第四章 基因工程（单元自测卷）生物浙科版选择性必修3

2025-2026学年高二生物下学期单元自测 第四章 基因工程 （测试时间：75分钟 满分：100分） 1、 单选题（本部分包括20题，每题2分，共计40分。每题只有一个选项最符合题意。) 1．在判断抗虫基因是否成功转入棉花基因组的方法中，不属于分子检测的是 A．检测目的基因表达产物蛋白质能否与特定抗体形成杂交带 B．检测目的基因片段与DNA探针能否形成杂交带 C．检测目的基因转录形成的mRNA与DNA探针能否形成杂交带 D．通过观察害虫吃棉叶是否死亡 2．下列有关重组DNA技术所需的三种基本工具的描述，正确的是（　　） A．限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列 B．限制酶切割DNA分子一次可断开2个磷酸二酯键，产生2个游离的磷酸基团 C．有些DNA连接酶既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，又能连接双链DNA片段的平末端，从而恢复被限制酶切开的氢键 D．作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选 3．基因治疗是指：(    ) A．运用人工诱变的方法，使有基因缺陷的细胞发生基因突变而恢复正常 B．运用基因工程技术，把有缺陷的基因切除，达到治疗疾病的目的 C．把健康的外源基因导入到有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的 D．对有缺陷的基因进行修复，使其恢复正常，达到治疗疾病的目的 4．转基因技术是指利用分子生物学和基因工程的手段，将某种生物的基因转移到其他生物物种中，使其出现原物种不具有的新性状的技术。转基因技术实现的变异类型是（    ） A．基因重组 B．基因突变 C．染色体结构变异 D．染色体数目变异 5．农杆菌转化法是植物基因工程中常用的将重组DNA分子导入受体细胞的方法，常见转化过程如图所示，其中①-④表示相关过程。在转化拟南芥时可使用蘸花法：待拟南芥开花后将花序浸润在农杆菌悬液中1-2min，农杆菌会随着萌发的花粉管进入胚囊，含目的基因的表达载体进入胚囊中的卵细胞，受精后待果实成熟，即可获得含有目的基因的拟南芥种子。下列叙述错误的是（　　） A．图中②③过程需要严格控制生长素和细胞分裂素类似物的比例 B．过程③获得的转基因试管苗中，单个细胞内可能同时存在多个BURY基因 C．蘸花法转化拟南芥前去掉已形成的果实，有利于提高含目的基因种子的比例 D．两种转化法均可在当代获得转基因植株，并在当代完成转基因性状的鉴定 6．下列有关DNA的粗提取与鉴定实验的叙述，正确的是（    ） A．猪成熟的红细胞不宜选作DNA粗提取材料 B．等体积鸡（2n=78）的血液和鸭（2n=78）的血液提取的DNA量相等 C．切碎的洋葱中，加入洗涤剂和食盐后研磨有利于去除细胞壁 D．用棕色瓶收集并保存好剩余的二苯胺试剂，以备下一次实验时继续使用 7．2020年诺贝尔化学奖授予两位女科学家以表彰她们“开发出一种基因组编辑方法”。CRISPR/Cas9 基因组编辑系统工作原理如图所示，关于此技术的解释错误的是（    ） A．Cas9为一种能使磷酸二酯键断裂的酶 B．DNA-RNA杂交区域不存在T-A碱基对 C．在单链向导RNA中也存在碱基互补配对 D．人为改变向导RNA的序列可实现对特定基因的切割 8．DNA分子探针能用于检测（    ） A．甲亢患者 B．乙肝患者 C．坏血病 D．缺铁贫血病患者 9．培养转基因的高等动物时，常采用的受体细胞是（    ） A．卵母细胞 B．受精卵 C．胚胎干细胞 D．乳腺细胞 10．利用苏云金芽孢杆菌的抗虫基因培育的抗虫棉是否成功，最好检测 （   ） A．是否有抗生素产生 B．是否有目的基因表达 C．是否有抗虫的性状出现 D．是否能分离到目的基因 11．荧光蛋白的发现可以说是革新了生物学研究，下列叙述错误的是（    ） A．荧光蛋白中一定含有C、H、O、N四种元素 B．荧光蛋白可作为标记蛋白，用于研究癌细胞的转移 C．利用PCR技术准确扩增出荧光蛋白基因的关键是引物的正确设计 D．为了确保荧光蛋白基因在受体细胞中表达，应在荧光蛋白基因的下游添加启动子 12．蚯蚓富含金属硫蛋白（MT）等重金属结合蛋白能选择性吸收土壤中的镉。利用一定技术可将蚯蚓MT基因转入烟草，流程如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．过程③把重组质粒导入大肠杆菌的主要目的是对MT基因进行扩增 B．过程④中携带有目的基因的Ti质粒进入烟草愈伤组织细胞，并整合到植物细胞的染色体上 C．转基因产品即具有潜在的巨大经济效益，也可能存在一定的风险性 D．观察测定烟草是否表现出MT等蛋白并稳定遗传，是判断转基因成功的直接证据。 13．β-葡萄糖苷酶参与水解纤维素，最终得到单体葡萄糖。在食品、医药等方面发挥重要作用。下图为β-葡萄糖苷酶在不同温度条件下分别处理20min、60min、120min后相对酶活性变化的实验结果。下列叙述正确的是（    ） A．该实验的因变量有温度、处理时间 B．该酶相对活性随温度升高、处理时间延长而降低 C．低温条件下该酶与底物结合发生作用过程中，其空间结构没有改变 D．可利用蛋白质工程改造该酶分子的结构，提高其在高温环境下的活性 14．“筛选”是生物工程中常用的技术手段，下列关于筛选的叙述正确的是（    ） A．将转化后的菌悬液接种到平板后，可利用核酸分子杂交技术筛选含目的基因的菌落 B．经过体细胞核移植形成的胚胎，在移植前往往需要筛选特定性别的胚胎 C．单抗制备过程中，细胞融合后利用选择培养基筛选产生特定抗体的杂交瘤细胞、 D．酶解法获得原生质体后，可利用质壁分离与复原实验筛选出活力强的原生质体 15．如图是有关真核细胞中某DNA片段和tRNA的图示，以下说法正确的是（    ） A．某限制性核酸内切酶能识别图一中的碱基序列，并在切割后形成一个黏性末端 B．图二中的m表示氨基酸，该tRNA是由相应的基因转录而来 C．用PCR扩增技术扩增含有图一片段的DNA时，需加入DNA聚合酶使③断开 D．将图一DNA分子在含14N原料的条件下复制两次，子代DNA中不含有15N的DNA占3/4 16．下图是一种靶向基因敲除技术即TALEN技术。该技术的敲除工具是由DNA识别域TALE和非特异性核酸内切酶FoKI两个部分组成的蛋白质。TALE的二连氨基酸(字母N、I、G、H、D分别代表一种氨基酸)与四种碱基(A、G、C、T)有恒定的对应关系。FoKI是一种形成二聚体后具有核酸内切酶活性的蛋白单体。下列相关叙述错误的是（    ） A．单独使用FoKI对基因的切割敲除具有随机性 B．TALE蛋白的合成通常涉及PCR技术和蛋白质工程 C．二连氨基酸能与四种含氮碱基发生恒定的碱基互补配对 D．TALE蛋白左右臂的二连氨基酸序列的设计依据靶基因碱基序列 17．下列关于PCR技术及凝胶电泳鉴定的说法，正确的是（    ） A．DNA分子在凝胶中的迁移速率与DNA分子大小、形状、所带电荷等有关，与凝胶无关 B．若以某DNA片段作为模版，5次循环后理论上反应物中应有32个这样的DNA片段 C．PCR所用的解旋酶和DNA聚合酶都具有耐高温的特性 D．凝胶中的DNA分子可以直接在光下被检测 18．在基因工程操作中，通常需要利用质粒作为载体将基因送入受体细胞。如图1所示为pUC18/19的结构示意图（AmpR是氨苄青霉素抗性基因），pUC18和pUC19除了MCS序列不同外，其他序列完全相同。图2为pUC18和MCS序列。以下相关叙述正确的是（　　） A．由环状质粒pUC18/19得到图2中的单链结构，只需要用到DNA解旋酶 B．由质粒pUC18和pUC19形成的图2中的单链，彼此不能完全互补配对 C．用BcgⅠ限制酶对质粒和目的基因进行酶切，导入成功的受体细胞的培养基中不需要添加氨苄青霉素 D．若将基因表达载体导入大肠杆菌细胞中，需使细胞处于兴奋状态 19．进行PCR实验时，下列操作不能提高扩增特异性的是（    ） A．提高模板DNA的纯度 B．引物浓度远高于初始模板DNA的浓度 C．降低退火的温度 D．提高引物的长度和GC的比例 20．大肠杆菌通过一系列酶促反应可将苏氨酸转化为异亮氨酸，苏氨酸脱水酶是其中一个关键酶。当异亮氨酸浓度较高时，异亮氨酸可与苏氨酸脱水酶结合，抑制酶活性。科学家利用蛋白质工程技术改造苏氨酸脱水酶中异亮氨酸的结合位点，获得高产菌株。下列叙述正确的是（　　） A．异亮氨酸抑制苏氨酸脱水酶活性属于负反馈调节，有利于异亮氨酸的生产 B．改造大肠杆菌时，需用基因工程技术改变苏氨酸脱水酶基因的核苷酸序列 C．在发酵过程中，将苏氨酸从发酵液中移除可显著提高该高产菌株的发酵效率 D．增加传代次数有利于维持该高产菌株遗传性状和生产能力的稳定性 二、非选择题（本题共5题，除特别标注外，每空1分，共60分） 21．19世纪末，巴斯德开创了第一次疫苗革命，其特点是接种灭活或减毒的病原微生物。20世纪70年代开始，现代生物技术的迅猛发展开创了第二次疫苗革命，使疫苗的研制进入分子水平。图1是通过基因工程制备乙型肝炎表面抗原（HbsAg）从而获得乙肝疫苗的过程，数字①-⑦为相关步骤。 在图1步骤①和③中，需要用合适的限制酶切割乙肝表面抗原基因和质粒。乙肝表面抗原基因及质粒的部分限制酶的识别序列及位置如图2。启动子是质粒中基因得以正常表达所必需的部分。LacZ基因控制合成某种酶，该酶能将无色染料X-gal变成蓝色，最终能在含无色染料X-gal的培养基上将含该基因的菌落染成蓝色。 (1)在图1步骤④中，使用的基因工程工具酶是_____，将一个乙肝表面抗原基因与一个质粒重组的过程中，游离的磷酸基团数目减少_____个。 (2)根据图2，为了避免自身环化及便于筛选，切割质粒选用的限制酶是_____，获得乙肝表面抗原基因选用的限制酶是_____。 (3)为筛选含有乙肝表面抗原的大肠杆菌细胞，需要将大肠杆菌接种到含_____的固体培养基上，挑选_____的菌落纯化培养。 (4)若运用PCR技术检测乙肝表面抗原基因是否导入，需根据目的基因的序列设计_____，利用待检DNA为模板进行PCR。PCR过程包括多次循环，每个循环分为3个步骤：_____→_____→延伸。若基因导入成功PCR过程中至少复制_____次可以得到两条链等长的目的基因。 22．-1，3葡聚糖酶可以水解许多病原真菌细胞壁外层的-1，3葡聚糖和几丁质，降解真菌细胞壁，从而抑制真菌的生长与繁殖。研究人员在植物中克隆到-1，3葡聚糖酶基因（BG2）并转入苹果主栽品种，以减少苹果真菌病害、实现无公害生产。 (1)BG2的克隆可利用_______技术，这需要一小段能与该基因碱基序列互补配对的_______作为引物，在体外对目的基因进行大量复制，常采用_______来鉴定产物。 (2)下图为利用PATC940（经农杆菌Ti质粒改造获得）构建BG2抗病质粒的过程。图中右下处的酶为_______，人工设计的复合启动子的作用是驱动转录和提高转录活性，它位于目的基因（BG2）的_______（填“上游”或“下游”）。XbaI酶切后的末端与SpeI酶切后的末端能连接是因为_______。    (3)研究人员将转入BG2抗病质粒的农杆菌与苹果外植体共培养，以进行遗传转化。目的基因BG2将随着_______转移到被侵染的细胞而进入细胞，并随其整合到该细胞的_______上。 (4)在完成遗传转化后，选择培养基中至少要加入两种抗生素，请推测其作用分别是：一种用于_______，另一种用于_______。 23．最初从多管水母属中分离出的绿色荧光蛋白（GFP）基因，现已广泛地应用于基因工程中载体上的标记基因。烟草花叶病毒（TMV）是造成烟草产量损失的主要病毒。某科研团队设计了利用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）快速筛选表达TMV外壳蛋白基因（CP）的转基因烟草品系（该品系能抑制病毒的复制，从而显著延缓病毒感染的发生），设计过程如下图。    回答下列问题： (1)获取外源基因： ①为了获得TMV的外壳蛋白基因（CP），先要分离得到TMV的外壳蛋白，分析该蛋白质的氨基酸序列和相应的核苷酸序列，再利用_____________法获得该外源基因。 ②野生型GFP是由238个氨基酸组成的单体蛋白，首先需要在基因数据库中检索获取GFP基因的编码序列，并采用____________中结合PCR的定点突变等技术，设计和改造GFP中第64、65号2个氨基酸后，成为EGFP使其荧光强度提高35倍。对于该基因的检测，通常需进一步通过____________鉴定，而不用PCR产物凝胶电泳的结果，原因是____________。③用一定的方法将CP基因和EGFP基因连接获得CP-EGFP融合基因。 (2)利用表达载体构建重组DNA分子： 用不同的限制性内切核酸酶对含CP-EGFP融合基因的DNA片段和表达载体Ti质粒进行处理，使它们的两端各自形成____________的黏性末端，从而避免基因片段和质粒的自身环化和反向连接。然后用DNA连接酶将CP-EGFP融合基因和Ti质粒连接形成重组Ti质粒，其中CP-EGFP融合基因插入质粒的____________中。 (3)重组DNA分子转化受体细胞（根癌农杆菌和烟草叶片细胞）： ①先将根癌农杆菌放于低温、低浓度的CaCl2溶液中，造成细胞膨胀，____________改变，成为感受态细胞。再在低温条件下将根癌农杆菌与重组Ti质粒混合培养在____________培养基中，最后进行短暂的热刺激处理，使CP-EGFP融合基因转入根癌农杆菌细胞。②用筛选、鉴定后的重组根癌农杆菌去侵染消毒后的离体烟草叶片时，____________的叶片会产生酚类化合物，诱导根癌农杆菌质粒上vir系列基因表达形成特异性内切酶和DNA聚合酶等，进而从质粒上____________出特定DNA片段并整合到烟草叶片细胞的染色体上。转化完成后需及时用____________的抗生素进行脱菌操作。 (4)检测目的基因及其表达产物： 将处理后的烟草叶片在相应的MS培养基上培养成试管苗，该培养基一般不添加葡萄糖而是添加蔗糖，其原因有：相同物质的量浓度下蔗糖比葡萄糖提供更多的能量，还有____________（写出1点）。为检验CP基因是否转入并成功表达，可直接检测组培苗烟草叶片细胞中是否具有____________的特征，省去了分子水平的检测步骤，大大降低了工作量。 (5)为什么转入CP基因（非抗性基因）的烟草植株具有对抗TMV的感染能力?科研团队的研究结果表明：CP基因转录的RNA以反义方式作用于病毒的____________，或同模板竞争复制酶而干扰病毒的复制，并且抗性过程需要外壳蛋白的直接参与。 24．干扰素是一类具有抗病毒、抑制细胞增殖等多种功能的糖蛋白。研究发现鼹鼠纤维母细胞体外培养时，细胞增殖到一定程度会分泌β-干扰素，使这些细胞迅速死亡。研究人员通过基因工程的方法获得β干扰素。回答下列问题： (1)获取目的基因：提取纤维母细胞的mRNA，在逆转录酶的催化下得到cDNA并进行PCR扩增。在设计PCR引物时，通常需要在引物的______端添加限制酶识别序列，以便构建表达载体。将PCR体系各成分加入已灭菌的微量离心管后以3000r/min的转速离心，离心的目的是______。 (2)构建表达载体：选用的质粒为pBR322（结构如下图所示），图中①属于______。启动子是一段有特殊结构的DNA片段，能被______识别并结合，驱动基因的转录。为避免目的基因的反向连接和自身环化，提高表达载体的获得率，应选用限制酶______切割pBR322和干扰素基因，后获得重组质粒。 (3)筛选含重组质粒的大肠杆菌：科研人员将表达载体导入大肠杆菌后，采用了影印法筛选目标菌种，部分操作过程及结果如下图所示，即用无菌的线毡布压在添加______的培养基A上，带出少许菌种，平移并压在添加______的培养基B上。符合要求的大肠杆菌菌落是______（填培养基中数字），理由是______。    (4)干扰素的生物活性测定 ①干扰素安全浓度测定：非洲绿猴肾细胞（Vero）常用于干扰素活性测定，将Vero细胞系接种到多孔细胞培养板中，培养24h后向各孔内加入______，并设置多个重复组，同时设置对照组。继续培养24h，测定各组细胞存活率。实验结果表明，干扰素对细胞的影响呈浓度依赖性，在浓度低于25μg/mL时，对细胞无毒性，安全浓度范围为0-25μg/mL。 ②抗病毒活性的测定：检测不同浓度干扰素影响下VSV病毒（可用Vero细胞培养）的增殖情况，请完善实验思路： a.将30μg/mL的干扰素______。 b._______________________________。 c.继续培养24h，试验组每孔接入相同浓度的VSV病毒。 d.培养至对照组有75%的Vero细胞出现病变时，检测各组VSV病毒的拷贝数。 25．（一）研究人员欲从土壤中筛选高淀粉酶活性的目标菌研究。回答下列问题： (1)为筛选胞外淀粉酶分泌型菌种，一般从__________（A．果园树下  B．肉类加工厂周围  C．米酒厂周围  D．枯树周围）获得土样，用无菌水稀释，接种至以__________为唯一碳源的固体培养基上进行培养，另外，该培养基还应含有氮源、水、无机盐、生长因子和__________。 (2)微生物菌种纯化时，为得到单菌落，最常用的两种接种方法是__________和__________。从土壤中筛选目标菌时，加碘液染色后，平板上出现了A、B两种菌落（如下图所示）。如果要得到淀粉酶活力较高的菌株，应该选择__________（填“A”或“B”）菌落进一步纯化。 (3)如果上图所示的平板培养基上除了上述A、B菌落外，还明显存在着另外一个菌落，但菌落周围并没有出现透明圈，据上述培养条件推测形成该菌落的微生物应属于__________生物。 （二）枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株（B菌），从中克隆得到了一种纤维素酶（酶）基因。将获得的酶基因与高效表达载体（HT质粒）连接，再导入B菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。 (4)对克隆到的酶基因测序，与数据库中的酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白的氨基酸序列相同，这是因为________________________________________。 (5)酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为。为了使酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接，克隆酶基因时在其两端添加了SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是____________________。酶切后的酶基因需要在__________酶的作用下与HT质粒连接构建基因表达载体。一个基因表达载体的组成必须有启动子、终止子、复制原点、__________、__________等。 (6)转化形成工程菌的过程中，应先用__________处理枯草芽孢杆菌，使其处于容易吸收周围DNA的状态。 (7)将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1不进行处理，对照组2进行相应处理。在相同条件下培养96小时，检测培养基中纤维素的含量。图2结果说明工程菌降解纤维素的能力最强，推测对照组2的处理应为______________________________。 答案第1页，共2页 1 学科网（北京）股份有限公司 $………………○………………外………………○………………装………………○………………订………………○………………线………………○……………… ………………○………………内………………○………………装………………○………………订………………○………………线………………○……………… 此卷只装订不密封 ………………○………………内………………○………………装………………○………………订………………○………………线………………○……………… ………………○………………外………………○………………装………………○………………订………………○………………线………………○……………… … 学校：______________姓名：_____________班级：_______________考号：______________________ 2025-2026学年高二生物下学期单元自测 第四章 基因工程 （测试时间：75分钟 满分：100分） 1、 单选题（本部分包括20题，每题2分，共计40分。每题只有一个选项最符合题意。) 1．在判断抗虫基因是否成功转入棉花基因组的方法中，不属于分子检测的是 A．检测目的基因表达产物蛋白质能否与特定抗体形成杂交带 B．检测目的基因片段与DNA探针能否形成杂交带 C．检测目的基因转录形成的mRNA与DNA探针能否形成杂交带 D．通过观察害虫吃棉叶是否死亡 2．下列有关重组DNA技术所需的三种基本工具的描述，正确的是（　　） A．限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列 B．限制酶切割DNA分子一次可断开2个磷酸二酯键，产生2个游离的磷酸基团 C．有些DNA连接酶既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，又能连接双链DNA片段的平末端，从而恢复被限制酶切开的氢键 D．作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选 3．基因治疗是指：(    ) A．运用人工诱变的方法，使有基因缺陷的细胞发生基因突变而恢复正常 B．运用基因工程技术，把有缺陷的基因切除，达到治疗疾病的目的 C．把健康的外源基因导入到有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的 D．对有缺陷的基因进行修复，使其恢复正常，达到治疗疾病的目的 4．转基因技术是指利用分子生物学和基因工程的手段，将某种生物的基因转移到其他生物物种中，使其出现原物种不具有的新性状的技术。转基因技术实现的变异类型是（    ） A．基因重组 B．基因突变 C．染色体结构变异 D．染色体数目变异 5．农杆菌转化法是植物基因工程中常用的将重组DNA分子导入受体细胞的方法，常见转化过程如图所示，其中①-④表示相关过程。在转化拟南芥时可使用蘸花法：待拟南芥开花后将花序浸润在农杆菌悬液中1-2min，农杆菌会随着萌发的花粉管进入胚囊，含目的基因的表达载体进入胚囊中的卵细胞，受精后待果实成熟，即可获得含有目的基因的拟南芥种子。