第四章 基因工程（知识清单）生物浙科版选择性必修3

该高中生物学基因工程知识清单系统涵盖基因工程的技术基础、操作过程、应用及蛋白质工程等核心内容，通过可视化思维导图建立知识框架，核心考点梳理必背知识与陷阱规避，为学生搭建从基础理论到实践应用的递进式学习支架。 清单采用星级标注区分考点重要程度，如操作过程标注五星重点，通过酶的比较表格、PCR过程图解等培养科学思维，结合基因编辑治疗等热点案例及跨学科整合设计，配套真题演练与双标记基因筛选等方法提升，助力学生高效掌握知识，教师可据此优化教学策略。

第三章 基因工程（知识清单） 学习导航站 知识主脉络：可视化思维导图，建立知识框架 核心知识库：重难考点总结，梳理必背知识、陷阱规避 第1节 基因工程赋予生物新的遗传特性（2个考点） 考点1基因工程是在多个生物分支学科基础上发展而来★★☆☆☆ 考点2基因工程的技术基础★★★★☆ 考点3 基因工程的操作过程★★★★★ 第2节 基因工程及其延伸技术应用广泛（3个考点） 考点1 基因工程改善了人类的生活品质★★★☆☆ 考点2 蛋白质工程是基因工程的延伸★★★☆☆ 考点3 基因数据库是人类共有的财富★★☆☆☆ （星级越高，重要程度越高） 素养加油站：跨学科内容与热点问题分析、聚焦考点预测 方法储备库：高频考点，方法归纳 、 第1节 基因工程赋予生物新的遗传特性（2个考点） 考点1基因工程是在多个生物分支学科基础上发展而来★★☆☆☆ 1. 基因工程的概念 （1） 操作环境：生物体外 （2） 操作水平：分子水平 （3） 主要技术：DNA分子重组技术 （4） 操作结果：赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人类需要的遗传性状或表达所需产物。 （5） 变异原理： 2. 基因工程的理论基础 [教材隐性知识]　源自选择性必修3 P68“科技探索之路”肺炎链球菌的转化实验不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了__ ；科学家发现，在细菌拟核DNA之外的_ 有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移；多种_ _ 、_ __和逆转录酶的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件；___ 技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。 考点2基因工程的技术基础★★★★☆ 1．重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(简称“限制酶”) ①主要来源：原核生物　 ②种类：数千种 ③特点：专一性，即能识别DNA 分子的 ，使每一条链特定部位的 键断开。 ④结果：形成粘性末端或平末端。如下图。 [提醒]　①限制酶的识别序列一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 ②限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。 ③在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。 (2)DNA连接酶 ①作用：将双链DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的切口。 ②类型：E.coli DNA连接酶，来源于大肠杆菌，缝合互补的 ； T4 DNA连接酶，来源于T4噬菌体，缝合互补的 。 （3） 载体：种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等 特点：①具有多个 的识别位点 ②带有特殊的 基因，便于重组DNA分子的筛选③携带外源DNA进入 后，能够复制或整合到受体细胞染色体上，随受体DNA同步复制。 作用：携带外源DNA进入受体细胞。 　与DNA有关的几种酶的比较 酶的种类 作用底物 作用部位 作用结果 限制酶 DNA分子 磷酸二酯键 将DNA切成两个或多个片段 DNA连接酶 DNA分子片段 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接成一个DNA分子 DNA聚合酶 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 以DNA单链为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 解旋酶 DNA分子 碱基对中的氢键 将双链的DNA分子间氢键解开 DNA水解酶 DNA分子 磷酸二酯键 将DNA片段水解成单个的脱氧核苷酸 2．DNA的粗提取与鉴定 (1)基本原理：DNA 酒精，某些蛋白质易溶于酒精，初步分离DNA与蛋白质；DNA能溶于物质的量浓度为 的NaCl溶液，从而溶解DNA；一定温度下，DNA遇到 试剂呈现 色，从而鉴定DNA。　 (2)操作流程： [提醒]　①本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和其他细胞器(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。 ②加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。 考点3 基因工程的操作过程★★★★★ 1．目的基因的筛选与获取 (1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞__ _或获得预期__ _等的基因。 (2)筛选合适的目的基因 ①从相关的已知_ 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用_ 和序列比对工具进行筛选。 (3)目的基因的获取 ①人工合成目的基因。 ②PCR_ 　和扩增目的基因 a．PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据__ 的原理，在体外提供参与DNA复制的各种__ _ 与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行__ 的技术。 b．PCR反应的条件：一定的_ 溶液 、DNA模板、2种_ _______、4种__　 、__　 的_DNA聚合酶，以及能自动调控_ 的仪器。 c．PCR扩增的过程：变性（温度超过 ℃ 时，双链DNA解旋为单链） 复性（当温度下降到 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链结合） 延伸（当温度上升到 ℃左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸在 的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链） d．PCR产物的鉴定：常采用_ 来鉴定。 [归纳提升]　(1)耐高温的DNA聚合酶的作用：催化合成DNA子链。 (2)引物(2种)的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。 (3)缓冲液的作用：维持反应体系pH稳定。 (4)复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。 ③通过构建_ 来获取目的基因。 2．基因表达载体的构建——基因工程的核心 (1)目的：使目的基因__ ，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)基因表达载体的组成及作用 (3)构建过程 [提醒]　启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 DNA DNA mRNA mRNA 位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(正常情况下，不编码氨基酸) 3.将目的基因导入受体细胞 生物种类 植物 动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法、__ 　 显微注射法 __ _____处理法 受体细胞 　 原核细胞 转化过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入 [辨析]　(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。 (2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入 4．目的基因的检测与鉴定 第2节 基因工程及其延伸技术应用广泛 考点1 基因工程改善了人类的生活品质★★★☆☆ 1． 基因工程在农牧业方面的应用 （1） 培育抗性植物：抗虫植物、抗病植物、抗除草剂植物 （2） 改良作物品质：将某种必须氨基酸含量多的 导入植物中，可以提高这种氨基酸含量；将与植物 基因导入矮牵牛中，使它呈现出自然界没有的颜色变异，提高了观赏价值。 （3） 提高动物生长速率：如导入 基因。 （4） 改善畜产品的品质： 将 导入奶牛基因组，使获得的转基因牛分泌的乳汁中，乳糖含量大大降低而其他成分不受影响。 2． 基因工程在医药卫生领域的应用 （1） 生产药物：微生物或植物细胞，对微生物或动物的细胞进行 使他们能够生产药物。 利用哺乳动物批量生产药物:科学家将药用蛋白基因与 　 的基因启动子等调控元件重组在一起，通过 的方法导入哺乳动物的受精卵中，制成乳腺生物反应器或乳房生物反应器。 （2） 建立移植器官工厂：在器官供体的基因组中导入调控基因表达的DNA序列，以抑制 的表达，或设法除去抗原决定基因，再结合 技术，培育出不会引起 反应的转基因克隆器官。 3． 基因工程在食品工业方面的应用 （1） 利用基因 生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。 （2） 科学家将编码 导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过工业发酵批量生产凝乳酶。 （3） 加工转化糖浆需要的淀粉酶，加工烘烤食品要用到的脂肪酶等也都可以通过构建 ，然后利用发酵技术大量生产。 考点2 蛋白质工程是基因工程的延伸★★★☆☆ 1． 蛋白质工程的概念 （1） 基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。 （2）目的：改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求 （3）手段：基因改造从而改造现有蛋白质，或基因合成从而制造新的蛋白质 2．蛋白质工程与基因工程的异同 项目 蛋白质工程 基因工程 过程 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的_ →推测应有的_ 序列→找到并改变相对应的_ 序列　 (基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 实质 定向改造或生产人类所需要的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品 结果 可生产_ 的蛋白质 只能生产_ 的蛋白质 联系 蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程 3.蛋白质工程的应用 (1)在医药方面 ①利用蛋白质工程研发_ 。 ②实例：如果将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，在一定条件下，可以延长保存时间。 (2)在工业方面 ①蛋白质工程被广泛用于改进_ 或开发新的工业用酶。 ②实例：枯草杆菌蛋白酶具有水解蛋白质的作用，因此常被用于洗涤剂工业、丝绸工业等。 (3)在农业方面 科学家正在尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物_ 的效率，增加粮食的产量。 　判断基因工程和蛋白质工程 操作操作 蛋白质 考点3 以测序为基础的基因数据库是人类共有的财富★★☆☆☆ 1.概念：测序技术使人类获得了海量的生物数据，并建立了庞大的 。 2.作用：数据库信息可通过互联网共享，也可用于检索、比对核酸或蛋白质序列审视生命进化的历程。 1、 前沿科学动态 基因工程已从传统分子操作升级为精准编辑、合成设计、AI 驱动、多学科交叉的前沿领域。基因编辑工具，可以在不切断 DNA 双链的情况下，直接单碱基替换（C→T、A→G），脱靶率更低、安全性更高。利用先导编辑器，实现任意碱基替换、小片段插入或缺失，脱靶率远低于 CRISPR-Cas9。 2、 热点问题分析 将 CRISPR、碱基编辑、合成生物学与教材中基因工程的基本工具、 操作程序 、应用相结合，利用案例（如地中海贫血治疗、基因编辑大豆）串联以上知识点，并结合基因工程 + 蛋白质工程 + 细胞工程 + 发酵工程综合流程设计。医学领域，基因工程可用于治愈单基因病，基因碱基编辑治疗镰状细胞贫血、β- 地中海贫血、CPS1 缺乏症。癌症免疫方面，进行CAR-T 细胞基因编辑、PD-1/PD-L1 通路调控、溶瘤病毒改造。 异种器官移植方面，培育基因编辑猪（敲除免疫排斥/病毒基因），2025 年世界首例基因编辑猪肝移植成功。 三、跨学科知识整合 基因工程与发酵工程相结合，利用工程菌生产药物或化学品。医药行业，可设计全新代谢通路，用工程菌生产青蒿素、紫杉醇、可降解塑料、高附加值化学品。将基因工程与细胞工程结合，利用CAR-T、单克隆抗体技术实现异种器官移植。将基因工程 + 蛋白质工程：改造酶 、抗体、毒素（如耐热 Taq 酶、抗虫 Bt 蛋白优化）。或基因工程与生物信息学相结合进DNA 序列比对、基因数据库检索、进化树构建等。 1．(2023·新课标，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　) A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 2．(2024·连云港调研)质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是(　　) 项目 细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况 细菌在含四环素的培养基上生长情况 ① 能生长 不能生长 ② 能生长 能生长 ③ 不能生长 能生长 A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点 B．①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b C．质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个 D．将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶 3．人白细胞介素－2(IL－2)是一种细胞因子，含有3个半胱氨酸，分别位于第58、105、125位，其中58位与105位半胱氨酸之间形成的二硫键对保持IL－2活性起重要作用。用大肠杆菌生产IL－2，为保证产物活性，将IL－2基因中编码125位半胱氨酸的序列突变为丝氨酸序列。下列叙述错误的是(　　) A．突变的IL－2基因的序列发生了碱基对的增添 B．天然的和基因工程生产的IL－2均在核糖体上合成 C．突变的IL－2基因的表达降低了二硫键错配的可能 D．大肠杆菌中IL－2基因的复制和表达遵循中心法则 4．蛋白质工程是基因工程的延伸，下列有关蛋白质工程的叙述，正确的是(　　) A．蛋白质工程是基因工程的延伸，所以不需要遵循中心法则 B．蛋白质工程中可以不用构建基因表达载体 C．生产的蛋白质能在自然界中找到 D．需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶 5.(2023·湖北，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 方法提升：双标记基因与影印接种法筛选含重组质粒的菌落 (1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。 (2)被转化的细菌有三种：含自身环化目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。 (3)筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的细菌即为含重组质粒的细菌，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 6．(2024·河池模拟)研究人员将目的基因插入质粒，构建重组质粒的过程如图所示，再将该重组质粒导入大肠杆菌中。由LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X－gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。下列叙述错误的是(　　) A．将目的基因插入质粒中时，需要用到的酶有Xho Ⅰ、Nhe Ⅰ和DNA连接酶 B．需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的状态 C．按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后，大肠杆菌可正常表达该目的基因 D．在含X－gal的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌，可出现蓝色菌落 7.将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割质粒。如图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请思考以下问题： (1)限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割产生的黏性末端分别是_______________和______________。 (2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶？请说明理由。 ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ 　分析限制酶的作用和选择 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。 (3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶。 (4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。 ( 1 ) 学科网（北京）股份有限公司 $ 第三章 基因工程（知识清单） 学习导航站 知识主脉络：可视化思维导图，建立知识框架 核心知识库：重难考点总结，梳理必背知识、陷阱规避 第1节 基因工程赋予生物新的遗传特性（2个考点） 考点1基因工程是在多个生物分支学科基础上发展而来★★☆☆☆ 考点2基因工程的技术基础★★★★☆ 考点3 基因工程的操作过程★★★★★ 第2节 基因工程及其延伸技术应用广泛（3个考点） 考点1 基因工程改善了人类的生活品质★★★☆☆ 考点2 蛋白质工程是基因工程的延伸★★★☆☆ 考点3 基因数据库是人类共有的财富★★☆☆☆ （星级越高，重要程度越高） 素养加油站：跨学科内容与热点问题分析、聚焦考点预测 方法储备库：高频考点，方法归纳 第1节 基因工程赋予生物新的遗传特性（2个考点） 考点1基因工程是在多个生物分支学科基础上发展而来★★☆☆☆ 1. 基因工程的概念 （1） 操作环境：生物体外 （2） 操作水平：分子水平 （3） 主要技术：DNA分子重组技术 （4） 操作结果：赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人类需要的遗传性状或表达所需产物。 （5） 变异原理：基因重组 2. 基因工程的理论基础 [教材隐性知识]　源自选择性必修3 P68“科技探索之路”肺炎链球菌的转化实验不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了__可以在同种生物的不同个体之间转移；科学家发现，在细菌拟核DNA之外的_质粒 有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移；多种_限制酶_ 、_DNA 连接酶__和逆转录酶的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件；___基因组编辑技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。 考点2基因工程的技术基础★★★★☆ 1．重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(简称“限制酶”) ①主要来源：原核生物　 ②种类：数千种 ③特点：专一性，即能识别DNA 分子的 特定核苷酸序列，使每一条链特定部位的磷酸二酯 键断开。 ④结果：形成粘性末端或平末端。如下图。 [提醒]　①限制酶的识别序列一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 ②限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。 ③在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。 (2)DNA连接酶 ①作用：将双链DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的切口。 ②类型：E.coli DNA连接酶，来源于大肠杆菌，缝合互补的粘性末端； T4 DNA连接酶，来源于T4噬菌体，缝合互补的粘性末端和平末端。 （3） 载体：种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等 特点：①具有多个限制酶的识别位点 ②带有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选③携带外源DNA进入受体细胞后，能够复制或整合到受体细胞染色体上，随受体DNA同步复制。 作用：携带外源DNA进入受体细胞。 　与DNA有关的几种酶的比较 酶的种类 作用底物 作用部位 作用结果 限制酶 DNA分子 磷酸二酯键 将DNA切成两个或多个片段 DNA连接酶 DNA分子片段 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接成一个DNA分子 DNA聚合酶 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 以DNA单链为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 解旋酶 DNA分子 碱基对中的氢键 将双链的DNA分子间氢键解开 DNA水解酶 DNA分子 磷酸二酯键 将DNA片段水解成单个的脱氧核苷酸 2．DNA的粗提取与鉴定 (1)基本原理：DNA不溶于酒精，某些蛋白质易溶于酒精，初步分离DNA与蛋白质；DNA能溶于物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液，从而溶解DNA；一定温度下，DNA遇到二苯胺试剂呈现蓝色，从而鉴定DNA。　 (2)操作流程： [提醒]　①本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和其他细胞器(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。 ②加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。 考点3 基因工程的操作过程★★★★★ 1．目的基因的筛选与获取 (1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞__性状_或获得预期__表达产物_等的基因。 (2)筛选合适的目的基因 ①从相关的已知_结构和功能清晰 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用_序列数据库 和序列比对工具进行筛选。 (3)目的基因的获取 ①人工合成目的基因。 ②PCR_获取　和扩增目的基因 a．PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据__DNA半保留复制 的原理，在体外提供参与DNA复制的各种__组分_ 与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行__大量复制_ 的技术。 b．PCR反应的条件：一定的_缓冲溶液 、DNA模板、2种_引物_______、4种__　脱氧核苷酸 、__　耐高温的_DNA聚合酶，以及能自动调控_温度 的仪器。 c．PCR扩增的过程：变性（温度超过 90 ℃ 时，双链DNA解旋为单链） 复性（当温度下降到 50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链结合） 延伸（当温度上升到 72 ℃左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶 的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链） d．PCR产物的鉴定：常采用_琼脂糖凝胶电泳 来鉴定。 [归纳提升]　(1)耐高温的DNA聚合酶的作用：催化合成DNA子链。 (2)引物(2种)的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。 (3)缓冲液的作用：维持反应体系pH稳定。 (4)复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。 ③通过构建_基因文库 来获取目的基因。 2．基因表达载体的构建——基因工程的核心 (1)目的：使目的基因__在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代 ，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)基因表达载体的组成及作用 (3)构建过程 [提醒]　启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 DNA DNA mRNA mRNA 位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(正常情况下，不编码氨基酸) 3.将目的基因导入受体细胞 生物种类 植物 动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法、__花粉管通道法　 显微注射法 __Ca2＋_____处理法 受体细胞 体细胞或受精卵　 受精卵 原核细胞 转化过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入 [辨析]　(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。 (2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入 4．目的基因的检测与鉴定 第2节 基因工程及其延伸技术应用广泛 考点1 基因工程改善了人类的生活品质★★★☆☆ 1． 基因工程在农牧业方面的应用 （1） 培育抗性植物：抗虫植物、抗病植物、抗除草剂植物 （2） 改良作物品质：将某种必须氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物中，可以提高这种氨基酸含量；将与植物 花青素代谢相关的 基因导入矮牵牛中，使它呈现出自然界没有的颜色变异，提高了观赏价值。 （3） 提高动物生长速率：如导入生长激素基因。 （4） 改善畜产品的品质： 将 肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，使获得的转基因牛分泌的乳汁中，乳糖含量大大降低而其他成分不受影响。 2． 基因工程在医药卫生领域的应用 （1） 生产药物：微生物或植物细胞，对微生物或动物的细胞进行 基因改造 使他们能够生产药物。 利用哺乳动物批量生产药物:科学家将药用蛋白基因与 　乳腺中特异表达 的基因启动子等调控元件重组在一起，通过 显微注射 的方法导入哺乳动物的受精卵中，制成乳腺生物反应器或乳房生物反应器。 （2） 建立移植器官工厂：在器官供体的基因组中导入调控基因表达的DNA序列，以抑制　抗原决定基因 的表达，或设法除去抗原决定基因，再结合 克隆技术，培育出不会引起 免疫排斥 反应的转基因克隆器官。 3． 基因工程在食品工业方面的应用 （1） 利用基因工程菌 生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。 （2） 科学家将编码 牛凝乳酶的基因 导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过工业发酵批量生产凝乳酶。 （3） 加工转化糖浆需要的淀粉酶，加工烘烤食品要用到的脂肪酶等也都可以通过构建基因工程菌，然后利用发酵技术大量生产。 考点2 蛋白质工程是基因工程的延伸★★★☆☆ 1． 蛋白质工程的概念 （1） 基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。 （2）目的：改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求 （3）手段：基因改造从而改造现有蛋白质，或基因合成从而制造新的蛋白质 2．蛋白质工程与基因工程的异同 项目 蛋白质工程 基因工程 过程 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的_蛋白质结构 →推测应有的_氨基酸序列→找到并改变相对应的_脱氧核苷酸序列　 (基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 实质 定向改造或生产人类所需要的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品 结果 可生产_自然界中不存在的蛋白质 只能生产_自然界中已存在的蛋白质 联系 蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程 3.蛋白质工程的应用 (1)在医药方面 ①利用蛋白质工程研发_药物 。 ②实例：如果将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，在一定条件下，可以延长保存时间。 (2)在工业方面 ①蛋白质工程被广泛用于改进_酶的性能 或开发新的工业用酶。 ②实例：枯草杆菌蛋白酶具有水解蛋白质的作用，因此常被用于洗涤剂工业、丝绸工业等。 (3)在农业方面 科学家正在尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物_光合作用 的效率，增加粮食的产量。 　判断基因工程和蛋白质工程 操作操作 蛋白质 考点3 以测序为基础的基因数据库是人类共有的财富★★☆☆☆ 1.概念：测序技术使人类获得了海量的生物数据，并建立了庞大的生物信息数据库。 2.作用：数据库信息可通过互联网共享，也可用于检索、比对核酸或蛋白质序列审视生命进化的历程。 1、 前沿科学动态 基因工程已从传统分子操作升级为精准编辑、合成设计、AI 驱动、多学科交叉的前沿领域。基因编辑工具，可以在不切断 DNA 双链的情况下，直接单碱基替换（C→T、A→G），脱靶率更低、安全性更高。利用先导编辑器，实现任意碱基替换、小片段插入或缺失，脱靶率远低于 CRISPR-Cas9。 2、 热点问题分析 将 CRISPR、碱基编辑、合成生物学与教材中基因工程的基本工具、 操作程序 、应用相结合，利用案例（如地中海贫血治疗、基因编辑大豆）串联以上知识点，并结合基因工程 + 蛋白质工程 + 细胞工程 + 发酵工程综合流程设计。医学领域，基因工程可用于治愈单基因病，基因碱基编辑治疗镰状细胞贫血、β- 地中海贫血、CPS1 缺乏症。癌症免疫方面，进行CAR-T 细胞基因编辑、PD-1/PD-L1 通路调控、溶瘤病毒改造。 异种器官移植方面，培育基因编辑猪（敲除免疫排斥/病毒基因），2025 年世界首例基因编辑猪肝移植成功。 三、跨学科知识整合 基因工程与发酵工程相结合，利用工程菌生产药物或化学品。医药行业，可设计全新代谢通路，用工程菌生产青蒿素、紫杉醇、可降解塑料、高附加值化学品。将基因工程与细胞工程结合，利用CAR-T、单克隆抗体技术实现异种器官移植。将基因工程 + 蛋白质工程：改造酶 、抗体、毒素（如耐热 Taq 酶、抗虫 Bt 蛋白优化）。或基因工程与生物信息学相结合进DNA 序列比对、基因数据库检索、进化树构建等。 1．(2023·新课标，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　) A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 1．C　[酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A不符合题意；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到黏性末端，二者不能连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C符合题意；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D不符合题意。] 2．(2024·连云港调研)质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是(　　) 项目 细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况 细菌在含四环素的培养基上生长情况 ① 能生长 不能生长 ② 能生长 能生长 ③ 不能生长 能生长 A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点 B．①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b C．质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个 D．将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶 2．C　[质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点，A错误；①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b，②是c，③是a，B错误；将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶，D错误。] 3．人白细胞介素－2(IL－2)是一种细胞因子，含有3个半胱氨酸，分别位于第58、105、125位，其中58位与105位半胱氨酸之间形成的二硫键对保持IL－2活性起重要作用。用大肠杆菌生产IL－2，为保证产物活性，将IL－2基因中编码125位半胱氨酸的序列突变为丝氨酸序列。下列叙述错误的是(　　) A．突变的IL－2基因的序列发生了碱基对的增添 B．天然的和基因工程生产的IL－2均在核糖体上合成 C．突变的IL－2基因的表达降低了二硫键错配的可能 D．大肠杆菌中IL－2基因的复制和表达遵循中心法则 3．A　[由题意可知，将IL－2基因中编码125位半胱氨酸的序列突变为丝氨酸序列，只是一个氨基酸发生了改变，应该是发生了碱基替换，而不是碱基对的增添，A错误；天然的和基因工程生产的IL－2的化学本质都是蛋白质，都是在核糖体上合成的，B正确；58位与105位半胱氨酸之间形成的二硫键对保持IL－2活性起重要作用，突变的IL－2基因的表达降低了二硫键错配的可能，C正确；大肠杆菌是原核生物(细胞生物)，其遗传物质是DNA，基因的复制和表达都遵循中心法则，D正确。] 4．蛋白质工程是基因工程的延伸，下列有关蛋白质工程的叙述，正确的是(　　) A．蛋白质工程是基因工程的延伸，所以不需要遵循中心法则 B．蛋白质工程中可以不用构建基因表达载体 C．生产的蛋白质能在自然界中找到 D．需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶 4．D　[蛋白质工程最终也是通过基因控制蛋白质的合成，遵循中心法则，A错误；利用蛋白质工程生产出自然界中不存在的蛋白质，满足实际需求，C错误；蛋白质工程是基因工程的延伸，需要构建基因表达载体，需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶，B错误，D正确。] 5.(2023·湖北，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 5．D　[若用Hind Ⅲ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；DNA凝胶电泳技术可以分离出不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与原质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。] 方法提升：双标记基因与影印接种法筛选含重组质粒的菌落 (1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。 (2)被转化的细菌有三种：含自身环化目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。 (3)筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的细菌即为含重组质粒的细菌，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 6．(2024·河池模拟)研究人员将目的基因插入质粒，构建重组质粒的过程如图所示，再将该重组质粒导入大肠杆菌中。由LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X－gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。下列叙述错误的是(　　) A．将目的基因插入质粒中时，需要用到的酶有Xho Ⅰ、Nhe Ⅰ和DNA连接酶 B．需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的状态 C．按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后，大肠杆菌可正常表达该目的基因 D．在含X－gal的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌，可出现蓝色菌落 6．C　[按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后，由于目的基因的转录方向和启动子的方向相反，大肠杆菌不能正常表达该目的基因，C错误；重组质粒含有LacZ基因，其编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X－gal产生蓝色物质，故在含X－gal的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌，可使菌落呈蓝色，D正确。] 7.将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割质粒。如图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请思考以下问题： (1)限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割产生的黏性末端分别是_______________和______________。 (2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶？请说明理由。 ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ 　分析限制酶的作用和选择 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。 (3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶。 (4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。 ( 1 ) 学科网（北京）股份有限公司 $