGGTG------CAACCA3’ ② 5’TGGTTG---CACCAT3’ 的互补序列在EGFP基因左侧、AnB1基因右侧部分，达不到扩增的目的，且选项中无①②组合，D正确，ABC错误。 故选D。 (3) 由于EGFP基因720bp，AnB1基因390bp，构建好的环化质粒中既含EGFP基因又含AnB1基因，用引物F1-F 和 F2-R对构建含的环化质粒进行了PCR扩增，得到的DNA片段大小应为720+390=1110 bp，图3中P1、P2出现了大小相近的条带，P3中未出现条带，P4中出现的条带在500-1000之间，所以可以舍弃的质粒有P3、P4，C正确，ABD错误。 故选C。 5．（24-25高二下·天津南开·期中）甲型流感病毒的抗原性与感染性与其表面的R蛋白（血凝素蛋白）密切相关，现利用基因工程的方法生产相关疫苗。图甲为构建R蛋白基因表达载体的过程，图乙为重组质粒被相关酶切后的电泳结果。下列相关叙述错误的是（    ） A．电泳技术可以用于人类亲子鉴定、生物间亲缘关系的鉴定 B．图甲过程中至少需要应用到逆转录酶、限制酶、DNA连接酶 C．若构建好的重组质粒长度共2000bp，据图乙可推测BamHI在重组质粒上有3个酶切位点 D．在通过PCR技术从1个cDNA分子中特异性扩增出R蛋白基因时，为得到55条脱氧核苷酸链等长的R蛋白基因，理论上应至少进行6次PCR循环 【答案】D 【分析】题图分析：图甲中①是逆转录过程，②是经过复制形成双链cDNA，③是将R蛋白基因和质粒结合形成基因表达载体，图乙是用限制酶切割后形成的电泳图。 【详解】A、不同生物的DNA切割后长度不同，切割后再进行电泳，可以用于人类亲子鉴定、生物间亲缘关系的鉴定，A正确； B、图甲获得重组质粒过程，需要逆转录形成双链cDNA分子，需要逆转录酶。R蛋白基因与质粒的重组，需要用到限制酶、DNA连接酶，B正确； C、用Hind Ⅲ将质粒2000bp切割后形成了200bp、400bp和1400bp共3个片段，说明Hind Ⅲ在重组质粒上有3个酶切位点，而用Hind Ⅲ和BamHI将质粒切割后形成了200bp、420bp、560bp的片段，2000=420×2+560+200×3，所以一共形成了6个片段，因此共有6个酶切位点，因此BamHI在重组质粒上有6-3=3个酶切位点，C正确； D、通过PCR技术将cDNA分子扩增成双链DNA后，若要从中特异性扩增出等长的R蛋白基因（即不含黏性末端的R蛋白基因），循环3次可获得2个不含黏性末端的R蛋白基因，循环4次可获得8个不含黏性末端的R蛋白基因，循环5次可获得22个不含黏性末端的R蛋白基因，循环6次可获得52个不含黏性末端的R蛋白基因，为到55条脱氧核苷酸链等长的R蛋白基因，理论上应至少进行7次PCR循环，D错误。 故选D。 6．（24-25高二下·天津·期中）通过转Bt基因技术获得抗虫棉是我国科学家的重大科研成果。下列有关转Bt基因技术的叙述，错误的是（　　） A．将重组Ti质粒导入农杆菌前，用Ca2+处理农杆菌可促进转化 B．基因表达载体中启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录过程 C．可利用农杆菌转化法，将插入T-DNA中的 Bt基因转移到棉花细胞染色体DNA上 D．若某抗虫棉仅一条染色体上插入一个Bt基因，则该植株自交后代抗虫个体占1/2 【答案】D 【分析】基因工程基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取，②基因表达载体的构建，③将目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定。其中核心步骤为基因表达载体的构建，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。 【详解】A、用Ca2+处理农杆菌可使其处于感受态，便于吸收重组质粒，这是农杆菌转化法的常规步骤，A正确； B、启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，启动转录过程，属于基因表达载体的必要组件，B正确； C、农杆菌的T-DNA可转移至宿主细胞并整合到染色体DNA中，插入T-DNA的Bt基因随之转移至棉花细胞，C正确； D、若抗虫棉为杂合体（仅一条染色体含Bt基因），自交后代中抗虫个体占3/4（显性性状），而非1/2，D错误。 故选D。 7．（24-25高二下·天津·期中）下图所示，要将t-PA改良基因通过基因工程大量制备改良药物t-PA蛋白，下列说法错误的是（    ） A．可先用限制酶Xma Ⅰ和Nhe Ⅰ切割质粒pCLY11，再和t-PA改良基因连接 B．质粒上的neor基因和mlacZ基因均可做为标记基因，便于重组DNA分子的筛选 C．可通过E.co1i DNA连接酶催化目的基因和酶切后的质粒进行连接 D．成功导入重组质粒的受体细胞在含有新霉素的培养基上能存活，且呈现白色 【答案】A 【分析】基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。包括四个基本程序：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细 胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、观察可知，限制酶Xma Ⅰ和Bgl Ⅱ在质粒上有合适的切割位点，且切割后产生的黏性末端能与t-PA改良基因的末端互补，所以可先用这两种酶切割质粒pCLY11，再和t -PA改良基因连接，A错误； B、由图可知，质粒上的neor基因（新霉素抗性基因）和mlacZ基因（表达产物会使细胞呈蓝色否则呈白色）都可以用来区分含有重组质粒和不含重组质粒的细胞，均可作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选，B正确； C、E. coli DNA连接酶可以催化目的基因和酶切后的质粒进行连接，形成重组质粒，C正确； D、成功导入重组质粒的受体细胞，因为neor基因（新霉素抗性基因）完整，所以在含有新霉素的培养基上能存活，又因为mlacZ基因被破坏，其表达产物不能使细胞呈蓝色，所以细胞应呈现白色，而不是蓝色，D正确。 故选A。 8．（24-25高二下·内蒙古呼和浩特·阶段练习）利用PCR获得目的基因后，用限制酶EcoRI同时处理目的基因与质粒，拼接后可得到重组基因表达载体，其部分DNA片段如下图所示。下列有关引物的分析正确的是（　　）    A．通过PCR进行目的基因的扩增时，所选的引物可为引物1和引物5 B．检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时，应选引物2和引物4 C．若设计的引物与模板不完全配对时，可以适当提高PCR复性的温度 D．DNA聚合酶能够与引物结合，并从引物的5'端依次连接脱氧核苷酸 【答案】B 【分析】1、PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 2、PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 3、结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加．PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。 【详解】A、引物结合在模板链的3'端，通过PCR获取目的基因时，所选的引物可为引物2和引物3，A错误； B、引物结合在模板链的3'端，检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时，应选用引物2 和引物4进行PCR，B正确； C、若设计的引物与模板不完全配对，可适当降低 PCR 复性的温度，以便引物与模板链结合，C错误； D、DNA聚合酶能与引物结合，并从引物的3'端连接脱氧核苷酸，D错误。 故选B。 二、解答题 9．（24-25高二下·天津滨海新·期中）心肌长期负荷过重引起的心肌细胞肥大、间质纤维化等过程称为心脏重塑，与基因Snhg5相关．Snhg5转录出的RNA并不翻译产生蛋白质，而是以RNA的形式发挥调节作用。研究人员利用转基因技术建立了心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠。 (1)Snhg5转录所需的原料是______。 (2)研究人员利用PCR技术获得了Snhg5基因，有关该过程正确的是______。 A．需要了解Sngh5基因的全部碱基序列 B．新链的合成只能从3'→5' C．反应体系加入的酶需要具有热稳定性 D．需要构建两种不同的引物 (3)通过PCR获得的目的基因Snhg5和质粒能用相应的酶切割、连接形成重组质粒（图1）。研究人员在构建重组质粒时得到6株可能含有重组质粒的大肠杆菌，分别提取各菌株中的质粒，使用限制性内切核酸酶SaⅡ和HindⅢ切割后，经DNA凝胶电泳技术检测得到结果如图2所示，其中含有重组质粒的菌株编号是______。 (4)根据图1，为获得α—MHC—Snhg5—hGH转基因片段，研究人员应使用限制性酶KpnⅠ和______切割Snhg5重组质粒。 (5)PCR技术的原理是______，扩增目的基因的前提是______ 【答案】(1)4 种核糖核苷酸 (2)CD (3)1、3、4、6 (4)SacⅠ (5) DNA 半保留复制 已知目的基因两端的脱氧核苷酸序列 【分析】1、PCR 技术的原理是DNA 半保留复制，PCR 过程中，在热稳定 DNA 聚合酶的催化下，以 DNA 为模板，以引物为延伸起点，利用 4 种脱氧核糖核苷酸，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板 DNA 互补的子链 DNA，其原理与 DNA 的半保留复制机制类似。 2、基因工程的步骤包括：目的基因的筛选与获取、表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）转录需要四种游离的核糖核苷酸作为原材料，以mRNA为模板。 （2）关于 PCR 技术获得 Snhg5 基因，正确的是反应体系加入的酶需要具有热稳定性和需要构建两种不同的引物；PCR 过程中需要高温变，所以反应体系中要加入具有热稳定性的 DNA 聚合酶，如 Taq 酶；PCR 需要两种不同的引物，它们分别与目的基因两条链的两端互补配对。 （3）6株可能含有重组质粒的大肠杆菌，分别提取各菌株中的质粒，使用限制性内切核酸酶SaⅡ和HindⅢ切割后，进行琼脂糖凝胶电泳，其中含有重组质应出现两条带，菌株1、3、4、6满足。 （4）由图1可见，重组质粒中α-MHC-Snhg5-hGH转基因片段的两端分别为限制性内切核酸酶KpnⅠ和SacⅡ的切点，所以用KpnⅠ和SacⅡ切割Snhg5重组质粒可获得α-MHC-Snhg5-hGH转基因片段。 （5）PCR技术的原理是的原理是DNA 半保留复制，已知目的基因两端的脱氧核苷酸序列以便合成引物扩增目的基因。 10．（24-25高二下·天津·期中）下图为“乙肝基因工程疫苗”生产过程的图解，质粒上箭头所指部位为相应的限制酶的切割位点。质粒中lacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的X-gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。请回答下列问题：    (1)过程①为了防止目的基因和质粒的自身环化，选用限制酶的最佳方案是________。 A．只有BamHI B．BamHI和EcoRI C．EcoRV和BamHI D．EcoRV和EcoRI (2)基因工程中常用大肠杆菌作为受体菌的原因是________。 (3)基因工程的四步程序是目的基因的获取、构建基因表达载体、________和目的基因的检测与鉴定。其中在构建基因表达载体时，所用载体除了质粒以外，还可以选择_________，为了保证目的基因正确表达，质粒中必须含有能与RNA聚合酶结合的元件________。 (4)过程②用________处理大肠杆菌后，大肠杆菌处于_________的生理状态，这种状态可以称为感受态。 (5)为了筛选含目的基因表达载体的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的培养基中额外加入_________，培养一段时间后挑选出_________（填“蓝色”或“白色”）的菌落进一步培养，从而获得大量目的菌。 (6)目的基因导入受体细胞后，常用________技术检测目的基因是否翻译出乙肝病毒外壳。 【答案】(1)B (2)结构简单，繁殖速度快 (3) 将目的基因导入到受体细胞 噬菌体、动植物病毒 启动子 (4) Ca2+ 容易吸收周围环境中DNA分子 (5) 青霉素、X-gal 白色 (6)抗原-抗体杂交 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）由图可知，目的基因内部含有EcoR V切割位点，因此构建基因表达载体时不能选择EcoR V切割，若只选择BamH I切割质粒和目的基因，则构建基因表达载体时易出现目的基因和质粒的自身环化和目的基因和质粒的倒接，因此过程①为了防止目的基因和质粒的自身环化，需要选择BamH I和EcoR I，即B正确，ACD错误。 故选B。 （2）由于大肠杆菌结构简单，繁殖速度快，遗传物质相对较少，因此常用大肠杆菌作为基因工程的受体细胞。 （3）基因工程的四步程序是目的基因的获取、构建基因表达载体、将目的基因导入到受体细胞和目的基因的检测与鉴定。基因工程中的载体包括质粒、噬菌体、动植物病毒。