下列叙述错误的是（　　） A．图中②③过程需要严格控制生长素和细胞分裂素类似物的比例 B．过程③获得的转基因试管苗中，单个细胞内可能同时存在多个BURY基因 C．蘸花法转化拟南芥前去掉已形成的果实，有利于提高含目的基因种子的比例 D．两种转化法均可在当代获得转基因植株，并在当代完成转基因性状的鉴定 6．下列有关DNA的粗提取与鉴定实验的叙述，正确的是（    ） A．猪成熟的红细胞不宜选作DNA粗提取材料 B．等体积鸡（2n=78）的血液和鸭（2n=78）的血液提取的DNA量相等 C．切碎的洋葱中，加入洗涤剂和食盐后研磨有利于去除细胞壁 D．用棕色瓶收集并保存好剩余的二苯胺试剂，以备下一次实验时继续使用 7．2020年诺贝尔化学奖授予两位女科学家以表彰她们“开发出一种基因组编辑方法”。CRISPR/Cas9 基因组编辑系统工作原理如图所示，关于此技术的解释错误的是（    ） A．Cas9为一种能使磷酸二酯键断裂的酶 B．DNA-RNA杂交区域不存在T-A碱基对 C．在单链向导RNA中也存在碱基互补配对 D．人为改变向导RNA的序列可实现对特定基因的切割 8．DNA分子探针能用于检测（    ） A．甲亢患者 B．乙肝患者 C．坏血病 D．缺铁贫血病患者 9．培养转基因的高等动物时，常采用的受体细胞是（    ） A．卵母细胞 B．受精卵 C．胚胎干细胞 D．乳腺细胞 10．利用苏云金芽孢杆菌的抗虫基因培育的抗虫棉是否成功，最好检测 （   ） A．是否有抗生素产生 B．是否有目的基因表达 C．是否有抗虫的性状出现 D．是否能分离到目的基因 11．荧光蛋白的发现可以说是革新了生物学研究，下列叙述错误的是（    ） A．荧光蛋白中一定含有C、H、O、N四种元素 B．荧光蛋白可作为标记蛋白，用于研究癌细胞的转移 C．利用PCR技术准确扩增出荧光蛋白基因的关键是引物的正确设计 D．为了确保荧光蛋白基因在受体细胞中表达，应在荧光蛋白基因的下游添加启动子 12．蚯蚓富含金属硫蛋白（MT）等重金属结合蛋白能选择性吸收土壤中的镉。利用一定技术可将蚯蚓MT基因转入烟草，流程如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．过程③把重组质粒导入大肠杆菌的主要目的是对MT基因进行扩增 B．过程④中携带有目的基因的Ti质粒进入烟草愈伤组织细胞，并整合到植物细胞的染色体上 C．转基因产品即具有潜在的巨大经济效益，也可能存在一定的风险性 D．观察测定烟草是否表现出MT等蛋白并稳定遗传，是判断转基因成功的直接证据。 13．β-葡萄糖苷酶参与水解纤维素，最终得到单体葡萄糖。在食品、医药等方面发挥重要作用。下图为β-葡萄糖苷酶在不同温度条件下分别处理20min、60min、120min后相对酶活性变化的实验结果。下列叙述正确的是（    ） A．该实验的因变量有温度、处理时间 B．该酶相对活性随温度升高、处理时间延长而降低 C．低温条件下该酶与底物结合发生作用过程中，其空间结构没有改变 D．可利用蛋白质工程改造该酶分子的结构，提高其在高温环境下的活性 14．“筛选”是生物工程中常用的技术手段，下列关于筛选的叙述正确的是（    ） A．将转化后的菌悬液接种到平板后，可利用核酸分子杂交技术筛选含目的基因的菌落 B．经过体细胞核移植形成的胚胎，在移植前往往需要筛选特定性别的胚胎 C．单抗制备过程中，细胞融合后利用选择培养基筛选产生特定抗体的杂交瘤细胞、 D．酶解法获得原生质体后，可利用质壁分离与复原实验筛选出活力强的原生质体 15．如图是有关真核细胞中某DNA片段和tRNA的图示，以下说法正确的是（    ） A．某限制性核酸内切酶能识别图一中的碱基序列，并在切割后形成一个黏性末端 B．图二中的m表示氨基酸，该tRNA是由相应的基因转录而来 C．用PCR扩增技术扩增含有图一片段的DNA时，需加入DNA聚合酶使③断开 D．将图一DNA分子在含14N原料的条件下复制两次，子代DNA中不含有15N的DNA占3/4 16．下图是一种靶向基因敲除技术即TALEN技术。该技术的敲除工具是由DNA识别域TALE和非特异性核酸内切酶FoKI两个部分组成的蛋白质。TALE的二连氨基酸(字母N、I、G、H、D分别代表一种氨基酸)与四种碱基(A、G、C、T)有恒定的对应关系。FoKI是一种形成二聚体后具有核酸内切酶活性的蛋白单体。下列相关叙述错误的是（    ） A．单独使用FoKI对基因的切割敲除具有随机性 B．TALE蛋白的合成通常涉及PCR技术和蛋白质工程 C．二连氨基酸能与四种含氮碱基发生恒定的碱基互补配对 D．TALE蛋白左右臂的二连氨基酸序列的设计依据靶基因碱基序列 17．下列关于PCR技术及凝胶电泳鉴定的说法，正确的是（    ） A．DNA分子在凝胶中的迁移速率与DNA分子大小、形状、所带电荷等有关，与凝胶无关 B．若以某DNA片段作为模版，5次循环后理论上反应物中应有32个这样的DNA片段 C．PCR所用的解旋酶和DNA聚合酶都具有耐高温的特性 D．凝胶中的DNA分子可以直接在光下被检测 18．在基因工程操作中，通常需要利用质粒作为载体将基因送入受体细胞。如图1所示为pUC18/19的结构示意图（AmpR是氨苄青霉素抗性基因），pUC18和pUC19除了MCS序列不同外，其他序列完全相同。图2为pUC18和MCS序列。以下相关叙述正确的是（　　） A．由环状质粒pUC18/19得到图2中的单链结构，只需要用到DNA解旋酶 B．由质粒pUC18和pUC19形成的图2中的单链，彼此不能完全互补配对 C．用BcgⅠ限制酶对质粒和目的基因进行酶切，导入成功的受体细胞的培养基中不需要添加氨苄青霉素 D．若将基因表达载体导入大肠杆菌细胞中，需使细胞处于兴奋状态 19．进行PCR实验时，下列操作不能提高扩增特异性的是（    ） A．提高模板DNA的纯度 B．引物浓度远高于初始模板DNA的浓度 C．降低退火的温度 D．提高引物的长度和GC的比例 20．大肠杆菌通过一系列酶促反应可将苏氨酸转化为异亮氨酸，苏氨酸脱水酶是其中一个关键酶。当异亮氨酸浓度较高时，异亮氨酸可与苏氨酸脱水酶结合，抑制酶活性。科学家利用蛋白质工程技术改造苏氨酸脱水酶中异亮氨酸的结合位点，获得高产菌株。下列叙述正确的是（　　） A．异亮氨酸抑制苏氨酸脱水酶活性属于负反馈调节，有利于异亮氨酸的生产 B．改造大肠杆菌时，需用基因工程技术改变苏氨酸脱水酶基因的核苷酸序列 C．在发酵过程中，将苏氨酸从发酵液中移除可显著提高该高产菌株的发酵效率 D．增加传代次数有利于维持该高产菌株遗传性状和生产能力的稳定性 二、非选择题（本题共5题，除特别标注外，每空1分，共60分） 21．19世纪末，巴斯德开创了第一次疫苗革命，其特点是接种灭活或减毒的病原微生物。20世纪70年代开始，现代生物技术的迅猛发展开创了第二次疫苗革命，使疫苗的研制进入分子水平。图1是通过基因工程制备乙型肝炎表面抗原（HbsAg）从而获得乙肝疫苗的过程，数字①-⑦为相关步骤。 在图1步骤①和③中，需要用合适的限制酶切割乙肝表面抗原基因和质粒。乙肝表面抗原基因及质粒的部分限制酶的识别序列及位置如图2。启动子是质粒中基因得以正常表达所必需的部分。LacZ基因控制合成某种酶，该酶能将无色染料X-gal变成蓝色，最终能在含无色染料X-gal的培养基上将含该基因的菌落染成蓝色。 (1)在图1步骤④中，使用的基因工程工具酶是_____，将一个乙肝表面抗原基因与一个质粒重组的过程中，游离的磷酸基团数目减少_____个。 (2)根据图2，为了避免自身环化及便于筛选，切割质粒选用的限制酶是_____，获得乙肝表面抗原基因选用的限制酶是_____。 (3)为筛选含有乙肝表面抗原的大肠杆菌细胞，需要将大肠杆菌接种到含_____的固体培养基上，挑选_____的菌落纯化培养。 (4)若运用PCR技术检测乙肝表面抗原基因是否导入，需根据目的基因的序列设计_____，利用待检DNA为模板进行PCR。PCR过程包括多次循环，每个循环分为3个步骤：_____→_____→延伸。若基因导入成功PCR过程中至少复制_____次可以得到两条链等长的目的基因。 22．-1，3葡聚糖酶可以水解许多病原真菌细胞壁外层的-1，3葡聚糖和几丁质，降解真菌细胞壁，从而抑制真菌的生长与繁殖。研究人员在植物中克隆到-1，3葡聚糖酶基因（BG2）并转入苹果主栽品种，以减少苹果真菌病害、实现无公害生产。 (1)BG2的克隆可利用_______技术，这需要一小段能与该基因碱基序列互补配对的_______作为引物，在体外对目的基因进行大量复制，常采用_______来鉴定产物。 (2)下图为利用PATC940（经农杆菌Ti质粒改造获得）构建BG2抗病质粒的过程。图中右下处的酶为_______，人工设计的复合启动子的作用是驱动转录和提高转录活性，它位于目的基因（BG2）的_______（填“上游”或“下游”）。XbaI酶切后的末端与SpeI酶切后的末端能连接是因为_______。    (3)研究人员将转入BG2抗病质粒的农杆菌与苹果外植体共培养，以进行遗传转化。目的基因BG2将随着_______转移到被侵染的细胞而进入细胞，并随其整合到该细胞的_______上。 (4)在完成遗传转化后，选择培养基中至少要加入两种抗生素，请推测其作用分别是：一种用于_______，另一种用于_______。 23．最初从多管水母属中分离出的绿色荧光蛋白（GFP）基因，现已广泛地应用于基因工程中载体上的标记基因。烟草花叶病毒（TMV）是造成烟草产量损失的主要病毒。某科研团队设计了利用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）快速筛选表达TMV外壳蛋白基因（CP）的转基因烟草品系（该品系能抑制病毒的复制，从而显著延缓病毒感染的发生），设计过程如下图。    回答下列问题： (1)获取外源基因： ①为了获得TMV的外壳蛋白基因（CP），先要分离得到TMV的外壳蛋白，分析该蛋白质的氨基酸序列和相应的核苷酸序列，再利用_____________法获得该外源基因。 ②野生型GFP是由238个氨基酸组成的单体蛋白，首先需要在基因数据库中检索获取GFP基因的编码序列，并采用____________中结合PCR的定点突变等技术，设计和改造GFP中第64、65号2个氨基酸后，成为EGFP使其荧光强度提高35倍。对于该基因的检测，通常需进一步通过____________鉴定，而不用PCR产物凝胶电泳的结果，原因是____________。③用一定的方法将CP基因和EGFP基因连接获得CP-EGFP融合基因。 (2)利用表达载体构建重组DNA分子： 用不同的限制性内切核酸酶对含CP-EGFP融合基因的DNA片段和表达载体Ti质粒进行处理，使它们的两端各自形成____________的黏性末端，从而避免基因片段和质粒的自身环化和反向连接。然后用DNA连接酶将CP-EGFP融合基因和Ti质粒连接形成重组Ti质粒，其中CP-EGFP融合基因插入质粒的____________中。 (3)重组DNA分子转化受体细胞（根癌农杆菌和烟草叶片细胞）： ①先将根癌农杆菌放于低温、低浓度的CaCl2溶液中，造成细胞膨胀，____________改变，成为感受态细胞。再在低温条件下将根癌农杆菌与重组Ti质粒混合培养在____________培养基中，最后进行短暂的热刺激处理，使CP-EGFP融合基因转入根癌农杆菌细胞。②用筛选、鉴定后的重组根癌农杆菌去侵染消毒后的离体烟草叶片时，____________的叶片会产生酚类化合物，诱导根癌农杆菌质粒上vir系列基因表达形成特异性内切酶和DNA聚合酶等，进而从质粒上____________出特定DNA片段并整合到烟草叶片细胞的染色体上。转化完成后需及时用____________的抗生素进行脱菌操作。 (4)检测目的基因及其表达产物： 将处理后的烟草叶片在相应的MS培养基上培养成试管苗，该培养基一般不添加葡萄糖而是添加蔗糖，其原因有：相同物质的量浓度下蔗糖比葡萄糖提供更多的能量，还有____________（写出1点）。为检验CP基因是否转入并成功表达，可直接检测组培苗烟草叶片细胞中是否具有____________的特征，省去了分子水平的检测步骤，大大降低了工作量。 (5)为什么转入CP基因（非抗性基因）的烟草植株具有对抗TMV的感染能力?科研团队的研究结果表明：CP基因转录的RNA以反义方式作用于病毒的____________，或同模板竞争复制酶而干扰病毒的复制，并且抗性过程需要外壳蛋白的直接参与。 24．干扰素是一类具有抗病毒、抑制细胞增殖等多种功能的糖蛋白。研究发现鼹鼠纤维母细胞体外培养时，细胞增殖到一定程度会分泌β-干扰素，使这些细胞迅速死亡。研究人员通过基因工程的方法获得β干扰素。回答下列问题： (1)获取目的基因：提取纤维母细胞的mRNA，在逆转录酶的催化下得到cDNA并进行PCR扩增。在设计PCR引物时，通常需要在引物的______端添加限制酶识别序列，以便构建表达载体。将PCR体系各成分加入已灭菌的微量离心管后以3000r/min的转速离心，离心的目的是______。 (2)构建表达载体：选用的质粒为pBR322（结构如下图所示），图中①属于______。启动子是一段有特殊结构的DNA片段，能被______识别并结合，驱动基因的转录。为避免目的基因的反向连接和自身环化，提高表达载体的获得率，应选用限制酶______切割pBR322和干扰素基因，后获得重组质粒。 (3)筛选含重组质粒的大肠杆菌：科研人员将表达载体导入大肠杆菌后，采用了影印法筛选目标菌种，部分操作过程及结果如下图所示，即用无菌的线毡布压在添加______的培养基A上，带出少许菌种，平移并压在添加______的培养基B上。符合要求的大肠杆菌菌落是______（填培养基中数字），理由是______。    (4)干扰素的生物活性测定 ①干扰素安全浓度测定：非洲绿猴肾细胞（Vero）常用于干扰素活性测定，将Vero细胞系接种到多孔细胞培养板中，培养24h后向各孔内加入______，并设置多个重复组，同时设置对照组。继续培养24h，测定各组细胞存活率。实验结果表明，干扰素对细胞的影响呈浓度依赖性，在浓度低于25μg/mL时，对细胞无毒性，安全浓度范围为0-25μg/mL。 ②抗病毒活性的测定：检测不同浓度干扰素影响下VSV病毒（可用Vero细胞培养）的增殖情况，请完善实验思路： a.将30μg/mL的干扰素______。 b._______________________________。 c.继续培养24h，试验组每孔接入相同浓度的VSV病毒。 d.培养至对照组有75%的Vero细胞出现病变时，检测各组VSV病毒的拷贝数。 25．（一）研究人员欲从土壤中筛选高淀粉酶活性的目标菌研究。回答下列问题： (1)为筛选胞外淀粉酶分泌型菌种，一般从__________（A．果园树下  B．肉类加工厂周围  C．米酒厂周围  D．枯树周围）获得土样，用无菌水稀释，接种至以__________为唯一碳源的固体培养基上进行培养，另外，该培养基还应含有氮源、水、无机盐、生长因子和__________。 (2)微生物菌种纯化时，为得到单菌落，最常用的两种接种方法是__________和__________。从土壤中筛选目标菌时，加碘液染色后，平板上出现了A、B两种菌落（如下图所示）。如果要得到淀粉酶活力较高的菌株，应该选择__________（填“A”或“B”）菌落进一步纯化。 (3)如果上图所示的平板培养基上除了上述A、B菌落外，还明显存在着另外一个菌落，但菌落周围并没有出现透明圈，据上述培养条件推测形成该菌落的微生物应属于__________生物。 （二）枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株（B菌），从中克隆得到了一种纤维素酶（酶）基因。将获得的酶基因与高效表达载体（HT质粒）连接，再导入B菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。 (4)对克隆到的酶基因测序，与数据库中的酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白的氨基酸序列相同，这是因为________________________________________。 (5)酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为。为了使酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接，克隆酶基因时在其两端添加了SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是____________________。酶切后的酶基因需要在__________酶的作用下与HT质粒连接构建基因表达载体。一个基因表达载体的组成必须有启动子、终止子、复制原点、__________、__________等。 (6)转化形成工程菌的过程中，应先用__________处理枯草芽孢杆菌，使其处于容易吸收周围DNA的状态。 (7)将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1不进行处理，对照组2进行相应处理。在相同条件下培养96小时，检测培养基中纤维素的含量。图2结果说明工程菌降解纤维素的能力最强，推测对照组2的处理应为______________________________。 试题 第3页（共8页） 试题 第4页（共8页） 试题 第1页（共8页） 试题 第2页（共8页） 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 2025-2026学年高二生物下学期单元自测 第四章 基因工程 （测试时间：75分钟 满分：100分） 1、 单选题（本部分包括20题，每题2分，共计40分。每题只有一个选项最符合题意。) 1．在判断抗虫基因是否成功转入棉花基因组的方法中，不属于分子检测的是 A．检测目的基因表达产物蛋白质能否与特定抗体形成杂交带 B．检测目的基因片段与DNA探针能否形成杂交带 C．检测目的基因转录形成的mRNA与DNA探针能否形成杂交带 D．通过观察害虫吃棉叶是否死亡 【答案】D 【分析】考点是基因工程的程序，主要考查目的基因的检测与表达，属于识记水平的考查。 【详解】检测目的基因表达产物蛋白质能否与特定抗体形成杂交带，采用的是抗原-抗体杂交技术，属于分子水平上的检测，A正确。 检测目的基因片段与DNA探针能否形成杂交带，采用的是DNA分子杂交技术，属于分子水平上的检测，B正确。 检测目的基因转录形成的mRNA与DNA探针能否形成杂交带，采用的是分子杂交技术，属于分子水平上的检测，C正确。 通过观察害虫吃棉叶是否死亡，属于个体水平上的鉴定，D错误。 2．下列有关重组DNA技术所需的三种基本工具的描述，正确的是（　　） A．限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列 B．限制酶切割DNA分子一次可断开2个磷酸二酯键，产生2个游离的磷酸基团 C．有些DNA连接酶既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，又能连接双链DNA片段的平末端，从而恢复被限制酶切开的氢键 D．作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选 【答案】B 【分析】1、限制酶： （1）特点：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 （2）识别序列：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。 2、DNA连接酶（将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键）： （1）种类： E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 （2）作用：E.coli DNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段；而T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低。 3、载体（通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞）： （1）质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 （2）质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点供外源DNA片段(基因)插入其中。携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。这些质粒上常有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨某青霉素抗性基因等，便于重组DNA分子的筛选。 【详解】A、大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成，A错误； B、限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，即一条链断1个磷酸二酯键，产生1个游离的磷酸基团，所以限制酶切割DNA分子一次可断开2个磷酸二酯键，产生2个游离的磷酸基团，B正确； C、T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，而不是氢键，C错误； D、作为载体的质粒通常采用抗性基因（四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因）作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选，D错误。 故选B。 3．基因治疗是指：(    ) A．运用人工诱变的方法，使有基因缺陷的细胞发生基因突变而恢复正常 B．运用基因工程技术，把有缺陷的基因切除，达到治疗疾病的目的 C．把健康的外源基因导入到有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的 D．对有缺陷的基因进行修复，使其恢复正常，达到治疗疾病的目的 【答案】C 【详解】基因治疗是指将健康的外源基因导入到有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。属于基因工程的应用。 故选C。 4．转基因技术是指利用分子生物学和基因工程的手段，将某种生物的基因转移到其他生物物种中，使其出现原物种不具有的新性状的技术。转基因技术实现的变异类型是（    ） A．基因重组 B．基因突变 C．染色体结构变异 D．染色体数目变异 【答案】A 【分析】基因工程又叫DNA重组技术，是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 【详解】转基因技术又叫DNA重组技术，是指利用特殊的方法，将特定的目的基因导入受体细胞中，并使之产生可预期的、定向的遗传改变，实现的变异类型是基因重组。 故选A。 5．农杆菌转化法是植物基因工程中常用的将重组DNA分子导入受体细胞的方法，常见转化过程如图所示，其中①-④表示相关过程。在转化拟南芥时可使用蘸花法：待拟南芥开花后将花序浸润在农杆菌悬液中1-2min，农杆菌会随着萌发的花粉管进入胚囊，含目的基因的表达载体进入胚囊中的卵细胞，受精后待果实成熟，即可获得含有目的基因的拟南芥种子。下列叙述错误的是（　　） A．图中②③过程需要严格控制生长素和细胞分裂素类似物的比例 B．过程③获得的转基因试管苗中，单个细胞内可能同时存在多个BURY基因 C．蘸花法转化拟南芥前去掉已形成的果实，有利于提高含目的基因种子的比例 D．两种转化法均可在当代获得转基因植株，并在当代完成转基因性状的鉴定 【答案】D 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建（核心）；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、图中②③过程表示脱分化和再分化过程，需要严格控制生长素和细胞分裂素类似物的比例，以诱导细胞的增殖和分化，A正确； B、过程③获得的转基因试管苗中，由于农杆菌转化植物细胞，可多次插入目的基因，故过程③获得的转基因试管苗中，单个细胞内可能同时存在多个BURY基因，B正确； C、蘸花法转化拟南芥后所得种子可能含有目的基因，而转化前已形成的果实中的种子均不含目的基因，故需要在转化前去掉，有利于提高含目的基因种子的比例，C正确； D、农杆菌转化法可在当代获得转基因植株，蘸花法转化法先获得含目的基因的种子，种子再种下去长成转基因植株，即在下一代中获得转基因植株，D错误。 故选D。 6．下列有关DNA的粗提取与鉴定实验的叙述，正确的是（    ） A．猪成熟的红细胞不宜选作DNA粗提取材料 B．等体积鸡（2n=78）的血液和鸭（2n=78）的血液提取的DNA量相等 C．切碎的洋葱中，加入洗涤剂和食盐后研磨有利于去除细胞壁 D．用棕色瓶收集并保存好剩余的二苯胺试剂，以备下一次实验时继续使用 【答案】A 【解析】DNA粗提取和鉴定的原理： 1、DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同（DNA在0.14mol/L的氯化钠中溶解度最低）；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。 2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。 3、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、猪成熟的红细胞没有细胞核和细胞器，不含DNA，不宜选作DNA粗提取材料，A正确； B、等体积鸡（2n=78）的血液和鸭（2n=78）的血液中所含血细胞的数量不同，所以提取到的DNA量不同，B错误； C、切碎的洋葱中，加入洗涤剂有利于去除细胞膜，食盐能溶解DNA，C错误； D、二苯胺试剂应该现配现用，D错误。 故选A。 7．2020年诺贝尔化学奖授予两位女科学家以表彰她们“开发出一种基因组编辑方法”。CRISPR/Cas9 基因组编辑系统工作原理如图所示，关于此技术的解释错误的是（    ） A．Cas9为一种能使磷酸二酯键断裂的酶 B．DNA-RNA杂交区域不存在T-A碱基对 C．在单链向导RNA中也存在碱基互补配对 D．人为改变向导RNA的序列可实现对特定基因的切割 【答案】B 【分析】根据题意分析可知：CRISPR/Cas9系统基因编辑技术是利用该基因表达系统中的向导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。由于其他DNA序列也含有与向导RNA互补配对的序列，所以会造成向导RNA错误结合而出现脱靶现象。 【详解】A、Cas9能在特定位置切割DNA，为一种能使磷酸二酯键断裂的酶，A正确； B、DNA上含有A、T、G、C四种碱基，RNA中存在A、U、G、C四种碱基，DNA中的T可与RNA中的A互补配对，所以DNA-RNA杂交区域存在T-A碱基对，B错误； C、在单链向导RNA中也存在部分碱基互补配对，C正确； D、根据图示可知“向导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA”，所以人为改变向导RNA的序列可实现对特定基因的切割，D正确。 故选B。 8．DNA分子探针能用于检测（    ） A．甲亢患者 B．乙肝患者 C．坏血病 D．缺铁贫血病患者 【答案】B 【分析】基因诊断技术它的基本原理是：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交，这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它不仅能在DNA和DNA之间进行，也能在DNA和RNA之间进行，因此，当用一段已知基因的核酸序列作出探针，与变性后的单链基因组DNA接触时，如果两者的碱基完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被测基因组DNA中含有已知的基因序列。 【详解】A、甲亢是由于甲状腺激素分泌过多导致的，不能用DNA分子探针来检测，A错误； B、乙肝是由于乙肝病毒引起的，而乙肝病毒可以用DNA分子探针来检测，B正确； C、坏血病主要是由于缺维生素C引起的，不能用DNA分子探针来检测，C错误； D、缺铁贫血病是由于缺铁引起的，不能用DNA分子探针来检测，D错误。 故选B。 9．培养转基因的高等动物时，常采用的受体细胞是（    ） A．卵母细胞 B．受精卵 C．胚胎干细胞 D．乳腺细胞 【答案】B 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】受精卵的全能性最高，因此要培养转基因的高等动物时，需要选择受精卵作为受体细胞，B正确。 故选B。 10．利用苏云金芽孢杆菌的抗虫基因培育的抗虫棉是否成功，最好检测 （   ） A．是否有抗生素产生 B．是否有目的基因表达 C．是否有抗虫的性状出现 D．是否能分离到目的基因 【答案】C 【详解】鉴定目的基因是否导入成功关键是看能否表达出来，抗虫基因的表达一般对棉花接种棉铃虫，观察其存活情况，来鉴定棉花是否具有抗虫特性，综上所述，C正确，A、B、D不正确。 故选C。 【点睛】本题考查基因工程的相关知识，意在考查考生能理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系，能运用所学知识与观点，形成知识网络的能力。 11．荧光蛋白的发现可以说是革新了生物学研究，下列叙述错误的是（    ） A．荧光蛋白中一定含有C、H、O、N四种元素 B．荧光蛋白可作为标记蛋白，用于研究癌细胞的转移 C．利用PCR技术准确扩增出荧光蛋白基因的关键是引物的正确设计 D．为了确保荧光蛋白基因在受体细胞中表达，应在荧光蛋白基因的下游添加启动子 【答案】D 【分析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 【详解】A、蛋白质的元素组成主要是C、H、O、N，荧光蛋白中一定含有C、H、O、N四种元素，A正确； B、荧光蛋白在一定条件下能发荧光，故可作为标记蛋白，用于研究癌细胞的转移，B正确； C、利用PCR技术准确扩增出荧光蛋白基因的关键是引物的正确设计，设计引物序列的主要依据是目的基因两端的部分核苷酸序列，C正确； D、启动子可用于驱动基因的转录，为了确保荧光蛋白基因在受体细胞中表达，应在启动子下游添加荧光蛋白基因，D错误。 故选D。 12．蚯蚓富含金属硫蛋白（MT）等重金属结合蛋白能选择性吸收土壤中的镉。利用一定技术可将蚯蚓MT基因转入烟草，流程如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．过程③把重组质粒导入大肠杆菌的主要目的是对MT基因进行扩增 B．过程④中携带有目的基因的Ti质粒进入烟草愈伤组织细胞，并整合到植物细胞的染色体上 C．转基因产品即具有潜在的巨大经济效益，也可能存在一定的风险性 D．观察测定烟草是否表现出MT等蛋白并稳定遗传，是判断转基因成功的直接证据。 【答案】B 【分析】基因工程的四个步骤是：获取目的基因，构建基因表达载体，将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定。根据题意和图示分析可知：图中过程①)表示通过反转录法合成相应的 DNA：过程②表示利用 PCR 技术对目的基因进行扩增；过程③表示将目的基因导入大肠杆菌：过程④表示用农杆菌转化法将目的基因导入植物愈伤组织细胞。 【详解】A、过程③把重组质粒导入大肠杆菌的主要目的是利用大肠杆菌对 MT 基因进行扩增，以获得更多的目的基因，A正确； B、过程④表示用农杆菌转化法将目的基因（T-DNA）导入植物愈伤组织细胞，利用农杆菌的Ti质粒可以将目的基因整合到植物的染色体上，Ti质粒并没有进入植物细胞，B错误； C、转基因产品存在一定的安全争议，也带来了巨大的经济效益，C正确； D、MT等重金属结合蛋白能选择性吸收土壤中的镉，判断转基因成功，最直接的即看MT蛋白是否合成并稳定遗传，D正确。 故选B。 13．β-葡萄糖苷酶参与水解纤维素，最终得到单体葡萄糖。在食品、医药等方面发挥重要作用。下图为β-葡萄糖苷酶在不同温度条件下分别处理20min、60min、120min后相对酶活性变化的实验结果。下列叙述正确的是（    ） A．该实验的因变量有温度、处理时间 B．该酶相对活性随温度升高、处理时间延长而降低 C．低温条件下该酶与底物结合发生作用过程中，其空间结构没有改变 D．可利用蛋白质工程改造该酶分子的结构，提高其在高温环境下的活性 【答案】D 【分析】酶的作用条件较温和：在最适宜的温度和pH条件下，酶的活性最高；温度和pH偏高或偏低，酶的活性都会明显降低；在过酸、过碱或温度过高条件下酶会变性失活，而在低温条件下酶的活性降低，但不会失活。 【详解】A、由图可知，该实验的自变量有温度、处理时间，因变量是相对酶活性，A错误； B、由图可知，在37℃之前，该酶的活性随温度的升高而提高，处理60min的酶活性比处理20min的酶活性大，因此无法得出该酶活性随温度、处理时间延长而降低的结论，B错误； C、酶与底物结合发生作用过程中无论低温还是最适温度时，酶的空间结构都会发生可逆性变化，C错误； D、蛋白质工程是一种通过改变蛋白质的结构和功能来实现特定目标的技术。通过改变酶的几个氨基酸或引入二硫键，可以改变酶的结构，从而提高酶的热稳定性，使其在高温环境下保持活性，D正确。 故选D。 14．“筛选”是生物工程中常用的技术手段，下列关于筛选的叙述正确的是（    ） A．将转化后的菌悬液接种到平板后，可利用核酸分子杂交技术筛选含目的基因的菌落 B．经过体细胞核移植形成的胚胎，在移植前往往需要筛选特定性别的胚胎 C．单抗制备过程中，细胞融合后利用选择培养基筛选产生特定抗体的杂交瘤细胞、 D．酶解法获得原生质体后，可利用质壁分离与复原实验筛选出活力强的原生质体 【答案】A 【分析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。 【详解】A、利用基因工程将转化后的菌液接种到平板后，可利用PCR技术或DNA分子杂交技术（利用碱基互补配对原理）筛选含目的基因的菌落，A正确。 B、体细胞核移植形成的胚胎性别与提供体细胞的个体一致，在移植前不需要筛选性别，B错误； C、单抗制备过程中，细胞融合后利用选择培养基筛选成功融合的杂交瘤细胞，在经过细胞克隆化培养和抗体检测，可筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞，C错误； D、质壁分离指原生质层和细胞壁分离，原生质体没有细胞壁，不能发生质壁分离，D错误。 故选A。 15．如图是有关真核细胞中某DNA片段和tRNA的图示，以下说法正确的是（    ） A．某限制性核酸内切酶能识别图一中的碱基序列，并在切割后形成一个黏性末端 B．图二中的m表示氨基酸，该tRNA是由相应的基因转录而来 C．用PCR扩增技术扩增含有图一片段的DNA时，需加入DNA聚合酶使③断开 D．将图一DNA分子在含14N原料的条件下复制两次，子代DNA中不含有15N的DNA占3/4 【答案】B 【分析】每一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且在特定的位点进行切割。细胞中所有的RNA都是由DNA上相应的基因转录而来。DNA复制为半保留复制。 【详解】A、依据教材，该酶为EcorI，识别DNA中的碱基序列为GAATTC，并在GA之间切割，形成了2个黏性末端，A错误； B、tRNA运输的m为氨基酸，tRNA是基因转录产物，B正确； C、PCR扩增技术中③断开不需要酶，是高温使之断开，C错误； D、15N标记的亲代DNA在含14N原料的条件下半保留复制两次后，得到4个子代DNA，其中含有15N的DNA有2个，则不含有15N的DNA占1/2，D错误。 故选B。 16．下图是一种靶向基因敲除技术即TALEN技术。该技术的敲除工具是由DNA识别域TALE和非特异性核酸内切酶FoKI两个部分组成的蛋白质。TALE的二连氨基酸(字母N、I、G、H、D分别代表一种氨基酸)与四种碱基(A、G、C、T)有恒定的对应关系。FoKI是一种形成二聚体后具有核酸内切酶活性的蛋白单体。下列相关叙述错误的是（    ） A．单独使用FoKI对基因的切割敲除具有随机性 B．TALE蛋白的合成通常涉及PCR技术和蛋白质工程 C．二连氨基酸能与四种含氮碱基发生恒定的碱基互补配对 D．TALE蛋白左右臂的二连氨基酸序列的设计依据靶基因碱基序列 【答案】C 【分析】蛋白质工程就是通过对蛋白质化学、蛋白质晶体学和蛋白质动力学的研究，获得有关蛋白质理化特性和分子特性的信息，在此基础上对编码蛋白质的基因进行有目的的设计和改造，通过基因工程技术获得可以表达蛋白质的转基因生物系统，这个生物系统可以是转基因微生物、转基因植物、转基因动物，甚至可以是细胞系统。 【详解】A、FoKI是非特异性核酸内切酶，单独使用FoKI对基因的切割敲除具有随机性，A正确； B、TALE蛋白的合成通常涉及PCR技术（扩增得到很多TALE基因）和蛋白质工程（对基因进行改造，得到很多蛋白质），B正确； C、氨基酸内没有碱基，不能与四种含氮碱基发生恒定的碱基互补配对，只是存在恒定的对应关系，C错误； D、由于TALE的二连氨基酸(字母N、I、G、H、D分别代表一种氨基酸)与四种碱基(A、G、C、T)有恒定的对应关系，TALE蛋白左右臂的二连氨基酸序列的设计依据靶基因碱基序列，D正确。 故选C。 17．下列关于PCR技术及凝胶电泳鉴定的说法，正确的是（    ） A．DNA分子在凝胶中的迁移速率与DNA分子大小、形状、所带电荷等有关，与凝胶无关 B．若以某DNA片段作为模版，5次循环后理论上反应物中应有32个这样的DNA片段 C．PCR所用的解旋酶和DNA聚合酶都具有耐高温的特性 D．凝胶中的DNA分子可以直接在光下被检测 【答案】B 【分析】DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 【详解】A、DNA分子在凝胶中的迁移速率与DNA分子大小、形状、所带电荷等有关，与凝胶浓度有关，A错误； B、若以某DNA片段作为模版，DNA为指数扩增，5次循环后理论上反应物中应有25=32个这样的DNA片段，B正确； C、PCR计数不需要解旋酶，C错误； D、凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 故选B。 18．在基因工程操作中，通常需要利用质粒作为载体将基因送入受体细胞。如图1所示为pUC18/19的结构示意图（AmpR是氨苄青霉素抗性基因），pUC18和pUC19除了MCS序列不同外，其他序列完全相同。图2为pUC18和MCS序列。以下相关叙述正确的是（　　） A．由环状质粒pUC18/19得到图2中的单链结构，只需要用到DNA解旋酶 B．由质粒pUC18和pUC19形成的图2中的单链，彼此不能完全互补配对 C．用BcgⅠ限制酶对质粒和目的基因进行酶切，导入成功的受体细胞的培养基中不需要添加氨苄青霉素 D．若将基因表达载体导入大肠杆菌细胞中，需使细胞处于兴奋状态 【答案】C 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、将环状质粒打开成图2中的单链结构需要用到限制酶（将环状链切割成直链）及DNA解旋酶（解开双链变成单链），A错误； B、pUC18和pUC19除了MCS序列不同外，其他序列完全相同。由图可知，MCS序列已被切割，因此由质粒pUC18和pUC19形成的图2中的单链，彼此能完全互补配对，B错误； C、若使用了BcgⅠ限制酶同时对质粒和目的基因进行酶切，氨苄青霉素抗性基因被切断而失活，故导入成功的受体细胞不能置于含有氨苄青霉素的培养基中，C正确； D、若将基因表达载体导入大肠杆菌细胞中，需用Ca2+处理细胞制备感受态细胞，D错误。 故选C。 19．进行PCR实验时，下列操作不能提高扩增特异性的是（    ） A．提高模板DNA的纯度 B．引物浓度远高于初始模板DNA的浓度 C．降低退火的温度 D．提高引物的长度和GC的比例 【答案】C 【详解】A、提高模板DNA的纯度可减少杂质干扰，避免非特异性扩增，从而提高特异性，不符合题意，A错误； B、引物浓度过高可有利于与模板DNA的结合，可能会提高扩增的特异性，不符合题意，B错误； C、降低退火温度会使引物与模板结合不严格，增加非特异性结合，显著降低特异性，符合题意，C正确； D、增加引物长度和GC比例可提高退火温度及结合特异性，减少非目标扩增，不符合题意，D错误。 故选C。 20．大肠杆菌通过一系列酶促反应可将苏氨酸转化为异亮氨酸，苏氨酸脱水酶是其中一个关键酶。当异亮氨酸浓度较高时，异亮氨酸可与苏氨酸脱水酶结合，抑制酶活性。科学家利用蛋白质工程技术改造苏氨酸脱水酶中异亮氨酸的结合位点，获得高产菌株。下列叙述正确的是（　　） A．异亮氨酸抑制苏氨酸脱水酶活性属于负反馈调节，有利于异亮氨酸的生产 B．改造大肠杆菌时，需用基因工程技术改变苏氨酸脱水酶基因的核苷酸序列 C．在发酵过程中，将苏氨酸从发酵液中移除可显著提高该高产菌株的发酵效率 D．增加传代次数有利于维持该高产菌株遗传性状和生产能力的稳定性 【答案】B 【详解】A、异亮氨酸作为产物抑制苏氨酸脱水酶活性属于负反馈调节，但该调节会减少异亮氨酸的合成，不利于其生产，A错误； B、蛋白质工程通过改造基因的核苷酸序列来改变蛋白质结构，因此需用基因工程技术修改苏氨酸脱水酶基因，B正确； C、高产菌株的酶活性已不受异亮氨酸抑制，移除苏氨酸（反应底物）会减少异亮氨酸的生成，降低效率，C错误； D、传代次数增加可能导致质粒丢失或基因突变，破坏菌株遗传稳定性，D错误。 故选B。 二、非选择题（本题共5题，除特别标注外，每空1分，共60分） 21．19世纪末，巴斯德开创了第一次疫苗革命，其特点是接种灭活或减毒的病原微生物。20世纪70年代开始，现代生物技术的迅猛发展开创了第二次疫苗革命，使疫苗的研制进入分子水平。图1是通过基因工程制备乙型肝炎表面抗原（HbsAg）从而获得乙肝疫苗的过程，数字①-⑦为相关步骤。 在图1步骤①和③中，需要用合适的限制酶切割乙肝表面抗原基因和质粒。乙肝表面抗原基因及质粒的部分限制酶的识别序列及位置如图2。启动子是质粒中基因得以正常表达所必需的部分。LacZ基因控制合成某种酶，该酶能将无色染料X-gal变成蓝色，最终能在含无色染料X-gal的培养基上将含该基因的菌落染成蓝色。 (1)在图1步骤④中，使用的基因工程工具酶是_____，将一个乙肝表面抗原基因与一个质粒重组的过程中，游离的磷酸基团数目减少_____个。 (2)根据图2，为了避免自身环化及便于筛选，切割质粒选用的限制酶是_____，获得乙肝表面抗原基因选用的限制酶是_____。 (3)为筛选含有乙肝表面抗原的大肠杆菌细胞，需要将大肠杆菌接种到含_____的固体培养基上，挑选_____的菌落纯化培养。 (4)若运用PCR技术检测乙肝表面抗原基因是否导入，需根据目的基因的序列设计_____，利用待检DNA为模板进行PCR。PCR过程包括多次循环，每个循环分为3个步骤：_____→_____→延伸。若基因导入成功PCR过程中至少复制_____次可以得到两条链等长的目的基因。 【答案】(1) DNA连接酶 4 (2) BamHⅠ和HindⅢ BclⅠ和HindⅢ (3) 氨苄青霉素和无色染料X-gal 未被染上蓝色的菌落/白色菌落 (4) 引物 变性 退火/复性 3/三 【分析】分析图1：过程①为目的基因的获取；过程②为提取质粒；过程③为用限制酶切割质粒；过程④为基因表达载体的构建中的目的基因与质粒的连接；过程⑤为将目的基因导入大肠杆菌（受体细胞）；过程⑥为大肠杆菌的增殖；过程⑦为目的基因的表达。 【详解】（1）图1中过程④为基因表达载体的构建中的目的基因与质粒的连接，使用的基因工程工具酶是DNA连接酶，催化DNA分子片段中磷酸二酯键的形成；一个乙肝表面抗原基因（含有2个游离的磷酸基团）与一个质粒（被切开的质粒含有2个游离的磷酸基团）重组的过程中（图1的步骤④），游离的磷酸基团数目减少4个。 （2）目的基因中含有限制酶EcoRⅠ的切割位点，因此不能用EcoRⅠ切割外源DNA分子，为了避免自身环化及便于筛选，切割乙肝表面抗原基因选用的限制酶是BclⅠ和HindⅢ。用限制酶BclⅠ切割质粒会破坏启动子，因此切割质粒选用的限制酶是BamHⅠ和HindⅢ（BclⅠ和BamHⅠ切割产生的黏性末端相同）。 （3）构建基因表达载体时使用了限制酶HindⅢ，导致lacZ基因被破坏（导入重组质粒的大肠杆菌不能合成某种酶，不能使无色染料X-gal变成蓝色），但没有破坏氨苄青霉素抗性基因（导入重组质粒的大肠杆菌能抗氨苄青霉素）。为筛选含有乙肝表面抗原的大肠杆菌细胞，需要将导入操作之后的大肠杆菌接种到含氨苄青霉素和无色染料X-gal的培养基上，白色色大肠杆菌菌落（未被染上蓝色的菌落）为所需菌种。 （4）若运用PCR技术检测乙肝表面抗原基因是否导入，需根据目的基因的序列设计引物，引物的作用是使得耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3，端进行子链的延伸；利用待检DNA为模板进行PCR。PCR过程包括多次循环，每个循环分为3个步骤：变性（高温使得DNA解螺旋，DNA的两条链作为模板）→退火／复性（便于引物与DNA模板单链结合）→延伸（合成新的子链）；从目标DNA链中PCR出两条链等长的目的基因需要进行3次PCR循环（第一次循环扩增出来的新片段很长很长；第二次循环以新的长片段为模板进行，但新片段的一端是引物开头的，所以第二个循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离出目的基因；第三次循环，当以第二次循环得到的新片段为模板时，因为这个片段的长度就是需要扩增的长度，当第三次循环完成时，这个片段是需要的长度，且是双链DNA，这就得到了需要的目的基因了）。 22．-1，3葡聚糖酶可以水解许多病原真菌细胞壁外层的-1，3葡聚糖和几丁质，降解真菌细胞壁，从而抑制真菌的生长与繁殖。研究人员在植物中克隆到-1，3葡聚糖酶基因（BG2）并转入苹果主栽品种，以减少苹果真菌病害、实现无公害生产。 (1)BG2的克隆可利用_______技术，这需要一小段能与该基因碱基序列互补配对的_______作为引物，在体外对目的基因进行大量复制，常采用_______来鉴定产物。 (2)下图为利用PATC940（经农杆菌Ti质粒改造获得）构建BG2抗病质粒的过程。图中右下处的酶为_______，人工设计的复合启动子的作用是驱动转录和提高转录活性，它位于目的基因（BG2）的_______（填“上游”或“下游”）。XbaI酶切后的末端与SpeI酶切后的末端能连接是因为_______。    (3)研究人员将转入BG2抗病质粒的农杆菌与苹果外植体共培养，以进行遗传转化。目的基因BG2将随着_______转移到被侵染的细胞而进入细胞，并随其整合到该细胞的_______上。 (4)在完成遗传转化后，选择培养基中至少要加入两种抗生素，请推测其作用分别是：一种用于_______，另一种用于_______。 【答案】(1) PCR 短单链核酸 琼脂糖凝胶电泳 (2) DNA连接酶 上游 Xba1与Spe1酶切后的黏性末端相同 (3) T-DNA 染色体DNA (4) 杀死农杆菌 成功转化质粒细胞(组织)的筛选(检测目的基因是否导入受体细胞) 【分析】PCR技术扩增目的基因（1）原理：DNA双链复制（2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。 【详解】（1）β–1，3葡聚糖酶基因（BG2）在体外大量克隆，可利用PCR技术，PCR技术扩增目的基因时，需要一小段能与该基因（BG2）碱基序列互补配对的短单链核酸（RNA）作为引物，在体外对目的基因进行大量复制，PCR产物鉴定常用的方法是琼脂糖凝胶电泳鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度有关，从而能对BG2进行鉴定。 （2）右下处的酶能构建BG2抗病质粒，将目的基因和质粒连接起来，故该酶为DNA连接酶。人工设计的复合启动子的作用是驱动转录和提高（增强）转录活性，从而保证目的基因的高效表达，位于目的基因（BG2）的上游。XbaⅠ酶切后的末端与SpeⅠ酶切后的末端能连接即黏性末端能发生碱基互补，其能连接是因为Xba1与Spe1酶切后的黏性末端相同。 （3）研究人员将转入BG2抗病质粒的农杆菌与苹果外植体共培养，外植体与农杆菌共培养的目的是利用农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。 （4）在完成遗传转化后，需要杀死农杆菌以及检测含有目的基因的质粒是否成功转入到受体细胞，因此选择培养基中至少要加入两种抗生素，一种用于杀死农杆菌，另一种用于成功转化质粒细胞（组织）的筛选（或检测目的基因是否导入受体细胞）。 23．最初从多管水母属中分离出的绿色荧光蛋白（GFP）基因，现已广泛地应用于基因工程中载体上的标记基因。烟草花叶病毒（TMV）是造成烟草产量损失的主要病毒。某科研团队设计了利用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）快速筛选表达TMV外壳蛋白基因（CP）的转基因烟草品系（该品系能抑制病毒的复制，从而显著延缓病毒感染的发生），设计过程如下图。    回答下列问题： (1)获取外源基因： ①为了获得TMV的外壳蛋白基因（CP），先要分离得到TMV的外壳蛋白，分析该蛋白质的氨基酸序列和相应的核苷酸序列，再利用_____________法获得该外源基因。 ②野生型GFP是由238个氨基酸组成的单体蛋白，首先需要在基因数据库中检索获取GFP基因的编码序列，并采用____________中结合PCR的定点突变等技术，设计和改造GFP中第64、65号2个氨基酸后，成为EGFP使其荧光强度提高35倍。对于该基因的检测，通常需进一步通过____________鉴定，而不用PCR产物凝胶电泳的结果，原因是____________。③用一定的方法将CP基因和EGFP基因连接获得CP-EGFP融合基因。 (2)利用表达载体构建重组DNA分子： 用不同的限制性内切核酸酶对含CP-EGFP融合基因的DNA片段和表达载体Ti质粒进行处理，使它们的两端各自形成____________的黏性末端，从而避免基因片段和质粒的自身环化和反向连接。然后用DNA连接酶将CP-EGFP融合基因和Ti质粒连接形成重组Ti质粒，其中CP-EGFP融合基因插入质粒的____________中。 (3)重组DNA分子转化受体细胞（根癌农杆菌和烟草叶片细胞）： ①先将根癌农杆菌放于低温、低浓度的CaCl2溶液中，造成细胞膨胀，____________改变，成为感受态细胞。再在低温条件下将根癌农杆菌与重组Ti质粒混合培养在____________培养基中，最后进行短暂的热刺激处理，使CP-EGFP融合基因转入根癌农杆菌细胞。②用筛选、鉴定后的重组根癌农杆菌去侵染消毒后的离体烟草叶片时，____________的叶片会产生酚类化合物，诱导根癌农杆菌质粒上vir系列基因表达形成特异性内切酶和DNA聚合酶等，进而从质粒上____________出特定DNA片段并整合到烟草叶片细胞的染色体上。转化完成后需及时用____________的抗生素进行脱菌操作。 (4)检测目的基因及其表达产物： 将处理后的烟草叶片在相应的MS培养基上培养成试管苗，该培养基一般不添加葡萄糖而是添加蔗糖，其原因有：相同物质的量浓度下蔗糖比葡萄糖提供更多的能量，还有____________（写出1点）。为检验CP基因是否转入并成功表达，可直接检测组培苗烟草叶片细胞中是否具有____________的特征，省去了分子水平的检测步骤，大大降低了工作量。 (5)为什么转入CP基因（非抗性基因）的烟草植株具有对抗TMV的感染能力?科研团队的研究结果表明：CP基因转录的RNA以反义方式作用于病毒的____________，或同模板竞争复制酶而干扰病毒的复制，并且抗性过程需要外壳蛋白的直接参与。 【答案】(1) 化学合成 蛋白质工程 基因测序 PCR产物凝胶电泳技术仅能用于分析待测DNA分子的大小，无法确定待测DNA分子的碱基序列 (2) 不同 T-DNA片段 (3) 细胞膜通透性 （LB）液体 带有伤口 切割和复制 根癌农杆菌敏感（或除卡那霉素外的根癌农杆菌敏感而烟草细胞不敏感） (4) 相同质量分数下蔗糖能更好的维持培养基内的低渗环境，使用蔗糖可以在一定程度上减少微生物的污染，使用蔗糖可诱导韧皮部的形成 强绿色荧光 (5)复制模板（或RNA模板或RNA） 【分析】基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 【详解】（1）①获得目的基因的方法可以通过分析该蛋白质的氨基酸序列和相应的核苷酸序列，再利用化学合成方法获得目的基因。 ②要设计和改造GFP中第64、65号2个氨基酸，需要用到蛋白质工程并结合PCR的定点突变等技术。对于该基因改造是否成功的检测，通常需进一步通过基因测序。PCR产物凝胶电泳技术仅能用于分析待测DNA分子的大小，无法确定待测DNA分子的碱基序列，检测不精确所以在这里不使用该方法。 （2）要使含CP-EGFP融合基因的DNA片段和Ti质粒两端产生不同的黏性末端，才能避免基因片段和质粒的自身环化和反向连接，因此可以用不同的限制性核酸内切酶对含目的基因的DNA片段和质粒进行处理。连接形成的重组质粒目的基因要插入到质粒的T-DNA片段中，这样容易转移。 （3）重组DNA分子转化受体细胞使先利用钙离子转化法，改变农杆菌的细胞膜的通透性使之成为感受态细胞，这样重组质粒更容易进入。再在低温条件下将根癌农杆菌与重组Ti质粒混合培养在液体培养基中，最后进行短暂的热刺激处理，使CP-EGFP融合基因转入根癌农杆菌细胞。用筛选、鉴定后的重组根癌农杆菌去侵染消毒后的离体烟草叶片时，带有伤口的叶片会产生酚类化合物，诱导根癌农杆菌质粒上vir系列基因表达形成特异性内切酶和DNA聚合酶等，进而从质粒上切割和复制出根癌农杆菌敏感特定DNA片段并整合到烟草叶片细胞的染色体上。转化完成后需及时用根癌农杆菌敏感的抗生素进行脱菌操作。 （4）MS培养基上培养成试管使加入的能源物质一般用蔗糖而不用葡萄糖是因为相同物质的量浓度下蔗糖比葡萄糖提供更多的能量，其次考虑渗透压，相同质量分数下蔗糖能更好的维持培养基内的低渗环境，使用蔗糖可以在一定程度上减少微生物的污染，使用蔗糖可诱导韧皮部的形成等。为检验CP基因是否转入并成功表达，可直接检测组培苗烟草叶片细胞中是否具有强绿色荧光。 （5）CP基因转录的RNA以反义方式作用于病毒的遗传物质RNA模板，导致病毒的复制受到干扰，因此转入CP基因（非抗性基因）的烟草植株具有对抗TMV的感染能力。 24．干扰素是一类具有抗病毒、抑制细胞增殖等多种功能的糖蛋白。研究发现鼹鼠纤维母细胞体外培养时，细胞增殖到一定程度会分泌β-干扰素，使这些细胞迅速死亡。研究人员通过基因工程的方法获得β干扰素。回答下列问题： (1)获取目的基因：提取纤维母细胞的mRNA，在逆转录酶的催化下得到cDNA并进行PCR扩增。在设计PCR引物时，通常需要在引物的______端添加限制酶识别序列，以便构建表达载体。将PCR体系各成分加入已灭菌的微量离心管后以3000r/min的转速离心，离心的目的是______。 (2)构建表达载体：选用的质粒为pBR322（结构如下图所示），图中①属于______。启动子是一段有特殊结构的DNA片段，能被______识别并结合，驱动基因的转录。为避免目的基因的反向连接和自身环化，提高表达载体的获得率，应选用限制酶______切割pBR322和干扰素基因，后获得重组质粒。 (3)筛选含重组质粒的大肠杆菌：科研人员将表达载体导入大肠杆菌后，采用了影印法筛选目标菌种，部分操作过程及结果如下图所示，即用无菌的线毡布压在添加______的培养基A上，带出少许菌种，平移并压在添加______的培养基B上。符合要求的大肠杆菌菌落是______（填培养基中数字），理由是______。    (4)干扰素的生物活性测定 ①干扰素安全浓度测定：非洲绿猴肾细胞（Vero）常用于干扰素活性测定，将Vero细胞系接种到多孔细胞培养板中，培养24h后向各孔内加入______，并设置多个重复组，同时设置对照组。继续培养24h，测定各组细胞存活率。实验结果表明，干扰素对细胞的影响呈浓度依赖性，在浓度低于25μg/mL时，对细胞无毒性，安全浓度范围为0-25μg/mL。 ②抗病毒活性的测定：检测不同浓度干扰素影响下VSV病毒（可用Vero细胞培养）的增殖情况，请完善实验思路： a.将30μg/mL的干扰素______。 b._______________________________。 c.继续培养24h，试验组每孔接入相同浓度的VSV病毒。 d.培养至对照组有75%的Vero细胞出现病变时，检测各组VSV病毒的拷贝数。 【答案】(1) 5’ 使反应液集中于离心管底部，有利于反应进行 (2) 终止子 RNA聚合酶 BamHⅠ和XhoⅠ (3) 氨苄青霉素 四环素 3、5 组质粒中不含有四环素抗性基因，不能在添加了四环素的培养基B中生长 (4) 同浓度的干扰素溶液 a.稀释配制成系列浓度梯度的干扰素溶液 b.将Vero细胞接种到多孔细胞培养板中，培养24h后每孔加入等量不同浓度的干扰素溶液，同时设置对照组 【分析】基因工程的操作步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 由图可知，由于HindⅢ会破坏启动子，质粒上EcoRⅠ 有两个识别位点，所以应选用限制酶BamHⅠ和XhoⅠ切割pBR322和干扰素基因。 【详解】（1）由于PCR时，子链扩增方向为5'→3'端，在设计PCR引物时，通常需要在引物的5'端添加限制酶识别序列，以便构建表达载体。PCR时，将PCR体系各成分加入已灭菌的微量离心管后以3000r/min的转速离心，可使反应液集中于离心管底部，有利于反应进行，提高PCR的反应速率。 （2）由图可知，箭头为启动子，①为终止子，启动子能被RNA聚合酶识别，启动基因的转录。为避免目的基因的反向连接和自身环化，提高表达载体的获得率，常用两种限制酶切割目的基因和质粒，由于HindⅢ会破坏启动子，质粒上EcoRⅠ 有两个识别位点，所以应选用限制酶BamHⅠ和XhoⅠ切割pBR322和干扰素基因，随后用DNA连接酶连接目的基因和质粒获得重组质粒。 （3）由图可知，质粒中的标记基因为氨苄青霉素抗性基因，所以培养基A添加了氨苄青霉素，可筛选出带有质粒的大肠杆菌，在构建重组质粒时，破坏了四环素抗性基因，所以培养基B中添加了四环素，其上的菌落表示未导入目的基因的大肠杆菌。综上，符合要求的大肠杆菌为3、5。 （4）该实验第一步目的是干扰素安全浓度测定，所以将Vero细胞系接种到多孔细胞培养板中，培养24h后向各孔内加入同浓度的干扰素溶液，培养一定时间后，测定各组细胞存活率。 该实验第二步的目的是抗病毒活性的测定，需检测不同浓度干扰素影响下VSV病毒（可用Vero细胞培养）的增殖情况。所以应将干扰素稀释为不同浓度的干扰素溶液，即自变量是干扰素的浓度，因变量是VSV病毒的增殖情况，故实验可将Vero细胞接种到多孔细胞培养板中，培养24h后每孔加入等量不同浓度的干扰素溶液，同时设置对照组，再继续培养24h，试验组每孔接入相同浓度的VSV病毒，最后检测实验组和对照组中VSV病毒的增殖情况，VSV病毒的增殖数量最少的组对应的浓度为效果较好的浓度。 25．（一）研究人员欲从土壤中筛选高淀粉酶活性的目标菌研究。回答下列问题： (1)为筛选胞外淀粉酶分泌型菌种，一般从__________（A．果园树下  B．肉类加工厂周围  C．米酒厂周围  D．枯树周围）获得土样，用无菌水稀释，接种至以__________为唯一碳源的固体培养基上进行培养，另外，该培养基还应含有氮源、水、无机盐、生长因子和__________。 (2)微生物菌种纯化时，为得到单菌落，最常用的两种接种方法是__________和__________。从土壤中筛选目标菌时，加碘液染色后，平板上出现了A、B两种菌落（如下图所示）。如果要得到淀粉酶活力较高的菌株，应该选择__________（填“A”或“B”）菌落进一步纯化。 (3)如果上图所示的平板培养基上除了上述A、B菌落外，还明显存在着另外一个菌落，但菌落周围并没有出现透明圈，据上述培养条件推测形成该菌落的微生物应属于__________生物。 （二）枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株（B菌），从中克隆得到了一种纤维素酶（酶）基因。将获得的酶基因与高效表达载体（HT质粒）连接，再导入B菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。 (4)对克隆到的酶基因测序，与数据库中的酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白的氨基酸序列相同，这是因为________________________________________。 (5)酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为。为了使酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接，克隆酶基因时在其两端添加了SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是____________________。酶切后的酶基因需要在__________酶的作用下与HT质粒连接构建基因表达载体。一个基因表达载体的组成必须有启动子、终止子、复制原点、__________、__________等。 (6)转化形成工程菌的过程中，应先用__________处理枯草芽孢杆菌，使其处于容易吸收周围DNA的状态。 (7)将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1不进行处理，对照组2进行相应处理。在相同条件下培养96小时，检测培养基中纤维素的含量。图2结果说明工程菌降解纤维素的能力最强，推测对照组2的处理应为______________________________。 【答案】(1) C 淀粉 琼脂 (2) 稀释涂布平板法 平板划线法 B (3)自养型 (4)密码子具有简并性，发生碱基的改变仍然编码同一种氨基酸 (5) BamHⅠ、SmaⅠ（顺序不能调换） DNA连接酶 目的基因 标记基因（抗性基因） (6) (7)接种（等量）B菌 【分析】1、无菌操作包括灭菌和消毒两种方式，消毒的方法有巴氏消毒法、酒精消毒、煮沸消毒法；灭菌的方法有干热灭菌、灼烧灭菌和高压蒸汽灭菌。 2、微生物的接种：微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，常用来统计样品活菌数目的方法是稀释涂布平板法。 3、限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。 【详解】（1）在果园、肉类加工厂周围、酒厂周围，草炭土这四个地方，肉类加工厂含有的蛋白质最多，故其周围含有的胞外蛋白酶分泌型菌种最多。因此筛选胞外蛋白酶分泌型菌种，一般从C肉类加工厂周围获得土样。土样用经高压蒸汽灭菌的蒸馏水稀释，接种至以淀粉为唯一碳源的固体培养基上进行培养，另外，该培养基还应含有氮源、水、无机盐，生长因子和琼脂。 （2）微生物菌种纯化时，为得到单菌落，最常用的两种接种方法是稀释涂布平板法和平板划线法。淀粉遇碘液变蓝，若细菌产生淀粉酶，那么培养基中的淀粉被分解，会出现透明圈，而且细菌周围的透明圈越大，产生的淀粉酶活性越强。分析题图可知，从土壤中筛选目标菌时，加碘液染色后，平板上B菌落的透明圈较大，说明B菌产生的淀粉酶活力较高，故应该选择B菌落进一步纯化。 （3）菌落周围并没有出现透明圈，即该菌落的微生物没有利用淀粉但却能生长，说明该菌落的微生物应属于自养生物，能自身合成有机物供给自身生长需要。 （4）对克隆到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白的氨基酸序列相同，这是因为密码子具有简并性，发生碱基的改变仍然编码同一种氨基酸。 （5）C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'，即转录是从DNA链的3'端开始，再结合质粒中启动子的方向可知，图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是BamHⅠ、SmaⅠ。酶切后的 C1酶基因需要在DNA连接酶的作用下与HT质粒连接构建基因表达载体。一个基因表达载体的组成必须有启动子、终止子、复制原点、目的基因、标记基因等。 （6）枯草芽孢杆菌应先用Ca2+处理，使其处于能吸收周围DNA的感受态状态，有利于转化形成工程菌。 （7）将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1不进行处理，对照组2向培养基中接种接种（等量）B菌。在相同条件下培养96小时，检测培养基中纤维素的含量。结果接种工程菌的一组培养基中纤维素含量最低，说明工程菌降解纤维素的能力最强。 答案第1页，共2页 答案第1页，共2页 学科网（北京）股份有限公司 $ 2025-2026学年高二生物下学期单元自测 第四章 基因工程 一、单选题：本题共20个小题，每小题2分，共40分。 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 D B C A D A B B B C 题号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 答案 D B D A B C B C C B 二、非选择题：本题共5小题，除特别标注外，每空1分，共60分。 21．（10分） (1) DNA连接酶 4 (2) BamHⅠ和HindⅢ BclⅠ和HindⅢ (3) 氨苄青霉素和无色染料X-gal 未被染上蓝色的菌落/白色菌落 (4) 引物 变性 退火/复性 3/三 22．（10分） (1) PCR 短单链核酸 琼脂糖凝胶电泳 (2) DNA连接酶 上游 Xba1与Spe1酶切后的黏性末端相同 (3) T-DNA 染色体DNA (4) 杀死农杆菌 成功转化质粒细胞(组织)的筛选(检测目的基因是否导入受体细胞) 23．（14分） (1) 化学合成 蛋白质工程 基因测序 PCR产物凝胶电泳技术仅能用于分析待测DNA分子的大小，无法确定待测DNA分子的碱基序列 (2) 不同 T-DNA片段 (3) 细胞膜通透性 （LB）液体 带有伤口 切割和复制 根癌农杆菌敏感（或除卡那霉素外的根癌农杆菌敏感而烟草细胞不敏感） (4) 相同质量分数下蔗糖能更好的维持培养基内的低渗环境，使用蔗糖可以在一定程度上减少微生物的污染，使用蔗糖可诱导韧皮部的形成 强绿色荧光 (5)复制模板（或RNA模板或RNA） 24．（12分） (1) 5’ 使反应液集中于离心管底部，有利于反应进行 (2) 终止子 RNA聚合酶 BamHⅠ和XhoⅠ (3) 氨苄青霉素 四环素 3、5 组质粒中不含有四环素抗性基因，不能在添加了四环素的培养基B中生长 (4) 同浓度的干扰素溶液 a.稀释配制成系列浓度梯度的干扰素溶液 b.将Vero细胞接种到多孔细胞培养板中，培养24h后每孔加入等量不同浓度的干扰素溶液，同时设置对照组 25．（14分） (1) C 淀粉 琼脂 (2) 稀释涂布平板法 平板划线法 B (3)自养型 (4)密码子具有简并性，发生碱基的改变仍然编码同一种氨基酸 (5) BamHⅠ、SmaⅠ（顺序不能调换） DNA连接酶 目的基因 标记基因（抗性基因） (6) (7)接种（等量）B菌 / 学科网（北京）股份有限公司 $