3.2基因工程的基本操作程序 第1课时课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

该高中生物学课件聚焦基因工程中目的基因的筛选与获取，以培育转基因抗虫棉步骤导入，通过任务单引导学生结合DNA复制知识探究PCR原理、条件及过程，搭建新旧知识衔接的学习支架。 其亮点在于以问题驱动和实验探究为主，通过对比DNA复制与PCR培养科学思维，详细的PCR扩增及电泳实验步骤强化探究实践，课堂小测巩固知识。学生提升科学探究能力，教师获得结构化教学资源。

第3章 第2节 基因工程的基本操作程序 第1课时 学习目标 01 简述目的基因的筛选和获取方法 02 简述PCR的原理、条件及过程 01 从社会中来 培育转基因抗虫棉的四个步骤 与载体拼接 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 （有抗虫特性） 导入 抗虫基因 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的 检测与鉴定 基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？ 过渡 自主学习 任务单（一） 请同学们阅读教材P76-79的内容，思考讨论并回答下列问题： 1.什么是目的基因？举例？ 2.筛选合适目的基因的方法有什么？ 3.总结出PCR的概念、原理、目的、优点、发明者。 4.结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？所需设备是什么？ 5.构建出PCR的大致过程；PCR扩增为什么需要引物？ 6.如何对PCR产物进行鉴定？PCR技术与DNA复制过程有哪些异同？ 02 第一步：目的基因的筛选与获取 目的基因 1.概念: 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。 2.作用: 根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因。 3.实例: 与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。 资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白 （Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统杀死棉铃虫。 培育转基因抗虫棉用到的目的基因 Bt 抗虫蛋白基因 简称 Bt 基因 02 第一步：目的基因的筛选与获取 当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。 ①Bt抗虫蛋白的抗虫原理？ ②抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？ Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响 02 第一步：目的基因的筛选与获取 ——筛选适合的目的基因 DNA测序仪 核苷酸序列比对 氨基酸序列比对 美国国家生物信息中心 (1)明确目的基因的方法： ①从相关已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。 02 第一步：目的基因的筛选与获取 ①通过构建基因文库来获取目的基因 前提： DNA合成仪 基因比较小、核苷酸序列已知 通过DNA合成仪用化学方法直接合成 ③利用PCR特异性地快速扩增目的基因 ②人工合成目的基因 方法： (2)获取目的基因的方法 蛋白质的 氨基酸序列 mRNA的 核苷酸序列 基因的 核苷酸序列 目的基因 推测 推测 化学合成 ——筛选适合的目的基因 02 第一步：目的基因的筛选与获取 ——利用PCR获取和扩增目的基因 PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 PCR的概念： 中文全称 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外（PCR扩增仪/PCR仪） 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 原理 操作环境 目的 PCR扩增仪 02 第一步：目的基因的筛选与获取 02 第一步：目的基因的筛选与获取 ——利用PCR获取和扩增目的基因 3′ 5′ 子链的延伸方向是5 ′→3 ′ DNA聚合酶 3′ 5′ 模板链 子链 DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′端 子链合成需要引物: 引物为DNA聚合酶提供了游离的3 ′端，使DNA聚合酶从3 ′端延伸子链。(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能) 02 第一步：目的基因的筛选与获取 ——利用PCR获取和扩增目的基因 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。 什么是引物 子链延伸 子链延伸 引物是决定PCR特异性的关键。 -5 ′ 3 ′ - 引物1 5 ′ - -3 ′ 5 ′ - -3 ′ 引物2 3 ′ - -5 ′ 02 第一步：目的基因的筛选与获取 ——利用PCR获取和扩增目的基因 耐高温的DNA聚合酶 （Taq酶） DNA模板 引物（2种） 稳定的缓冲溶液 （一般添加Mg2+） 四种脱氧核苷酸(dNTP) 激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶 dATP dGTP dCTP dTTP 02 第一步：目的基因的筛选与获取 ——利用PCR获取和扩增目的基因 dATP 腺嘌呤脱氧核苷酸 dADP 腺苷（A) 腺嘌呤 脱氧核糖 P P P ~ ~ OH H 在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 02 第一步：目的基因的筛选与获取 ——利用PCR获取和扩增目的基因 体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 说明：PCR所用原料实为dNTP，dNTP和ATP类似可以通过基团转移为反应提供能量。 