RNA聚合酶可识别并结合启动子因此为了保证目的基因正确表达，质粒中必须含有能与RNA聚合酶结合的元件启动子。 （4）将目的基因导入大肠杆菌时，常用Ca2+处理大肠杆菌后，使大肠杆菌处于容易吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种状态可以称为感受态。 （5）据图可知，质粒上含有标记基因青霉素抗性基因，且质粒中lacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的X-gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。据图可知，目的基因的插入会破坏lacZ基因，因此为了筛选含目的基因表达载体的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的培养基中额外加入青霉素、X-gal，由于重组质粒上lacZ基因被破坏，因此不能分解培养基中的X-gal，菌落为白色，故培养一段时间后挑选出白色的菌落进一步培养，从而获得大量目的菌。 （6）检测目的基因是否表达，常用抗原-抗体杂交技术，即目的基因导入受体细胞后，常用抗原-抗体杂交技术检测目的基因是否翻译出乙肝病毒外壳。 11．（24-25高二下·天津河北·期中）如图是利用基因工程方法培育抗虫棉的过程。请据图回答相关问题： (1)从苏云金芽孢杆菌的DNA上获取抗虫基因，需要用到的工具是______，此工具主要是从原核生物中分离纯化出来的，它能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。并且使每一条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的______。 (2)构建重组质粒时，常用Ti质粒作为载体。是因为Ti质粒上具有______，它能把目的基因整合到受体细胞的______上。 (3)E过程是利用______技术完成。要确定抗虫基因导入棉花细胞后，是否赋予了棉花抗虫特性，在个体水平上还需要做抗虫接种实验；若要检测具有抗虫基因的棉花是否产生了相应毒蛋白，在分子水平上可利用______方法进行检测。 【答案】(1) 限制酶 磷酸二酯建 (2) T﹣DNA 染色体的DNA (3) 植物组织培养 抗原﹣抗体杂交 【分析】（1）获得目的基因的方法有：①从基因文库中获取；②利用PCR技术扩增；③人工合成（逆转录法和化学合成法）。 【详解】（1）从苏云金芽孢杆菌的DNA上获取抗虫基因，需要用到的工具是限制性内切酶，此工具主要是从原核生物中分离纯化出来的，它能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个脱氧梭苷酸之间的磷酸二酯键断开。 （2）构建重组质粒时，常用Ti质粒作为载体，是因为Ti质粒上具有T﹣DNA，它能把目的基因整合到受体细胞染色体DNA。 （3）E过程是根据植物细胞的全能性，利用植物组织培养技术完成的，要确定抗虫基因导入棉花细胞后，是否赋予了棉花抗虫特性，在个体水平上还需要做抗虫接种实验，在分子水平上还需要做抗原﹣抗体杂交技术实验。 12．（24-25高二下·天津南开·期中）土壤盐渍化影响水稻生长发育。科研人员将水稻耐盐基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉更88中，培育出了4株耐盐碱水稻新品种。其操作流程及相关限制酶识别序列和切割位点如下图，图中I~Ⅲ为限制酶的酶切位点，bar为抗除草剂基因，Kanr为卡那霉素抗性基因。请回答： (1)过程①需要模板DNA、dNTP（同时提供原料和能量）、________酶、2种引物、Mg2+等。被转化的根瘤农杆菌会将Ti质粒的________转移到水稻的染色体DNA上。 (2)过程①所用引物如下，则过程②使用的限制酶是________和________，限制酶识别序列应该添加在引物的________端。 5'—CGCGGATCCATGAGAAAGGGCCCGTGG—3' 5'—CGAGCTCCTATCCCCAGAGAGGTAGCGA—3' (3)花椰菜病毒启动子含有________的核苷酸序列，本研究中设计两个相同启动子分别连接bar和目的基因，其目的是________。 (4)科研人员采用特定的方法大量提取成功转化的4株植株叶片的基因组DNA（目的基因中不含AAGCTT），用HindⅢ完全消化，消化产物经电泳、转膜后与目的基因的探针杂交，其杂交结果如图所示（图中数字标号代表转化成功的植株）。下列有关分析正确的有__________。 ①还有不含目的基因的DNA条带在图中没有显示 ②杂交带位置不同说明HindIII消化形成的DNA片段长度不同 ③相同位置上杂交带对应DNA片段的脱氧核苷酸序列相同 ④目的基因插入受体细胞核DNA的位置和数量都是随机的 【答案】(1) 耐高温的DNA聚合酶 T-DNA (2) BamHI SacI 5' (3) RNA聚合酶识别、结合 依据bar表达推测目的基因同时表达 (4)①②④ 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）过程①是PCR扩增目的基因，PCR技术需要模板DNA、dNTP（同时提供原料和能量）、耐高温的DNA聚合酶（Taq酶 ）、2种引物、Mg2+等。在农杆菌转化法中，被转化的根瘤农杆菌会将Ti质粒的T-DNA转移到水稻的染色体DNA上。 （2）观察一对引物5'端会发现有BamH I的识别序列GATCC和Sac I的识别序列GAGCTC，故过程②使用的限制酶是BamH I和Sac I。在引物设计时，限制酶识别序列应该添加在引物的5'端，因为DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链。 （3）启动子又叫RNA聚合酶结合位点，故其含有RNA聚合酶识别、结合的核苷酸序列，有了启动子才能驱动基因的转录，最终获得相关表达产物，本研究中设计两个相同启动子分别连接bar和目的基因，其目的是依据bar表达推测目的基因同时表达。 （4）①消化产物经电泳、转膜后与目的基因的探针杂交，不含目的基因的DNA条带在图中没有显示，①正确； ②杂交带位置不同说明Hind Ⅲ消化形成的DNA片段长度不同，因为不同长度的DNA片段在电泳中的迁移速率不同，②正确； ③相同位置上杂交带对应DNA片段长度相同，脱氧核苷酸序列不一定相同，③错误； ④目的基因插入受体细胞核DNA的位置和数量都是随机的，所以不同植株的实验结果中杂交带数目不同，④正确。 故选①②④。 13．（24-25高二下·天津东丽·期中）“中天杨”是由我国科学家采用生物转基因技术，历经8年时间培育成功的抗盐碱、耐干旱的杨树新品种。该品种以八里庄杨为实验材料，经转mtl-D基因培育获得。如图为培育“中天杨”的操作流程，①~⑥表示操作过程，该过程中可能用到的限制酶如表所示。回答下列问题。 注：Ti质粒中的Tetr为四环素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因。 限制酶 BclI EcoRI XbaI Sau3AI BamHI 切割位点 T↓GATCA G↓AATTC T↓CTAGA ↓GATC G↓GATCC (1)与杂交育种相比，基因工程育种的优点有________（多选）。 ①操作方法简便 ②目的性强，能定向改造生物性状 ③育种周期短 ④不受生殖隔离限制，能克服远缘杂交不亲和障碍 ⑤安全性高，对生态没有威胁 (2)过程①②选用限制酶________和________构建基因表达载体。 (3)采用PCR技术扩增目的基因时，每次循环一般依次经过变性、复性和________三个步骤，若扩增4个循环，则共用引物________个。 (4)将目的基因导入植物细胞除图示方法外，还有________法，此方法是我国科学家独创的一种方法。 (5)通过过程③将基因表达载体导入农杆菌后进行筛选，成功导入目的基因的农杆菌具有________特征（单选）。 A．能在含四环素和氨苄青霉素的培养基上生长 B．不能在含四环素的培养基上生长，能在含氨苄青霉素的培养基上生长 C．不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，能在含四环素的培养基上生长 D．不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，不能在含四环素的培养基上生长 (6)为了检测“中天杨”是否培育成功，个体水平上该如何检测？________。 【答案】(1)②③④ (2) Xbal BclI (3) 延伸 30 (4)花粉管通道法 (5)B (6)抗盐碱、耐干旱检测 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）与杂交育种相比，基因工程育种的操作方法较复杂，容易造成基因污染进而对生态产生威胁，但基因工程育种的目的性强，能定向改变生物性状，且育种周期短，不受生殖隔离限制，能克服远缘杂交不亲和障碍，故选②③④。 （2）在进行基因表达载体的构建时，据题意可知，BamHI和 EcoRI会破坏复制原点和标记基因，不能选用，选用 Sau3AI也会导致复制原点和标记基因被破坏，因此需要用Xbal、BcI切割质粒，应选择两种限制酶切割目的基因和 Ti质粒，即过程①②选用限制酶 Xbal、BclI。 （3）PCR技术包括变性、复性和延伸三个步骤；若该目的基因循环扩增4次，理论上需要消耗 2×24-2=30个引物。 （4）将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法，花粉管通道法是我国科学家独创的。 （5）基因表达载体上 Ampr为氨苄青霉素抗性基因，成功导入目的基因的农杆菌具有不能在含四环素的培养基上生长，能在含氨苄青霉素的培养基上生长的特点，ACD错误，B正确。 故选B。 （6）“中天杨”是由我国科学家采用生物转基因技术，历经8年时间培育成功的抗盐碱、耐干旱的杨树新品种，“中天杨”培育成功应该具备抗盐碱、耐干旱的性状，所以在个体水平上可以进行抗盐碱、耐干旱检测。 14．（24-25高二下·天津滨海新·期中）下图为“乙肝基因工程疫苗”生产过程的图解，质粒上箭头所指部位为相应的限制酶的切割位点。质粒中lacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的X-gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。请回答下列问题： (1)过程①为了防止目的基因和质粒的自身环化，选用限制酶的最佳方案是______。 A．只有BamHⅠ B．BamHⅠ和EcoRⅠ C．EcoRⅤ和BamHⅠ D．EcoRⅤ和EcoRⅠ (2)限制酶切割后，需要用DNA连接酶连接形成重组DNA分子，既能连接黏性末端又能高效连接平末端的是________________。 (3)过程②处理大肠杆菌后，大肠杆菌处于___________________________的生理状态。 (4)为了筛选含目的基因表达载体的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的培养基中额外加入______，培养段时间后挑选出__________（填“蓝色”或“白色”）的菌落进一步培养，从而获得大量目的菌。 (5)目的基因导入受体细胞后，常用________________技术检测目的基因是否翻译出乙肝病毒外壳。 【答案】(1)B (2)T4 DNA 连接酶 (3)容易吸收周围环境中 DNA 分子 (4) X-gal 白色 (5)抗原-抗体杂交 【分析】基因工程基本操作程序： 1、目的基因的获取：方法有PCR、化学方法人工合成、DNA合成仪合成。 2、基因表达载体的构建：基因表达载体的组成有目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点。 3、将目的基因导入受体细胞：导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法、基因枪法；导入动物细胞的方法是显微注射法；导入微生物的方法：感受态细胞法。 4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平检测：①DNA分子杂交检测目的基因是否整合到转基因生物的DNA上；②分子杂交检测目的基因是否转录出mRNA；③抗原—抗体杂交检测目的基因是否翻译出蛋白质；（2）个体生物学水平检测：抗虫抗病接种实验等。 【详解】（1）构建基因表达载体最佳方法是使用双酶切法处理目的基因和载体，使其产生相同的黏性末端，进而通过DNA连接酶构建基因表达载体，选择限制酶的要求是不能破坏目的基因，故不选择EcoR V，可以选择BamH I和EcoR I处理目的基因和质粒。 故选B。 （2）限制酶切割后，需要用DNA连接酶连接形成重组DNA分子，能连接黏性末端又能高效连接平末端的是 T4 DNA连接酶。 （3）过程②是用钙离子（Ca2+）处理，目的是将大肠杆菌变成感受态细胞，此时的大肠杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化。 （4）质粒中lacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的X-gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色。构建基因表达载体时，目的基因的插入使lacZ基因破坏，不能表达出相应的酶，进而不能使培养基中X-gal分解，因此菌落呈现白色。