3.2基因工程的基本操作程序课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第2节 基因工程的基本操作程序 第2章 细胞工程 苏云金杆菌 与载体拼接 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 提取 导入 抗虫基因 （Bt抗虫蛋白基因） 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的 检测与鉴定 (含抗虫基因） （含有并表达抗虫基因） 植物组培 第一步：目的基因的筛选与获取 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。 苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白(Bt抗虫蛋白)，破坏鳞目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家通过实验，将该细菌的“杀虫基因”转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。这个“杀虫基因”就是培育转基因抗虫棉用到的目的基因--Bt抗虫蛋白基因，简称Bt基因。 1、什么是目的基因？ Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。 【思考2】抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？ 【思考1】Bt基因的杀虫机理是怎样的？ 当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。 资料：在培育转基因抗虫棉之前，利用苏云金杆菌制成的杀虫剂已经广泛用于棉害防治，这与苏云金杆菌体内的Bt基因有关，科学家不仅掌握了Bt基因的序列，而且也对其表达产物Bt抗虫蛋白有了深入了解，因此，Bt基因是转基因抗虫棉合适的目的基因。 已知结构 功能清晰 从相关的______ __和____ _____的基因中进行筛选。 1.筛选目的基因 测序技术 序列数据库 序列比对工具 DNA测序仪 核苷酸序列比对 氨基酸序列比对 随着测序技术的发展，以及序列数据库（如GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这也为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。 生物材料 人工合成 获取目的基因 DNA cDNA 一定大小范围的DNA PCR mRNA 基因组文库 cDNA文库 基因文库 包括 限制酶 酶切 逆转录 导入受体菌中保存 基因比较小，核苷酸序列又已知 DNA合成仪 2.获取目的基因的方法 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 常用 ①基因组文库 受体菌 该受体菌群为基因组文库 ②cDNA文库 如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 产生的多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的 。 逆转录 cDNA文库 逆转录 先对目的基因进行扩增 获取一个Bt基因之后，是否就该立即开始准备转基因操作？ 抗虫基因 快速获得大量抗虫基因 苏云金杆菌 提取 PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。 PCR是__________________的缩写，是一项根据___________________的原理，在_______提供参与DNA复制的__________与____________，对_______________________进行___________的技术； PCR技术： 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外 各种组分 反应条件 目的基因的核苷酸序列 大量复制 全称 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外（PCR扩增仪/PCR仪） 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 可以在短时间内大量扩增目的基因 原理 操作环境 目的 优点： 结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？ 要点回顾：体内DNA复制 模板： 原料： 能量： 酶： DNA的两条母链 4种游离的脱氧核苷酸 解旋酶、DNA聚合酶 ③复制特点: ①边解旋边复制 ②半保留复制 碱基互补配对原则 （保证复制的准确进行） ①条件 ④复制原则: 子链的延伸方向： 5'端→3'端 原因：DNA聚合酶只能从5'端向3'端延伸子链。只能将游离的单个脱氧核苷酸连接到已有片段的3’端。 ②延伸方向 ATP 参与的组分 在DNA复制中的作用 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成DNA子链的原料 催化合成DNA子链 与模板链结合，使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 体内DNA复制所需的基本条件 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 体外复制怎么改进？ 参与的组分 在DNA复制中的作用 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成DNA子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 体内DNA复制所需的基本条件 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 体外用高温代替（90℃以上） 体外需用耐高温的DNA聚合酶（Taq酶） 引物： (1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。 (2)引物为DNA聚合酶提供游离的3′端，使DNA聚合酶从3′端延伸子链。 （DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能） -3′ 5′- 3′- -5′ 子链延伸 -5′ 3′- 5′- -3′ 子链延伸 (3)由于DNA两条链是反向平行的，序列不同，所以需2种引物。 （引物的5′端与模板链3′端互补配对） 2种引物之间无关系， 序列不同，不互补 四种脱氧核苷酸(实际上是4种dNTP) 微量离心管 缓冲液 PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行。真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg 2+ 激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg 2+ 。 DNA模板 引物 分别与两条模板链结合的2种引物 耐高温的DNA聚合酶 （Taq酶） dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量 PCR反应所需： dNTP是脱氧核苷三磷酸的缩写，N是指A、T、G、C四种含氮碱基，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP， dATP与ATP在结构上有什么区别？dATP为什么能用作DNA复制的底物？ 如图所示，ATP结构中的五碳糖为核糖，而dATP结构中的五碳糖为脱氧核糖。 ATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤核糖核苷酸，所以ATP是转录的底物；同理，dATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，所以dATP可以用作DNA复制的底物。 PCR扩增过程 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 4种脱氧核苷酸（dNTP） 引物 待扩增的DNA片段（模板） 5’ 5’ 变性 复性 延伸 温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。 当温度超过______以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。 (1)变性： 氢键 单链DNA 变性 90℃ 待扩增的DNA片段 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 不需要解旋酶 思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？ 因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。 变性 复性 延伸 3’ 5’ 3’ 5’ 引物1 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ 思考：为什么需要引物？ 引物结合在模板链的什么位置？ ①因为Taq酶不能从头开始添加核苷酸。 ②引物结合在DNA模板链 3'端位置，引导子链从 5'端→3'端方向复制。（延伸到模板链末端） 当温度下降 到左右时， 种引物通过 与两条单链DNA结合。 (2)复性： 碱基互补配对 50℃ 两 便于引物与互补DNA链结合 ①每种引物内部不能发生局部碱基互补配对，否则会导致自身折叠 ②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对，否则会导致引物自连 ③引物长度不宜过短，防止引物随机结合 引物的要求： 变性 复性 延伸 当温度上升到______左右时，溶液中的4种_____________在耐高温的______________ __________的作用下，根据_____________原则合成新的DNA链。 脱氧核苷酸 DNA聚合酶 72℃ (3)延伸： (Taq酶) 3’ 5’ 3’ 5’ 引物1 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ Taq酶 3’ Taq酶 3’ 思考2：为什么温度要上升至72℃？ 72℃是Taq酶的最适温度 碱基互补配对 思考1：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？ Taq酶结合在引物的3’端 变性 复性 延伸 第二轮循环的产物 第三轮的产物 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 第一轮循环的产物 3’ 5’ 3’ 5’ 由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。 即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。 PCR扩增过程 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 1.利用PCR技术扩增目的基因，在第几次循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段（即出现完整的目的基因）？ [思考讨论] 2.利用PCR技术扩增目的基因设计引物时需要知道目的基因的全部核苷酸序列吗？ 只需要根据目的基因两端的部分核苷酸序列设计引物（无需知道全部序列） 前提：模板DNA的起始数量为1，且引物与DNA分子的中间部位结合时 ①子代DNA分子数：______个 ②子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：__个 ③子代DNA分子中含引物的DNA分子数为：___个 ④同时含两条引物的DNA分子数：______个 ⑤子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为： 个 2n 2n - 2 2n-1 2 2n 前提：模板DNA的起始数量为1，且引物与DNA分子的中间部位结合时 ⑥子代DNA分子中不等长链DNA分子数为：__个 ⑦子代DNA分子中等长链DNA分子数为： 个 ⑧复制过程中共需引物________个 ⑨第n次复制需要引物______个 2n-2n 2n 2n＋1 - 2 2n 2n - 1对 短链-短链DNA 长链-中长链DNA：2个 中长链-短链DNA：2n-2个 PCR不能直接扩增RNA，应先将RNA逆转录为cDNA后进行PCR扩增。 （逆转录PCR，简称RT-PCR ）。 [P79旁栏思考]用PCR可以扩增mRNA吗？ ①逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子； ②核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA； ③以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA。 体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分 反应还需要其它条件： 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 （通常为小的单链RNA） 无需解旋酶，用高温代替 DNA（目的基因）模板 4种脱氧核苷酸(dNTP) 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 引物（通常与两条模板链结合的2种短的单链DNA） 如缓冲液（一般添加Mg2+）、和控温设备 ★总结PCR的进行需要的条件： dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP） 打开DNA双链，破坏氢键 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 功能：①提供原料；②提供能量 PCR扩增产物的鉴定： 常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。 较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。 第二步：基因表达载体的构建 （一）构建基因表达载体的目的 标记基因 便于重组DNA分子的鉴定和选择 复制原点 目的基因插入位点 （多个酶切位点） ①让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代； ②使目的基因能够表达和发挥作用。 与RNA聚合酶结合位点 RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA 启动子 终止子 本质： 作用： 一段有特殊序列结构的DNA片段； 一段有特殊序列结构的DNA片段； 终止转录 本质： 作用： 基因的结构 启动子 终止子 非编码区 非编码区 编码区 能编码特定的蛋白质 编码区上游 编码区下游 （二）基因表达载体的构成 ①启动子 ②终止子： 基因的下游，能终止转录 基因的上游，RNA聚合酶识别和结合的部位； 驱动基因转录出mRNA 目的基因 氨苄青霉素抗性基因 复制原点 目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。 启动子和终止子之间的部位 诱导型启动子 诱导物 作用 激活或抑制 目的基因表达 诱导型启动子： （三）基因表达载体的构建过程 两个黏性末端 （/平末端） 质粒（载体） DNA分子（含目的基因） 获得目的基因，带有 两个黏性末端 （/平末端） DNA 连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同种 限制酶 （或产生相同末端的限制酶） 载体 目的基因 自连 片段间的连接 目的基因自连 质粒自连 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 正向连接 反向连接 1 1’ 2 2’ 1 2 2’ 1’ 2 2’ 1’ 1 讨论：用同一种限制酶切割目的基因和质粒，用DNA连接酶连接后得到哪些分子？ 1.载体、目的基因的自身环化 2.目的基因和载体反向连接 弊端 分析1：限制酶的选择 选择原则：★ （1）不破坏目的基因； （2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点； （3）确保表达载体和目的基因出现相同黏性末端； （4）避免目的基因和质粒自身环化和反向连接 可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶切割目的基因和质粒。 方法：利用2种标记基因筛选 分析2：如何筛选出含目的基因的质粒（空质粒/含目的基因的质粒） ①将转化后的细菌放在含氨苄青霉素培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌、含空质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落； ②再利用灭菌的绒布影印到含四环素培养基上，不生长的即为含目的基因的菌落，如图1、5。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 方法：利用2种标记基因筛选 分析2：如何筛选出含目的基因的质粒（空质粒/含目的基因的质粒） 第三步：将目的基因导入受体细胞 1.导入方法 受体细胞类型 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 农杆菌转化法 花粉管通道法 （我国科学家独创） （常用） 显微注射法 Ca2+处理法 植物细胞 植物细胞：花粉管通道法 方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA 溶液直接注入子房中 含目的基因的DNA 溶液 （我国科学家独创） 植物细胞 方法二：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 植物细胞：花粉管通道法 （我国科学家独创） 植物细胞 植物细胞：农杆菌转化法 转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。 农杆菌 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 Ti质粒 T—DNA 农杆菌细胞内含有______，当它侵染植物细胞后，能将_______上的_______（______________）转移到被侵染的细胞，并且将其________________________________ Ti质粒 Ti质粒 T-DNA 可转移的DNA 整合到该细胞的染色体DNA上 裸子植物：种子裸露，无果实 被子植物：种子有果皮包被，会开花结果，包括双子叶植物、单子叶植物 表现出新性状的植株 植物组织培养 第一次导入 第二次导入 第一次拼接 第二次拼接 将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-DNA上。 (非人工操作)是指含目的基因的 T-DNA 被拼接到受体细胞的染色体DNA上。 (非人工操作)含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞。 将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。 Ti质粒 T—DNA 目的基因 构建基因表达载体 重组 Ti质粒 转入农杆菌 导入植物细胞 （如：叶片、花序等） 植物细胞：农杆菌转化法 方法一：将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。 方法二：将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。 农杆菌转化的具体方法： 体细胞 受精卵 受体细胞为？ 受体细胞为？ 植物细胞：农杆菌转化法 很多植物不是只开一朵花，而是很多小花按一定规律长在一起，这一整簇的结构就叫花序。 动物细胞：显微注射技术 方法: 显微注射技术 操作程序: 取受精卵 显微注射 早期胚胎培养 胚胎移植 新性状动物 思考：为什么常选用动物受精卵作为受体细胞呢？ ①体积大，易操作。 ②全能性高，易培养成完整个体。 微生物细胞：Ca2+处理法 （1）受体细胞： 理由： （2）方法流程： 大肠杆菌 溶于缓冲液中的重组DNA分子 感受态细胞 CaCl2 （易吸收外源DNA分子的状态） 转化（重组DNA分子进入受体细胞） 原核生物（常用大肠杆菌） 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。 Ca2+ 转化法 可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态）。 第四步：目的基因的检测与鉴定 思考：将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？ 即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？ 目的：检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。 你认为可以从哪些方面/水平进行检测？ 即便导入了基因表达载体（目的基因成功导入），但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正确，能否正确表达，因此也需要在转录和翻译以及个体水平上进行检测和鉴定。 Bt 基因 mRNA Bt 蛋白 抗虫棉 PCR等技术检测 抗原-抗体杂交技术 分子水平的检测 抗虫接种实验 个体生物学水平的鉴定 以检测 Bt 基因是否导入棉花体内并表达为例： 1. 分子水平的检测 提取 DNA 转基因棉花 PCR 是否扩增出目的基因 利用 Bt 基因的核苷酸序列设计引物 （1）检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因——PCR技术＋电泳 提取DNA，进行PCR反应 ——检测染色体DNA上是否插入了目的基因 PCR等技术 只含目的基因片段 琼脂糖凝胶电泳 1. 分子水平的检测 提取 DNA 转基因棉花 PCR 是否扩增出目的基因 利用 Bt 基因的核苷酸序列设计引物 M： marker 1-6：转基因棉花 7： 非转基因棉花 8： 阴性对照 电泳 （1）检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因——PCR技术＋电泳 (2)检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR技术＋电泳 琼脂糖凝胶电泳 1. 分子水平的检测 苏云金杆菌 Bt蛋白 注射到小鼠体内 抗体 标记抗体 抗原 杂交 脱分化 （3）检测目的基因是否翻译成蛋白质———抗原—抗体杂交 1. 分子水平的检测 2.个体生物学水平鉴定 方法： 抗虫或抗病接种实验 采摘抗虫棉叶片 饲喂 棉铃虫 观察棉铃虫存活情况 ——检测目的基因是否表现出相应的性状 拓展：分子水平的检测 基因探针：是一段带有检测标记（荧光或同位素标记），且顺序已知的，与目的基因能互补的核酸序列。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转而来的RNA。 变性 变性 杂交DNA分子 （可检测） 探针 受体细胞的DNA DNA分子杂交技术： 碱基互补配对原则 原理？ 检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因/是否转录出mRNA——DNA分子杂交技术 基本思路： 步骤一：制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段（基因探针），并用PCR扩增。 步骤二：提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液。 步骤三：高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。 课堂小结 基因工程的基本操作程序 1.目的基因的筛选和获取-前提 利用PCR获取和扩增 人工合成 2.构建基因表达载体-核心 目的基因、启动子、终止子、标记基因 3.将目的基因导入受体细胞-关键 农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、 感受态细胞转化法(微生物); 4.目的基因的检测与鉴定-保证 分子检测：是否插入、转录、翻译 个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。 P84探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 1. 实验原理 ①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合； PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。 ②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。 （1）PCR的原理 P84探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 ①电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带负电荷，在电场中DNA便向正极泳动。 1. 实验原理 （2）电泳的原理 P84探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 ②鉴定：PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 1. 实验原理 （2）电泳的原理 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 P84探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 ②鉴定：PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 1. 实验原理 （2）电泳的原理 P84探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 ②鉴定：PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 1. 实验原理 （2）电泳的原理 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 P84探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 推动杆 调节旋钮 卸枪头按钮 体积刻度 吸液杆 枪头 2.材料用具 （注意：加不同样品时，需要更换枪头） 微量离心管 P84探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （1pg～1μg） 5～10μL 总体积 50μL PCR反应体系的配方 2.材料用具 P84探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 （1）DNA片段的扩增 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min 3.方法步骤 （2）DNA片段的电泳鉴定 配制琼脂糖溶液 制备凝胶 加样 电泳 观察记录 P84探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 P84探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 4.注意事项 （1）为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 （2）该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 （3）在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 （4）在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 P84探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。 5.结果分析与评价 P84探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 如果扩增不成功，可能的原因有： 漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。 如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有： 引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 (2)你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 5.结果分析与评价 课后习题 1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。 （1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。（ ） （2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。（ ） （3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。（ ） √ × × 课后习题 2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（ ） A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶 B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶 C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸 D 课后习题 二、拓展应用 研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。 外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。 Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v1.0.8 Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.6.37 Lavf58.51.100 $