微专题06 基因编辑与生物技术（培优专练）2026年高考生物二轮复习高效培优系列

微专题06 基因编辑与生物技术 真题引领练 素养拔高练 高考真题限时测、知己知彼百战不殆 限时：30分钟 1．【新情境】（2025·全国卷·高考真题）琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4的电泳结果如图所示（“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极）。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙，甲只有限制酶R的一个酶切位点，样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是（    ） A．配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液 B．该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷 C．甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同 D．据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物 2．（2025·福建·高考真题）质粒P含有2个EcoRⅠ、1个SacⅠ和1个BamHⅠ的限制酶切割位点。已知BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间，用上述3种酶切割该质粒，酶切产物的凝胶电泳结果如图，其中泳道①条带是未酶切的质粒P，泳道②③④条带为3种单酶切产物，泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。下列叙述正确的是（    ） A．DNA分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极 B．可确认泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物 C．泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物 D．泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数 3．【实践应用】（2024·重庆·高考真题）有研究者构建了H基因条件敲除小鼠用于相关疾病的研究，原理如图。构建过程如下：在H基因前后均插入LX序列突变成h基因（仍正常表达H蛋白），获得Hh雌性小鼠；将噬菌体的G酶基因插入6号染色体上，获得G+G-雄鼠（G+表示插入，G_表示未插入G酶基因） (1)以上述雌雄小鼠为亲本，最快繁殖两代就可以获得H基因条件敲除小鼠（hhG+G-和hhG+G+）。在该过程中，用于繁殖F1的基因型是_____________。长期采用近亲交配，会导致小鼠后代生存和生育能力下降，诱发这种情况的遗传学原因是_____________。在繁殖时，研究人员偶然发现一只G+G-不表达G酶的小鼠，经检测发现在6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列，该异常结果形成的原因是_____________。 (2)部分小鼠的基因型鉴定结果如图2，③的基因型为_____________。结合图1的原理，若将图2中所有基因型的小鼠都喂食TM试剂一段时间后，检测H蛋白水平为0的是_____________（填序号）。 (3)某种病的患者在一定年龄会表现出智力障碍，该病与H蛋白表达下降有关（小鼠H蛋白与人的功能相同）。现有H基因完全敲除鼠甲和H基因条件敲除鼠乙用于研究缺失H蛋白导致该病发生的机制，更适合的小鼠是_____________（“甲”或“乙”），原因是_____________。 4．【实践应用】（2025·甘肃·高考真题）水稻白叶枯病（植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯白色病斑）由白叶枯病菌引起，严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，对水稻白叶枯病的感病基因SWEET（该基因被白叶枯病菌利用以侵染水稻）的启动子区进行了定点“修改”，编辑后的水稻幼胚通过植物组织培养技术获得抗病植株（如下图）。回答下列问题。 (1)CRISPR-Cas9重组Ti质粒构建完成后，可通过__________（方法）将该质粒转入植物细胞，并将__________整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的细胞，需要在植物组织培养基中添加__________。 (2)实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为__________，对其消毒时需依次使用酒精和__________处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂素，原因是__________。 (3)为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用__________技术检测目标基因的启动子区是否被成功编辑；然后，在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较__________来验证抗病性。 (4)在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为__________。 5．【新情境】（2025·浙江·高考真题）玉米(2n=20)雌雄同株异花。从玉米某自交系(甲)中选育出2个雄性不育突变体(乙和丙)。已知雄性不育基因E1、E2由雄性可育基因E突变所致；如图1所示。甲×乙的F2中雄性可育285株、雄性不育94株，甲×丙的F2中雄性可育139株、雄性不育45株。利用引物P1和P2，对甲、乙、丙以及它们之间杂交的后代(丁和戊)基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经SnaBⅠ完全酶切后电泳，结果如图2所示。 回答下列问题： (1)E1基因与E基因相比，由于___________，导致编码的蛋白质中1个氨基酸发生改变。E2基因与E基因相比，由于编码区增加了插入序列，导致___________，使编码的蛋白质中氨基酸数目减少。 (2)雄性不育对雄性可育是___________性状，乙的基因型是___________。甲×丙产生的F1其雌配子有___________种，F2可育植株中纯合子占___________。若甲×戊的F1随机交配，则F2中E1的基因频率是___________。 (3)写出丁×戊获得F1的遗传图解。 (4)雄性不育突变体不能自交繁殖。为了保存雄性不育突变体，需长期保留含不育基因的杂合子。该杂合子可采用上述“PCR结合限制性内切核酸酶酶切后分析条带”进行鉴定，还可采用的方法有___________(答出2点即可)。 (5)利用引物P1、P2对甲的基因组DNA进行PCR扩增和电泳，下列叙述错误的是___________。 A．PCR反应中TaqDNA聚合酶是沿着模板链的3'端向5'端聚合核苷酸 B．图2中胶板的上端是电泳时的负极，且电泳时DNA片段由负极向正极泳动 C．若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得16条含32P标记的DNA单链 D．若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得8个含32P标记且长度为b的DNA分子 6．（2024·天津·高考真题）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。 (1)Sa产生抗药性可遗传变异的来源有______（至少答出2点）。 (2)推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。    ①根据图1信息，简述质粒2的构建过程（需包含所选引物和限制酶）：______，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含______的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 ③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含______的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含____________的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是______。    7．【实践应用】（2025·全国二卷·高考真题）番茄的花是两性花，杂交育种时需进行去雄操作，耗时费力且难以避免自交污染。我国研究者利用基因工程技术开发了雄性不育番茄品系，提高了番茄杂交育种的效率。 (1)研究者选择性状优良的WT品系番茄，对在雄蕊中特异性表达的S基因进行编辑，获得S基因中增加一个碱基对的纯合突变体甲。甲花粉不成活。甲与WT杂交，F1育性正常。F1自交，F2中216株育性正常，68株雄性不育。这表明甲的雄性不育性状属于__________性状，该性状的遗传遵循分离定律。 (2)为了确认雄性不育是由S基因编辑导致的，研究者使用了一种竞争性等位基因特异性PCR，该PCR体系同时含3种引物和4种探针（如图）。探针的荧光基团与淬灭基团分离时显现荧光。 ①引物3'末端与模板的严格配对对于子链的延伸至关重要。引物I和引物II的3'末端碱基分别是__________。该PCR体系从第__________个循环开始，复性环节中带有荧光基团的探针与模板链结合，作为引物在延伸环节中掺入子链，使产物显现荧光。 ②用该体系对F2的基因组DNA进行PCR检测，育性不同植株的检测结果为__________，证实雄性不育性状是由S基因编辑导致的。 (3)甲无法自交保种。研究者将控制子叶为紫色的显性基因与WT型的S基因插入Ti质粒的T-DNA中，两基因紧密相邻。用农杆菌转化法导入甲，获得育性恢复的纯合品系乙。请写出用甲和乙为材料，连续生产甲的最简杂交方案。__________ (4)研究者在野生番茄中发现一个抗病基因，拟用杂交方法将此基因引入到甲、乙品系中。从操作的简便性出发，应将抗病基因先引入甲还是乙？请说明理由。____________。 8．【联系生活】（2025·全国二卷·高考真题）斑翅果蝇是农业害虫。我国研究者利用基因编辑技术培育带有雌性不育基因的斑翅果蝇，若将其释放到野外可降低野生斑翅果蝇种群数量。 (1)CRISPR/Cas9基因编辑系统中的gRNA与靶基因特异性结合，引导Cas9酶切断靶基因。断裂的DNA可能发生非同源末端连接修复，导致靶基因中发生碱基的______，引起基因突变；也可能发生同源重组修复，导致靶基因被供体DNA中的片段替换（图1）。 (2)果蝇2号染色体上T基因控制合成一种信号物质，该物质由神经细胞分泌，是雌蝇产卵的必需信号，对雄蝇育性无影响。研究者制备图2所示供体DNA，将其与靶向T基因的gRNA和Cas9酶共同注入果蝇受精卵。继续培养后在低倍镜下挑选出_______的成蝇，即为成功实现驱动片段替换的个体——G0。 (3)理论上，当细胞中1个T基因被驱动片段替换后，会表达靶向T基因的gRNA和Cas9酶，同时作为同源重组修复的模板，导致_______，使雌蝇不育。用G0雄蝇与野生型雌蝇杂交，F1雌蝇育性情况为______。 (4)有的G0果蝇受精卵中T基因发生末端连接修复，突变为t基因。t基因既不能正常表达，也不能被gRNA识别。用携带t基因的G0雄蝇与野生型雌蝇杂交，F1自由交配，若整个过程中没有t基因的新发产生，F2雌蝇中可育个体占比为______，可见t基因对驱动片段在种群中的传播有抵抗作用。 (5)研究者对驱动片段进行改造，将其中编码gRNA的基因增加为3个，分别靶向T基因中不同的位点。请评价改造后的驱动片段的优点________。 9．【新情境】（2025·全国二卷·高考真题）学习以下材料，回答(1)~(4)题。 工程菌检测癌基因 贝氏不动杆菌(B菌)是一种能在肠道定植且对人体健康无害的细菌。B菌可吸收环境中的DNA片段，并将其整合至自身基因组，该过程称为水平基因转移(HGT)。研究者改造B菌，借助其HGT捕获诱发结肠癌的突变K基因，以辅助诊断结肠癌。 为鉴定B菌捕获K基因的HGT能力，研究者制备两种转基因细胞。转基因结肠癌细胞(R1细胞)染色体上部分DNA序列和转基因B菌(B1菌)拟核上部分DNA序列如图1。当细菌细胞中两个DNA分子的两端具有同源序列时，可发生同源序列之间的片段互换。将B1菌与R1细胞裂解液混合一段时间，再把B1菌接种至含有卡那霉素或壮观霉素的平板上，根据菌落生成情况，确认其具有捕获K基因的HGT能力。 结肠癌细胞以及正常结肠细胞死亡后会将其DNA释放至肠腔中。为进一步获得能够区分突变K基因和正常K基因的B菌，需对其进行优化。B菌中天然存在用于防御噬菌体的CRISPR/Cas 系统。CRISPR/Cas 系统由 Cas 蛋白与 gRNA 构成，其工作原理如图2。目标DNA 被 Cas 蛋白切断后，会在细菌细胞中被降解。研究者利用这一机制，构建相关重组DNA并导入B菌，获得B2菌。B2菌仅在捕获突变K基因后才能在含有卡那霉素的平板上存活。 研究者对B菌的工程改造策略为检测突变基因提供了新的思路，未来可能会有广泛用途。 (1)图1中B1菌的HGT过程与减数分裂中的_____________过程机制相似，都属于基因重组。 (2)成功捕获K基因的B1菌在含卡那霉素或壮观霉素的平板上的菌落生成情况分别是_____________。 (3)对文中CRISPR/Cas系统的理解，正确的是_____________ A．CRISPR序列中的重复序列编码的RNA序列能与噬菌体DNA碱基互补配对 B．Cas蛋白能独立识别特定DNA序列并断开磷酸二酯键 C．B菌的不同菌株中CRISPR序列可能是有差异的 D．利用人工改造后的CRISPR/Cas系统可实现对细胞内基因的编辑 (4)B2菌中重组DNA的设计方案如下图，已知TetR基因的表达产物可抑制P启动子的转录活性。请将选项的序号填入下图相应的方框中①_______；②_____；③______。 a.持续启动基因表达的强启动子     b.卡那霉素诱导型启动子 c.突变K基因      d. 正常K基因 e.壮观霉素抗性基因     f.卡那霉素抗性基因 10．【实践应用】（2024·江苏·高考真题）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：    (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是________。 (2)步骤②转化时，科研人员常用________处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有________的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是________。 (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与________结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是________（从图2的“A~D”中选填）。    (4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。    （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是________。 （ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是________。 （ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有________。 素养导向限时测、训练解题思维、提升关键能力 限时：35分钟 1．【信息观】（2021·重庆沙坪坝·一模）2020年的诺贝尔化学奖授予了两位在基因组编辑技术（如CRISPR/Cas）领域作出杰出贡献的女科学家。这项技术的问世源自于人们在本世纪初对细菌抵御噬菌体的机理研究：不少的细菌第一次被特定的噬菌体感染后，由细菌Cas2基因表达的Cas2核酸内切酶（蛋白质）便会随机低效切断入侵的噬菌体DNA双链，并将切下的DNA片段插入CRISPR位点，形成“免疫记忆”。当细菌再次遭遇同种噬菌体时，由CRISPR位点转录产生的crRNA便会将另一种核酸内切酶（如Cas9）准确带到入侵者DNA处，并将之切断，即“免疫杀灭”。过程如图所示。下列说法错误的是（    ） A．细菌体内发生图中的①过程，需要细菌提供场所、模板、原料、能量等 B．图中②过程的机理类似于mRNA与DNA模板链的结合 C．核酸内切酶Cas2和Cas9均作用于DNA双链，但只有前者有序列特异性 D．细菌利用CRISPR/Cas分子装置剿灭入侵噬菌体的过程相当于高等动物的特异性免疫 2．【信息观】（2025·河北保定·一模）（多选题）CRISPR-Cas9基因编辑技术指通过向导sgRNA识别目的基因组序列，引导Cas9蛋白对基因进行切割，利用CRISPR-Cas9技术编辑水稻抗病基因的流程如图所示。下列说法正确的是（　　） A．sgRNA可以精准切割目标基因，产生平末端或黏性末端 B．据图推测，向导sgRNA的靶向作用主要由Cas9蛋白决定 C．Cas9蛋白相当于限制酶，能将基因中的磷酸二酯键断开 D．该技术可定向改变水稻的基因序列，为水稻育种提供思路 3．【信息观】（2026·河南洛阳·模拟预测）细胞核骨架蛋白 LMNA 的基因单一碱基点突变可引发心肌疾病。某研究团队利用CRISPR/dCas9 系统的单碱基编辑技术(不断裂DNA 双链，只改变单个碱基)，通过胞嘧啶碱基编辑器 (C编辑)和腺嘌呤碱基编辑器 (A编辑)分别纠正L35P、R249Q点突变，在对患者心肌细胞及模型小鼠的实验中均获成功。下列叙述错误的是（    ） 注: gRNA 为向导 RNA L35P 点突变修复：LMNA 的35号位由脯氨酸替换亮氨酸的突变 R249Q 点突变修复：LMNA 的249号位由谷氨酰胺替换精氨酸的突变 A．图示中的 dCas9 蛋白不催化磷酸二酯键的断裂 B．经过A 编辑后，LMNA 基因表达的肽链长度发生改变 C．CRISPR/dCas9单碱基编辑技术可应用于治疗基因异常引起的遗传病 D．通过C 编辑修复L35P 点突变,由 G/C 替换成A/T 至少需经过两次 DNA复制 4．【归纳与概括】（2026·河南郑州·一模）2025年，中国科学家开发了一种新型纳米载体系统（TAT—PLGA），可实现非侵入式胚胎基因编辑。该技术流程如下：收集斑马鱼受精后2小时内的胚胎；将包裹CRISPR/Cas9的TAT—PLGA纳米颗粒注入培养液；胚胎与纳米颗粒共培养，纳米颗粒穿透卵膜递送基因编辑工具；筛选基因编辑成功的胚胎继续发育。研究显示，该技术使斑马鱼胚胎编辑效率达90%，胚胎存活率超80%。下列基于该技术的分析，正确的是（　　） A．选择受精后2小时内的胚胎是因其处于囊胚期，内细胞团的细胞全能性高 B．若将编辑后胚胎移植到受体鱼中，需使受体与供体血型匹配以防排斥 C．该技术可为人类胚胎干细胞研究提供模型，但禁止应用于人类胚胎 D．筛选编辑成功胚胎时，需对内细胞团进行基因检测 5．【演绎与推理】（2026·陕西安康·一模）杨凌农科院利用CRISPR-Cas9编辑小麦TaDREB2基因，获得抗旱新品系。下列叙述错误的是（    ） A．该技术可精准敲除目标基因，避免连锁累 B．抗旱性状若由多基因控制，则效果可能有限 C．编辑后的植株需经多代自交以稳定遗传 D．该变异属于染色体结构变异 6．【归纳与概括】（2026·陕西安康·一模）杨凌农业高新技术产业示范区2024年成功培育抗条锈病小麦新品系“杨麦CR2”。该品系利用CRISPR-Cas9技术敲除感病基因TaMLO1，使其获得广谱持久抗性。田间试验显示：在条锈病高发区，“杨麦CR2”发病率<5%，而对照“西农511”达68%。全基因组测序证实，仅TaMLO1位点发生15bp缺失，无脱靶效应。然而，部分农户反映“杨麦CR2”千粒重略低于对照（42.3 g/45.1 g）。育种团队解释：TaMLO1参与籽粒灌浆调控，敲除后略有减产，但综合抗病收益远超损失。基于上述信息，并结合现代育种原理，下列评价最恰当的是（    ） A．CRISPR编辑属于诱变育种，其变异方向不可控 B．“杨麦CR2”为转基因作物，需严格标识上市 C．该育种实现了目标性状精准改良，符合绿色农业理念 D．千粒重下降说明基因编辑破坏了小麦遗传稳定性 7．【归纳与概括】（2025·广东汕尾·一模）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，其工作原理如图所示。下列有关说法错误的是（    ） A．Cas9蛋白的作用相当于限制酶 B．复合体中的SgRNA通过碱基互补配对与目标DNA序列特异性结合 C．将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是农杆菌转化法 D．利用CRISPR/Cas9可将目的基因定点插入到受体细胞基因组中 8．【归纳与概括】（2025·浙江嘉兴·一模）通过改造猪的基因组，可培育人类异种器官移植的“心脏供体猪”。流程如下：①从特定品种猪耳部获取成纤维细胞；②利用基因编辑技术改造会引起人体免疫排斥的相关基因；③将基因编辑成功的细胞核移植到去核的猪卵母细胞中，构建重组胚胎；④将重组胚胎移植到代孕母猪体内，获得基因编辑克隆猪。下列叙述错误的是（    ） A．过程①中，酶解猪耳部组织获得的细胞即为成纤维细胞 B．过程②中，基因编辑系统能识别并切割相关基因中的特定序列 C．过程③中，经显微操作去除次级卵母细胞的细胞核 D．过程④中，重组胚胎发育至囊胚时，移植入代孕母猪 9．【演绎与推理】（2026·湖南张家界·二模）CRISPR/Cas9基因编辑技术可对目标基因进行定点编辑，下列相关叙述错误的是（　　） A．Cas9蛋白的作用是切割DNA分子，属于限制性内切核酸酶 B．该技术需要根据目标基因的序列设计向导RNA C．基因编辑过程中，细胞可通过DNA修复机制修复断裂的DNA D．该技术可用于治疗人类的单基因遗传病，不会产生任何安全风险 10．【创造性思维】（2026·四川德阳·二模）天然橡胶（NR）是全球重要战略资源，但热带橡胶树供给受限。橡胶草可以在温带地区生长，其根部能合成NR。但细胞内的蔗糖会同时用于合成NR和菊粉。基因编辑技术为NR的高效供给提供了全新路径：研究人员利用CRISPR/Cas9技术敲除橡胶草中菊粉合成关键酶基因Tk1-SST和Tk1-FFT，使NR积累量翻倍。 结合材料及所学知识回答下列问题： (1)CRISPR/Cas9系统中，负责特异性识别并结合靶基因的向导分子是_________，该向导分子与靶基因结合区域最多含有_________种核苷酸。 (2)敲除Tk1-SST和Tk1-FFT双基因后，橡胶草NR产量提升的代谢机制为： 敲除Tk1-SST和Tk1-FFT基因 → ______________ → NR积累量显著增加 (3)为验证Tk1-SST基因敲除效果，科研人员提取橡胶草根部细胞DNA，用位于待敲除区域两侧的引物进行PCR扩增，电泳结果如下图所示。已知野生型扩增产物长度为1200bp，敲除成功后产物长度约为400bp。 据图判断，株系3最可能为______（填“纯合敲除”“野生型”或“嵌合体”），依据是_________。若将该株系单独培养几代后，发现400bp条带逐渐增强而1200bp条带逐渐减弱，最可能的原因是_________。 (4)与传统的将外源NR合成酶基因导入橡胶草基因组的技术相比，利用CRISPR/Cas9技术敲除内源菊粉合成基因以增产NR的优势在于_________（答1点即可）。 11．【分析结果与得出结论】（2026·四川宜宾·二模）传统的CRISPR/Cas9系统原理如图1、2所示，科学家通过突变得到一个没有核酸酶活性的Cas9蛋白，使其失去切割DNA的功能，但与sgRNA结合等功能不变，这样的Cas9称之为dCas9，目前CRISPR/dCas9系统常用于基因组转录调控。研究者设计了一套CRISPR/dCas9系统Y，将其导入某大肠杆菌菌株中，可以实现对多个基因的同步激活与抑制，以提高该菌抗肿瘤化合物Z的产量。 (1)系统Y中可以含有多种序列不同的sgRNA，sgRNA依据_________原则与目标序列特异性结合，引导dCas9结合到DNA上。 (2)图2是sgRNA构建过程示意图，过程甲对特征序列和重复序列扩增需在不同的PCR体系中进行，原因是_________________。最早在经历_________个循环后出现产物A．过程乙可分两个环节，第一个环节，过程甲的产物A、B在高温下解旋形成单链，复性后延伸，得到重组DNA片段，该环节_________（填“需要”或“不需要”）引物，原因是______。 (3)研究者检测了系统Y对基因的激活效果，当sgRNA靶向结合R基因的上游区域时，Z产量提升约2.9倍。系统Y中dCas9蛋白和转录激活因子P蛋白相连，sgRNA可以与dCas9自动组装到一起。推测当sgRNA与R基因的上游区域结合，P蛋白可募集_________酶启动R基因转录，有利于Z的合成。 (4)研究者检测了系统Y对基因的抑制效果，设计了能靶向结合F基因（与细胞分裂相关）不同区域Q1和Q2的sgRNA1、sgRNA2，分别转入不同的大肠杆菌中，细胞数量相对值如图3. 实验表明：____________。 12．【表达与交流】（2026·吉林长春·一模）斜纹夜蛾是危害大豆的主要害虫，该害虫体内的几丁质酶基因（Cht）表达产物能帮助其降解植物细胞壁，从而利于幼虫取食。某科研团队计划通过基因工程结合基因编辑技术，培育一种具有特定抗虫能力的大豆新品种，设计思路如下： ①将Cht基因的启动子（负责响应害虫取食信号）与一种毒蛋白基因（Tox）连接，构建重组载体，并导入大豆细胞。当斜纹夜蛾取食造成植物损伤时，伤口部位分泌的茉莉酸（一种植物信号分子）能诱导该启动子驱动Tox基因表达，产生毒蛋白杀死害虫。 ②利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，敲除或修饰大豆自身的JAZ基因（该基因能抑制茉莉酸信号通路），以增强植株对茉莉酸信号的感知和响应效率，从而提升抗虫效果。 回答下列问题： (1)基因工程的核心步骤是_____。该步骤中，需用_______酶识别并分别切割Cht基因的启动子和Tox基因，使二者产生相同的黏性末端，再用_______酶连接形成融合基因。 (2)茉莉酸诱导Tox基因表达的机制是：茉莉酸与大豆细胞内的受体蛋白结合形成复合物，该复合物与________基因启动子上游的特定响应元件结合，进而启动Tox基因的转录。该设计的优点是____，从而减少对大豆自身代谢的消耗，并降低对非靶标生物的影响。 (3)若要检测Tox基因是否能在茉莉酸诱导下成功表达，可采用________技术检测大豆细胞中是否存在Tox毒蛋白。 (4)利用CRISPR/Cas9编辑JAZ基因后，大豆的抗虫效果显著提升，原因是_______。 (5)与直接喷洒化学杀虫剂相比，该基因工程结合基因编辑的抗虫技术的优势是_______。 13．【表达与交流】（2025·四川乐山·一模）乐山是四川重要的茶叶产区，茶园在每年修剪和采摘后会产生大量的茶树枝条等农业废弃物（主要成分为木质纤维素）。传统处理方式通常是焚烧或堆积，这不仅造成空气污染和温室气体排放，也是资源的巨大浪费。某研究团队从乐山峨眉山原始森林的腐殖土中，分离到一株高效降解木质纤维素的真菌——疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria）。该真菌的W基因簇（基因簇是指基因组中紧密排列、功能相关或结构相似的一组基因，通常协同发挥作用，常见于真核生物中）能表达出一种强大的复合纤维素酶系，包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，可以将纤维素高效分解为葡萄糖。现在，为将其应用于茶园的秸秆处理，研究人员计划利用转基因技术改造出生产该酶的大肠杆菌工程菌，相关限制酶的识别序列如表。请回答下列问题： 限制酶 XbaⅠ EcoRⅠ SpeⅠ XhoⅠ HindⅢ 识别序列（5′→3′） T↓CTAGA G↓AATTC A↓CTAGT C↓TCGAG A↓AGCTT (1)传统的获取大量酶的生产方法是进行真菌发酵。但这种方法周期较长，且容易受到杂菌污染。为了更高效、可控地生产，现代生物技术倾向于采用_______工程的方法。其基本操作流程是：从疣孢漆斑菌细胞中提取总RNA，通过______过程获得其纤维素酶基因，然后将其导入到一个生长迅速、蛋白分泌能力强的受体细胞（如大肠杆菌）中，让受体菌成为“细胞工厂”来大量生产该酶。 (2)图1标识了载体pBL和W基因簇中限制酶的切割位点（1kb=1000bp，假设构建重组质粒前后，质粒pBL对应部分大小基本不变）。已知a链为W基因簇中的转录模板链，结合上表分析，为保证W基因簇与质粒pBL正确连接，PCR扩增W基因簇时需在引物1和引物2的5′端分别添加的碱基序列5′-______-3′、5′-______-3′。切割载体时应选用的限制酶是______。 (3)图1载体pBL中的色氨酸合成酶基因的作用是______，将重组质粒导入色氨酸合成缺陷的大肠杆菌菌株，利用______的培养基筛选菌株并提取质粒，用引物1和引物2进行PCR扩增，相关产物电泳图见图2.已知1号泳道和2号泳道分别是重组质粒和空载质粒的电泳图（均用EcoRⅠ酶切成线性），在3号、4号的PCR扩增产物中，符合预期的W基因簇的DNA片段是______号，若要进一步验证可对其进行______。空白对照组5中使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是______。 14．【表达与交流】（2024·浙江宁波·二模）回答与生物技术有关的下列两小题： Ⅰ.甘蓝型油菜引入我国历史较短，其遗传基础狭隘。菘蓝（别名“板蓝根”）是传统中药材，具有广谱抗病毒特性。研究人员利用甘蓝型油菜（体细胞中染色体数为38）与菘蓝（体细胞中染色体数为14）进行体细胞杂交，培育抗病毒的甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系，过程如图1。 (1)甘蓝型油菜与菘蓝的体细胞经__________酶处理后获得原生质体，再经__________诱导获得融合细胞。融合细胞接种到含有营养物质和__________的培养基上，经__________过程形成愈伤组织，发育形成完整的再生植株F1。植物体细胞杂交技术依据的生物学原理有：__________。（至少答出两个） (2)将F1与甘蓝型油菜回交，获得BC1，其染色体组成为__________（只用字母表示）。用BC1与甘蓝型油菜再一次回交，得到的BC2植株群体的染色体数目范围是_______。 (3)研究人员从BC2筛选出7种只含有1条菘蓝染色体的甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系（A、B、C、D、E、F、G）。为探究甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系在抗新冠病毒（SARS-CoV-2）中的作用，研究人员用其提取物处理动物细胞，24h后感染新冠病毒，一段时间后收集病毒细胞培养液，检测病毒的含量，结果如图2。 ①作为标准参考的GADPH蛋白表达量__________，可排除无关变量对实验结果的影响。 ②结果表明：__________。 ③尝试说出建立甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系在育种方面的意义：__________。（答出两个方面） Ⅱ.母源因子是初级卵母细胞在减数分裂Ⅰ前期的后段开始产生并积累的mRNA和蛋白质，其对于调控动物早期胚胎的发育十分重要。为研究不同母源因子的功能，相应母源突变体的培育显得尤为重要。 (4)母源因子由母源效应基因通过基因__________过程产生，其产生并积累的时期由于同源染色体未分离，因此只有纯合突变的雌性个体的后代才是母源突变体。 (5)获得母源突变体的传统方法是反复交配与筛选。以母源效应基因A为例，科学家利用基因编辑技术将斑马鱼的一个A基因敲除后获得杂合子，记作（+/-）。如图1是获得母源突变体的杂交方案，请补全下图__________。 (6)传统交配筛选的方法存在耗时长、纯合的合子突变体的致死率高等缺陷。为了解决上述问题，科学家在CRISPR/Cas9基因编辑系统的基础上进行了改进。 ①sgRNA编码序列能与相应靶基因序列发生碱基互补配对。为构建含有sgRNA编码序列的重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA用__________处理，然后将其插入到经相同酶处理过的质粒上。斑马鱼的卵母细胞与精子受精前停滞在减数分裂Ⅰ前期，此时还未开始合成母源因子，在此阶段前对卵母细胞进行基因敲除可避免母源因子的积累。 ②为了实现卵母细胞中基因的特异性敲除，如图2所示，科学家将含有3个不同的但靶向相同基因的sgRNA编码基因的重组质粒组装到具有特殊元件的载体上，形成新的重组质粒后导入卵母细胞。 注：eflap—能够驱动基因广泛表达的启动子；EGFP—增强型绿色荧光蛋白基因；I-SecI一归位内切酶，可将质粒随机插入到斑马鱼的基因组中。 从理论上分析，一个sgRNA便能实现靶基因的敲除，请分析3个sgRNA串联有何优势，请答出2点__________。 (7)I-SecI介导的基因插入率并不能达到100%，请根据上述研究分析如何在斑马鱼早期胚胎中筛选出突变体，并说明理由_____。 15．【分析结果与得出结论】（2025·湖南·一模）斑马鱼是研究心脏器官发育和相关疾病发病机制的重要模式生物。 (1)我国科学家对北京本地的斑马鱼品系进行研究，发现了一个心脏畸形突变体甲，杂交结果如图1，这一对相对性状的遗传遵循孟德尔的_______定律。 (2)为确定突变基因的位置，研究者根据斑马鱼染色体上特定基因的序列长度差异（如D/d、E/e等）设计引物，分别提取上述F1中的野生型（WT）和心脏畸形（Mu）的DNA进行PCR，结果如图2.突变基因最可能与等位基因_____在一对同源染色体上，依据是_________。基因测序推测该突变基因可能是kc10，将kc10突变体和突变体甲杂交，若子代______，则进一步证明kc10是该突变体的突变基因。 (3)科学家发现kc10和tb5的突变体心脏畸形类似。tb5是启动心脏发育相关基因转录的关键转录因子，其活性过低或过高都会导致心脏发育畸形。为了研究kcl0和tb5的关系，将tb5的DNA结合序列和荧光素酶基因连接到一个质粒上并稳定转入细胞中（图3a），同时给予细胞相同浓度tb5蛋白和不同浓度的kc10蛋白处理，结果如图3b所示，结果表明______。 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 微专题06 基因编辑与生物技术 真题引领练 素养拔高练 高考真题限时测、知己知彼百战不殆 限时：30分钟 1．【新情境】（2025·全国卷·高考真题）琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4的电泳结果如图所示（“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极）。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙，甲只有限制酶R的一个酶切位点，样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是（    ） A．配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液 B．该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷 C．甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同 D．据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物 【答案】D 【解析】A、配制琼脂糖凝胶时选用适当缓冲溶液，可维持电泳过程中体系的pH稳定，保证核酸分子正常泳动，A正确； B、电泳时，样品向+极移动，说明在该实验条件下甲、乙两种 DNA 分子均带负电荷，符合核酸分子在电泳中的带电特性，B正确； C、电泳中，DNA分子的迁移速率与分子大小、电荷的多少等多种因素有关。甲、乙电泳条带位置虽然相同，但影响DNA分子的迁移速率的因素很多，所以碱基对的数量可能不同，C正确； D、甲只有限制酶R的一个酶切位点，若被酶R完全酶切，只会得到2种DNA片段（2个条带），这两个条带的碱基数量比甲要少，电泳跑的距离要比甲更远，所以据图推测样品4才是甲被酶R完全酶切后的产物，D 错误。 故选D。 2．（2025·福建·高考真题）质粒P含有2个EcoRⅠ、1个SacⅠ和1个BamHⅠ的限制酶切割位点。已知BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间，用上述3种酶切割该质粒，酶切产物的凝胶电泳结果如图，其中泳道①条带是未酶切的质粒P，泳道②③④条带为3种单酶切产物，泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。下列叙述正确的是（    ） A．DNA分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极 B．可确认泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物 C．泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物 D．泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数 【答案】C 【解析】A、因为DNA分子带负电，在凝胶中会向电源正极迁移，所以其迁移方向是从电源负极到正极，并非从电源正极到负极，A错误； B、P质粒有两个EcoRI限制酶的切割位点，单酶切后的产物最小，电泳时迁移速度较快，可推知③条带可能是EcoR Ⅰ的单酶切产物（单酶切产生2个片段大小相同），泳道②条带和泳道④条带位置一致，无法区分泳道②条带是SacI还是BamHI的单酶切产物，B错误； C、EcoR I有2个酶切位点，单酶切会产生2个片段，Sac I有1个酶切位点，单酶切会产生1个线性片段。Sac I和EcoR I双酶切，会产生3个片段，观察电泳图谱，泳道⑤有3个条带，可推测泳道⑤为Sac I和EcoR I酶切产物，C正确； D、酶切只是将质粒的环状结构切开，变成线性等结构，碱基总数不会改变，D错误。 故选C。 3．【实践应用】（2024·重庆·高考真题）有研究者构建了H基因条件敲除小鼠用于相关疾病的研究，原理如图。构建过程如下：在H基因前后均插入LX序列突变成h基因（仍正常表达H蛋白），获得Hh雌性小鼠；将噬菌体的G酶基因插入6号染色体上，获得G+G-雄鼠（G+表示插入，G_表示未插入G酶基因） (1)以上述雌雄小鼠为亲本，最快繁殖两代就可以获得H基因条件敲除小鼠（hhG+G-和hhG+G+）。在该过程中，用于繁殖F1的基因型是_____________。长期采用近亲交配，会导致小鼠后代生存和生育能力下降，诱发这种情况的遗传学原因是_____________。在繁殖时，研究人员偶然发现一只G+G-不表达G酶的小鼠，经检测发现在6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列，该异常结果形成的原因是_____________。 (2)部分小鼠的基因型鉴定结果如图2，③的基因型为_____________。结合图1的原理，若将图2中所有基因型的小鼠都喂食TM试剂一段时间后，检测H蛋白水平为0的是_____________（填序号）。 (3)某种病的患者在一定年龄会表现出智力障碍，该病与H蛋白表达下降有关（小鼠H蛋白与人的功能相同）。现有H基因完全敲除鼠甲和H基因条件敲除鼠乙用于研究缺失H蛋白导致该病发生的机制，更适合的小鼠是_____________（“甲”或“乙”），原因是_____________。 【答案】(1) HhG+G- 近亲繁殖会导致隐性致病基因纯合可能性增加 染色体片段从一条染色体移接到另一条非同源染色体上 (2) HhG+G+、HhG+G- ④ (3) 乙 乙的H基因敲除与表达受TM试剂调控 【解析】（1）由题干可知，亲本为HhG-G-、HHG+G-，要获得H基因条件敲除小鼠hhG+G-和hhG+G+，则用于繁殖F1的基因型是HhG+G-。近亲繁殖会导致隐性致病基因纯合可能性增加，会导致小鼠后代生存和生育能力下降。6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列，G酶基因序列分开到两条染色体上，异常表达，其变异为染色体片段从一条染色体移接到另一条非同源染色体上。 （2）由图2可知，③含有基因H、h、G，故其基因型为HhG+G+、HhG+G-。结合图1和图2，①只含有h基因，仍正常表达H蛋白，②③都含有H基因，可正常表达H蛋白，④含有h基因和G基因，TM试剂激活G酶可剪切LX序列，使h基因异常，无法表达H蛋白，故检测H蛋白水平为0的是④。 （3）由题干可知，患者在一定年龄会表现出智力障碍，该病与H蛋白表达下降有关，由题干和题图可知，乙的H基因敲除后表达受TM试剂调控，故选择H基因条件敲除鼠乙。 4．【实践应用】（2025·甘肃·高考真题）水稻白叶枯病（植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯白色病斑）由白叶枯病菌引起，严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，对水稻白叶枯病的感病基因SWEET（该基因被白叶枯病菌利用以侵染水稻）的启动子区进行了定点“修改”，编辑后的水稻幼胚通过植物组织培养技术获得抗病植株（如下图）。回答下列问题。 (1)CRISPR-Cas9重组Ti质粒构建完成后，可通过__________（方法）将该质粒转入植物细胞，并将__________整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的细胞，需要在植物组织培养基中添加__________。 (2)实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为__________，对其消毒时需依次使用酒精和__________处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂素，原因是__________。 (3)为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用__________技术检测目标基因的启动子区是否被成功编辑；然后，在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较__________来验证抗病性。 (4)在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为__________。 【答案】(1) 农杆菌转化法 Ti质粒上的T - DNA 潮霉素 (2) 外植体 次氯酸钠 生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素 (3) PCR - 测序 病斑的大小（或病斑面积、发病情况等合理答案） (4)对感病基因SWEET的启动子区进行定点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻。 【解析】（1）将重组Ti质粒转入植物细胞常用农杆菌转化法。因为农杆菌中的Ti质粒上的T - DNA（可转移DNA）能够整合到植物细胞的染色体DNA上。利用农杆菌侵染植物细胞，从而将重组Ti质粒导入植物细胞。为了筛选出转化成功的细胞，由于重组Ti质粒上含有潮霉素抗性基因（HygR），所以需要在植物组织培养的培养基中添加潮霉素，只有成功导入重组Ti质粒的细胞才能在含有潮霉素的培养基上存活。 （2）在植物组织培养中，离体的植物器官、组织或细胞被称为外植体，所以实验中用到的水稻幼胚被称为外植体。 对水稻幼胚消毒时需依次使用酒精、次氯酸钠处理。 在植物组织培养诱导形成再生植株的过程中，生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。不同浓度的生长素和细胞分裂素的配比可以调控细胞的分裂和分化方向，从而诱导形成根和芽等不同的器官，最终形成再生植株。 （3）为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用PCR - 测序技术检测目标基因的启动子区是否编辑成功。通过PCR扩增目标基因的启动子区片段，然后进行测序，与编辑前的序列进行对比，看是否发生了预期的改变。 在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较病斑的大小（或病斑面积、发病情况等）来验证抗病性。如果基因编辑后的水稻病斑明显小于野生型水稻，说明其抗病性增强。 （4）在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为：对感病基因SWEET的启动子区进行定点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻，从而使水稻获得了抗病性。 5．【新情境】（2025·浙江·高考真题）玉米(2n=20)雌雄同株异花。从玉米某自交系(甲)中选育出2个雄性不育突变体(乙和丙)。已知雄性不育基因E1、E2由雄性可育基因E突变所致；如图1所示。甲×乙的F2中雄性可育285株、雄性不育94株，甲×丙的F2中雄性可育139株、雄性不育45株。利用引物P1和P2，对甲、乙、丙以及它们之间杂交的后代(丁和戊)基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经SnaBⅠ完全酶切后电泳，结果如图2所示。 回答下列问题： (1)E1基因与E基因相比，由于___________，导致编码的蛋白质中1个氨基酸发生改变。E2基因与E基因相比，由于编码区增加了插入序列，导致___________，使编码的蛋白质中氨基酸数目减少。 (2)雄性不育对雄性可育是___________性状，乙的基因型是___________。甲×丙产生的F1其雌配子有___________种，F2可育植株中纯合子占___________。若甲×戊的F1随机交配，则F2中E1的基因频率是___________。 (3)写出丁×戊获得F1的遗传图解。 (4)雄性不育突变体不能自交繁殖。为了保存雄性不育突变体，需长期保留含不育基因的杂合子。该杂合子可采用上述“PCR结合限制性内切核酸酶酶切后分析条带”进行鉴定，还可采用的方法有___________(答出2点即可)。 (5)利用引物P1、P2对甲的基因组DNA进行PCR扩增和电泳，下列叙述错误的是___________。 A．PCR反应中TaqDNA聚合酶是沿着模板链的3'端向5'端聚合核苷酸 B．图2中胶板的上端是电泳时的负极，且电泳时DNA片段由负极向正极泳动 C．若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得16条含32P标记的DNA单链 D．若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得8个含32P标记且长度为b的DNA分子 【答案】(1) 碱基对替换 终止密码子提前 (2) 隐性 E2E2 2/两/二 1/3 1/4 (3) (4)测交，自交，核酸分子杂交，基因测序 (5)C 【解析】（1）由图1可知，E1基因与E基因相比，由于碱基对替换，导致编码的蛋白质中1个氨基酸发生改变。由图1可知，E2基因与E基因相比，编码区增加了插入序列，结果编码的蛋白质中氨基酸数目减少，说明翻译提前终止，故反推出编码区增加了插入序列，导致mRNA上终止密码子提前。 （2）由题意可知，甲×乙的F2中雄性可育285株、雄性不育94株，即F2中雄性可育：雄性不育=285：94≈3：1，可知雄性不育为隐性性状，雄性可育为显性性状。甲基因型为EE，故图2中b片段对应E基因，E2基因长度大于E1，故a片段为E2，E1内部存在限制酶SnaBⅠ的识别序列，可被切割为c和d，据此可知乙的基因型为E2E2，丙的基因型为E1E1。甲×丙产生的F1的基因型为EE1，故其可产生2种类型的雌配子，分别是E、E1，F1自交，F2中的基因型及比例为EE：EE1：E1E1=1：2：1，其中EE、EE1雄性可育，因此F2可育植株中纯合子占1/3。由图2可知戊的基因型为E1E2，甲×戊的F1的基因型及比例为EE1：EE2=1：1，F1均可育，随机交配，基因频率不变，因此F2中E1的基因频率与F1中的相同，为1/2×1/2=1/4。 （3）由图2可知戊的基因型为E1E2，雄性不育，可作母本，产生两种类型的雌配子，分别是E1：E2=1：1；丁基因型为EE1，雄性可育，可作父本，产生两种类型雄配子，分别是E：E1=1：1，雌雄配子随机结合，F1的基因型为EE1：EE2：E1E1：E1E2=1：1：1：1，其中EE1和EE2为雄性可育，E1E1和E2E2为雄性不可育，因此丁×戊获得F1的遗传图解为： （4）鉴定基因有无常用的方法有PCR技术、核酸分子杂交、基因测序等，同时也可采用自交和杂交的方法进行鉴定，如含不育基因的杂合子EE1或EE2，测交后代雄性可育：雄性不育=1：1；自交后代雄性可育：雄性不育=3：1。 （5）A、PCR反应中的引物能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，故TaqDNA聚合酶是沿着模板链的3'端向5'端聚合核苷酸，A正确； B、DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，因此若图2中胶板的上端是电泳时的负极，电泳时DNA片段由负极向正极泳动，B正确； CD、在PCR扩增中，1对引物中的每个引物P1和P2分别结合互补的链后进行延伸。每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得24=16个双链DNA分子，其中的15个双链DNA分子都有1条链结合P1引物。若用32P标记引物P1，可获得15条含32P标记的DNA单链，其中第1次扩增时，与P2引物结合的链最终形成的双链DNA分子没有被32P标记。同时获得长度为b，即目的基因片段长度的双链DNA分子为24-2×4=8个。C错误，D正确。 故选C。 6．（2024·天津·高考真题）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。 (1)Sa产生抗药性可遗传变异的来源有______（至少答出2点）。 (2)推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。    ①根据图1信息，简述质粒2的构建过程（需包含所选引物和限制酶）：______，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含______的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 ③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含______的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含____________的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是______。    【答案】(1)基因突变、基因重组、表观遗传等 (2) 采用引物1和4进行PCR扩增（或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切 氯霉素（或氯霉素+头孢霉素） 脱水四环素 头孢霉素 D 【解析】（1）Sa为原核生物产生抗药性可遗传变异的来源有基因突变、基因重组、表观遗传等。 （2）①由图1可知，质粒2上依次接有SacⅡ、EcoRⅠ、SacⅡ三个酶切位点，而质粒1上只有SacⅡ酶切位点，R基因的上下游依次含有SacⅡ、EcoRⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ酶切位点，若要构建质粒2，可以采用引物1和4进行PCR扩增可得到整个R基因，以及上下游片段（或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，因为重组的质粒2上含有氯霉素抗性基因，所以可以将重组后的含质粒2的菌落涂布在含氯霉素（或氯霉素+头孢霉素）的平板上，能生存下来的菌落就是，含质粒2的Sa单菌落。 ③推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测需要敲除R基因，因为质粒2上含有Y可被脱水四环素又到表达的Sa致死基因，所以将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含脱水四环素的平板上，可诱导R基因死亡，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是D组，由图1可知，R基因两侧含有的引物为2和3，所以扩增后含有引物2或3，或者2和3的可能含有R基因，所以表明R基因已被敲除的是D组。 7．【实践应用】（2025·全国二卷·高考真题）番茄的花是两性花，杂交育种时需进行去雄操作，耗时费力且难以避免自交污染。我国研究者利用基因工程技术开发了雄性不育番茄品系，提高了番茄杂交育种的效率。 (1)研究者选择性状优良的WT品系番茄，对在雄蕊中特异性表达的S基因进行编辑，获得S基因中增加一个碱基对的纯合突变体甲。甲花粉不成活。甲与WT杂交，F1育性正常。F1自交，F2中216株育性正常，68株雄性不育。这表明甲的雄性不育性状属于__________性状，该性状的遗传遵循分离定律。 (2)为了确认雄性不育是由S基因编辑导致的，研究者使用了一种竞争性等位基因特异性PCR，该PCR体系同时含3种引物和4种探针（如图）。探针的荧光基团与淬灭基团分离时显现荧光。 ①引物3'末端与模板的严格配对对于子链的延伸至关重要。引物I和引物II的3'末端碱基分别是__________。该PCR体系从第__________个循环开始，复性环节中带有荧光基团的探针与模板链结合，作为引物在延伸环节中掺入子链，使产物显现荧光。 ②用该体系对F2的基因组DNA进行PCR检测，育性不同植株的检测结果为__________，证实雄性不育性状是由S基因编辑导致的。 (3)甲无法自交保种。研究者将控制子叶为紫色的显性基因与WT型的S基因插入Ti质粒的T-DNA中，两基因紧密相邻。用农杆菌转化法导入甲，获得育性恢复的纯合品系乙。请写出用甲和乙为材料，连续生产甲的最简杂交方案。__________ (4)研究者在野生番茄中发现一个抗病基因，拟用杂交方法将此基因引入到甲、乙品系中。从操作的简便性出发，应将抗病基因先引入甲还是乙？请说明理由。____________。 【答案】(1)隐性 (2) G、A 3 雄性不育株PCR产物发绿色荧光.育性正常株1/3发红色荧光，2/3发红、绿荧光 (3)甲与乙杂交获得F1，F1与甲杂交，选出子代中绿色子叶幼苗即为甲。子代中紫色子叶幼苗继续种植以备连续生产甲。 (4)应先引入甲。与甲进行杂交和多代回交不用去雄。 【解析】（1）甲花粉不成活。甲与WT杂交，F1育性正常，说明不育为隐性性状。 （2）①引物I和引物II分别与野生型和突变型S型基因结合，相对于野生型的S基因，突变型的S基因中增加一个碱基对A-T，引物与模板链互补配对，且从子链（引物）的3'端开始延伸，为了更好地区分突变型和野生型的S基因，因此在引物I和引物II的3'末端碱基分别是G、A；该PCR体系同时含3种引物和4种探针，是一种竞争性等位基因特异性PCR，第1次循环以基因为模板，引物I、引物Ⅲ或引物II、引物Ⅲ扩增S基因，第一轮PCR结束后加入的引物I或II在子链中，第二次PCR引物I、引物Ⅲ或引物II、引物Ⅲ扩增第一次复制得到的S基因，第二轮PCR结束后可以得到引物I、引物Ⅲ或引物II、引物Ⅲ的子链，第三轮PCR开始，探针1或探针3（不是引物I或引物II）会特异性地与含有引物I或引物II互补序列的模板链结合，而带有荧光基团的探针是引物的一部分，因此该PCR体系从第3个循环开始，复性环节中带有荧光基团的探针与模板链结合，探针1与探针2分离，去与互补序列结合，荧光基团脱离淬灭基团，所以才发荧光。 ②F1自交（假设用A表示野生型S基因，a表示突变型S基因），F2中216株育性正常（1/3AA、2/3Aa），68株雄性不育（1/3aa），若雄性不育性状是由S基因编辑导致的，则用该体系对F2的基因组DNA进行PCR检测，雄性不育株（仅含突变型S基因，只能与探针3结合）PCR产物发绿色荧光，育性正常株（均为野生型S基因，只与探针1结合）1/3发红色荧光，2/3发红、绿荧光（含有野生型S基因和突变型S基因，既可以与红色探针结合，也可以与绿色探针结合）。 （3）研究者将控制子叶为紫色的显性基因与WT型的S基因插入Ti质粒的T-DNA中，两基因连锁，用农杆菌转化法导入甲，获得育性恢复的纯合品系乙，甲与乙杂交获得F1，F1与甲杂交，选出子代中绿色子叶幼苗即为甲。子代中紫色子叶幼苗继续种植以备连续生产甲。 （4）甲花粉不成活，应先引入甲，与甲进行杂交和多代回交不用去雄。 8．【联系生活】（2025·全国二卷·高考真题）斑翅果蝇是农业害虫。我国研究者利用基因编辑技术培育带有雌性不育基因的斑翅果蝇，若将其释放到野外可降低野生斑翅果蝇种群数量。 (1)CRISPR/Cas9基因编辑系统中的gRNA与靶基因特异性结合，引导Cas9酶切断靶基因。断裂的DNA可能发生非同源末端连接修复，导致靶基因中发生碱基的______，引起基因突变；也可能发生同源重组修复，导致靶基因被供体DNA中的片段替换（图1）。 (2)果蝇2号染色体上T基因控制合成一种信号物质，该物质由神经细胞分泌，是雌蝇产卵的必需信号，对雄蝇育性无影响。研究者制备图2所示供体DNA，将其与靶向T基因的gRNA和Cas9酶共同注入果蝇受精卵。继续培养后在低倍镜下挑选出_______的成蝇，即为成功实现驱动片段替换的个体——G0。 (3)理论上，当细胞中1个T基因被驱动片段替换后，会表达靶向T基因的gRNA和Cas9酶，同时作为同源重组修复的模板，导致_______，使雌蝇不育。用G0雄蝇与野生型雌蝇杂交，F1雌蝇育性情况为______。 (4)有的G0果蝇受精卵中T基因发生末端连接修复，突变为t基因。t基因既不能正常表达，也不能被gRNA识别。用携带t基因的G0雄蝇与野生型雌蝇杂交，F1自由交配，若整个过程中没有t基因的新发产生，F2雌蝇中可育个体占比为______，可见t基因对驱动片段在种群中的传播有抵抗作用。 (5)研究者对驱动片段进行改造，将其中编码gRNA的基因增加为3个，分别靶向T基因中不同的位点。请评价改造后的驱动片段的优点________。 【答案】(1)增添、缺失或替换 (2)发出红色荧光 (3) 另1个T基因也被驱动片段替换 均不育 (4)3/8 (5)T基因中即使发生末端连接修复，也可以被其它gRNA识别，引发同源重组修复，降低t基因产生概率 【解析】（1）基因突变是指碱基对的增添、缺失或替换。故断裂的DNA可能发生非同源末端连接修复，导致靶基因中发生碱基的增添、缺失或替换，引起基因突变。 （2）将供体DNA与靶向T基因的gRNA和Cas9酶共同注入果蝇受精卵，实质是基因工程中将基因表达载体注入受体细胞，需要根据标记基因挑选，图2中红色荧光蛋白基因是标记基因，所以在低倍镜下挑选出发出红色荧光的成蝇，即为成功实现驱动片段替换的个体——G0。 （3）当细胞中1个T基因被驱动片段替换后，会表达靶向T基因的gRNA和Cas9酶，而gRNA可以与T基因特异性结合，同时Cas9酶在特定位点将其切割，所以导致另1个T基因也被驱动片段替换，用G0雄蝇与野生型雌蝇杂交，杂交子代中一对同源染色体上T基因被替换，而另一条没有被替换，但根据前面分析，最终这对染色体上的T基因都会被替换，所以F1雌果蝇均不育。 （4）有的C0果蝇受精卵中T基因发生末端连接修复，突变为t基因。t基因既不能正常表达，也不能被gRNA识别，t基因本身也是发生了基因突变，所以tt是不育的，但不能将野生型2号染色体上的T基因进行驱动片段替换，因此如果果蝇同时含有t和野生型基因，是可育的。 用携带t基因的C0雄蝇（记为Tt）与野生型雌蝇（记为++）杂交，子代T+：t+=1:1，T+变为TT，在雌果蝇中表现不育，所以F1自由交配，雄果蝇产生的配子T：t：+=2:1:1，雌果蝇产生的配子t：+=1:1，随机结合F2中Tt：T+：tt：t+：++=2:2:1:2:1，所以雌果蝇中可育个体比例为3/8。 （5）对驱动片段进行改造，将其中编码gRNA的基因增加为3个，分别靶向T基因中不同的位点的好处是T基因中即使发生末端连接修复，也可以被其它gRNA识别，引发同源重组修复，降低t基因产生概率。 9．【新情境】（2025·全国二卷·高考真题）学习以下材料，回答(1)~(4)题。 工程菌检测癌基因 贝氏不动杆菌(B菌)是一种能在肠道定植且对人体健康无害的细菌。B菌可吸收环境中的DNA片段，并将其整合至自身基因组，该过程称为水平基因转移(HGT)。研究者改造B菌，借助其HGT捕获诱发结肠癌的突变K基因，以辅助诊断结肠癌。 为鉴定B菌捕获K基因的HGT能力，研究者制备两种转基因细胞。转基因结肠癌细胞(R1细胞)染色体上部分DNA序列和转基因B菌(B1菌)拟核上部分DNA序列如图1。当细菌细胞中两个DNA分子的两端具有同源序列时，可发生同源序列之间的片段互换。将B1菌与R1细胞裂解液混合一段时间，再把B1菌接种至含有卡那霉素或壮观霉素的平板上，根据菌落生成情况，确认其具有捕获K基因的HGT能力。 结肠癌细胞以及正常结肠细胞死亡后会将其DNA释放至肠腔中。为进一步获得能够区分突变K基因和正常K基因的B菌，需对其进行优化。B菌中天然存在用于防御噬菌体的CRISPR/Cas 系统。CRISPR/Cas 系统由 Cas 蛋白与 gRNA 构成，其工作原理如图2。目标DNA 被 Cas 蛋白切断后，会在细菌细胞中被降解。研究者利用这一机制，构建相关重组DNA并导入B菌，获得B2菌。B2菌仅在捕获突变K基因后才能在含有卡那霉素的平板上存活。 研究者对B菌的工程改造策略为检测突变基因提供了新的思路，未来可能会有广泛用途。 (1)图1中B1菌的HGT过程与减数分裂中的_____________过程机制相似，都属于基因重组。 (2)成功捕获K基因的B1菌在含卡那霉素或壮观霉素的平板上的菌落生成情况分别是_____________。 (3)对文中CRISPR/Cas系统的理解，正确的是_____________ A．CRISPR序列中的重复序列编码的RNA序列能与噬菌体DNA碱基互补配对 B．Cas蛋白能独立识别特定DNA序列并断开磷酸二酯键 C．B菌的不同菌株中CRISPR序列可能是有差异的 D．利用人工改造后的CRISPR/Cas系统可实现对细胞内基因的编辑 (4)B2菌中重组DNA的设计方案如下图，已知TetR基因的表达产物可抑制P启动子的转录活性。请将选项的序号填入下图相应的方框中①_______；②_____；③______。 a.持续启动基因表达的强启动子     b.卡那霉素诱导型启动子 c.突变K基因      d. 正常K基因 e.壮观霉素抗性基因     f.卡那霉素抗性基因 【答案】(1)非姐妹染色单体交换片段 (2)有、无 (3)CD (4) a f d 【解析】（1）据图1可知，两个不同DNA片段由于两端具有同源序列而发生了中间相应基因的互换，与减数分裂过程中同源染色体的非姐妹染色单体之间片段的互换类似，都属于基因重组。 （2）据图1可知，经过同源序列之间的片段互换后，B1菌中的DNA上含有了卡那霉素抗性基因，失去了壮观霉素抗性基因，因此成功捕获K基因的B1菌在含卡那霉素的培养基上能够生长，但在含壮观霉素的平板上不能生长，即成功捕获K基因的B1菌在含卡那霉素或壮观霉素的平板上的菌落生成情况分别是有和无。 （3）A、据图可知，CRISPR序列中的经加工后插入到细胞基因组的噬菌体DNA转录形成的RNA序列能与噬菌体DNA碱基互补配对，A错误； B、Cas蛋白不能识别特定DNA序列，gRNA可识别特定的DNA序列，B错误； C、B菌的不同菌株中CRISPR序列可能是有差异的，因此转录形成的gRNA可识别噬菌体不同的DNA序列从而实现从不同位点切割，C正确； D、由于CRISPR/Cas系统中的gRNA可识别特定的DNA序列，而Cas蛋白可切割DNA，因此利用人工改造后的CRISPR/Cas系统可实现对细胞内基因的编辑，D正确。 故选CD。 （4）B2菌仅在捕获突变K基因后才能在含有卡那霉素的平板上存活，而③选择了正常K基因，说明CRISPR/Cas系统切割的是正常的K基因，这样才能保证捕获突变的K基因，进而达到菌仅在捕获突变K基因后才能在含有卡那霉素的平板上存活。又知TetR基因的表达产物可抑制P启动子的转录活性，因此需要TetR基因持续表达，故①为持续启动基因表达的强启动子，结合题意B2菌仅在捕获突变K基因后才能在含有卡那霉素的平板上存活，可知②为卡那霉素抗性基因，故①②③依次为a、f、d。 10．【实践应用】（2024·江苏·高考真题）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：    (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是________。 (2)步骤②转化时，科研人员常用________处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有________的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是________。 (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与________结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是________（从图2的“A~D”中选填）。    (4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。    （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是________。 （ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是________。 （ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有________。 【答案】(1)EcoR I、Hind Ⅲ (2) CaCl2 卡那霉素 S-F和P-R (3) 启动子 C (4) SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多 高温使蛋白变性 低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持 【解析】（1）目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应插入pET-SOD之后，由图可知，限制酶a和限制酶b分别是EcoR I、Hind Ⅲ。 （2）将目的基因导入细菌时常用CaCl2处理细菌，使其处于容易吸收外来DNA分子的状态。由图可知，重组DNA含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET-SOD-ELP50同时含有pET-SOD和ELP50，结合图示可知，引物S-F和P-R对应序列包含SOD和ELP50的相应序列，可特异性对pET-SOD-ELP50进行扩增。由于ELP50中含有重复序列，使用S-F和E-R对导入普通质粒和重组质粒的大肠杆菌进行PCR扩增，得到的产物可能无法区分。 （3）RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图可知，决定SOD-ELP50融合蛋白的基因长度为462+750=1212bp，编码1212÷3=404个氨基酸，已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11kDa=44.44kDa，电泳后应该为条带C。 （4）（ⅰ）由图可知，20℃时，较不加NaCl，加入NaCl后纯化蛋白数量更多。 （ⅱ）100℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。 （ⅲ）20℃，加入NaCl时，较SOD，SOD-ELP50组沉淀中蛋白质相对含量较高，说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。 素养导向限时测、训练解题思维、提升关键能力 限时：35分钟 1．【信息观】（2021·重庆沙坪坝·一模）2020年的诺贝尔化学奖授予了两位在基因组编辑技术（如CRISPR/Cas）领域作出杰出贡献的女科学家。这项技术的问世源自于人们在本世纪初对细菌抵御噬菌体的机理研究：不少的细菌第一次被特定的噬菌体感染后，由细菌Cas2基因表达的Cas2核酸内切酶（蛋白质）便会随机低效切断入侵的噬菌体DNA双链，并将切下的DNA片段插入CRISPR位点，形成“免疫记忆”。当细菌再次遭遇同种噬菌体时，由CRISPR位点转录产生的crRNA便会将另一种核酸内切酶（如Cas9）准确带到入侵者DNA处，并将之切断，即“免疫杀灭”。过程如图所示。下列说法错误的是（    ） A．细菌体内发生图中的①过程，需要细菌提供场所、模板、原料、能量等 B．图中②过程的机理类似于mRNA与DNA模板链的结合 C．核酸内切酶Cas2和Cas9均作用于DNA双链，但只有前者有序列特异性 D．细菌利用CRISPR/Cas分子装置剿灭入侵噬菌体的过程相当于高等动物的特异性免疫 【答案】C 【解析】A、①表示细菌Cas2基因控制Cas2核酸内切酶（蛋白质）合成的过程，需要细菌提供场所、模板、原料、能量等，A正确； B、②过程表示与Cas9结合的crRNA将Cas9带到入侵者DNA处，此过程依赖于crRNA与入侵者DNA的碱基互补配对，类似于mRNA与DNA模板链的结合，B正确； C、根据题意，“Cas2核酸内切酶（蛋白质）会随机低效切断入侵的噬菌体DNA双链”，故核酸内切酶Cas2没有序列特异性，C错误； D、细菌利用如图所示的CRISPR/Cas分子装置剿灭入侵噬菌体的过程，是后天形成的，相当于高等动物的特异性免疫，D正确。 故选C。 【点睛】 2．【信息观】（2025·河北保定·一模）（多选题）CRISPR-Cas9基因编辑技术指通过向导sgRNA识别目的基因组序列，引导Cas9蛋白对基因进行切割，利用CRISPR-Cas9技术编辑水稻抗病基因的流程如图所示。下列说法正确的是（　　） A．sgRNA可以精准切割目标基因，产生平末端或黏性末端 B．据图推测，向导sgRNA的靶向作用主要由Cas9蛋白决定 C．Cas9蛋白相当于限制酶，能将基因中的磷酸二酯键断开 D．该技术可定向改变水稻的基因序列，为水稻育种提供思路 【答案】CD 【解析】A、题图可知，sgRNA起导向作用，Cas9蛋白可以精准切割目标基因，A错误； BC、sgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割，所以sgRNA可以特异性识别目标DNA分子，Cas9蛋白作用于磷酸二酯键，Cas9蛋白相当于限制酶；向导sgRNA的靶向作用主要由sgRNA决定，B错误，C正确； D、根据题图可知：通过设计向导sgRNA识别序列，可人为选择DNA上的目标位点进行切割，可以对基因进行定向改造，因此该技术可定向改变水稻的基因序列，为水稻育种提供思路，D正确。 故选CD。 3．【信息观】（2026·河南洛阳·模拟预测）细胞核骨架蛋白 LMNA 的基因单一碱基点突变可引发心肌疾病。某研究团队利用CRISPR/dCas9 系统的单碱基编辑技术(不断裂DNA 双链，只改变单个碱基)，通过胞嘧啶碱基编辑器 (C编辑)和腺嘌呤碱基编辑器 (A编辑)分别纠正L35P、R249Q点突变，在对患者心肌细胞及模型小鼠的实验中均获成功。下列叙述错误的是（    ） 注: gRNA 为向导 RNA L35P 点突变修复：LMNA 的35号位由脯氨酸替换亮氨酸的突变 R249Q 点突变修复：LMNA 的249号位由谷氨酰胺替换精氨酸的突变 A．图示中的 dCas9 蛋白不催化磷酸二酯键的断裂 B．经过A 编辑后，LMNA 基因表达的肽链长度发生改变 C．CRISPR/dCas9单碱基编辑技术可应用于治疗基因异常引起的遗传病 D．通过C 编辑修复L35P 点突变,由 G/C 替换成A/T 至少需经过两次 DNA复制 【答案】B 【解析】A、dCas9是失去切割DNA的能力，不催化磷酸二酯键断裂。这是单碱基编辑技术的关键前提——不造成DNA双链断裂，只改变单个碱基，A正确； B、A编辑器作用于腺嘌呤（A→G），R249Q点突变修复是第249位谷氨酰胺（Gln）替换为精氨酸（Arg），并未提前出现终止密码子，因此肽链长度不变，B错误； C、CRISPR/dCas9 系统的单碱基编辑技术(不断裂DNA 双链，只改变单个碱基)，题干已明确说明该技术在患者心肌细胞和小鼠模型中成功修复突变，具有治疗潜力，C正确； D、C编辑器将胞嘧啶（C）脱氨成尿嘧啶（U），U在DNA复制时被识别为T，因此第一次复制后形成U-A配对，第二次复制后才稳定为T-A（即A-T配对），D正确。 故选B。 4．【归纳与概括】（2026·河南郑州·一模）2025年，中国科学家开发了一种新型纳米载体系统（TAT—PLGA），可实现非侵入式胚胎基因编辑。该技术流程如下：收集斑马鱼受精后2小时内的胚胎；将包裹CRISPR/Cas9的TAT—PLGA纳米颗粒注入培养液；胚胎与纳米颗粒共培养，纳米颗粒穿透卵膜递送基因编辑工具；筛选基因编辑成功的胚胎继续发育。研究显示，该技术使斑马鱼胚胎编辑效率达90%，胚胎存活率超80%。下列基于该技术的分析，正确的是（　　） A．选择受精后2小时内的胚胎是因其处于囊胚期，内细胞团的细胞全能性高 B．若将编辑后胚胎移植到受体鱼中，需使受体与供体血型匹配以防排斥 C．该技术可为人类胚胎干细胞研究提供模型，但禁止应用于人类胚胎 D．筛选编辑成功胚胎时，需对内细胞团进行基因检测 【答案】C 【解析】A、斑马鱼受精后2小时内的胚胎处于卵裂早期，尚未发育到囊胚期，不存在内细胞团这一结构，A错误； B、胚胎移植的生理学基础明确，受体对移入的外来胚胎基本不发生免疫排斥反应，无需进行血型匹配，B错误； C、斑马鱼属于常用的模式生物，该编辑技术可作为模型为人类胚胎干细胞相关研究提供参考，但出于生物技术伦理规范，我国明确禁止将基因编辑技术应用于人类生殖性胚胎的改造，C正确； D、首先受精后2小时内的胚胎未分化出内细胞团，其次若对囊胚期胚胎进行基因检测，需取滋养层细胞检测，取用内细胞团会损伤胚胎后续发育，D错误。 5．【演绎与推理】（2026·陕西安康·一模）杨凌农科院利用CRISPR-Cas9编辑小麦TaDREB2基因，获得抗旱新品系。下列叙述错误的是（    ） A．该技术可精准敲除目标基因，避免连锁累 B．抗旱性状若由多基因控制，则效果可能有限 C．编辑后的植株需经多代自交以稳定遗传 D．该变异属于染色体结构变异 【答案】D 【解析】A、CRISPR-Cas9技术通过靶向切割DNA实现基因的精准敲除，可避免传统杂交育种中的连锁累赘现象（即非目标基因连锁遗传），A正确； B、若抗旱性状由多基因控制（数量性状），单一基因编辑可能无法完全调控复杂表型，故效果可能受限，B正确； C、基因编辑后获得的植株为杂合子，需通过多代自交使目标基因纯合化以稳定遗传性状，C正确； D、CRISPR-Cas9编辑的是基因内部碱基序列（如敲除、点突变），属于基因突变范畴；染色体结构变异指染色体片段的缺失、重复、倒位或易位，与基因编辑无关，D错误。 故选D。 6．【归纳与概括】（2026·陕西安康·一模）杨凌农业高新技术产业示范区2024年成功培育抗条锈病小麦新品系“杨麦CR2”。该品系利用CRISPR-Cas9技术敲除感病基因TaMLO1，使其获得广谱持久抗性。田间试验显示：在条锈病高发区，“杨麦CR2”发病率<5%，而对照“西农511”达68%。全基因组测序证实，仅TaMLO1位点发生15bp缺失，无脱靶效应。然而，部分农户反映“杨麦CR2”千粒重略低于对照（42.3 g/45.1 g）。育种团队解释：TaMLO1参与籽粒灌浆调控，敲除后略有减产，但综合抗病收益远超损失。基于上述信息，并结合现代育种原理，下列评价最恰当的是（    ） A．CRISPR编辑属于诱变育种，其变异方向不可控 B．“杨麦CR2”为转基因作物，需严格标识上市 C．该育种实现了目标性状精准改良，符合绿色农业理念 D．千粒重下降说明基因编辑破坏了小麦遗传稳定性 【答案】C 【解析】A、CRISPR编辑属于基因工程育种，通过精准敲除特定基因实现定向变异，变异方向可控，不同于传统诱变育种的随机性，A错误； B、“杨麦CR2”仅敲除小麦自身感病基因（TaMLO1），未导入外源基因，不属于转基因作物，B错误； C、该育种精准敲除感病基因，显著降低发病率（<5% vs 68%），虽千粒重略降（42.3g vs 45.1g），但抗病性提升减少农药使用，符合绿色农业可持续发展理念，C正确； D、千粒重下降是因TaMLO1基因具有多效性（参与籽粒灌浆），属基因编辑的预期效应，全基因组测序证实无脱靶效应，遗传稳定性未破坏，D错误。 故选C。 7．【归纳与概括】（2025·广东汕尾·一模）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，其工作原理如图所示。下列有关说法错误的是（    ） A．Cas9蛋白的作用相当于限制酶 B．复合体中的SgRNA通过碱基互补配对与目标DNA序列特异性结合 C．将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是农杆菌转化法 D．利用CRISPR/Cas9可将目的基因定点插入到受体细胞基因组中 【答案】C 【解析】A、Cas9蛋白可以切割DNA序列，作用相当于限制酶，A正确； B、由图可知复合体中的SgRNA通过碱基互补配对与目标DNA序列特异性结合，B正确； C、将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是转化法，C错误； D、由图可知，利用CRISPR/Cas9可将目的基因定点插入到受体细胞基因组中，D正确。 故选C。 8．【归纳与概括】（2025·浙江嘉兴·一模）通过改造猪的基因组，可培育人类异种器官移植的“心脏供体猪”。流程如下：①从特定品种猪耳部获取成纤维细胞；②利用基因编辑技术改造会引起人体免疫排斥的相关基因；③将基因编辑成功的细胞核移植到去核的猪卵母细胞中，构建重组胚胎；④将重组胚胎移植到代孕母猪体内，获得基因编辑克隆猪。下列叙述错误的是（    ） A．过程①中，酶解猪耳部组织获得的细胞即为成纤维细胞 B．过程②中，基因编辑系统能识别并切割相关基因中的特定序列 C．过程③中，经显微操作去除次级卵母细胞的细胞核 D．过程④中，重组胚胎发育至囊胚时，移植入代孕母猪 【答案】A 【解析】A、酶解猪耳部组织（使用胰蛋白酶等）可分散细胞，但获得的细胞包括成纤维细胞、上皮细胞等多种类型，A错误； B、基因编辑系统（如CRISPR-Cas9）通过向导RNA识别特定DNA序列，并由Cas9酶切割该序列，实现靶向基因改造，B正确； C、核移植过程中，需将供体细胞核移植到去核的卵母细胞中；猪卵母细胞常处于减数第二次分裂中期（MII期，即次级卵母细胞阶段），通过显微操作去除其细胞核是标准步骤，C正确； D、在胚胎工程中，重组胚胎发育至囊胚阶段（具有内细胞团和滋养层细胞）时，移植入代孕母猪子宫，以提高着床成功率，D正确； 故选A。 9．【演绎与推理】（2026·湖南张家界·二模）CRISPR/Cas9基因编辑技术可对目标基因进行定点编辑，下列相关叙述错误的是（　　） A．Cas9蛋白的作用是切割DNA分子，属于限制性内切核酸酶 B．该技术需要根据目标基因的序列设计向导RNA C．基因编辑过程中，细胞可通过DNA修复机制修复断裂的DNA D．该技术可用于治疗人类的单基因遗传病，不会产生任何安全风险 【答案】D 【详解】A、Cas9蛋白可识别切割特定序列的DNA，功能与限制性内切核酸酶一致，A正确； B、向导RNA需要通过碱基互补配对定位目标基因，因此需要根据目标基因的序列设计特异性向导RNA，B正确； C、Cas9切割使DNA断裂后，细胞可通过自身的DNA修复机制修复断裂的DNA，以此完成基因编辑，C正确； D、CRISPR/Cas9技术仍存在脱靶效应等问题，可能引发基因突变、染色体异常等安全风险，并非不会产生任何安全风险，D错误。 10．【创造性思维】（2026·四川德阳·二模）天然橡胶（NR）是全球重要战略资源，但热带橡胶树供给受限。橡胶草可以在温带地区生长，其根部能合成NR。但细胞内的蔗糖会同时用于合成NR和菊粉。基因编辑技术为NR的高效供给提供了全新路径：研究人员利用CRISPR/Cas9技术敲除橡胶草中菊粉合成关键酶基因Tk1-SST和Tk1-FFT，使NR积累量翻倍。 结合材料及所学知识回答下列问题： (1)CRISPR/Cas9系统中，负责特异性识别并结合靶基因的向导分子是_________，该向导分子与靶基因结合区域最多含有_________种核苷酸。 (2)敲除Tk1-SST和Tk1-FFT双基因后，橡胶草NR产量提升的代谢机制为： 敲除Tk1-SST和Tk1-FFT基因 → ______________ → NR积累量显著增加 (3)为验证Tk1-SST基因敲除效果，科研人员提取橡胶草根部细胞DNA，用位于待敲除区域两侧的引物进行PCR扩增，电泳结果如下图所示。已知野生型扩增产物长度为1200bp，敲除成功后产物长度约为400bp。 据图判断，株系3最可能为______（填“纯合敲除”“野生型”或“嵌合体”），依据是_________。若将该株系单独培养几代后，发现400bp条带逐渐增强而1200bp条带逐渐减弱，最可能的原因是_________。 (4)与传统的将外源NR合成酶基因导入橡胶草基因组的技术相比，利用CRISPR/Cas9技术敲除内源菊粉合成基因以增产NR的优势在于_________（答1点即可）。 【答案】(1) sgRNA 8 (2)其编码的酶无法合成，导致菊粉合成途径受阻，原本用于菊粉合成的蔗糖便更多流向天然橡胶的合成路径 (3) 嵌合体 电泳结果同时出现1200bp（野生型）和400bp（敲除型）两种条带 成功敲除的细胞在培养过程中逐渐占据优势（或未敲除的细胞生长缓慢，被逐渐淘汰） (4)仅对橡胶草自身基因进行精准编辑，不引入外源基因，生物安全性更高（或改造后的橡胶草不属于转基因生物，更易通过安全审批；或从源头阻断竞争通路，增产效果更直接高效） 【解析】（1）CRISPR/Cas9系统中，依靠sgRNA（向导RNA）通过碱基互补配对特异性识别结合靶基因；向导RNA的基本单位是4种核糖核苷酸，靶基因基本组成单位是4种脱氧核苷酸，所以结合区域最多含有8种不同的核糖核苷酸。 （2）根据题干信息，橡胶草细胞内的蔗糖同时用于合成NR和菊粉。敲除菊粉合成关键基因后，无法合成菊粉合成关键酶，菊粉合成被阻断，原本用于合成菊粉的蔗糖可转向用于NR合成，因此NR积累量升高。 （3）野生型只含正常基因，仅能扩增出1200bp条带；纯合敲除只含敲除后的基因，仅能扩增出400bp条带；株系3同时出现两种条带，说明同一个体中同时存在未敲除和敲除成功的细胞，符合嵌合体的特点；成功敲除的细胞在培养过程中逐渐占据优势（或未敲除的细胞生长缓慢，被逐渐淘汰），因此嵌合体培养多代后，400bp条带逐渐增强、1200bp条带逐渐减弱。 （4）导入外源基因的技术需要将外源DNA插入橡胶草基因组，可能引发生物安全问题、或插入位置干扰其他基因功能，而本方法是敲除自身内源基因，不需要引入外源基因，安全性更高，性状更稳定。（或改造后的橡胶草不属于转基因生物，更易通过安全审批；或从源头阻断竞争通路，增产效果更直接高效） 11．【分析结果与得出结论】（2026·四川宜宾·二模）传统的CRISPR/Cas9系统原理如图1、2所示，科学家通过突变得到一个没有核酸酶活性的Cas9蛋白，使其失去切割DNA的功能，但与sgRNA结合等功能不变，这样的Cas9称之为dCas9，目前CRISPR/dCas9系统常用于基因组转录调控。研究者设计了一套CRISPR/dCas9系统Y，将其导入某大肠杆菌菌株中，可以实现对多个基因的同步激活与抑制，以提高该菌抗肿瘤化合物Z的产量。 (1)系统Y中可以含有多种序列不同的sgRNA，sgRNA依据_________原则与目标序列特异性结合，引导dCas9结合到DNA上。 (2)图2是sgRNA构建过程示意图，过程甲对特征序列和重复序列扩增需在不同的PCR体系中进行，原因是_________________。最早在经历_________个循环后出现产物A．过程乙可分两个环节，第一个环节，过程甲的产物A、B在高温下解旋形成单链，复性后延伸，得到重组DNA片段，该环节_________（填“需要”或“不需要”）引物，原因是______。 (3)研究者检测了系统Y对基因的激活效果，当sgRNA靶向结合R基因的上游区域时，Z产量提升约2.9倍。系统Y中dCas9蛋白和转录激活因子P蛋白相连，sgRNA可以与dCas9自动组装到一起。推测当sgRNA与R基因的上游区域结合，P蛋白可募集_________酶启动R基因转录，有利于Z的合成。 (4)研究者检测了系统Y对基因的抑制效果，设计了能靶向结合F基因（与细胞分裂相关）不同区域Q1和Q2的sgRNA1、sgRNA2，分别转入不同的大肠杆菌中，细胞数量相对值如图3. 实验表明：____________。 【答案】(1)碱基互补配对 (2) R1和F2部分序列互补，会导致PCR失败 3 不需要 此时两条DNA的同源部分即可作为其延伸的引物 (3)RNA聚合 (4)系统Y能抑制基因表达（两种靶向结合区域均能抑制基因表达）；靶向Q1时效果更好；P蛋白不影响系统Y的抑制功能 【解析】（1）系统Y中可以含有多种序列不同的sgRNA，sgRNA依据碱基互补配对原则与目标序列特异性结合，引导dCas结合到DNA 上。 （2）由图2可知，R1和F2部分序列互补，会导致PCR失败，故甲对特征序列和重复序列扩增需在不同的PCR体系中进行。PCR中，第1个循环形成2条DNA链，第2个循环形成4条DNA链，第3个循环才能得到与目标序列长度一致的产物，所以经历3个循环后出现产物A。过程乙可分两个环节，第一个环节，过程甲的产物A、B在高温下解旋形成单链，复性后延伸，得到重组DNA片段，不需要引物，是因为产物A和B的单链之间存在互补序列，复性时可以互补结合，延伸时DNA聚合酶可以以此为模板进行延伸。 （3）P蛋白是转录激活因子，可募集RNA聚合酶启动R基因转录，从而有利于Z的合成。 （4）对照组不含sgRNA（无靶向结合），细胞数量相对值为1；实验组转入sgRNA1或sgRNA2，均含dCas9，部分组含P蛋白。 结果分析：与对照组相比，靶向Q1和Q2的实验组细胞数量均低于1，说明dCas9结合到F基因（细胞分裂相关基因）后，抑制了F基因的表达。靶向Q1的实验组细胞数量比靶向Q2的更低，说明靶向F基因的Q1区域时，抑制效果更显著，含P蛋白与不含P蛋白的组细胞数量无明显差异，说明P蛋白不影响系统Y的抑制功能。 12．【表达与交流】（2026·吉林长春·一模）斜纹夜蛾是危害大豆的主要害虫，该害虫体内的几丁质酶基因（Cht）表达产物能帮助其降解植物细胞壁，从而利于幼虫取食。某科研团队计划通过基因工程结合基因编辑技术，培育一种具有特定抗虫能力的大豆新品种，设计思路如下： ①将Cht基因的启动子（负责响应害虫取食信号）与一种毒蛋白基因（Tox）连接，构建重组载体，并导入大豆细胞。当斜纹夜蛾取食造成植物损伤时，伤口部位分泌的茉莉酸（一种植物信号分子）能诱导该启动子驱动Tox基因表达，产生毒蛋白杀死害虫。 ②利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，敲除或修饰大豆自身的JAZ基因（该基因能抑制茉莉酸信号通路），以增强植株对茉莉酸信号的感知和响应效率，从而提升抗虫效果。 回答下列问题： (1)基因工程的核心步骤是_____。该步骤中，需用_______酶识别并分别切割Cht基因的启动子和Tox基因，使二者产生相同的黏性末端，再用_______酶连接形成融合基因。 (2)茉莉酸诱导Tox基因表达的机制是：茉莉酸与大豆细胞内的受体蛋白结合形成复合物，该复合物与________基因启动子上游的特定响应元件结合，进而启动Tox基因的转录。该设计的优点是____，从而减少对大豆自身代谢的消耗，并降低对非靶标生物的影响。 (3)若要检测Tox基因是否能在茉莉酸诱导下成功表达，可采用________技术检测大豆细胞中是否存在Tox毒蛋白。 (4)利用CRISPR/Cas9编辑JAZ基因后，大豆的抗虫效果显著提升，原因是_______。 (5)与直接喷洒化学杀虫剂相比，该基因工程结合基因编辑的抗虫技术的优势是_______。 【答案】(1) 基因表达载体的构建 相同的限制（同尾） DNA连接 (2) Cht 仅在害虫取食诱导茉莉酸产生时启动毒蛋白表达 (3)抗原-抗体杂交 (4)JAZ基因是茉莉酸信号通路的抑制基因，CRISPR/Cas9编辑后JAZ基因功能丧失，茉莉酸信号通路不再被抑制，其诱导Tox基因表达的效率大幅提升，毒蛋白合成量增加，从而增强抗虫效果 (5)减少化学杀虫剂使用，降低环境污染及农产品农药残留 【解析】（1）基因工程的基本操作程序包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测和鉴定，其中基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。该步骤中，需用相同的限制（同尾）识别并分别切割Cht基因的启动子和Tox基因，使二者产生相同的黏性末端，再用DNA连接酶连接形成融合基因。 （2）由题干信息可知：将Cht基因的启动子（负责响应害虫取食信号）与一种毒蛋白基因（Tox）连接，构建重组载体，并导入大豆细胞。当斜纹夜蛾取食造成植物损伤时，伤口部位分泌的茉莉酸（一种植物信号分子）能诱导该启动子驱动Tox基因表达，产生毒蛋白杀死害虫。已知茉莉酸是一种植物信号分子，诱导Tox基因表达的机制是：茉莉酸与大豆细胞内的受体蛋白结合形成复合物，该复合物与Cht基因启动子上游的特定响应元件结合，进而启动Tox基因的转录，翻译出毒蛋白杀死害虫。该设计用到Cht基因的启动子，该启动子能负责响应害虫取食信号，故优点是仅在害虫取食诱导茉莉酸产生时启动毒蛋白表达，从而减少对大豆自身代谢的消耗，并降低对非靶标生物的影响。 （3）若要检测Tox基因是否能在茉莉酸诱导下成功表达出Tox毒蛋白，可利用抗原与抗体特异性结合的原理，采用抗原-抗体杂交技术检测大豆细胞中是否存在Tox毒蛋白。 （4）由题干信息可知，JAZ基因能抑制茉莉酸信号通路，利用CRISPR/Cas9编辑技术敲除或修饰大豆自身的JAZ基因后，JAZ基因功能丧失，茉莉酸信号通路不再被抑制，其诱导Tox基因表达的效率大幅提升，毒蛋白合成量增加，从而增强大豆的抗虫效果。 （5）通过基因工程结合基因编辑技术培育出具有特定抗虫能力的大豆新品种，与直接喷洒化学杀虫剂相比，该基因工程结合基因编辑的抗虫技术的优势是可以减少化学杀虫剂使用，降低环境污染及农产品农药残留。 13．【表达与交流】（2025·四川乐山·一模）乐山是四川重要的茶叶产区，茶园在每年修剪和采摘后会产生大量的茶树枝条等农业废弃物（主要成分为木质纤维素）。传统处理方式通常是焚烧或堆积，这不仅造成空气污染和温室气体排放，也是资源的巨大浪费。某研究团队从乐山峨眉山原始森林的腐殖土中，分离到一株高效降解木质纤维素的真菌——疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria）。该真菌的W基因簇（基因簇是指基因组中紧密排列、功能相关或结构相似的一组基因，通常协同发挥作用，常见于真核生物中）能表达出一种强大的复合纤维素酶系，包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，可以将纤维素高效分解为葡萄糖。现在，为将其应用于茶园的秸秆处理，研究人员计划利用转基因技术改造出生产该酶的大肠杆菌工程菌，相关限制酶的识别序列如表。请回答下列问题： 限制酶 XbaⅠ EcoRⅠ SpeⅠ XhoⅠ HindⅢ 识别序列（5′→3′） T↓CTAGA G↓AATTC A↓CTAGT C↓TCGAG A↓AGCTT (1)传统的获取大量酶的生产方法是进行真菌发酵。但这种方法周期较长，且容易受到杂菌污染。为了更高效、可控地生产，现代生物技术倾向于采用_______工程的方法。其基本操作流程是：从疣孢漆斑菌细胞中提取总RNA，通过______过程获得其纤维素酶基因，然后将其导入到一个生长迅速、蛋白分泌能力强的受体细胞（如大肠杆菌）中，让受体菌成为“细胞工厂”来大量生产该酶。 (2)图1标识了载体pBL和W基因簇中限制酶的切割位点（1kb=1000bp，假设构建重组质粒前后，质粒pBL对应部分大小基本不变）。已知a链为W基因簇中的转录模板链，结合上表分析，为保证W基因簇与质粒pBL正确连接，PCR扩增W基因簇时需在引物1和引物2的5′端分别添加的碱基序列5′-______-3′、5′-______-3′。切割载体时应选用的限制酶是______。 (3)图1载体pBL中的色氨酸合成酶基因的作用是______，将重组质粒导入色氨酸合成缺陷的大肠杆菌菌株，利用______的培养基筛选菌株并提取质粒，用引物1和引物2进行PCR扩增，相关产物电泳图见图2.已知1号泳道和2号泳道分别是重组质粒和空载质粒的电泳图（均用EcoRⅠ酶切成线性），在3号、4号的PCR扩增产物中，符合预期的W基因簇的DNA片段是______号，若要进一步验证可对其进行______。空白对照组5中使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是______。 【答案】(1) 基因 逆转录 (2) CTCGAG TCTAGA SpeⅠ和XhoⅠ (3) 作为标记基因，筛选含有重组质粒的大肠杆菌 不含色氨酸 3 DNA测序 检测PCR反应中是否有外源DNA的污染 【解析】（1）传统的获取大量酶的生产方法是进行真菌发酵。但这种方法周期较长，且容易受到杂菌污染。为了更高效、可控地生产酶，现代生物技术倾向于采用基因工程的方法。从疣孢漆斑菌细胞中提取总RNA，通过逆转录过程获得其纤维素酶基因。因为逆转录是以RNA为模板合成DNA的过程，这样可以从真菌的RNA得到对应的基因。然后将其导入到一个生长迅速、蛋白分泌能力强的受体细胞（如大肠杆菌）中，让受体菌成为“细胞工厂”来大量生产该酶。 （2）为了使目的基因能在受体细胞中表达，应该将目的基因插在启动子和终止子之间，载体pBL启动子和终止子之间有限制酶有SpeⅠ、XhoⅠ、HindⅢ，但载体pBL的启动子和终止子之外还有另外的HindⅢ识别位点，因此切割载体时应选用的限制酶是SpeⅠ、XhoⅠ，要想W基因簇与质粒pBL正确连接，目的基因也应该用这两种限制酶切割，两端应该有SpeⅠ、XhoⅠ识别序列，但图中显示目的基因中有SpeⅠ识别序列，不能用该酶切割目的基因，从表格中各酶的识别序列可知，XbaⅠ和SpeⅠ是同尾酶，因此目的基因两端需要添加XbaⅠ和XhoⅠ的识别序列，已知a链为W基因簇转录模板链，转录方向是从模板链3′→5'，因此为保证目的基因能在受体细胞表达，引物2端应该与启动子相连，引物1端应该与终止子相连，即PCR扩增W基因簇时需在引物1和引物2的5′端分别添加XhoⅠ、XbaⅠ识别序列5′-CTCGAG-3′、5′-TCTAGA-3′，切割载体时应选用的限制酶是SpeⅠ、XhoⅠ。 （3）图1载体pBL中的色氨酸合成酶基因属于标记基因，有利于目的基因的初步检测。所以，图1载体pBL中的色氨酸合成酶基因的作用是作为标记基因，筛选含有重组质粒的大肠杆菌。由于受体大肠杆菌是色氨酸合成缺陷型，只有导入含该基因的质粒（空载或重组），才能在无外源色氨酸的培养基上存活，因此可利用不含色氨酸的培养基筛选菌株并提取质粒。已知1号泳道和2号泳道分别是重组质粒和空载质粒的电泳图，长度分别是3000bp左右、2000bp左右，因此目的基因（W）的长度大约是1000bp，图中3号泳道上DNA片段长度是1000bp左右，因此符合预期的W基因簇的DNA片段是3号。进一步验证：PCR产物的大小仅为初步判断，需通过DNA 测序确认其序列与W基因簇完全一致，排除非特异性扩增产物。空白对照组用无菌水代替模板DNA，检验PCR反应中是否有外源DNA的污染，若出现扩增产物，说明试剂或操作中存在外源DNA污染；若无产物，证明实验体系无污染，确保实验组结果的可靠性。 14．【表达与交流】（2024·浙江宁波·二模）回答与生物技术有关的下列两小题： Ⅰ.甘蓝型油菜引入我国历史较短，其遗传基础狭隘。菘蓝（别名“板蓝根”）是传统中药材，具有广谱抗病毒特性。研究人员利用甘蓝型油菜（体细胞中染色体数为38）与菘蓝（体细胞中染色体数为14）进行体细胞杂交，培育抗病毒的甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系，过程如图1。 (1)甘蓝型油菜与菘蓝的体细胞经__________酶处理后获得原生质体，再经__________诱导获得融合细胞。融合细胞接种到含有营养物质和__________的培养基上，经__________过程形成愈伤组织，发育形成完整的再生植株F1。植物体细胞杂交技术依据的生物学原理有：__________。（至少答出两个） (2)将F1与甘蓝型油菜回交，获得BC1，其染色体组成为__________（只用字母表示）。用BC1与甘蓝型油菜再一次回交，得到的BC2植株群体的染色体数目范围是_______。 (3)研究人员从BC2筛选出7种只含有1条菘蓝染色体的甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系（A、B、C、D、E、F、G）。为探究甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系在抗新冠病毒（SARS-CoV-2）中的作用，研究人员用其提取物处理动物细胞，24h后感染新冠病毒，一段时间后收集病毒细胞培养液，检测病毒的含量，结果如图2。 ①作为标准参考的GADPH蛋白表达量__________，可排除无关变量对实验结果的影响。 ②结果表明：__________。 ③尝试说出建立甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系在育种方面的意义：__________。（答出两个方面） Ⅱ.母源因子是初级卵母细胞在减数分裂Ⅰ前期的后段开始产生并积累的mRNA和蛋白质，其对于调控动物早期胚胎的发育十分重要。为研究不同母源因子的功能，相应母源突变体的培育显得尤为重要。 (4)母源因子由母源效应基因通过基因__________过程产生，其产生并积累的时期由于同源染色体未分离，因此只有纯合突变的雌性个体的后代才是母源突变体。 (5)获得母源突变体的传统方法是反复交配与筛选。以母源效应基因A为例，科学家利用基因编辑技术将斑马鱼的一个A基因敲除后获得杂合子，记作（+/-）。如图1是获得母源突变体的杂交方案，请补全下图__________。 (6)传统交配筛选的方法存在耗时长、纯合的合子突变体的致死率高等缺陷。为了解决上述问题，科学家在CRISPR/Cas9基因编辑系统的基础上进行了改进。 ①sgRNA编码序列能与相应靶基因序列发生碱基互补配对。为构建含有sgRNA编码序列的重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA用__________处理，然后将其插入到经相同酶处理过的质粒上。斑马鱼的卵母细胞与精子受精前停滞在减数分裂Ⅰ前期，此时还未开始合成母源因子，在此阶段前对卵母细胞进行基因敲除可避免母源因子的积累。 ②为了实现卵母细胞中基因的特异性敲除，如图2所示，科学家将含有3个不同的但靶向相同基因的sgRNA编码基因的重组质粒组装到具有特殊元件的载体上，形成新的重组质粒后导入卵母细胞。 注：eflap—能够驱动基因广泛表达的启动子；EGFP—增强型绿色荧光蛋白基因；I-SecI一归位内切酶，可将质粒随机插入到斑马鱼的基因组中。 从理论上分析，一个sgRNA便能实现靶基因的敲除，请分析3个sgRNA串联有何优势，请答出2点__________。 (7)I-SecI介导的基因插入率并不能达到100%，请根据上述研究分析如何在斑马鱼早期胚胎中筛选出突变体，并说明理由_____。 【答案】(1) 纤维素（果胶） PEG 植物激素（生长素和细胞分裂素） 脱分化 细胞膜的流动性、植物细胞的全能性 (2) PPQQR 38-45 (3) 一致 甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系G能有效抑制新冠病毒 拓宽了甘蓝型油菜的遗传基础，为抗病甘蓝型油菜的研究奠定基础；可作为育种中间桥梁材料，将优良性状转移至近缘种。 (4)转录、翻译/表达 (5) (6) 限制酶 提高sgRNA的表达（转录）效率；提高目的基因的识别准确性 (7)重组质粒中含有荧光标记基因，若将重组质粒导入受体细胞，则可通过观察是否发出绿色荧光进行筛选 【解析】（1）植物细胞壁的成分为纤维素和果胶，甘蓝型油菜与菘蓝的体细胞经纤维素酶和果胶酶处理后获得原生质体，用物理法（离心、振动、电刺激）或者化学法（聚乙二醇PEG）诱导细胞融合，获得融合的原生质体。融合细胞接种到含有营养物质和植物激素（生长素和细胞分裂素）的培养基上，经过脱分化形成愈伤组织，再经过再分化发育形成完整的再生植株F1。植物体细胞杂交过程中，细胞融合过程利用了细胞膜具有流动性的特点，植物组织培养过程利用了植物细胞的全能性。 （2）甘蓝型油菜（PPQQ）与菘蓝（RR）进行体细胞杂交，F1的染色体组成为PPQQRR，将F1与甘蓝型油菜（PPQQ）回交，F1能产生配子为PQR，甘蓝型油菜（PPQQ）能产生配子为PQ，BC1的染色体组成为PPQQR，用BC1（PPQQR）与甘蓝型油菜（PPQQ）再一次回交，得到的BC2植株群体的染色体组成为PPQQ~PPQQ+R，甘蓝型油菜（PPQQ）的体细胞中染色体数为38，菘蓝（RR）体细胞中染色体数为14，R的染色体数为7，因此BC2植株群体的染色体组成为38~38+7，即为38-45。 （3）①为排除无关变量为实验的干扰，作为标准参考的GADPH蛋白表达量一致。 ②由图2可知，与对照组和A、B、C、D、E、F组（实验组）相比，甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系G中病毒的含量较低，且与菘蓝组类似，这说明甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系G能有效抑制新冠病毒。 ③建立甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系，拓宽了甘蓝型油菜的遗传基础，为抗病甘蓝型油菜的研究奠定基础；可作为育种中间桥梁材料，将优良性状转移至近缘种。 （4）母源因子是mRNA和蛋白质，需要基因的转录和翻译产生。 （5）A组杂交组合，Aa×Aa，则后代基因型为AA：Aa：aa=1：2：1，只有纯合突变的雌性个体的后代才是母源突变体，则合子突变体①为-/-，B组杂交组合，母源突变体基因型为-/-，则图示如下： （6）①需要用限制酶对sgRNA编码序列的DNA和质粒酶切处理才能进行连接形成重组质粒。 ②eflap—能够驱动基因广泛表达的启动子；EGFP—增强型绿色荧光蛋白基因；I-SecI—归位内切酶，可将质粒随机插入到斑马鱼的基因组中。则从理论上分析，可提高sgRNA的表达（转录）效率，提高目的基因的识别准确性。 （7）由于I-SecI介导的基因插入率并不能达到100%，则可通过标记基因进行筛选，由于重组质粒中含有荧光标记基因，则若将重组质粒导入受体细胞，则可通过观察是否发出绿色荧光进行筛选。 15．【分析结果与得出结论】（2025·湖南·一模）斑马鱼是研究心脏器官发育和相关疾病发病机制的重要模式生物。 (1)我国科学家对北京本地的斑马鱼品系进行研究，发现了一个心脏畸形突变体甲，杂交结果如图1，这一对相对性状的遗传遵循孟德尔的_______定律。 (2)为确定突变基因的位置，研究者根据斑马鱼染色体上特定基因的序列长度差异（如D/d、E/e等）设计引物，分别提取上述F1中的野生型（WT）和心脏畸形（Mu）的DNA进行PCR，结果如图2.突变基因最可能与等位基因_____在一对同源染色体上，依据是_________。基因测序推测该突变基因可能是kc10，将kc10突变体和突变体甲杂交，若子代______，则进一步证明kc10是该突变体的突变基因。 (3)科学家发现kc10和tb5的突变体心脏畸形类似。tb5是启动心脏发育相关基因转录的关键转录因子，其活性过低或过高都会导致心脏发育畸形。为了研究kcl0和tb5的关系，将tb5的DNA结合序列和荧光素酶基因连接到一个质粒上并稳定转入细胞中（图3a），同时给予细胞相同浓度tb5蛋白和不同浓度的kc10蛋白处理，结果如图3b所示，结果表明______。 【答案】(1)分离 (2) G/g 野生型组含G、g基因，心脏畸形组只含有G基因，说明突变基因和G连锁 全为突变体 (3)kc10部分抑制tb5的转录活性 【解析】（1）由图1可知，野生型：突变体≈3：1，该性状符合孟德尔分离定律。 （2）分析图2，G/g 等位基因在野生型（WT）和心脏畸形（Mu）中仅野生型有G条带，突变型仅有g条带，说明突变基因与 G/g 连锁。若 kc10突变体与突变体甲杂交，子代全部表现为 心脏畸形，说明两者为 隐性纯合突变（基因型均为 kc10/kc10），即 kc10是突变基因。 （3）根据图3结果，kc10含量增加，荧光素酶相对活性减弱，但没有降到0，说明kc10部分抑制tb5的转录活性。 / 学科网（北京）股份有限公司 $