即在筛选含目的基因表达载体的大肠杆菌时，可在培养大肠杆菌的培养基中额外加入X-gal，培养一段时间后挑选出白色的菌落进一步培养，从而获得大量目的菌。 （5）目的基因导入受体细胞后，常用抗原-抗体杂交技术检测目的基因是否翻译出乙肝病毒外壳。如果目的基因表达，是可以检测到相应的蛋白质。 三、实验题 15．（24-25高二下·天津和平·期中）非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染家猪和野猪引起的一种高致病性传染病。科研人员在病毒ASFV的K基因（大小为790bp）中间插入荧光聚酶基因（Gluc基因）和增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP基因），从而构建可以进行快速观察及定量检测酶活性的重组病毒（ASFV-Gluc-EGFP）体系，如图1所示。回答下列问题： (1)为了初步鉴定重组病毒是否构建成功，科研人员提取病毒DNA，选用________（引物组合）进行PCR扩增，扩增结果有1、2两种类型，如图2所示。该实验结果表明Gluc基因和EGFP基因________（填“有”或“没有”）插入病毒ASFV的K基因。 (2)为了进一步验证重组病毒是否成功表达，科研人员将猪肺泡巨噬细胞（PAMS）培养一段时间后，平均分成A、B两组，其中A组接种病毒ASFV，B组接种________。支持“重组病毒成功表达”的实验结果为：________。 (3)同时，科研人员又分别测定了A、B两组的病毒数量变化，发现两者无显著差异，该结果表明_______。因此，该重组病毒体系的构建可为后续研究ASFV的致病机制及药物治疗奠定基础。 【答案】(1) 引物1和引物4/引物4和引物1 有 (2) 重组病毒 B组可观察到绿色荧光，检测到荧光素酶有活性；A组无荧光，荧光素酶无活性 (3)Gluc基因和EGFP基因的插入不影响病毒的复制 【分析】基因工程表达载体的构建是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 【详解】（1）重组病毒中K基因内部插入了Gluc基因和EGFP基因，分析图1可知：选用引物组合引物l和引物4进行PCR扩增可获得完整的Gluc基因和EGFP基因序列；扩增结果有1、2两种类型，如图2所示，由于K基因大小约790bp (类型1)，而目的基因插入成功的应大于790bp(类型2，约1758)。因此该实验结果表明Gluc基因和EGFP基因应该插入了病毒ASFV的K基因内。 （2）为了进一步验证重组病毒是否成功表达，科研人员将猪肺泡巨噬细胞（PAMS）培养一段时间后，平均分成A、B两组，根据对照原则，其中A组接种病毒ASFV，B组接种重组病毒。因重组病毒中含有荧光聚酶基因（Gluc基因）和增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP基因），因此B组可观察到绿色荧光，检测到荧光素酶有活性；而A组无荧光，荧光素酶无活性，若能出现上述结果，则可说明“重组病毒成功表达”。 （3）同时，科研人员又分别测定了A、B两组的病毒数量变化，发现两者无显著差异，该结果表明Gluc基因和EGFP基因的插入不影响病毒的复制。因此，该重组病毒体系的构建可为后续研究ASFV的致病机制及药物治疗奠定基础。 地 城 考点03 基因工程的应用 一、单选题 1．（24-25高二下·天津滨海新·期中）要定向改造大肠杆菌的遗传性状，使大肠杆菌能合成人的胰岛素，下列哪种技术可实现这一目标（    ） A．基因工程 B．杂交育种 C．诱变育种 D．单倍体育种 【答案】A 【分析】基因工程就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。优点是目的性强，克服远缘杂交不亲和障碍。 【详解】大肠杆菌与人之间存在生殖隔离，而杂交育种、诱变育种和单倍体育种不能打破物种之间的生殖隔离，但基因工程可实现不同物种之间的基因重组，能定向改造大肠杆菌的遗传性状，使大肠杆菌能合成人的胰岛素，A正确，BCD错误。 故选A。 2．（23-24高二下·天津河东·期中）新冠病毒（SARS-CoV-2）S蛋白的受体结合结构域（RBD）是引导病毒进入宿主细胞的关键结构。我国科研人员将GP67基因（指导合成一段信号肽，引导新合成的蛋白分泌到细胞外）与RBD基因融合，构建融合基因，大量生产RBD蛋白，用于制备疫苗，流程见下图。下列相关叙述错误的是（    ） A．过程①的理论基础是DNA具有相同的结构 B．过程②必须将融合基因与载体连接形成基因表达载体才能注射到受精卵内 C．过程③需用PCR技术检测融合基因是否成功表达 D．过程④可直接从培养液获得RBD，无需裂解细胞 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、过程①是基因与基因拼接在一起，该过程的基础是二者具有相同的空间结构和基本单位，即DNA具有相同的结构，A正确； B、过程②是将重组质粒（将融合基因与载体连接形成）导入昆虫细胞，由于受精卵全能性高，故通常将重组质粒注射到受精卵内，B正确； C、该过程中基因的表达产物是RBD蛋白，蛋白质的检测，通过抗原-抗体杂交技术实现，C错误； D、通过题干信息可知，该蛋白属于分泌蛋白，故过程④从培养液获得RBD，无需裂解细胞，D正确。 故选C。 3．（23-24高二下·天津·期中）下图a表示现代生物工程技术，b表示其结果，下列叙述错误的是（    ） A．如果a是胚胎分割技术，b中个体的基因型和表型一定相同 B．如果a是体外受精技术，得到b的繁殖方式属于有性生殖 C．如果a是核移植技术，可以促进优良畜群繁育 D．如果a是基因工程技术，b是乳腺生物反应器，则移植前需对胚胎进行性别选择 【答案】A 【分析】体细胞核移植的大致过程是：将供体体细胞核导入受体去核卵母细胞，形成重组细胞，用电脉冲刺激形成早期胚胎，导入代孕母羊的子宫，妊娠、出生后即克隆动物。胚胎移植概念：是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。其中提供胚胎的个体叫供体（遗传特性和生产性能优秀），接受胚胎的个体叫受体（有健康的体质和正常繁殖能力）。 【详解】A、如果a是胚胎分割技术，b中个体的基因型一定相同，表型由于受到环境影响不一定相同，A错误； B、有性生殖是指由亲本产生的有性生殖细胞（配子），经过两性生殖细胞（例如精子和卵细胞）的结合，成为受精卵，再由受精卵发育成为新的个体的生殖方式，如果a是体外受精技术，则形成的b属于有性生殖产生的动物，B正确； C、如果a是核移植技术，利用核移植技术可以加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育，这样克服了传统有性生殖过程花费时间长、优良性状难以在后代中长期保存等缺点，C正确； D、如果a是基因工程，b是乳腺生物反应器，目的基因表达的产物在雌性动物的乳汁中提取，则需对移植的胚胎进行性别选择，D正确。 故选A。 4．（20-21高二下·天津南开·期中）下列关于基因工程的叙述，错误的是（    ） A．基因工程是在分子水平上对生物进行遗传改造 B．基因工程的发展独立于生命科学基础理论的发展 C．基因工程已经广泛应用于医学、农业、工业、环境保护等领域 D．基因工程为在分子水平开展生命科学研究，带来了革命性的技术手段 【答案】B 【分析】1、基因工程的核心是构建重组DNA分子。 2、基因工程不仅在基因的结构、功能和表达调控等基础理论研究方面具有重要意义、而且在生产实践中开拓了广阔的应用前景，它给生命科学的研究及应用注入了无限生机和希望。 【详解】A、基因工程指在体外将各种生物的DNA分子进行改造和重新组合，导入微生物或真核细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生人类需要的产物，这是在分子水平上对生物进行遗传改造，A正确； B、基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来的，B错误； C、基因工程可以制造基因工程药物如干扰素、胰岛素等、可以制造出转基因大豆、提高微生物分解石油的能力等，基因工程工程已经广泛应用于医学、农业、工业、环境保护等领域，C正确； D、基因工程对DNA分子进行改造，对在分子水平开展生命科学研究，带来了革命性的技术手段，带动现代生物技术的兴起和发展，D正确。 故选B。 5．（22-23高二下·天津·期中）在下列选项中，不需要采用植物组织培养技术的是（    ） A．利用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗，获得多倍体植株 B．得到“番茄—马铃薯”杂种植株 C．利用基因工程培育抗棉铃虫的植株 D．单倍体育种 【答案】A 【分析】植物组织培养技术的应用：植物繁殖的新途径（微型繁殖、作物脱毒、人工种子）、作物新品种的培育（单倍体育种、突变体的利用）、细胞产物的工厂化生产。 【详解】A、利用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗，得到染色体数目加倍的植株，这属于多倍体育种，不需要采用植物组织培养技术，A正确； B、利用细胞工程技术培养“番茄—马铃薯”杂种植株时需要采用植物组织培养技术将杂种细胞培育成杂种植株，B错误； C、将转基因植物细胞培育成转基因植株需要采用植物组织培养技术，C错误； D、单倍体育种过程中，利用花药离体培养得到单倍体植株时需要采用植物组织培养技术，D错误。 故选A。 6．（20-21高二下·天津·期中）下列表示抗凝血酶乳腺生物反应器的制备过程，下列说法正确的是（　　） A．该转基因牛中的抗凝血酶基因只存在于乳腺细胞中 B．②表示性别为雄性的胚胎 C．常用农杆菌转化法将基因导入受体细胞 D．①表示受精卵 【答案】D 【解析】分析题图：图示为抗凝血酶乳腺生物反应器的制备过程，其中①为受体细胞，应该是受精卵；②表示早期胚胎（性别为雌性）。 【详解】A、该转基因牛中的抗凝血酶基因存在于所有体细胞中，只是在乳腺细胞中表达，A错误； B、由于只有母牛能产奶，因此②表示性别为雌性的胚胎，B错误； C、常用显微注射法将基因导入受体细胞，C错误； D、培育转基因动物时应该以受精卵为受体细胞，因此①表示受精卵，D正确。 故选D。 二、解答题 7．（24-25高二下·天津滨海新·期中）基因X的表达产物可保护损伤的神经细胞。科学家构建了含X的基因表达载体（图1），并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。请据此回答下列问题： (1)基因表达载体通常含有目的基因、启动子、______、______、______等结构：构建含X的基因表达载体时，应选择图1中的______限制酶。 (2)酶切后的载体和基因X进行连接，可产生3种连接产物：单个载体自连，基因X与载体正向连接、基因X与载体反向连接（如图1所示）。为鉴定这3种产物，选择EcoRⅠ酶和HindHⅢ酶对筛选得到的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。图中2泳道分别对应的载体的连接方式是______。 (3)在培养大鼠神经干细胞的过程中，可使用酶将细胞分散开。分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为______。 (4)将正向连接的重组载体导入神经干细胞后，为了检测基因X是否转录出mRNA，可用______技术。当培养的神经干细胞达到一定密度时，需进行______培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。 (5)科学家使用转基因动物生产药物时通常将药用蛋白基因与________等调控组件重组在一起导入哺乳动物的细胞中，使转基因动物通过分泌的乳汁来生产药物，此转基因动物被称作________。 【答案】(1) 终止子 复制原点 标记基因 BamH Ⅰ (2)反向连接 (3)细胞贴壁 (4) 分子杂交（PCR技术） 传代 (5) 乳腺中特异表达的基因的启动子 乳腺生物反应器 【分析】1、为了让限制酶切出的目的基因和载体切口能发生碱基互补配对而连接起来，通常应选择相同的限制酶对二者进行切割，所以分析图1可知，在构建含基因X的表达载体时，需选择图1中的BamH Ⅰ限制酶进行酶切。分析图2中电泳图谱可知，图中第1泳道为单个载体自连，因为载体长度为6000bp，基因X长度为600bp；由于基因X中有HindH Ⅲ酶识别序列，所以图中第3泳道显示所鉴定的载体是正向连接的；由于载体中有EcoR I酶识别序列，所以图中第2泳道显示所鉴定的载体是反向连接的。 2、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）基因表达载体可以进行复制，转录，且需要将目的基因从基因表达载体上切割下来，故基因表达载体通常含有目的基因、启动子、终止子、复制原点、标记基因等结构；根据题意和图示分析可知：由于X基因两边都有BamH Ⅰ限制酶识别序列，载体含有该限制酶识别序列，所以构建含X基因的表达载体时，需选择图1中的BamH Ⅰ限制酶进行酶切。 （2）分析图2中电泳图谱可知，图中第1泳道为单个载体自连，因为载体长度为6000bp，基因X长度为600bp；由于基因X中有HindH Ⅲ酶识别序列，所以图中第3泳道显示所鉴定的载体是正向连接的；由于载体中有EcoR I酶识别序列，所以图中第2泳道显示所鉴定的载体是反向连接的；综上所述可知，图中1、2、3泳道分别对应的载体的连接方式是载体自连、反向连接、正向连接。 （3）进行动物细胞培养时，需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶将从动物体内取出的组织块分散成单个细胞。