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物（通常为小的单链RNA） 无需解旋酶，用高温代替 DNA母链 4种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 引物（通常为小的单链DNA） 反应还需要其它条件，如缓冲液等 PCR的条件 02 第一步：目的基因的筛选与获取 ——利用PCR获取和扩增目的基因 02 第一步：目的基因的筛选与获取 ——利用PCR获取和扩增目的基因 PCR反应过程： 1）变性： 当温度上升到_______以上时，__ 断裂，双链DNA解聚为两条 。 氢键 单链DNA 待扩增的DNA片段 第一步：变性 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 变性 90℃ 思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？ 因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。 02 第一步：目的基因的筛选与获取 ——利用PCR获取和扩增目的基因 PCR反应过程： 2）复性： 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过 与两条单链DNA结合。 第二步：复性 引物1 引物2 DNA引物 3’ 5’ 3’ 5’ 碱基互补配对 5’ 5’ 思考：什么是引物？为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？ ①引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 ②因为Taq酶不能从0开始添加核苷酸。 ③引物结合在DNA模板链 3'端位置，引导子链从 5'端→3'端方向复制。 3’ 3’ 02 第一步：目的基因的筛选与获取 ——利用PCR获取和扩增目的基因 PCR反应过程： 3）延伸： 当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的___________的作用下，根据__ 合成新的DNA链。 第三步：延伸 引物1 引物2 Taq酶 Taq酶 3’ 5’ 3’ 5’ 脱氧核苷酸 5’ 5’ DNA聚合酶 72℃ 3’ 3’ 3’ 3’ 思考1：为什么温度要上升至72℃？ 思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？ 72℃是Taq酶的最适温度 Taq酶结合在引物的3’端 碱基互补配对原则 02 第一步：目的基因的筛选与获取 ——利用PCR获取和扩增目的基因 PCR反应过程： 1个DNA片段 2个DNA片段 4个DNA片段 8个DNA片段 第一轮 第二轮 小结：PCR重复多次后,DNA分子呈指数形式扩增（约为2n） 02 第一步：目的基因的筛选与获取 ——利用PCR获取和扩增目的基因 复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？ 复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低， 原因是： ①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。 ②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。 问题思考 02 第一步：目的基因的筛选与获取 ——利用PCR获取和扩增目的基因 问题思考 获取目的基因时至少要经过几次循环才能分离出目的基因？ 至少要三次循环。 02 第一步：目的基因的筛选与获取 ——利用PCR获取和扩增目的基因 PCR技术与DNA复制过程比较 PCR技术 DNA复制 相同点 原则 原料 条件 不同点 解旋方式 场所 酶 结果 碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板、能量、酶 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 体外复制 细胞内（主要在细胞核内） 耐高温的DNA聚合酶 解旋酶、DNA聚合酶 DNA（基因）片段 完整的DNA分子 02 第一步：目的基因的筛选与获取 ——利用PCR获取和扩增目的基因 用PCR可以扩增mRNA吗？ mRNA不可以直接扩增，需要将它反转录成cDNA再进行扩增。 mRNA 杂交双链 单链DNA 双链cDNA 反转录酶 核酸酶H DNA聚合酶 RNA链 DNA链 问题思考 02 第一步：目的基因的筛选与获取 ——利用PCR获取和扩增目的基因 PCR反应结果： 由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。 即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数） 指数 2n PCR产物的鉴定： 常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 变性 90℃以上 延伸 72℃左右 复性 50℃左右 基本过程 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.实验原理 (1)PCR在体外进行DNA片段的扩增原理 PCR利用了_____________________和___________________的原理。 DNA的热变性原理 DNA半保留复制 (2)DNA片段电泳鉴定的原理 DNA分子具有_________________，在一定的______下，这些基团可以带上_____________________，在___________的作用下，这些_____________会向着______________________的电极移动，这个过程就是_______。 可解离的基团 pH 正电荷或负电荷 带电分子 电泳 与它所带电荷相反 电场 在凝胶中DNA分子的迁移速率与________________、___________________和_______等有关。 凝胶中的DNA分子通过_______，可以在波长为__________的________下被检测出来。 凝胶的浓度 染色 300nm 紫外灯 DNA分子的大小 构象 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)试剂 ①4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。 2.材料用具 ③PCR反应体系的配方(见教材) ②电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 ①PCR仪 （自动控温，实现DNA的扩增） ②微量离心管 （实际上是进行PCR反应的场所） ③微量移液器 （用于向微量离心管转移PCR配方中的液体） ④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头） ⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等） 2.材料用具 (2)用具 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 3.实验步骤 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。 1.PCR加样 材料 用量 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 3.实验步骤 2.离心 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。 3.扩增 将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。 可根据目的片段长度适当调整延伸时间 预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 3.实验步骤 DNA片段的扩增 加样 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分 离心 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率） 扩增 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 3.实验步骤 4.配制琼脂糖溶液 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 5.制备凝胶 ②凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 ③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 ——加样孔侧连电极负极。 ①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 电泳缓冲液用来维持PH值，使DNA带负电荷。 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 3.实验步骤 6.电泳加样 7.电泳、观察 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。 凝胶载样缓冲液类似层析液 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。 4.注意事项 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 5.结果分析与评价 1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。 如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 04 课堂小结 目的基因的 获取与筛选 筛选合适的目的基因 获取目的基因 测序技术 序列数据库 序列对比工具 利用化学方法人工合成目的基因 通过构建基因文库获取目的基因 利用PCR获取和扩增目的基因 05 课堂小测 1.基因工程操作中，需要筛选和获取目的基因。下列关于目的基因的说法,不正确的是(    ) A.目的基因是指用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因 B.目的基因都有自我复制能力 C.可以根据相应的表达产物，从序列数据库中寻找目的基因 D.目的基因可以人工合成，也可以利用PCR快速获取或扩增 B 解析：目的基因通常不具有自我复制能力，B错误。 05 课堂小测 2.关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是( ) A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 A 解析：琼脂糖凝胶的浓度、待测样品中DNA分子的大小和构象等都会影响DNA分子在电泳中的迁移速率，故琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小，A正确；在电泳过程中，凝胶载样缓冲液中的指示剂不会与DNA结合，而是随着电流的通过而移动，可用于确定样品的迁移方向和距离，不能用于指示DNA分子的具体位置，B错误；在同一电场作用下，DNA片段越长，即DNA相对分子质量越大，迁移速率越慢，C错误；琼脂糖凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 05 课堂小测 3.下列关于DNA片段的电泳鉴定实验的说法,正确的是(    ) A.等琼脂糖凝固后插入梳子,形成加样孔 B.用微量移液器吸取不同的DNA样品时,需要更换枪头 C.电泳结束后,需用显微镜观察形成的电泳条带 D.电泳过程中既要使用核酸染色剂,也要使用电泳指示剂,它们的观察方法、作用一致 B 解析：进行琼脂糖凝胶电泳时,应将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具,并插入合适大小的梳子,以形成加样孔,等凝胶溶液完全凝固,小心拔出梳子,A错误;为保证实验结果的准确性,用微量移液器吸取不同的DNA样品时,需要更换枪头,B正确;电泳结束后,需将凝胶置于紫外灯下进行观察,C错误;电泳过程中既要使用核酸染色剂,也要使用电泳指示剂,它们的观察方法、作用不同,凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长300nm的紫外灯下被检测出来,D错误。 感谢指正 Thanks To Correct Me Lavf58.46.101 Lavf58.45.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Lavf59.23.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $