3.1 重组DNA技术的基本工具课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第1节 重组DNA技术的基本工具 第3章 基因工程 基因工程 基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。（p67） 基因工程的别名 操作环境 操作对象 操作水平 原理 结果 DNA重组技术 生物体外 基因 DNA分子水平 人们需要的新的生物类型和生物产品 基因重组 1.基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别是什么？ 　　有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行重组； 基因工程可以实现遗传物质在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。 减数分裂I前期，同源染色体上非姐妹染色单体间的互换； 减数分裂I后期，非同源染色体上非等位基因的自由组合。 基因工程理论基础 【思考】 2.为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？（拼接的基础） ①DNA分子的基本组成单位相同，都是4种脱氧核苷酸； ②空间结构相同，都是规则的双螺旋结构。 ③都遵循碱基互补配对原则。 DNA平面结构 3.为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？ （表达的基础） ①基因是控制生物性状的独立遗传单位。 ③生物界共用一套遗传密码。 ②基因的表达都遵循中心法则。 问题探讨 我国是棉花的生产和消费大国，棉花在种植过程中，常会受到一些虫害的侵袭，其中以棉铃虫最为常见，它可以使棉花产量减少三分之一，甚至绝收。 大量施用农药 × 能不能导入“杀虫基因”到棉花细胞，使棉花自身产生抗虫蛋白来抵抗棉铃虫呢？ 抗虫基因 转基因 基因工程 “分子手术刀” “分子缝合针” “分子运输车” 准确切割DNA分子 将DNA片段连接起来 将体外重组好的DNA分子导入受体细胞 剪 接 运 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 1.分子手术刀——限制性内切核酸酶 （1） 来源： 主要是原核生物 （2）化学本质： 蛋白质 （3） 种类： 数千种 （限制酶不是一种酶，而是一类酶） （4）作用特点： 能够识别 的特定脱氧核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的 断开。 5' 3' 5' 3' T A G G T A T C C A 酶的专一性 双链DNA分子 磷酸二酯键 磷酸二酯键 思考1：为什么限制性内切核酸酶不剪切细菌本身的DNA？ 细菌DNA分子中不具备这种限制酶的识别序列或该序列被修饰了。 思考2：限制酶在原核生物中的主要作用是什么？ 切割入侵的DNA分子，保证自身安全 （5） 限制酶的识别序列： 中轴线 四种限制酶识别的特定序列有何特点？ ①大多数限制酶的识别序列由 组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 6个核苷酸 ②都可以找到一条中心轴线； ③中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的（称为回文序列）。 1.下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ） A．GAATTC B．GGGGCCCC CTTAAG CCCCGGGG C．CTGCAG D．CTAAATC GACGTC GATTTAG D 1.分子手术刀——限制性内切核酸酶 ①实例1——EcoRⅠ限制酶切割 *EcoRⅠ识别序列为GAATTC *EcoRⅠ切割部位为GA之间的磷酸二酯键 黏性末端 黏性末端 ②实例2——SmaⅠ限制酶切割 *SmaⅠ识别序列为CCCGGG *SmaⅠ切割部位为CG之间的磷酸二酯键 平末端 DNA两条单链的切口处，伸出几个核苷酸，刚好能互补配对，这样的切口叫黏性末端。 切口处是平整的，这样的切口叫平末端。 （6） 切割结果： 1.分子手术刀——限制性内切核酸酶 形成黏性末端或平末端 1.写出下列限制酶切割形成的末端序列 BamHⅠ EcoRⅠ__________________________ Hind Ⅲ Bgl Ⅱ _________________________ -G -CCTAG -G -CTTAA -A -TTCGA -A -TCTAG or GATCC- G- or AATTC- G- or AGCTT- A- or GATCT- A- 1、同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？ 2、不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？ 相同。 可能相同 酶具有专一性，识别的序列相同 （比如BamHⅠ、BglⅡ） 同尾酶：识别的靶序列不同，但是酶切后形成的黏性末端相同 随堂练习 可断开2个磷酸二酯键； 产生2个游离的磷酸基团； 产生2个黏性末端； 消耗2分子水。 2、请结合图示，推断限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？ 产生多少个游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？ 随堂练习 二、DNA连接酶——“分子缝合针” 2.分子缝合针——DNA连接酶 （1）作用： 将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个 核苷酸之间的磷酸二酯键 。 （2）种类： 种类 ___________________ ___________________ 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 作用 区别 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 都能将双链DNA片段“缝合“起来， 恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 E.coli DNA连接酶连接平末端效率较T4DNA连接酶低。 注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化） 2.分子缝合针——DNA连接酶 （3）DNA连接酶的作用 两个DNA片段要具有互补的黏性末端才能连接起来。 DNA连接酶→磷酸二酯键 DNA连接酶→磷酸二酯键 DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA! DNA连接酶作用没有特异性。可以连接多种末端 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 基因工程 DNA复制 在两个DNA片段间形成磷酸二酯键 将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键 DNA连接酶与DNA聚合酶的比较★ 项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶 DNA酶 作用部位 作用对象 作用结果 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键 DNA片段 DNA 单个的脱氧 核苷酸 DNA DNA 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割双链DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链 【核心归纳】与DNA相关的几种酶的比较 三、基因导入受体细胞的载体——“分子运输车” 【思考】： 1. 用限制酶获得的所需要的基因（目的基因）是否可以直接导入受体？为什么？ 否，因为目的基因直接导入受体细胞，可能会被受体细胞中的酶降解或不能复制、表达。 2. 怎样将目的基因导入受体？ 运载体 3.分子运输车 （1)作用： （2）种类： 携带目的基因导入受体细胞中，使之在受体细胞内稳定存在并表达。 质粒、噬菌体和动植物病毒等。 （3）作为载体需具备的条件★： 条件 原因 能在细胞中进行 能使目的基因 且数量可扩增 有一个至多个 位点 供外源DNA片段(基因)插入其中 常有特殊的__________ 便于重组DNA分子的_____ 无毒害作用 对受体细胞 作用，避免受体细胞受到损伤 自我复制或整合到受体DNA上随受体DNA同步复制 限制酶切割 标记基因 筛选 稳定存在 无毒害 四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、荧光蛋白基因等 3.分子运输车 （4）最常用的载体——质粒 质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 【注意】真正被用作载体的质粒， 都是经过人工改造的。 有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。 便于重组DNA筛选与鉴定 DNA复制的起始位点，并带着插入的目的基因一起复制 终止子: 转录的终点，在转录过程中起调控作用。 启动子: 转录的起点，在转录过程中起调控作用。 质粒DNA分子质量一般为拟核DNA的0.5%~3% 筛选出真正成功导入的受体细胞 思考讨论： 1.若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是 。 2.霍乱弧菌中含有质粒，但 （填“能”、“不能”）用来做载体，因为选择的载体应该 。（甲类烈性传染病致病菌，公共卫生风险爆炸、不适合真核蛋白表达，绝对不选为工业 / 实验室常规基因工程载体） 噬菌体 噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕 对受体细胞无害 不能 3.（1）质粒 （是/不是）一种细胞器。 （2）细胞膜上的载体蛋白与基因工程中的载体的区别 ①化学本质不同：细胞膜上的载体： 。基因工程中的载体可能是DNA, 如_ ; 也可是生物, 如___ ；也可是λ噬菌体的衍生物。 ②功能不同：细胞膜上的载体功能是_______ ;基因工程中的载体是一种“分子运输车”,把 ____________ . 不是 蛋白质 质粒 动植物病毒 协助细胞膜控制物质进出细胞 目的基因导入受体细胞 霍乱弧菌：本身是、肠道传播、极易水体暴发流行。公共卫生风险爆炸、不适合真核蛋白表达，绝对不选为工业 / 实验室常规基因工程载体； 4.根据标记基因的作用，在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞 (填“一定”或“不一定”)是导入目的基因的受体细胞，理由是 。 不一定 仅导入空载体的和导入含目的基因载体的受体细胞均能在该培养基中存活 思考讨论： 重组DNA分子 课堂小结 限制酶 DNA连接酶 载体 质粒、 噬菌体、动植物病毒 基因工程的基本工具 作为载体的条件 种类: 磷酸二酯键 来源： 主要来源于原核生物 特点： 作用部位： 具有专一性 结果： 形成黏性末端或平末端 ①有一个至多个限制酶切割位点； ②能自我复制或能整合到宿主DNA上。 ③有特殊的标记基因； ④对受体细胞无害； 连接部位： 磷酸二酯键 种类：E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶 作用： 把两条双链DNA片段拼接起来 P74探究实践：DNA的粗提取与鉴定实验 实验设计思路： DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。 思考：1、从哪里提取DNA？ 2、如何从细胞中提取DNA，有哪些困难？ 细胞 细胞内成分复杂，且真核生物的DNA和蛋白质结合形成染色体，难以分离提纯。 P74探究实践：DNA的粗提取与鉴定实验 1 实验原理 1．提取DNA的原理 2．鉴定DNA的原理 （1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。 （2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同， 能溶于2mol/L NaCl溶液。 某种蛋白质的溶解度 在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。 P74探究实践：DNA的粗提取与鉴定实验 2 材料用具 1．选材 猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核和线粒体，几乎不含DNA，不适合； 鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。 含DNA的生物材料都可以，选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。 鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。 （1）选什么样的材料实验更易成功？ （2）猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？ 新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等 柠檬酸钠防止血液凝固的原理是通过与血液中的钙离子结合，形成可溶性的柠檬酸钙，从而减少血液中钙离子的浓度。钙离子在血液凝固过程中扮演着关键角色，它的减少有效地阻止了血液凝固。 P74探究实践：DNA的粗提取与鉴定实验 3 方法步骤 称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，充分研磨。 在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ； 或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。 在上清液中加入体积相等的、 溶液（体积分数为95%）, 静置2~3min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA 。 2.去除杂质— 3.DNA的析出— 1.破碎细胞—— 洋葱 10mL研磨液 上清液 上清液 预冷的酒精 白色丝状物 用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物； 或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。 析出DNA 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。 析出DNA，使DNA与杂质分开 不用纱布：DNA会被吸附到滤纸上而大量损失 破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中 酒精预冷的作用？①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； ②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出； ③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。 P74探究实践：DNA的粗提取与鉴定实验 将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。 4.溶解DNA并鉴定— 二苯胺 2mol/L的NaCl 空白对照组： 在等体积的NaCl溶液+二苯胺试剂，不加入丝状物 现配现用，用棕色瓶保存 溶解DNA，并去除部分杂质蛋白 对照组 实验组 ——看提取物颜色（白色丝状物） ——看与二苯胺反应颜色的深浅 DNA纯度 DNA的量 5.结果分析 二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。 1.提取出丝状物或沉淀物一定是白色的吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？ 观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。 本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。 2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？ 3.本实验的检测结果蓝色较浅的原因可能是什么？ ①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分。 ②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。 ③二苯胺最好现用现配，二苯胺易被空气氧化，影响鉴定效果。 4 结果分析与评价 P74探究实践：DNA的粗提取与鉴定实验 为了提纯DNA，某同学提出以下实验方案，请分析原因： 操作2:上述得到的DNA提取液，缓缓加入蒸馏水，调节NaCl溶液的浓度为0.14mol/L，玻璃棒搅拌，析出DNA。 操作1:得到的DNA粗提取物（丝状物或沉淀）加入2mol/L的NaCl溶液溶解，过滤，取滤液（DNA提取液）。 加2mol/L的NaCl溶液的目的： 加蒸馏水的目的： 溶解DNA，除掉高盐溶液中不能溶解的杂质，提纯DNA液。 降低NaCl溶液浓度，从而降低DNA分子在NaCl溶液中的溶解度，使DNA析出，除掉溶解在低盐溶液中的杂质。 5 进一步探究 通过反复溶解与析出DNA，就能够除去 的多种杂质。 与DNA溶解度不同 P74探究实践：DNA的粗提取与鉴定实验 注意事项： 1．以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。 2.利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。 3．加入研磨液后，必须充分研磨，否则细胞核不会充分破碎，释放出的DNA量就会减少。 4．加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。 5．预冷的酒精具有以下优点：①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。 P74探究实践：DNA的粗提取与鉴定实验 课后习题 1.DNA连接酶是重组 DNA 技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ） A. 能连接 DNA 分子双链碱基对之间的氢键 B. 能将单个脱氧核苷酸加到 DNA 片段的末端，形成磷酸二酯键 C. 能连接用同种限制酶切开的两条 DNA 片段，重新形成磷酸二酯键 D. 只能连接双链 DNA 片段互补的黏性末端，不能连接双链 DNA 片段的平末端 C 2.在重组 DNA 技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ） A. 大肠杆菌的质粒 B. 切割 DNA 分子的酶 C. DNA 片段的黏性末端 D. 用来识别特定基因的 DNA 探针 A 课后习题 二、拓展应用 想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的 DNA 分子？ 迄今为止，在基因工程操作中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们可以识别 DNA 上特定的碱基序列并使特定部位的磷酸二酯键断开。 微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的 DNA 降解。细菌中限制酶之所以不切割自身的 DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的 DNA 分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的 DNA 被切断，并且可以防止外源 DNA 入侵。 课后习题 2.有 2 个不同来源的 DNA 片段 A 和 B，A 片段用限制酶Spe I 进行切割，B 片段分别用限制酶Hind III、Xba I、Eco RV 和Xho I 进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 （1）哪种限制酶切割 B 片段产生的 DNA 片段能与限制酶Spe I 切割 A 片段产生的 DNA 片段相连接？为什么？ Xba I。因为Xba I 与Spe I 切割产生了相同的黏性末端。 课后习题 （2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？ 识别 DNA 分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的 DNA 片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。 Lavf56.40.101 Tencent APD MTS Lavf58.51.100 $