选择性必修3 第25章 基因工程 第30课时-【高考零起点】2026年新高考生物总复习学用Word（艺考）

该高中生物学高考复习学案系统梳理了基因工程专题核心考点，涵盖基因工程概念、基本工具、操作程序、应用及蛋白质工程，按“概念-工具-操作-应用”逻辑构建知识体系，通过问题链（如限制酶识别序列分析）和任务单（如PCR扩增步骤填空）引导学生自主梳理，形成从基础到综合的认知框架。 亮点在于诊断性自测与真题情境融合，开篇11道选择题覆盖工具特性、操作步骤等核心点，填空题结合2025湖南卷等真题设计实验分析任务，培养科学思维（如推理限制酶切割结果）和探究实践（如DNA粗提取步骤优化）。每个模块配有错题归因表和知识网络图绘制任务，助力学生个性化查漏，教师可通过答题数据精准指导，提升复习实效。

第二十五章　基因工程 第30课时 一、基因工程 1.基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 2.对基因工程概念的理解。 (1)操作环境：生物体外。 (2)操作对象：基因。 (3)操作水平：DNA分子水平。 (4)原理：基因重组。 (5)结果：按照人们的需要定向改造生物的遗传特性。 二、DNA基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性内切核酸酶(限制酶)。 (1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 (2)功能：能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 (3)结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶。 (1)两种DNA连接酶(E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶)的比较。 ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E.coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4 DNA 连接酶来源于T4噬菌体，能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体。 (1)载体具备的条件： ①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和筛选。 (2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于真核细胞的细胞核或原核细胞的拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 (3)其他载体：噬菌体、动植物病毒。 三、DNA的粗提取与鉴定 1.实验原理。 (1)DNA、蛋白质在物理和化学性质方面有差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。 ①DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精。 ②DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。 (2)在一定的温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 2.方法步骤。 (1)研磨：取30 g洋葱，切碎，放入研钵中，倒入10 mL研磨液充分研磨。 (2)除杂：漏斗中垫上纱布过滤洋葱研磨液后，在4 ℃冰箱中静置几分钟后取上清液，1 500 r/min 的转速下离心5 min取上清液。 (3)提取：往上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，溶液出现白色的丝状物是DNA。 方法一：用玻璃棒沿同一方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。 方法二：倒入塑料离心管中，10 000 r/min的转速下离心5 min，取沉淀物晾干。 (4)鉴定： 项目 A B 2 mol/L的NaCl溶液 5 mL 5 mL 丝状物或沉淀物 不加 加入 二苯胺试剂 4 mL 4 mL 沸水中加热 5 min 5 min 现象 无色 蓝色 四、基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 第一步：目的基因的筛选与获取。 1.目的基因：主要是编码蛋白质的结构基因。 2.原核基因采取直接分离获得，真核基因采取人工合成。人工合成目的基因常用方法有反转录法和化学合成法。 3.PCR技术扩增目的基因。 (1)原理：DNA半保留复制。 (2)过程： ①变性：加热超过90 ℃，DNA解链。 ②复性：冷却到50 ℃左右，两种引物与两条单链DNA结合。 ③延伸：加热至72 ℃左右，耐高温的DNA聚合酶从引物端开始互补链的合成。 第二步：基因表达载体的构建。 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：启动子＋目的基因＋终止子＋标记基因。 (1)启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 (2)终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的下游。 (3)标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。 第三步：将目的基因导入受体细胞。 1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2.常用的转化方法。 将目的基因导入植物细胞：花粉管通道法、农杆菌转化法。 将目的基因导入动物细胞：显微注射法，此方法的受体细胞多是受精卵。 将目的基因导入微生物细胞：C处理法。 3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。 第四步：目的基因的检测和鉴定。 1.分子水平：通过PCR等技术检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA；从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测目的基因是否翻译成蛋白质。 2.个体水平：还需要进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫特状以及抗性的程度。 五、基因工程的应用 1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。 2.动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。 3.基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。 4.基因工程在农牧业方面的应用。 (1)发展。 ①农牧业：1996—2017年，全世界转基因作物的种植面积增加了一百多倍，美国是世界上转基因作物种植面积最大的国家。2017年，我国转基因作物种植面积居世界第八位。 ②动物：第一种用于食用的转基因动物——转基因大西洋鲑在美国获得批准上市。 (2)转基因生物和选用的目的基因。 转基因生物 选用的目的基因 转基因抗虫植物 抗虫功能基因 转基因抗病植物 抗病基因 转基因抗除草剂植物 抗除草剂基因 转基因矮牵牛 花青素代谢有关基因 转基因奶牛 肠乳糖酶基因 5.基因工程在医药卫生领域的应用。 (1)生产药物。 ①常见的药物：细胞因子、抗体、疫苗和激素等。我国生产的重组人干扰素、血小板生成素、促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子等基因工程药物均已投放市场。 ②批量生产药物：乳腺(房)生物反应器。 a.目的基因：药用蛋白基因。 b.启动子：乳腺中特异表达的基因的启动子。 c.受体细胞：受精卵。 (2)移植器官：在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。 培养乳腺生物反应器转基因动物时要选用乳腺中特异表达的基因的启动子，原因是乳腺生物反应器通过分泌的乳汁提取相应的基因表达的产品，乳腺中特异性表达的启动子可让目的基因在乳腺细胞中表达。 6.基因工程在食品工业方面的应用。 (1)生产氨基酸：利用转基因生物合成阿斯巴甜的原料——天冬氨酸和苯丙氨酸。 (2)生产酶：利用转基因生物获得生产奶酪的凝乳酶、加工转化糖浆的淀粉酶、加工烘烤食品的脂肪酶等。 (3)生产维生素。 六、蛋白质工程的原理和应用 1.蛋白质工程的概念：以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 2.蛋白质工程崛起的缘由： (1)基因工程的实质和不足。 ①实质：将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状。 ②不足：原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。 (2)蛋白质工程的崛起。 ①理论和技术条件：分子生物学、晶体学以及计算机技术的迅猛发展。 ②天然蛋白质存在不足：天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。 ③实例： 蛋白质缺陷 改造措施 改造后效果 玉米中赖氨酸含量低 赖氨酸合成中两种酶的氨基酸被替换 玉米叶片和种子中游离赖氨酸分别提高5倍和2倍 3.蛋白质工程的基本原理。 它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构，又称为第二代基因工程。 (1)基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)，以上是蛋白质工程特有的途径；以下按照基因工程的一般步骤进行。(注意：目的基因只能用人工合成的方法。) (2)设计中的困难：如何推测非编码区以及内含子的脱氧核苷酸序列。 4.蛋白质工程的应用。 (1)医药工业方面：①速效胰岛素类似物：改变氨基酸序列，抑制胰岛素的聚合。②干扰素：在一定条件下，可以延长保存时间。③单克隆抗体：将小鼠抗体上结合抗原的区域“嫁接”到人的抗体上，降低诱发免疫反应的强度。 (2)其他工业方面：广泛用于改进酶的性能或开发新的工业用酶。如枯草杆菌蛋白酶。 (3)农业方面：①改造某些参与调控光合作用的酶，提高植物光合作用的效率。②改造微生物蛋白质的结构，增强防治病虫害的效果。 【注意】有关蛋白质工程的两点提醒 (1)改造对象是基因：任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的基因可以遗传下去。 (2)基因突变的新基因中含有不编码蛋白质的序列，而蛋白质工程中的新基因则没有。 一、选择 1.限制酶a和b的识别序列与切割位点如下图所示。下列叙述正确的是 (　　) A.酶a、酶b均能切割氢键和磷酸二酯键 B.能被酶a识别并切割的序列也能被酶b切割 C.相同DNA分子被酶a切割的概率一般高于酶b D.基因工程中用两种酶切割质粒就能防止其自身环化 2.(2021湖北卷)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，下列措施中有效的是 (　　) A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间 C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度 3.人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因的主要作用是 (　　) A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B.有利于对目的基因是否导入进行检测 C.增加质粒分子的相对分子质量 D.便于与外源基因连接 4.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，ampr表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述正确的是 (　　) A.图甲中的质粒用BamHⅠ切割后，含有4个游离的磷酸基团 B.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和BamHⅠ切割质粒和外源DNA C.用PstⅠ和Hind Ⅲ切割，可以保证重组DNA序列的唯一性 D.导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长 5.(2022山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是(　　) A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质 6.如图所示为PCR扩增的过程示意图，下列叙述正确的是 (　　) A.在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似 B.A过程需要解旋酶的参与 C.Taq DNA聚合酶是在B过程发挥作用的 D.该过程需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的 7.(2025江苏卷)(多选)图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有 (　　) A.基因A突变为a是一种碱基增添的突变 B.用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同 C.用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致 D.产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定 8.(2025安徽卷)大肠杆菌的两个基因Y和Z彼此相邻，转录时共用一个启动子(P)。科研小组分离到一株不能合成Y和Z蛋白的缺失突变体，但该突变体能合成另一种蛋白质，此蛋白质氨基端的30个氨基酸序列与Z蛋白氨基端的序列一致，而羧基端的25个氨基酸序列与Y蛋白羧基端的序列一致。据此，科研小组绘制了野生型菌株中Y和Z基因的排列顺序图，并推测突变体缺失的DNA碱基数目。下列图示和推测正确的是 (　　) A.缺失碱基数目是3的整倍数 B.缺失碱基数目是3的整倍数 C.缺失碱基数目是3的整倍数＋1 D.缺失碱基数目是3的整倍数＋2 9.(2025河北卷)(多选)X染色体上的D基因异常可导致人体患病，在男性中发病率为1/3 500，某患病男孩(其母亲没有患病)X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间的染色体片段发生颠倒重接。研究者对患儿和母亲的DNA进行了PCR检测，所用引物和扩增产物电泳结果如图。不考虑其他变异，下列分析错误的是 (　　) 注：引物组合S1和S2，R1和R2可分别用于对正常基因D和H序列的扩增检测。 A.该病患者中男性显著多于女性，女性中携带者的占比为1/3 500 B.用R1和R2对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果相同 C.与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变 D.利用S1和S2进行PCR检测，可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病 10.(2025广东卷)Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的 (　　) A.1'－碱基 B.2'－氢 C.3'－羟基 D.5'－磷酸基团 11.(2025安徽卷)质粒K中含有β－半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X－gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是 (　　) A.使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B.如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C.因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D.若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 二、填空 12.(2025湖南卷)非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题： (1)制备特定抗原 ①获取基因A，构建重组质粒(该质粒的部分结构如图所示)。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和________等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物________对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为________bp。  ②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是_____________________________________________________________ _____________________________________________________________________ (答出两点即可)。 (2)制备抗蛋白A单克隆抗体 用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有________(答出一种即可)。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和________，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。  13.(2025河南卷)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题： (1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是____________________________。将培养后的菌液混匀并充分________，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。  (2)为构建携带cg(CG的编码基因)的大肠杆菌表达载体(图1)，对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coliDNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有________酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是  ________________________________________________________________________。  限制酶的识别序列和切割位点如下： (3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，目的是__________________，随后在含________和________的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。  (4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度(保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键)，如图2所示。根据分析结果，选择第________位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是_________________ __________________________________________________________________。  14.(2025陕晋宁青卷)马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。 (1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、________、含Mg2＋的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的________步骤中起作用。  (2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的________(填“5'端”或“3'端”)添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5'－________－3'，切割载体时应选用的两种限制酶是________，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。  (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T－DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到_____________________________ _________________________________________________，抗性基因________可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经________形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。  15.(2025安徽卷)稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。 (1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用________(填方法)将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是________。  (2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R－U和下游片段R－D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。 采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的________。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落________(填序号)，出现菌落④的可能原因是____________________________ __________________________________________________________________。  (3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路___________________________________________ _____________________________________________________________________ __________________________________________________________________。  第二十五章　基因工程 第30课时 1.C　【解析】酶a与酶b切断的化学键相同，都是磷酸二酯键，而不是氢键，A错误；据图分析，酶a的识别序列是—GATC—，酶b的识别序列是—GGATCC—，酶b的识别序列包含酶a的识别序列，故能被酶b识别并切割的序列也能被酶a识别并切割，但能被酶a识别并切割的序列不一定能被酶b识别并切割，B错误；酶a的识别序列比酶b短，识别序列越短，含有的识别位点就越多，因此在相同的DNA分子中酶a的识别位点明显多于酶b，被酶a切割的概率一般高于酶b，C正确；为防止限制酶切割后的质粒自身环化，在基因工程中通常使用两种切割后产生不同黏性末端的限制酶切割同一质粒，D错误。 2.D　【解析】增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A错误；延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于复性中的配对位置影响不大，故不能有效减少反应非特异性条带，BC错误；非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加(部分碱基互补，未完全互补)，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异性条带的产生， D正确。 3.B　【解析】抗性基因的作用是筛选重组质粒，并不是提高受体细胞的耐药性，A错误；抗性基因作为标记基因，便于重组DNA的鉴定和筛选，即有利于对目的基因是否导入进行检测，B正确；抗性基因与增加质粒分子的相对分子质量无关，C错误；质粒上具有限制酶的切割位点，便于与外源基因连接，但切割点不在抗性基因上，D错误。 4.C　【解析】图甲中的质粒用BamHⅠ切割后，获得一个DNA片段，其只含有2个游离的磷酸基团，A错误；在构建重组质粒时，不能使用BamHⅠ切割外源DNA，因为用BamHⅠ切割会破坏目的基因，但可以用PstⅠ和Hind Ⅲ切割质粒和外源DNA，B错误；用PstⅠ和Hind Ⅲ切割质粒会得到2个DNA片段，再加入DNA连接酶，切开的质粒由于黏性末端不同，不会自身连接，从而保证只能得到一种符合要求的重组质粒，即含有目的基因和标记基因neo的重组质粒，保证了重组DNA序列的唯一性，C正确；由于用PstⅠ切割质粒后，其中的氨苄青霉素抗性基因会被破坏，所以导入目的基因的大肠杆菌不能在含氨苄青霉素的培养基中生长，D错误。 5.B　【解析】低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一起析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。 6.A　【解析】PCR技术扩增DNA的原理是DNA半保留复制，因此在该过程中DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，A正确；A过程在高温条件下完成，不需要解旋酶的参与，B错误；Taq DNA聚合酶能催化DNA子链的延伸，在过程C中发挥作用，C错误；该过程需要一对特异性的引物，这一对引物的序列不能是互补的，否则会因为碱基互补配对无法发挥作为引物的作用，D错误。 7.BD　【解析】A.对比A基因和a基因的序列，A基因中“AAGCTT”变为a基因中“AAGCTG”，是碱基替换(T→G)，并非碱基增添，A错误；B.HindⅢ切割产生黏性末端，AluⅠ切割后产生的是平末端，二者末端类型不相同，B正确；C.a基因中有2个HindⅢ切割位点，切割后产生3个片段，有3个AluⅠ切割位点，切割后产生4个片段，用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小不一致，C错误；D.因为正常基因A和致病基因a的HindⅢ切割位点数量不同，所以产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定，D正确。 8.B　【解析】已知突变体合成的蛋白质氨基端的30个氨基酸序列与Z蛋白氨基端的序列一致，羧基端的25个氨基酸序列与Y蛋白羧基端的序列一致。这说明转录是以Z基因起始，然后连接到Y基因进行转录的，所以野生型菌株中基因的排列顺序应该是Z基因在前，Y基因在后，且共用一个启动子P，转录时，模板链的方向是3'→5'，因此图示的方向应为3'－P－Z－Y－5'。由于该蛋白质氨基端有Z蛋白的部分序列，羧基端有Y蛋白的部分序列，说明缺失突变后，转录形成的mRNA依然可以编码氨基酸，没有造成移码突变(移码突变会导致突变位点后的氨基酸序列全部改变)。因为一个氨基酸由mRNA上的一个密码子(3个相邻碱基)决定，所以缺失的碱基数目应该是3的整倍数，这样才不会改变后续的信息读取，保证氨基端和羧基端的氨基酸序列分别与Z、Y蛋白部分序列一致。综上，B正确，ACD错误。 9.AB　【解析】A.某患病男孩其母亲没有患病，可知该病为伴X染色体隐性遗传病，该病患者中男性显著多于女性，在男性中发病率为1/3 500，则该致病基因d频率为1/3 500，正常基因D基因频率为3 499/3 500，女性中携带者的占比为2×1/3 500×3 499/3 500，A错误；B.该男孩的母亲为携带者，基因型为XDXd，该男孩基因型为XdY，该男孩的染色体倒位，故用R1和R2不能扩增出产物，母亲有正常的H基因，有产物，故对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果不同，B错误；C.该男孩的染色体倒位，故与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变，C正确；D.利用S1和S2进行PCR检测，有产物则含有正常D基因，若无产物，则含有致病基因，故可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病，D正确。 10.C　【解析】已知DNA聚合酶催化延伸子链方向只能从5'→3'，原因是脱氧核苷酸的3'碳连接的是羟基，可以结合下一个脱氧核苷酸的5'碳连接的磷酸基团，故为了DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的3'－羟基，使其不能结合下一个脱氧核苷酸的5'碳连接的磷酸基团，C正确。 11.C　【解析】A.使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于感受态，提高转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质粒，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确；B.由于仅含卡那霉素，未添加X－gal，无论导入的是重组质粒还是空白质粒，因不含X－gal，无法产生蓝色物质，故生长出的菌落均为白色，B正确；C.筛选平板中长出的白色菌落，可能是导入了重组质粒(含目的基因)，但也可能是虽然导入了质粒但目的基因没有成功表达目标蛋白，不能仅仅因为是白色菌落就判定为表达目标蛋白的菌株，C错误；D.若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化的质粒K中β－半乳糖苷酶基因完整，能表达活性β－半乳糖苷酶，分解X－gal形成蓝色菌落，D正确。 12.(1)①终止子、复制原点　P1和P3　782　②重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外、转速过高使蛋白A发生沉淀、蛋白A亲水性较差发生沉淀、蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解 (2)聚乙二醇(PEG)融合法(或灭活病毒诱导法、电融合法)　抗体检测 【解析】(1)①重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和终止子、复制原点等，终止子能终止转录过程。要确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用引物P1和P3。因为P1与基因A下游的非编码区互补配对，P3与基因A上游且靠近启动子的区域互补配对，这样扩增的片段大小为200＋582=782 bp。 ②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌，培养后上清液中无蛋白A，可能的原因有：重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外，转速过高使蛋白A发生沉淀，蛋白A亲水性较差发生沉淀，蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解。 (2)诱导动物细胞融合的常用方法有聚乙二醇(PEG)融合法、灭活病毒诱导法、电融合法等。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。 13.(1)在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大　稀释 (2)BamH Ⅰ　重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列 (3)使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态　卡拉胶　四环素 (4)44　该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小 【解析】(1)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。由于在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大，因此可选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌。将培养后的菌液混匀并充分稀释，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 (2)E.coliDNA连接酶连接平末端的效率很低，因此切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的限制酶，即不能选择EcoR V和SmaⅠ，而SpeⅠ与XbaⅠ切割后的黏性末端相同，若选择SpeⅠ与XbaⅠ切割，会出现质粒和目的基因的自连，甚至目的基因倒接，因此切割质粒时SpeⅠ与XbaⅠ中只能选择一个，而另一个限制酶需要选择BamH Ⅰ，又由于转录的方向是由启动子→终止子，且mRNA形成的方向是5'→3'，且mRNA与DNA的模板链方向相反，因此基因模板链的3'应靠近启动子，故为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有BamH I酶切位点。T4 DNA连接酶既可以连接平末端，也可连接黏性末端，不同的平末端均可由T4 DNA连接酶连接，由于限制酶的识别序列具有专一性，若连接后的序列不存在最初限制酶的识别序列，则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割。故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列。 (3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，便于重组DNA进入受体细胞。由于具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种可分解卡拉胶，使其菌落周围形成透明圈，且重组质粒上含有四环素抗性基因，因此导入目的基因的大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 (4)据图可知，虚线长度代表氨基酸间的空间距离，由于第44位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小，因此选择第44位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适。 14.(1)4种脱氧核苷酸　延伸 (2)5'端　AGATCT　BamHⅠ和EcoRⅠ (3)栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上　2　再分化 【解析】(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2＋的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶等。PCR一般分为变性、复性和延伸三步，其中DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用。 (2)为了使目的基因能够被限制酶切割，扩增目的基因时，需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列。结合图表分析，在载体的启动子和终止子之间有BamHⅠI、EcoRⅠI和Xba Ⅰ的识别序列，而S基因内部含有Xba Ⅰ、Nde Ⅰ和BamHⅠ的识别序列，要用BamHⅠ、EcoRⅠ或XbaⅠ切割载体，又不能用XbaⅠ、NdeⅠ或BamHⅠ切割S基因，再根据各种限制酶的识别序列及切割位点，可知，需要用BamHⅠ、EcoRⅠ切割载体，用BamHⅠ的同尾酶BgⅠ Ⅱ和EcoRⅠ切割S基因，故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5'－AGATCT－3'。 (3)T－DNA属于可转移DNA，用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T－DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上，抗性基因1位于T－DNA外部，用于筛选含有重组载体的农杆菌，而抗性基因2位于T－DNA内部，可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 15.(1)稀释涂布平板法　分离不同条件下生长的内生放线菌 (2)指数级扩增　②　重组质粒通过(单交换)同源重组整合到了内生放线菌的基因组中 (3)设置两组培养实验：对照组在低(或常规)铁浓度的培养基上进行，实验组在高铁浓度的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况(如菌落大小或抑制圈大小)。若高铁组的抑制效果明显弱于低铁组，则支持该推测。 【解析】(1)从含有多种微生物的研磨液中分离出单一菌落，并接种到选择培养基中常用的接种方法是稀释涂布平板法。使用选择培养基和不同的温度条件，目的是抑制其他杂菌的生长，分离不同条件下生长的内生放线菌。 (2)PCR技术的核心原理是通过多次循环(变性、复性、延伸)，使目标DNA片段的数量以指数形式快速增加，实现体外扩增。PCR鉴定是利用引物1和引物2进行的。在野生型菌株中，引物1和引物2之间的DNA片段长度为R－U(500 bp)＋R基因(2 000 bp)＋R－D(500 bp)=3 000 bp。对应图2中的菌落①和③。在成功发生双交换的R基因敲除株中，R基因(2 000 bp)被替换，引物1和引物2之间的DNA片段长度为R－U(500 bp)＋R－D(500 bp)=1 000 bp。对应图2中的菌落②。菌落④的PCR产物大小约为7 000 bp。这个大小可以通过以下方式解释：发生了单交换同源重组事件。整个重组质粒(大小为3 000 bp质粒骨架＋500 bpR－U＋500 bpR－D=4 000 bp)整合到了基因组中。整合后，引物1和引物2之间的区域长度变为原来的长度(3 000 bp)加上整个质粒的长度(4 000 bp)，即3 000＋4 000=7 000 bp。 (3)实验思路见答案。 学科网（北京）股份有限公司 $