在适宜环境中培养，细胞悬液中的细胞很快贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。 （4）分子杂交技术将正向连接的重组载体导入神经干细胞后，为了检测基因X是否转录出mRNA，由分析可知，可用核酸分子杂交技术或PCR技术，当培养的神经干细胞达到一定密度时产生接触抑制，需要换瓶，然后进行传代培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。 （5）利用基因工程技术，可以让哺乳动物批量生产药物。 科学家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子 等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动 物的受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入 泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物，这称 为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。目前，科学家已经 在牛、山羊等动物乳腺生物反应器中，获得了抗凝血酶、 血清白蛋白、生长激素和α-抗胰蛋白酶等重要的医药产品。 8．（24-25高二下·天津河东·期中）天然β淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提升。科研人员借助PCR技术对该β-淀粉酶基因改造，并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。图1表示对改造后的基因进行PCR扩增的过程，①~④表示引物。回答下列问题： (1)PCR反应需要在一定的缓冲液中（一般需要添加________激活酶）才能进行，需提供________、2种引物、________和________；PCR扩增时先要将温度上升到以上，使DNA变性，在该过程中，DNA双链发生的变化是________，复性时需要让温度下降到________，其目的是________。 (2)为了使改造后的基因能够完整地扩增，需要选择图1中的引物是________。已知该β-淀粉酶基因一条链两端的序列为（改造后的β-淀粉酶基因）GGGAAACT3'，选择的两种引物序列分别是________、________。经过35次循环后，一共消耗的引物数量有________个（写出算式，无需计算）。 (3)为了能够便于被限制酶切割，科研人员将限制酶的识别序列添加在改造后的基因两侧。图3表示三种限制酶在改造后的β-淀粉酶基因和pLN23质粒载体上的酶切位点，以及相关限制酶的识别序列。为了保证目的基因和质粒能够正确连接，切割含有β-淀粉酶基因的DNA片段时应当选择的限制酶是________、________。 (4)改造成功后的耐高温淀粉酶在工业上的实用意义是________（答出1点）。 【答案】(1) Mg2+ DNA模板 4种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶 双链DNA解旋为单链 50℃左右 两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 (2) ②和③ 5'-AAGGGCGG-3' 5'-AGTTTCCC-3' （235-1）×2 (3) EcoRⅠ BamHⅠ (4)提高生产效率（降低生产成本） 【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）PCR反应体系需要再含有Mg2+的缓冲液中进行，Mg2+可激活耐高温的DNA聚合酶。PCR的条件包括DNA模板、4种脱氧核苷酸、2种引物和耐高温的DNA聚合酶。PCR反应的每个循环可以分为变性、复性和延伸三步。当温度上升到90℃以上时，氢键断裂，双链DNA解旋为单链。当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对原则与两条单链DNA结合。 （2）引物与模板链的3'端结合，则扩增β-淀粉酶的编码序列所用的引物是②③。采用PCR技术扩增β-淀粉酶基因时，PCR中需要一对特异性的引物，该引物能与目的基因3′端碱基互补配对，所以引物的序列分别是 5'―AAGGGCGG―3'和5'―AGTTTCCC―3' 。一条双链DNA在PCR仪中进行35次循环，共产生235个DNA分子，其中235-1个DNA是新合成的，需要引物，所以需要（235-1）×2个引物。 （3）由图3可知，切割质粒只能用EcoR I和Sau3A I两种限制酶，但由于Sau3A I会破坏目的基因，所以切割含有目的基因的DNA片段不能用Sau3AI。BamH I与Sau3A I切出的黏性末端相同且BamH I和EcoR I切割含有目的基因的DNA片段后可得到与质粒两端黏性末端相同的目的基因，故应该用EcoR I和BamH I切割含有目的基因的DNA片段。 （4）改造成功后的耐高温淀粉酶在工业上的实用意义主要体现在以下几个方面：提在较高温度下催化淀粉水解，可以提高生产效率；高温条件下具有稳定性，降低生产成本；耐高温淀粉酶适用于更多的工业过程，扩展应用范围；在稳定的高温环境下，反应条件更容易控制，提高产品质量（答出1点，合理即可）。 9．（20-21高二下·天津滨海新·期中）奶酪是一种常见的食品，传统的方法是从未断奶的小牛的胃黏膜里提取牛凝乳酶，它能水解多肽链中苯丙氨酸和甲硫氨酸之间的肽键以促使牛奶凝结来生产奶酪，此方法产量低且昂贵。如今科学家将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌中，实现牛凝乳酶的批量生产，极大的满足了奶酪生产的需求。请回答相关问题： （1）科学家利用基因工程生产出大量的牛凝乳酶，该工程是在___________________水平上进行设计和施工的，其核心步骤是_________________________。 （2）上述基因工程技术过程中的目的基因是________________，常用__________方法扩增得到，该技术扩增DNA的过程包括__________________________。 （3）利用图示目的基因和质粒构建重组质粒，最好选用_______________（填限制性核酸内切酶名称）切割，这样选择的理由（至少写出两个）是__________和___________。若要初步筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，要在含___________________（氨苄青霉素/四环素）的培养基中进行培养。 （4）最后进行凝乳酶活性检测：将适量的大肠杆菌表达出的凝乳酶的提取物加入脱脂奶粉溶液中，37℃保温一段时间，可观察到_______________________现象。 【答案】 （DNA）分子 基因表达载体的构建 牛凝乳酶基因 PCR 变性、复性、延伸 NcoI和XhoI 目的基因不会被破坏 防止目的基因或载体自身的黏性末端连接 氨苄青霉素 脱脂奶粉溶液有明显的凝结 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）科学家利用基因工程生产出大量的牛凝乳酶，基因工程的操作对象是基因，因此该工程是在（DNA）分子水平上进行设计和施工的；基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。 （2）根据题意可知，上述基因工程技术过程中的目的基因是牛凝乳酶基因，该目的基因常用PCR　　技术扩增得到，PCR技术扩增DNA的过程包括高温变性、低温复性、中温延伸三个循环步骤。 （3）限制酶EcoRⅠ的切割位点位于目的基因上，用该酶切割会破坏目的基因，因此构建基因表达载体时不能选择该酶；为了防止自身环化和随意连接，应该选用两种限制酶进行切割，再结合质粒中的限制酶种类可知，利用图示目的基因和质粒构建重组质粒时，最好选用NcoI和XhoI切割，这样既避免了目的基因被破坏，而且还能防止目的基因或载体自身的黏性末端连接。用NcoI和XhoI切割会破坏抗四环素基因，但没有破坏抗氨苄青霉素基因，因此若要初步筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，要在含氨苄青霉素的培养基中进行培养。 （4）牛凝乳酶能水解多肽链中苯丙氨酸和甲硫氨酸之间的肽键以促进牛奶凝结来生产奶酪，因此最后进行凝乳酶活性检测时，将适量的大肠杆菌表达出的凝乳酶的提取物加入脱脂奶粉溶液中，37℃保温一段时间，可观察到脱脂奶粉溶液有明显的凝结现象。 【点睛】熟知基因工程的操作流程以及相关的原理是解答本题的关键，能根据题目中的相关信息进行合理的分析从而正确解答是解答本题的前提，掌握基因工程的应用前景是解答本题的另一关键。 地 城 考点04 蛋白质工程的原理和应用 一、单选题 1．（24-25高二下·天津河东·期中）如图为蛋白质工程操作的基本思路，下列叙述不正确的是（    ） A．代表蛋白质工程操作思路的过程是④⑤①②③ B．蛋白质工程的基本途径与中心法则相反，代表中心法则内容的是①② C．①代表转录，②代表翻译，③为折叠，④代表分子推测设计 D．蛋白质工程的目的是对基因的结构进行分子设计，通过基因合成或改造而实现 【答案】D 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）。 【详解】A、蛋白质工程操作思路是以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，即图中的④⑤①②③，A正确； B、蛋白质工程的基本途径与中心法则相反，中心法则是指遗传信息的传递过程，包括转录、翻译、DNA复制、RNA复制和逆转录过程，图中①代表转录，②代表翻译，因此代表中心法则内容的有①②，B正确； C、据图可知，①代表转录，②代表翻译，③为折叠，④代表分子设计，C正确； D、蛋白质工程的目的是对蛋白质的结构进行分子设计，通过基因合成或基因修饰实现，D错误。 故选D。 2．（24-25高二下·天津河东·期中）干扰素是动物细胞受到病毒侵染后产生的一种糖蛋白，可用于对抗病毒的感染和癌症，但体外保存相当困难。下图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，错误的是（    ）    A．图中新的干扰素基因必须插入质粒上的起始密码子和终止密码子之间才能表达 B．图中构建新的干扰素模型的主要依据是蛋白质的预期功能 C．图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构 D．图中各项技术环节中，有些需要通过基因工程实现 【答案】A 【分析】蛋白质工程是将控制蛋白质的基因进行修饰改造或合成新的基因，然后运用基因工程合成新的蛋白质。蛋白质工程的过程：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。蛋白质工程得到的蛋白质一般不是天然存在的蛋白质。 【详解】A、启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，从而驱动转录，而终止子提供转录终止的信号，因此图中新的干扰素基因必须插入质粒上的启动子和终止子之间才能表达，A错误； B、由题干可知，题图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，而蛋白质工程的主要依据是蛋白质的预期功能，因此图中构建新的干扰素模型的主要依据是蛋白质的预期功能，B正确； C、蛋白质工程的实质是对基因进行操作，操作简单，且能遗传给后代，即图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构，C正确； D、合成新的干扰素基因后，要构建基因表达载体在受体细胞中表达，这属于基因工程技术，D正确。 故选A。 3．（24-25高二下·天津南开·期中）天然胰岛素制剂容易形成二聚体或六聚体，皮下注射后往往要逐渐解离为单体，才能发挥作用，在一定程度上延缓了疗效。科学家利用蛋白质工程（基本思路见下图）研发出速效胰岛素，已在临床上广泛应用。下列有关叙述正确的是（    ） A．当前限制蛋白质工程发展的关键因素是基因工程技术还不成熟 B．利用基因工程和蛋白质工程生产胰岛素都经历①②过程 C．从六聚体胰岛素解离为单体形式是将胰岛素水解为氨基酸 D．利用蛋白质工程生产速效胰岛素要从推测b入手 【答案】B 【分析】蛋白质工程的流程：预期蛋白质的功能→设计预期的蛋白质结构(a)→推测应有氨基酸序列(b)→找到对应的脱氧核苷酸序列(基因)→转录(①)形成mRNA(c)→翻译(②)获得所需要的蛋白质。 【详解】A、当前限制蛋白质工程发展的关键因素是蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往很复杂，人们对蛋白质的高级结构了解太少，A错误； B、利用基因工程和蛋白质工程生产胰岛素都经历找到对应的脱氧核苷酸序列(基因)→转录(①)形成mRNA(c)→翻译(②)获得所需要的蛋白质过程，B正确； C、由题干信息可知，经过蛋白质工程改造后，发挥作用的仍是胰岛素分子，所以从六聚体胰岛素解离为单体形式是将六个胰岛素形成的六聚体水解为单个胰岛素的过程，C错误； D、蛋白质工程中，首先根据预期的蛋白质功能设计预期的蛋白质结构，因此利用蛋白质工程生产速效胰岛素要从设计预期的蛋白质结构(a)入手，D错误。 故选B。 4．（23-24高二下·天津·期末）天然蛋白t-PA 是心梗和脑血栓的急救药，研究证实将t-PA 第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低其诱发出血的副作用。下图为采取基因工程方法表达t-PA 改良基因，制造改良t-PA 蛋白的过程。下列叙述正确的是（    ） A．构建重组质粒时需要选用限制酶Xma I和Nhe I 切割质粒pCLY11 B．以上技术制造出性能优异的改良t-PA 过程被称为蛋白质工程 C．DNA 连接酶可以将t-PA 改良基因与质粒间的磷酸和核糖连接起来 D．导入重组质粒的受体细胞在含新霉素的培养基上能存活，且呈蓝色 【答案】B 【分析】蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出的第二代基因工程，因为是对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，所以必须通过基因修饰或基因合成实现。通过蛋白质工程生产出来的蛋白质更加符合人类生产和生活的需要。 【详解】A、根据碱基互补配对原则，t-PA基因的左端黏性末端为CCGG-，为XmaⅠ酶切得到，t-PA基因的右端黏性末端为GATC-，为BglⅡ酶切得到，质粒需要用相同的酶进行酶切以得到与目的基因相同的黏性末端，因此质粒需选用限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割质粒pCLY11，A错误； B、该技术通过改造基因，从而产生出优异的改良t-PA蛋白，因此该技术为蛋白质工程，B正确； C、DNA 连接酶可以将t-PA 改良基因与质粒间的磷酸和脱氧核糖连接起来，C错误； D、t-PA能高效降解因血浆纤维蛋白凝聚而成的血栓，成功转入重组质粒的受体细胞在培养基上会出现具有抗性的白色菌落，D错误。 故选A。 5．（20-21高二下·天津南开·期中）下列哪项不是蛋白质工程的基本思路（    ） A．通过改造或合成基因获得所需要的蛋白质 B．从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构 C．根据所预期的蛋白质结构，推测相应的氨基酸序列 D．根据推测的氨基酸序列，便能确定唯一对应的脱氧核苷酸序列 【答案】D 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 【详解】A、蛋白质工程通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，A不符合题意； BC、蛋白质工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因），BC不符合题意； D、由于有的氨基酸可能由多个密码子编码，因此根据氨基酸序列推测的脱氧核苷酸序列可能不唯一，D符合题意。 故选D。 6．（21-22高二下·天津·期中）科学家利用蛋白质工程技术将葡萄糖异构酶的第138位甘氨酸用脯氨酸替代，结果它的最适温度提高了10~12℃。下列说法正确的是（    ） A．蛋白质工程的目的是获得满足人类生产和生活需求的蛋白质 B．蛋白质工程和基因工程的根本区别是操作对象的差异 C．蛋白质工程在设计蛋白质结构时的依据是现有基因的脱氧核苷酸序列 D．蛋白质工程只能改造现有的蛋白质而不能制造新的蛋白质 【答案】A 【分析】1、蛋白质工程是通过修改基因或创造合成新基因来改变生物的遗传和表达性状，合成新的蛋白质，蛋白质工程从属于基因工程，蛋白质工程是第二代基因工程。 2、蛋白质工程的过程为：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。 【详解】A、蛋白质工程的实质是定向改造或生产人类所需蛋白质，故蛋白质工程可以获得满足人类生产和生活需求的蛋白质，A正确； B、蛋白质工程和基因工程都要对基因进行操作，其操作对象相同，B错误； C、蛋白质工程在设计蛋白质结构时的依据是预期的蛋白质功能，C错误； D、蛋白质工程可以产生自然界中不存在的蛋白质，能制造新的蛋白质，D错误。 故选A。 7．（20-21高二下·天津·期中）下列有关基因工程和蛋白质工程的叙述，不正确的是（　　） A．将基因表达载体导入小鼠的受精卵中常用显微注射法 B．我国科学家采用花粉管通道法培育出了转基因抗虫棉 C．蛋白质工程可通过直接改造蛋白质的结构从而改变其功能 D．蛋白质工程可合成自然界中不存在的蛋白质 【答案】C 【解析】1、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建（核心）；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。 2、蛋白质工程指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要。 【详解】A、将目的基因导入受精卵中常用显微注射法，A正确； B、我国利用花粉管通道法培育了转基因抗虫棉，B正确； C、蛋白质工程是通过改造基因来实现对蛋白质的改造的，C错误； D、蛋白质工程可制造一种新的蛋白质，即可合成自然界中不存在的蛋白质，D正确。 故选C。 8．（22-23高二下·天津·期中）新冠病毒是一种RNA病毒，极易产生变异，其通过表面刺突蛋白（S蛋白）的受体结合域（RBD）与人体细胞表面的ACE2受体相互作用而感染细胞。科学家设计了一种自然界中不存在的蛋白质LCB1，可与S蛋白RBD紧密结合，以干扰新冠病毒的感染。下列有关说法错误的是（    ） A．LCB1的作用效应与抗S蛋白抗体类似 B．LCB1可以通过细胞中原有的基因表达产生 C．LCB1的设计和合成遵循中心法则 D．LCB1的设计和合成是通过蛋白质工程实现的 【答案】B 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。蛋白质工程能够生产自然界中不存在的蛋白质。 【详解】A、LCB1能S蛋白结合，干扰新冠病毒对人体细胞的感染，说明其作用与抗体类似，A正确； B、LCB1是人工设计并合成的一种自然界不存在的蛋白质，故LCB1并不是通过细胞中原有的基因表达产生的，B错误； C、LCB1的设计和合成属于蛋白质工程，遵循中心法则，C正确； D、基因工程只能合成自然界已经存在的蛋白质，而LCB1蛋白药物是自然界不存在的，是通过蛋白质工程设计和合成的，D正确。 故选B。 二、实验题 9．（24-25高二下·天津滨海新·期中）水蛭是我国传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性，蛋白质工程流程如图所示。回答下列问题： (1)蛋白质工程是基因工程的延伸，区别在于基因工程原则上只能生产______的蛋白质，蛋白质工程可以通过改造或合成______来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白。 (2)基因工程中获取目的基因的常用方法有______、______和利用PCR技术扩增。 (3)图中物质a是______物质b是______，在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是________。 (4)研究者运用蛋白质工程技术，构建水蛭肽嵌合蛋白（TNHH），以大鼠为材料研究发现TNHH对脑出血后脑水肿具有一定的治疗效果。完善以下实验设计。 实验处理 A组 B组 C组 只进针，不在脑中注入血液 ①______ ②______ ③______ 静脉注射生理盐水 ④______ 实验结果 0 0 0 0 1.75 2.75 2.37 1.37 1.25 1.62 1.65 0.87 处理后时间（h） 6 24 72 168 6 24 72 168 6 24 72 168 注：实验结果为大鼠神经功能缺损评分，缺损评分越高，神经功能损伤越严重。 【答案】(1) 自然界已经存在的 基因 (2) 从基因文库中获取目的基因 通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成 (3) （具有一定氨基酸序列的）多肽链 mRNA/信使RNA 密码子的简并性（或一种氨基酸可能有多种密码子与之对应） (4) 在脑中注入血液 在脑中注入血液 静脉注射生理盐水 静脉注射TNHH溶液 【分析】1、蛋白质工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质的结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。 2、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。也就是说，蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。 【详解】（1）基因工程原则上只能生产自然界已经存在的蛋白质，而蛋白质工程可通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 （2）基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用PCR技术扩增。 （3）蛋白质工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质的结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列，据图可知，物质a是具有一定氨基酸序列的多肽链，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。 （4）据表可知，该实验是研究TNHH对脑出血的治疗效果，实验前先制备脑出血模拟鼠，所以①②均在脑中注入血液（适量且等量）。该实验的自变量是是否使用TNHH和处理时间，因变量是大鼠神经功能缺损评分，结合实验结果可知，③为静脉注射生理盐水，A组为空白对照组，B组为对照组，④为静脉注射TNHH溶液，C组为实验组。 三、解答题 10．（23-24高二下·天津·期中）二苯乙烯苷是我国传统药材何首乌特有的药效成分，具有抗氧化、清除自由基等功效。合成二苯乙烯苷的关键酶是芪合酶（STS），为获得大量的STS，研究人员利用质粒（如图2）将STS基因（如图1）转化到大肠杆菌细胞内进行表达。回答下列问题： (1)采用_________技术可以快速、大量获得目的基因，据图1分析，利用该技术扩增STS基因时，应选择的引物是________。 (2)为使STS基因与质粒正确连接，需在所选引物的_______（填“3”或“5’”）端分别增加相应限制酶的酶切位点，同时选用__________两种限制酶切割质粒。 (3)启动子是_______识别和结合的部位。很多启动子具有物种特异性，在图2质粒中插入STS基因，其上游启动子应选择_______（填写字母）。 A．何首乌启动子        B．大肠杆菌启动子        C．农杆菌启动子 (4)可将转化后的大肠杆菌接种到含________的培养基上进行筛选。能在该培养基上生长的大肠杆菌是否一定含有STS基因?请判断并说明理由：________。 (5)科研人员利用相关技术替换了STS某个位点的氨基酸，提高了STS的抗氧化能力，该技术属于_________。 【答案】(1) PCR 引物2 和引物 3 (2) 5' XhoI 和 NdeI (3) RNA 聚合酶 B (4) 氨苄青霉素 不一定，含氨苄青霉素抗性基因的未重组载体（空质粒）也可导入大肠杆菌，使大肠杆菌在培养基上形成菌落 (5)蛋白质工程 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）PCR技术是一种在体外模拟DNA复制过程，快速扩增目的基因片段的分子生物学技术，采用PCR技术可以快速、大量获得目的基因。P端是5'端，OH端是3'端，在引物作用下，DNA聚合酶只能从引物3'端开始延伸DNA链，因此利用该技术扩增STS基因时，应选择的引物是引物2和引物3。 （2）DNA聚合酶能从引物3'端开始延伸DNA链，为使STS基因与质粒正确连接，在设计PCR引物时需在所选引物的5′端分别增加相应限制酶的酶切位点，以确保目的基因两侧与质粒有相同的酶切位点。据图2可知，质粒中存在三种限制酶切位点，其中限制酶SacⅠ会破坏抗生素标记基因，因此切割质粒应该用XhoⅠ和NdeⅠ，因此目的基因也应该用这两种酶切割才能将目的基因和质粒连接起来，根据图1中转录方向和图2中启动子和终止子位置，应该在引物3的5′端增加NdeⅠ的酶切序列，在引物2的5′端增加XhoⅠ的酶切序列。 （3）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，启动基因的转录。据题意可知，本实验利用质粒将STS基因转化到大肠杆菌细胞内进行表达，因此在图2质粒中插入STS基因，其上游启动子应选择大肠杆菌启动子 ，B正确，AC错误。 故选B。 （4）质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，可将转化后的大肠杆菌接种到含氨苄青霉素的培养基上进行筛选。能在此培养基上生长的可能是含有STS基因导入大肠杆菌，也可能是含氨苄青霉素抗性基因的未重组载体导入大肠杆菌，使大肠杆菌在培养基上形成菌落，因此能在该培养基上生长的大肠杆菌不一定含有STS基因。 （5）蛋白质工程指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要，科研人员利用相关技术替换了STS某个位点的氨基酸，提高了STS的抗氧化能力，该技术属于蛋白质工程。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题03 基因工程 4大高频考点概览 考点01 重组DNA技术的基本工具 考点02 基因工程的基本操作程序 考点03 基因工程的应用 考点04 蛋白质工程的原理和应用 地 城 考点01 重组DNA技术的基本工具 一、单选题 1．（24-25高二下·天津滨海新·期中）用限制酶EcoRⅤ单独切割某普通质粒，可产生14kb（1kb即1000个碱基对）的长链，而同时用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ联合切割该质粒，可得到三种长度的DNA片段，见下图（其中*表示EcoRⅤ限制酶切割后的一个黏性末端）。 若用MboⅠ限制酶单独切割该普通质粒，则产生的DNA片段的长度为（    ） A．6和8 B．2.5和11.5 C．14 D．5.5和8.5 2．（24-25高二下·天津滨海新·期中）下图为不同限制酶的识别序列及切割位点（↓表示切割位点），下列叙述错误的是（    ） A．用EcoRⅠ切割DNA分子中部获得一个目的基因时，需断开的磷酸二酯键有2个 B．图示4种限制酶均不能够识别和切割RNA分子内的核苷酸序列 C．用BglⅡ切出的目的基因与BamHⅠ切割的质粒重组后，则不能再被这两种酶切开 D．酶切时需要控制好温度、酶浓度、PH等因素 3．（24-25高二下·天津滨海新·期中）下图为四种不同限制性核酸内切酶识别的序列及切割位置图示，下列叙述错误的是（    ） A．若DNA上的碱基随机排列，理论上每4096个碱基对会有一个BamHⅠ限制酶识别位点 B．作为优质的基因工程的通用载体，质粒上应具有同种限制酶的多个酶切位点 C．BamHⅠ限制酶切割得到的目的基因可以与BglⅡ限制酶切割后的质粒相连 D．若DNA上的碱基随机排列，NotⅠ限制酶切割位点出现频率低于其他三种限制酶 4．（24-25高二下·天津滨海新·期中）下列关于DNA重组技术基本工具的说法，正确的是（    ） A．DNA连接酶可催化脱氧核苷酸链间形成氢键 B．限制酶切割DNA后一定能产生黏性末端 C．质粒是基因工程中唯一的载体 D．微生物中的限制性核酸内切酶对自身DNA无损害作用 5．（24-25高二下·天津·期中）下表是几种限制酶的识别序列及切割位点。据表分析，下列相关叙述错误的是（　　） 限制酶 HindII AluI BamHI Sau3AI 识别序列及切割位点 5'-GTY↓RAC-3' 5'-AG↓CT-3' 5'-G↓GATCC-3' 5'-↓GATC-3' （注：Y表示C或T，R表示A或G） A．限制酶作用于磷酸二酯键 B．一种限制酶可识别不只一种核苷酸序列 C．AluI切割后的DNA片段可用T4DNA连接酶连接 D．将BamHI和Sau3AI切割形成的片段连接后，一定能被这两种酶识别并切割 6．（24-25高二下·天津·期中）下列有关基因工程的说法，正确的是（　　） A．基因工程常以抗生素抗性基因作为目的基因 B．限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸 C．质粒是基因工程最常用的载体，从生物体内获取后可直接使用 D．限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA 7．（24-25高二下·天津·期中）下列有关基因工程的工具，正确的是（    ） A．重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和运载体 B．用限制酶剪切获得一个目的基因时得到两个切口，有两个磷酸二酯键被断开 C．限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大 D．序列  和  被限制酶切出的黏性末端碱基数相同 8．（24-25高二下·天津南开·期中）从图1酶切结果分析，图2中的目的基因（长度为2.0kb）插入方向正确的重组质粒序号和作出该判断所用的限制酶是（    ） A．①,BamHI B．①,EcoRⅠ和HindⅢ C．②,EcoR I D．②,EcoRI和 HindⅢ 9．（24-25高二下·天津东丽·期中）用A和B两种限制酶同时和分别处理同一DNA片段，限制酶对应切点一定能切开。两种酶切位点及酶切产物电泳分离结果如图1和图2所示。下列叙述错误的（　　） A．用A和B两种限制酶同时处理同一DNA片段所得产物含8个游离磷酸基团 B．图1中X代表的碱基对数为4500，Y是限制酶B的酶切位点 C．电泳凝胶中DNA分子迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子大小和构象等有关 D．凝胶中的DNA分子通过染色，可以在紫外灯下被检测出来 10．（24-25高二下·天津·期中）以鸡血细胞为材料粗提取DNA的流程图如下，下列各项叙述错误的是（    ） 提取血细胞中的核物质→溶解核内DNA→析出并滤出含DNA的黏稠物→再溶解DNA黏稠物→过滤→提取DNA A．溶解核内DNA和再溶解DNA黏稠物都用2mol/L的NaCl溶液，作用原理相同 B．提取血细胞中的核物质和析出含DNA黏稠物都需加蒸馏水，蒸馏水的作用原理相同 C．提取血细胞中的核物质和提取DNA前的过滤都用纱布，目的都是获得滤液 D．析出含DNA的黏稠物和提取DNA时都需玻璃棒搅拌，目的都是获得DNA分子 11．（24-25高二下·天津·期中）关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”的实验操作，下列说法错误的是（　　） A．取洋葱研磨液的上清液倒入离心管中经离心后，管底的沉淀物为粗提取的DNA B．将提取的白色丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加二苯胺试剂并进行沸水浴，用于鉴定DNA C．PCR反应过程可以在PCR扩增仪中自动完成，而后常用琼脂凝胶电泳来鉴定 D．电泳时，接通电源后，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 12．（24-25高二下·天津南开·期中）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”（实验Ⅰ）和“DNA的粗提取与鉴定”（实验Ⅱ）的实验操作，下列相关叙述正确的是（    ） A．实验Ⅰ中，PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理 B．实验Ⅰ中，PCR反应中设置不同的温度是为了使DNA聚合酶催化不同的反应 C．实验Ⅱ中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA D．实验Ⅱ中，将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴，用于鉴定DNA 13．（24-25高二下·天津·期中）下表是几种限制酶的识别序列及切割位点（Y=C或T，R=A或G）。下列相关叙述正确的是（    ） 限制酶 HindII AluI BamHI Sau3AI 识别序列及切割位点 5'-GTY↓RAC-3' 5'-AG↓CT-3' 5'-G↓GATCC-3' 5'-↓GATC-3' A．限制酶切割一次需切断2个磷酸二酯键，增加4个游离的磷酸基团 B．由上表可知一种限制酶只能识别一种核苷酸序列，并在特定位点切割 C．AluI切割后的DNA片段可用E.coliDNA连接酶或T4连接酶连接 D．BamHI和Sau3AI切割形成的片段进行重组后，BamHI和Sau3AI均不能识别并切割 14．（23-24高二下·天津滨海新·期中）下列相关叙述，哪一项不是基因工程中的载体所必需具备的特征（    ） A．具有多种限制酶切割位点，以便目的基因的插入 B．能在受体细胞中稳定保存，使目的基因能在受体细胞中稳定保存 C．对受体细胞无害，且易从供体细胞分离出来 D．必需要有青霉素抗性基团，以便对重组DNA进行筛选 15．（23-24高二上·天津滨海新区·期中）在重组DNA技术中，将外源基因导入受体细胞，通常是利用质粒作为载体。下列关于质粒的叙述，正确的是（　　） A．质粒是一种结构简单的环状RNA分子 B．质粒的复制和表达过程都遵循中心法则和碱基互补配对原则 C．目的基因只有通过质粒整合到受体细胞的DNA中才能表达 D．大多数天然质粒都不需要人工改造，可以直接作为载体使用 地 城 考点02 基因工程的基本操作程序 一、单选题 1．（24-25高二下·天津和平·期中）图1表示某重组质粒的构建过程，质粒P0具有四环素抗性基因（Tetr）和氨苄青霉素抗性基因（Ampr），并且含有限制性内切核酸酶EcoRV的酶切位点。为筛选出含有重组质粒P1的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到甲、乙、丙三类菌落，三类菌落形态相同，其生长情况如图2。下列叙述正确的是（    ） A．甲类菌落可能同时导入了P0和P1质粒 B．乙类菌落扩大培养后即可用于生产 C．丙类菌落可能导入了P0质粒 D．用玻璃刮刀将无抗生素平板上的菌落按位置接种到其他三个平板上 （24-25高二下·天津·期中）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因（基因序列如图1）融合表达，运用重组酶技术构建质粒，重组酶通过识别两个DNA片段上的特定相同序列，将不同DNA片段连接，从而实现DNA重组，如下图2所示。构建好的环化质粒再导入大肠杆菌中并利用抗生素筛选。之后为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板：用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1-P4的扩增产物电泳结果如图3.根据下图回答下列小题。 2．分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中需加入的不同物质是（　　） A．酶和原料 B．引物和酶 C．引物和模板 D．原料和模板 3．引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用（　　） ① 5’ATGGTG------CAACCA3’ ② 5’TGGTTG---CACCAT3’ ③ 5’GACGAG---CTGCAG3’ ④ 5’ CTGCAG------CTCGTC3’ A．①③ B．②③ C．②④ D．③④ 4．根据图3中结果判断，可以舍弃的质粒有（　　） A．P1和P3 B．P2和P4 C．P3和P4 D．P1和P2 5．（24-25高二下·天津南开·期中）甲型流感病毒的抗原性与感染性与其表面的R蛋白（血凝素蛋白）密切相关，现利用基因工程的方法生产相关疫苗。图甲为构建R蛋白基因表达载体的过程，图乙为重组质粒被相关酶切后的电泳结果。下列相关叙述错误的是（    ） A．电泳技术可以用于人类亲子鉴定、生物间亲缘关系的鉴定 B．图甲过程中至少需要应用到逆转录酶、限制酶、DNA连接酶 C．若构建好的重组质粒长度共2000bp，据图乙可推测BamHI在重组质粒上有3个酶切位点 D．在通过PCR技术从1个cDNA分子中特异性扩增出R蛋白基因时，为得到55条脱氧核苷酸链等长的R蛋白基因，理论上应至少进行6次PCR循环 6．（24-25高二下·天津·期中）通过转Bt基因技术获得抗虫棉是我国科学家的重大科研成果。下列有关转Bt基因技术的叙述，错误的是（　　） A．将重组Ti质粒导入农杆菌前，用Ca2+处理农杆菌可促进转化 B．基因表达载体中启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录过程 C．可利用农杆菌转化法，将插入T-DNA中的 Bt基因转移到棉花细胞染色体DNA上 D．若某抗虫棉仅一条染色体上插入一个Bt基因，则该植株自交后代抗虫个体占1/2 7．（24-25高二下·天津·期中）下图所示，要将t-PA改良基因通过基因工程大量制备改良药物t-PA蛋白，下列说法错误的是（    ） A．可先用限制酶Xma Ⅰ和Nhe Ⅰ切割质粒pCLY11，再和t-PA改良基因连接 B．质粒上的neor基因和mlacZ基因均可做为标记基因，便于重组DNA分子的筛选 C．可通过E.co1i DNA连接酶催化目的基因和酶切后的质粒进行连接 D．成功导入重组质粒的受体细胞在含有新霉素的培养基上能存活，且呈现白色 8．（24-25高二下·内蒙古呼和浩特·阶段练习）利用PCR获得目的基因后，用限制酶EcoRI同时处理目的基因与质粒，拼接后可得到重组基因表达载体，其部分DNA片段如下图所示。下列有关引物的分析正确的是（　　）    A．通过PCR进行目的基因的扩增时，所选的引物可为引物1和引物5 B．检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时，应选引物2和引物4 C．若设计的引物与模板不完全配对时，可以适当提高PCR复性的温度 D．DNA聚合酶能够与引物结合，并从引物的5'端依次连接脱氧核苷酸 二、解答题 9．（24-25高二下·天津滨海新·期中）心肌长期负荷过重引起的心肌细胞肥大、间质纤维化等过程称为心脏重塑，与基因Snhg5相关．Snhg5转录出的RNA并不翻译产生蛋白质，而是以RNA的形式发挥调节作用。研究人员利用转基因技术建立了心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠。 (1)Snhg5转录所需的原料是______。 (2)研究人员利用PCR技术获得了Snhg5基因，有关该过程正确的是______。 A．需要了解Sngh5基因的全部碱基序列 B．新链的合成只能从3'→5' C．反应体系加入的酶需要具有热稳定性 D．需要构建两种不同的引物 (3)通过PCR获得的目的基因Snhg5和质粒能用相应的酶切割、连接形成重组质粒（图1）。研究人员在构建重组质粒时得到6株可能含有重组质粒的大肠杆菌，分别提取各菌株中的质粒，使用限制性内切核酸酶SaⅡ和HindⅢ切割后，经DNA凝胶电泳技术检测得到结果如图2所示，其中含有重组质粒的菌株编号是______。 (4)根据图1，为获得α—MHC—Snhg5—hGH转基因片段，研究人员应使用限制性酶KpnⅠ和______切割Snhg5重组质粒。 (5)PCR技术的原理是______，扩增目的基因的前提是______ 10．（24-25高二下·天津·期中）下图为“乙肝基因工程疫苗”生产过程的图解，质粒上箭头所指部位为相应的限制酶的切割位点。质粒中lacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的X-gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。请回答下列问题：    (1)过程①为了防止目的基因和质粒的自身环化，选用限制酶的最佳方案是________。 A．只有BamHI B．BamHI和EcoRI C．EcoRV和BamHI D．EcoRV和EcoRI (2)基因工程中常用大肠杆菌作为受体菌的原因是________。 (3)基因工程的四步程序是目的基因的获取、构建基因表达载体、________和目的基因的检测与鉴定。其中在构建基因表达载体时，所用载体除了质粒以外，还可以选择_________，为了保证目的基因正确表达，质粒中必须含有能与RNA聚合酶结合的元件________。 (4)过程②用________处理大肠杆菌后，大肠杆菌处于_________的生理状态，这种状态可以称为感受态。 (5)为了筛选含目的基因表达载体的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的培养基中额外加入_________，培养一段时间后挑选出_________（填“蓝色”或“白色”）的菌落进一步培养，从而获得大量目的菌。 (6)目的基因导入受体细胞后，常用________技术检测目的基因是否翻译出乙肝病毒外壳。 11．（24-25高二下·天津河北·期中）如图是利用基因工程方法培育抗虫棉的过程。请据图回答相关问题： (1)从苏云金芽孢杆菌的DNA上获取抗虫基因，需要用到的工具是______，此工具主要是从原核生物中分离纯化出来的，它能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。并且使每一条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的______。 (2)构建重组质粒时，常用Ti质粒作为载体。是因为Ti质粒上具有______，它能把目的基因整合到受体细胞的______上。 (3)E过程是利用______技术完成。要确定抗虫基因导入棉花细胞后，是否赋予了棉花抗虫特性，在个体水平上还需要做抗虫接种实验；若要检测具有抗虫基因的棉花是否产生了相应毒蛋白，在分子水平上可利用______方法进行检测。 12．（24-25高二下·天津南开·期中）土壤盐渍化影响水稻生长发育。科研人员将水稻耐盐基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉更88中，培育出了4株耐盐碱水稻新品种。其操作流程及相关限制酶识别序列和切割位点如下图，图中I~Ⅲ为限制酶的酶切位点，bar为抗除草剂基因，Kanr为卡那霉素抗性基因。请回答： (1)过程①需要模板DNA、dNTP（同时提供原料和能量）、________酶、2种引物、Mg2+等。被转化的根瘤农杆菌会将Ti质粒的________转移到水稻的染色体DNA上。 (2)过程①所用引物如下，则过程②使用的限制酶是________和________，限制酶识别序列应该添加在引物的________端。 5'—CGCGGATCCATGAGAAAGGGCCCGTGG—3' 5'—CGAGCTCCTATCCCCAGAGAGGTAGCGA—3' (3)花椰菜病毒启动子含有________的核苷酸序列，本研究中设计两个相同启动子分别连接bar和目的基因，其目的是________。 (4)科研人员采用特定的方法大量提取成功转化的4株植株叶片的基因组DNA（目的基因中不含AAGCTT），用HindⅢ完全消化，消化产物经电泳、转膜后与目的基因的探针杂交，其杂交结果如图所示（图中数字标号代表转化成功的植株）。下列有关分析正确的有__________。 ①还有不含目的基因的DNA条带在图中没有显示 ②杂交带位置不同说明HindIII消化形成的DNA片段长度不同 ③相同位置上杂交带对应DNA片段的脱氧核苷酸序列相同 ④目的基因插入受体细胞核DNA的位置和数量都是随机的 13．（24-25高二下·天津东丽·期中）“中天杨”是由我国科学家采用生物转基因技术，历经8年时间培育成功的抗盐碱、耐干旱的杨树新品种。该品种以八里庄杨为实验材料，经转mtl-D基因培育获得。如图为培育“中天杨”的操作流程，①~⑥表示操作过程，该过程中可能用到的限制酶如表所示。回答下列问题。 注：Ti质粒中的Tetr为四环素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因。 限制酶 BclI EcoRI XbaI Sau3AI BamHI 切割位点 T↓GATCA G↓AATTC T↓CTAGA ↓GATC G↓GATCC (1)与杂交育种相比，基因工程育种的优点有________（多选）。 ①操作方法简便 ②目的性强，能定向改造生物性状 ③育种周期短 ④不受生殖隔离限制，能克服远缘杂交不亲和障碍 ⑤安全性高，对生态没有威胁 (2)过程①②选用限制酶________和________构建基因表达载体。 (3)采用PCR技术扩增目的基因时，每次循环一般依次经过变性、复性和________三个步骤，若扩增4个循环，则共用引物________个。 (4)将目的基因导入植物细胞除图示方法外，还有________法，此方法是我国科学家独创的一种方法。 (5)通过过程③将基因表达载体导入农杆菌后进行筛选，成功导入目的基因的农杆菌具有________特征（单选）。 A．能在含四环素和氨苄青霉素的培养基上生长 B．不能在含四环素的培养基上生长，能在含氨苄青霉素的培养基上生长 C．不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，能在含四环素的培养基上生长 D．不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，不能在含四环素的培养基上生长 (6)为了检测“中天杨”是否培育成功，个体水平上该如何检测？________。 14．（24-25高二下·天津滨海新·期中）下图为“乙肝基因工程疫苗”生产过程的图解，质粒上箭头所指部位为相应的限制酶的切割位点。质粒中lacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的X-gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。请回答下列问题： (1)过程①为了防止目的基因和质粒的自身环化，选用限制酶的最佳方案是______。 A．只有BamHⅠ B．BamHⅠ和EcoRⅠ C．EcoRⅤ和BamHⅠ D．EcoRⅤ和EcoRⅠ (2)限制酶切割后，需要用DNA连接酶连接形成重组DNA分子，既能连接黏性末端又能高效连接平末端的是________________。 (3)过程②处理大肠杆菌后，大肠杆菌处于___________________________的生理状态。 (4)为了筛选含目的基因表达载体的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的培养基中额外加入______，培养段时间后挑选出__________（填“蓝色”或“白色”）的菌落进一步培养，从而获得大量目的菌。 (5)目的基因导入受体细胞后，常用________________技术检测目的基因是否翻译出乙肝病毒外壳。 三、实验题 15．（24-25高二下·天津和平·期中）非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染家猪和野猪引起的一种高致病性传染病。科研人员在病毒ASFV的K基因（大小为790bp）中间插入荧光聚酶基因（Gluc基因）和增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP基因），从而构建可以进行快速观察及定量检测酶活性的重组病毒（ASFV-Gluc-EGFP）体系，如图1所示。回答下列问题： (1)为了初步鉴定重组病毒是否构建成功，科研人员提取病毒DNA，选用________（引物组合）进行PCR扩增，扩增结果有1、2两种类型，如图2所示。该实验结果表明Gluc基因和EGFP基因________（填“有”或“没有”）插入病毒ASFV的K基因。 (2)为了进一步验证重组病毒是否成功表达，科研人员将猪肺泡巨噬细胞（PAMS）培养一段时间后，平均分成A、B两组，其中A组接种病毒ASFV，B组接种________。支持“重组病毒成功表达”的实验结果为：________。 (3)同时，科研人员又分别测定了A、B两组的病毒数量变化，发现两者无显著差异，该结果表明_______。因此，该重组病毒体系的构建可为后续研究ASFV的致病机制及药物治疗奠定基础。 地 城 考点03 基因工程的应用 一、单选题 1．（24-25高二下·天津滨海新·期中）要定向改造大肠杆菌的遗传性状，使大肠杆菌能合成人的胰岛素，下列哪种技术可实现这一目标（    ） A．基因工程 B．杂交育种 C．诱变育种 D．单倍体育种 2．（23-24高二下·天津河东·期中）新冠病毒（SARS-CoV-2）S蛋白的受体结合结构域（RBD）是引导病毒进入宿主细胞的关键结构。我国科研人员将GP67基因（指导合成一段信号肽，引导新合成的蛋白分泌到细胞外）与RBD基因融合，构建融合基因，大量生产RBD蛋白，用于制备疫苗，流程见下图。下列相关叙述错误的是（    ） A．过程①的理论基础是DNA具有相同的结构 B．过程②必须将融合基因与载体连接形成基因表达载体才能注射到受精卵内 C．过程③需用PCR技术检测融合基因是否成功表达 D．过程④可直接从培养液获得RBD，无需裂解细胞 3．（23-24高二下·天津·期中）下图a表示现代生物工程技术，b表示其结果，下列叙述错误的是（    ） A．如果a是胚胎分割技术，b中个体的基因型和表型一定相同 B．如果a是体外受精技术，得到b的繁殖方式属于有性生殖 C．如果a是核移植技术，可以促进优良畜群繁育 D．如果a是基因工程技术，b是乳腺生物反应器，则移植前需对胚胎进行性别选择 4．（20-21高二下·天津南开·期中）下列关于基因工程的叙述，错误的是（    ） A．基因工程是在分子水平上对生物进行遗传改造 B．基因工程的发展独立于生命科学基础理论的发展 C．基因工程已经广泛应用于医学、农业、工业、环境保护等领域 D．基因工程为在分子水平开展生命科学研究，带来了革命性的技术手段 5．（22-23高二下·天津·期中）在下列选项中，不需要采用植物组织培养技术的是（    ） A．利用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗，获得多倍体植株 B．得到“番茄—马铃薯”杂种植株 C．利用基因工程培育抗棉铃虫的植株 D．单倍体育种 6．（20-21高二下·天津·期中）下列表示抗凝血酶乳腺生物反应器的制备过程，下列说法正确的是（　　） A．该转基因牛中的抗凝血酶基因只存在于乳腺细胞中 B．②表示性别为雄性的胚胎 C．常用农杆菌转化法将基因导入受体细胞 D．①表示受精卵 二、解答题 7．（24-25高二下·天津滨海新·期中）基因X的表达产物可保护损伤的神经细胞。科学家构建了含X的基因表达载体（图1），并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。请据此回答下列问题： (1)基因表达载体通常含有目的基因、启动子、______、______、______等结构：构建含X的基因表达载体时，应选择图1中的______限制酶。 (2)酶切后的载体和基因X进行连接，可产生3种连接产物：单个载体自连，基因X与载体正向连接、基因X与载体反向连接（如图1所示）。为鉴定这3种产物，选择EcoRⅠ酶和HindHⅢ酶对筛选得到的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。图中2泳道分别对应的载体的连接方式是______。 (3)在培养大鼠神经干细胞的过程中，可使用酶将细胞分散开。分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为______。 (4)将正向连接的重组载体导入神经干细胞后，为了检测基因X是否转录出mRNA，可用______技术。当培养的神经干细胞达到一定密度时，需进行______培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。 (5)科学家使用转基因动物生产药物时通常将药用蛋白基因与________等调控组件重组在一起导入哺乳动物的细胞中，使转基因动物通过分泌的乳汁来生产药物，此转基因动物被称作________。 8．（24-25高二下·天津河东·期中）天然β淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提升。科研人员借助PCR技术对该β-淀粉酶基因改造，并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。图1表示对改造后的基因进行PCR扩增的过程，①~④表示引物。回答下列问题： (1)PCR反应需要在一定的缓冲液中（一般需要添加________激活酶）才能进行，需提供________、2种引物、________和________；PCR扩增时先要将温度上升到以上，使DNA变性，在该过程中，DNA双链发生的变化是________，复性时需要让温度下降到________，其目的是________。 (2)为了使改造后的基因能够完整地扩增，需要选择图1中的引物是________。已知该β-淀粉酶基因一条链两端的序列为（改造后的β-淀粉酶基因）GGGAAACT3'，选择的两种引物序列分别是________、________。经过35次循环后，一共消耗的引物数量有________个（写出算式，无需计算）。 (3)为了能够便于被限制酶切割，科研人员将限制酶的识别序列添加在改造后的基因两侧。图3表示三种限制酶在改造后的β-淀粉酶基因和pLN23质粒载体上的酶切位点，以及相关限制酶的识别序列。为了保证目的基因和质粒能够正确连接，切割含有β-淀粉酶基因的DNA片段时应当选择的限制酶是________、________。 (4)改造成功后的耐高温淀粉酶在工业上的实用意义是________（答出1点）。 9．（20-21高二下·天津滨海新·期中）奶酪是一种常见的食品，传统的方法是从未断奶的小牛的胃黏膜里提取牛凝乳酶，它能水解多肽链中苯丙氨酸和甲硫氨酸之间的肽键以促使牛奶凝结来生产奶酪，此方法产量低且昂贵。如今科学家将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌中，实现牛凝乳酶的批量生产，极大的满足了奶酪生产的需求。请回答相关问题： （1）科学家利用基因工程生产出大量的牛凝乳酶，该工程是在___________________水平上进行设计和施工的，其核心步骤是_________________________。 （2）上述基因工程技术过程中的目的基因是________________，常用__________方法扩增得到，该技术扩增DNA的过程包括__________________________。 （3）利用图示目的基因和质粒构建重组质粒，最好选用_______________（填限制性核酸内切酶名称）切割，这样选择的理由（至少写出两个）是__________和___________。若要初步筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，要在含___________________（氨苄青霉素/四环素）的培养基中进行培养。 （4）最后进行凝乳酶活性检测：将适量的大肠杆菌表达出的凝乳酶的提取物加入脱脂奶粉溶液中，37℃保温一段时间，可观察到_______________________现象。 地 城 考点04 蛋白质工程的原理和应用 一、单选题 1．（24-25高二下·天津河东·期中）如图为蛋白质工程操作的基本思路，下列叙述不正确的是（    ） A．代表蛋白质工程操作思路的过程是④⑤①②③ B．蛋白质工程的基本途径与中心法则相反，代表中心法则内容的是①② C．①代表转录，②代表翻译，③为折叠，④代表分子推测设计 D．蛋白质工程的目的是对基因的结构进行分子设计，通过基因合成或改造而实现 2．（24-25高二下·天津河东·期中）干扰素是动物细胞受到病毒侵染后产生的一种糖蛋白，可用于对抗病毒的感染和癌症，但体外保存相当困难。下图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，错误的是（    ）    A．图中新的干扰素基因必须插入质粒上的起始密码子和终止密码子之间才能表达 B．图中构建新的干扰素模型的主要依据是蛋白质的预期功能 C．图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构 D．图中各项技术环节中，有些需要通过基因工程实现 3．（24-25高二下·天津南开·期中）天然胰岛素制剂容易形成二聚体或六聚体，皮下注射后往往要逐渐解离为单体，才能发挥作用，在一定程度上延缓了疗效。科学家利用蛋白质工程（基本思路见下图）研发出速效胰岛素，已在临床上广泛应用。下列有关叙述正确的是（    ） A．当前限制蛋白质工程发展的关键因素是基因工程技术还不成熟 B．利用基因工程和蛋白质工程生产胰岛素都经历①②过程 C．从六聚体胰岛素解离为单体形式是将胰岛素水解为氨基酸 D．利用蛋白质工程生产速效胰岛素要从推测b入手 4．（23-24高二下·天津·期末）天然蛋白t-PA 是心梗和脑血栓的急救药，研究证实将t-PA 第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低其诱发出血的副作用。下图为采取基因工程方法表达t-PA 改良基因，制造改良t-PA 蛋白的过程。下列叙述正确的是（    ） A．构建重组质粒时需要选用限制酶Xma I和Nhe I 切割质粒pCLY11 B．以上技术制造出性能优异的改良t-PA 过程被称为蛋白质工程 C．DNA 连接酶可以将t-PA 改良基因与质粒间的磷酸和核糖连接起来 D．导入重组质粒的受体细胞在含新霉素的培养基上能存活，且呈蓝色 5．（20-21高二下·天津南开·期中）下列哪项不是蛋白质工程的基本思路（    ） A．通过改造或合成基因获得所需要的蛋白质 B．从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构 C．根据所预期的蛋白质结构，推测相应的氨基酸序列 D．根据推测的氨基酸序列，便能确定唯一对应的脱氧核苷酸序列 6．（21-22高二下·天津·期中）科学家利用蛋白质工程技术将葡萄糖异构酶的第138位甘氨酸用脯氨酸替代，结果它的最适温度提高了10~12℃。下列说法正确的是（    ） A．蛋白质工程的目的是获得满足人类生产和生活需求的蛋白质 B．蛋白质工程和基因工程的根本区别是操作对象的差异 C．蛋白质工程在设计蛋白质结构时的依据是现有基因的脱氧核苷酸序列 D．蛋白质工程只能改造现有的蛋白质而不能制造新的蛋白质 7．（20-21高二下·天津·期中）下列有关基因工程和蛋白质工程的叙述，不正确的是（　　） A．将基因表达载体导入小鼠的受精卵中常用显微注射法 B．我国科学家采用花粉管通道法培育出了转基因抗虫棉 C．蛋白质工程可通过直接改造蛋白质的结构从而改变其功能 D．蛋白质工程可合成自然界中不存在的蛋白质 8．（22-23高二下·天津·期中）新冠病毒是一种RNA病毒，极易产生变异，其通过表面刺突蛋白（S蛋白）的受体结合域（RBD）与人体细胞表面的ACE2受体相互作用而感染细胞。科学家设计了一种自然界中不存在的蛋白质LCB1，可与S蛋白RBD紧密结合，以干扰新冠病毒的感染。下列有关说法错误的是（    ） A．LCB1的作用效应与抗S蛋白抗体类似 B．LCB1可以通过细胞中原有的基因表达产生 C．LCB1的设计和合成遵循中心法则 D．LCB1的设计和合成是通过蛋白质工程实现的 二、实验题 9．（24-25高二下·天津滨海新·期中）水蛭是我国传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性，蛋白质工程流程如图所示。回答下列问题： (1)蛋白质工程是基因工程的延伸，区别在于基因工程原则上只能生产______的蛋白质，蛋白质工程可以通过改造或合成______来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白。 (2)基因工程中获取目的基因的常用方法有______、______和利用PCR技术扩增。 (3)图中物质a是______物质b是______，在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是________。 (4)研究者运用蛋白质工程技术，构建水蛭肽嵌合蛋白（TNHH），以大鼠为材料研究发现TNHH对脑出血后脑水肿具有一定的治疗效果。完善以下实验设计。 实验处理 A组 B组 C组 只进针，不在脑中注入血液 ①______ ②______ ③______ 静脉注射生理盐水 ④______ 实验结果 0 0 0 0 1.75 2.75 2.37 1.37 1.25 1.62 1.65 0.87 处理后时间（h） 6 24 72 168 6 24 72 168 6 24 72 168 注：实验结果为大鼠神经功能缺损评分，缺损评分越高，神经功能损伤越严重。 三、解答题 10．（23-24高二下·天津·期中）二苯乙烯苷是我国传统药材何首乌特有的药效成分，具有抗氧化、清除自由基等功效。合成二苯乙烯苷的关键酶是芪合酶（STS），为获得大量的STS，研究人员利用质粒（如图2）将STS基因（如图1）转化到大肠杆菌细胞内进行表达。回答下列问题： (1)采用_________技术可以快速、大量获得目的基因，据图1分析，利用该技术扩增STS基因时，应选择的引物是________。 (2)为使STS基因与质粒正确连接，需在所选引物的_______（填“3”或“5’”）端分别增加相应限制酶的酶切位点，同时选用__________两种限制酶切割质粒。 (3)启动子是_______识别和结合的部位。很多启动子具有物种特异性，在图2质粒中插入STS基因，其上游启动子应选择_______（填写字母）。 A．何首乌启动子        B．大肠杆菌启动子        C．农杆菌启动子 (4)可将转化后的大肠杆菌接种到含________的培养基上进行筛选。能在该培养基上生长的大肠杆菌是否一定含有STS基因?请判断并说明理由：________。 (5)科研人员利用相关技术替换了STS某个位点的氨基酸，提高了STS的抗氧化能力，该技术属于_________。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题03 基因工程 答案版 地 城 考点01 重组DNA技术的基因工具 一、单选题 1．A 2．A 3．B 4．D 5．D 6．B 7．C 8．B 9．B 10．B 11．A 12．C 13．C 14．D 15．B 地 城 考点02 基因工程的基本操作程序 一、单选题 1．A 2．C 3．D 4．C 5．D 6．D 7．A 8．B 二、解答题 9．(1)4 种核糖核苷酸 (2)CD (3)1、3、4、6 (4)SacⅠ (5) DNA 半保留复制 已知目的基因两端的脱氧核苷酸序列 10．(1)B (2)结构简单，繁殖速度快 (3) 将目的基因导入到受体细胞 噬菌体、动植物病毒 启动子 (4) Ca2+ 容易吸收周围环境中DNA分子 (5) 青霉素、X-gal 白色 (6)抗原-抗体杂交 11．(1) 限制酶 磷酸二酯建 (2) T﹣DNA 染色体的DNA (3) 植物组织培养 抗原﹣抗体杂交 12．(1) 耐高温的DNA聚合酶 T-DNA (2) BamHI SacI 5' (3) RNA聚合酶识别、结合 依据bar表达推测目的基因同时表达 (4)①②④ 13．(1)②③④ (2) Xbal BclI (3) 延伸 30 (4)花粉管通道法 (5)B (6)抗盐碱、耐干旱检测 14．(1)B (2)T4 DNA 连接酶 (3)容易吸收周围环境中 DNA 分子 (4) X-gal 白色 (5)抗原-抗体杂交 三、实验题 15．(1) 引物1和引物4/引物4和引物1 有 (2) 重组病毒 B组可观察到绿色荧光，检测到荧光素酶有活性；A组无荧光，荧光素酶无活性 (3)Gluc基因和EGFP基因的插入不影响病毒的复制 地 城 考点03 基因工程的应用 一、单选题 1．A 2．C 3．A 4．B 5．A 6．D 二、解答题 7．(1) 终止子 复制原点 标记基因 BamH Ⅰ (2)反向连接 (3)细胞贴壁 (4) 分子杂交（PCR技术） 传代 (5) 乳腺中特异表达的基因的启动子 乳腺生物反应器 8．(1) Mg2+ DNA模板 4种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶 双链DNA解旋为单链 50℃左右 两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 (2) ②和③ 5'-AAGGGCGG-3' 5'-AGTTTCCC-3' （235-1）×2 (3) EcoRⅠ BamHⅠ (4)提高生产效率（降低生产成本） 9． （DNA）分子 基因表达载体的构建 牛凝乳酶基因 PCR 变性、复性、延伸 NcoI和XhoI 目的基因不会被破坏 防止目的基因或载体自身的黏性末端连接 氨苄青霉素 脱脂奶粉溶液有明显的凝结 地 城 考点04 蛋白质工程的原理和应用 一、单选题 1．D 2．A 3．B 4．B 5．D 6．A 7．C 8．B 二、实验题 9．(1) 自然界已经存在的 基因 (2) 从基因文库中获取目的基因 通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成 (3) （具有一定氨基酸序列的）多肽链 mRNA/信使RNA 密码子的简并性（或一种氨基酸可能有多种密码子与之对应） (4) 在脑中注入血液 在脑中注入血液 静脉注射生理盐水 静脉注射TNHH溶液 三、解答题 10．(1) PCR 引物2 和引物 3 (2) 5' XhoI 和 NdeI (3) RNA 聚合酶 B (4) 氨苄青霉素 不一定，含氨苄青霉素抗性基因的未重组载体（空质粒）也可导入大肠杆菌，使大肠杆菌在培养基上形成菌落 (5)蛋白质工程 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $