3.2 基因工程的基本操作程序（情境专练）生物人教版选择性必修3

第三章 基因工程 第二节 基因工程的基本操作程序情境化练习题 情境创新练（5大知识）+素养拓展练（教材深挖+情境速递） 知识点 1 目的基因的筛选与获取 1．B 2．C 3．C． 知识点 2 基因表达载体的构建 4．B．5．B．6．D． 知识点3 将目的基因导入受体细胞 7．D 8．A 9．B 知识点4 目的基因的检测与鉴定 10．D 11．D 12．C 知识点5 DNA片段的扩增及电泳鉴定实验 13．B 14．C 15．D 二、综合题 16． 【答案】(1)T-DNA (2) HindIII和NotI ① DNA分子的大小和构象 (3) ③② GACTCACTA GAATAGGGC (4) 辅助质粒 ②③④ (5)靶向整合的细胞株中抗PD-L1抗体基因的转录水平（相对mRNA表达量）、蛋白质合成量均高于随机整合细胞株 （一）教材知识链接 1．Taq DNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活. 2．启动子是位于基因上游一段有特殊结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，它能驱动基因转录出mRNA。 3.终止子是位于基因下游的一段有特殊序列结构的DNA片段，使转录在所需要的地方停下来。 4．农杆菌可在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，其所含的Ti质粒上的T－DNA可转移并整合到受体细胞染色体的DNA上。 5．生物界共用同一套遗传密码。 6．原核生物具有繁殖快、多为单细胞遗传物质相对较少等特点。 7.可以防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化和反向连接。 8．DNA都是双螺旋结构，都由四种脱氧核苷酸组成 9．是否导入和转录通过PCR技术检测、是否翻译用相应的抗体进行抗原—抗体杂交 10.目的基因能够在受体细胞的基因和转组中稳定存在，且能够正常表达。 （二）教材深挖拓展 1．答案：限制酶BamH Ⅰ切割产生的黏性末端不正确，限制酶Hind Ⅲ切割产生的黏性末端正确。—G　　　GATCC— —CCTAG　　　G— 限制酶BamH Ⅰ 切割产生的黏性末端应为 2.2a DNA是半保留复制，一开始的模板链最终分布在子代DNA分子中 3.正确 性的目的是通过升高温度破坏氢键，将DNA分子双链解聚为单链，不同片段的DNA分子中氢键的数量不同导致稳定性不同。 4．基因表达载体的构建  ①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；②使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。 5.不能，若将目的基因直接导入受体细胞，目的基因可能被受体细胞分解或无法随细胞分裂进行复制，不能稳定遗传和表达。 6.Ti质粒上的T-DNA片段可以整合到受体细胞的染色体DNA上 7.操作简便；无需组织培养即可获得植株(答出一点即可，其他答案合理也可) （三）新情景素材速递 1、(1)环形DNA。因为仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度为800 bp的DNA片段。 (2各有1个。 (3)200 bp。 2、(1)提示：④为基因表达载体的构建，目的是使目的基因在受体细胞中能稳定存在并传递给下一代，同时能表达和发挥作用。 (2)提示：②表示逆转录，③表示通过PCR获得大量S蛋白基因。获得的S蛋白基因中不含启动子。 (3)提示：新冠病毒的遗传物质为RNA，易发生变异。 学科网（北京）股份有限公司 $ 第三章 基因工程 第二节 基因工程的基本操作程序情境化练习题 情境创新练（5大知识）+素养拓展练（教材深挖+情境速递） 知识点 1 目的基因的筛选与获取 1．（2026高三下·福建厦门·专题练习）KRS是A2基因突变引起的罕见遗传病。某家系患病情况如下图1，已知亲代中I-1的一个A2基因第1306位G替换成A，I-2的一个A2基因第3057位C缺失，其余均正常。提取家系中各人的总RNA，利用结合于1306位上、下游的一对特异性引物进行逆转录PCR，电泳检测结果如下图2。不考虑其它突变，下列叙述错误的是（　　） A．该病遗传方式为常染色体隐性遗传病 B．I-1中A2基因碱基替换导致相应mRNA变长 C．Ⅱ-1的两个A2基因均正常的概率为1/2 D．Ⅱ-2与正常男性婚配，后代不一定患KRS 【答案】B 【知识点】遗传系谱图中遗传方式的判定及应用、基因突变、PCR扩增的原理与过程 【详解】A、Ⅰ-1（正常男性）和I-2（正常女性）生育了患病的Ⅱ-2、Ⅱ-3，符合“无中生有”的隐性遗传特点；且患病个体包含男女，排除伴性遗传，故为常染色体隐性遗传病，A正确； B、I-1的A2基因是1306位G→A 的碱基替换（点突变），利用该位点上下游引物扩增cDNA后出现两条带，说明突变导致mRNA长度变短，可能是碱基替换影响了mRNA的剪接过程，最终mRNA片段缩短，B错误； C、I-1的基因型为A（正常）a₁（1306位突变），I-2的基因型为A（正常）a₂（3057位缺失）。根据分离定律，后代基因型及比例为：AA（1/4）、Aa₁（1/4）、Aa₂（1/4）、a₁a₂（1/4）。其中a₁a₂是患者，而Ⅱ-1是正常个体，凝胶图谱显示不含a1基因，Ⅱ-1含两个正常A基因（AA）的概率为1/2，C正确； D、Ⅱ-2是患者，基因型为a₁a₂。若与正常男性婚配，正常男性的基因型可能是AA（不携带致病基因），此时后代均为杂合子（Aa₁或Aa₂），不患KRS；仅当正常男性是携带者（Aa₁或Aa₂）时，后代才可能患病。因此后代不一定患KRS，D正确。 故选B。 2．（2026高三下·福建厦门·专题练习）蛛丝蛋白是一种特殊纤维蛋白，有强度高、韧性大等特点，在纺织、医疗、军工等多领域具有广阔的应用前景。利用PCR技术扩增蛛丝蛋白基因，可用于蛛丝蛋白的规模化生产。下列叙述正确的是（　　） A．耐高温的DNA聚合酶在PCR扩增的复性和延伸阶段发挥作用 B．PCR扩增蛛丝蛋白基因时，子链的延伸方向是3'→5' C．为使PCR产物能被特定限制酶切割，可在引物的5'端添加对应识别序列 D．限制酶破坏一个PCR产物中的两个磷酸二酯键，可获得两端为黏性末端的蛛丝基因片段 【答案】C 【知识点】PCR扩增的原理与过程 【详解】A、PCR分为变性、复性、延伸三个阶段，耐高温的DNA聚合酶仅在延伸阶段催化子链合成，复性阶段仅发生引物与模板的结合，该酶不发挥作用，A错误； B、PCR扩增蛛丝蛋白基因时，子链的延伸方向是5'→3'，B错误； C、在引物的5′端添加限制酶识别序列，扩增后的产物两端会包含该序列，从而能被相应限制酶切割，C正确； D、要得到两端都是黏性末端的目的片段，需要在PCR产物两端各切割1次，每切割双链DNA的一个切口会破坏2个磷酸二酯键，总共需要破坏4个磷酸二酯键，D错误。 故选C。 3．（25-26高三下·青海西宁·开学考试）某逆转录病毒侵染某真核细胞后，其RNA逆转录形成的双链DNA（V—DNA）整合到宿主细胞的DNA中。研究人员提取宿主细胞的DNA，用特定限制酶切割后连接成环，以环为模板进行PCR扩增V—DNA整合位置两侧的宿主未知序列，从而确定V—DNA的整合位点，如图所示。下列说法正确的是（　　） A．该病毒的RNA逆转录的过程需要逆转录酶和核糖核苷酸 B．将宿主DNA连接成环时用到的限制酶甲、乙需为同种酶 C．理论上用引物F1和F4可扩增出V—DNA中的序列M和N D．PCR呈指数式扩增，若循环4次，理论上需要16个引物 【答案】C 【知识点】中心法则及其发展、PCR扩增的原理与过程、DNA重组技术的基本工具 【详解】A、DNA的基本单位是脱氧核糖核苷酸，病毒逆转录形成双链DNA时，需要逆转录酶的催化作用，需要脱氧核苷酸作为原料，A错误； B、将宿主DNA连接成环时用到的限制酶甲、乙可以是同种酶，也可是切割后获得相同黏性末端的不同种酶，B错误； C、引物需要与模板的3'端结合，耐高温的DNA聚合酶可在引物的3'端延伸子链，因此利用图中的引物F1和F4组合可扩增出两侧的未知序列M和N，C正确； D、扩增循环n次，得到2n个DNA分子，总单链数为2×2n即2n＋1条，只有最初的2条母链不需要引物，因此共需要2n＋1-2个引物，因此若循环4次，理论上需要30个引物，D错误。 故选C。 知识点 2 基因表达载体的构建 4．（2026·江西九江·一模）科研人员为培育转基因大豆，构建了含特定功能元件的基因表达载体（左图为载体部分结构，右图为限制酶BsaⅠ的识别序列及酶切位点），LB/RB是T-DNA的边界序列，Kanr为卡那霉素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，下列说法正确的是（    ） A．经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列相同 B．用PCR技术扩增目的基因时，复性温度越低，扩增产物特异性越低 C．用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有4种 D．应选择含有氨苄青霉素的培养基去筛选成功转化的大豆细胞 【答案】B 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【详解】A、由限制酶BsaⅠ的识别序列及酶切位点可知，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-CAAT-3'和5'-GTTT-3'，A错误； B、用PCR技术扩增目的基因时，复性温度越低，引物与模板的结合特异性越差，非特异性结合增多，扩增产物特异性越低，B正确； C、由限制酶BsaⅠ的识别序列及酶切位点可知，用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端远远多于4种，C错误； D、Kanr是卡那霉素抗性基因，且位于T-DNA上，因此会进入受体细胞，重组Ti质粒通过农杆菌导入大豆细胞后，应使用含卡那霉素的培养基对受体细胞进行筛选，D错误。 故选B。 5．（25-26高三下·河南·开学考试）反向PCR技术是一种用于扩增已知序列两侧未知序列的技术，其基本思路是先将目标DNA进行环化，再以环化的DNA为模板进行扩增，相关过程如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．过程①通常用相同的限制酶分别切割目的基因的两侧 B．过程②需要DNA连接酶催化形成黏性末端碱基间的氢键 C．PCR扩增序列L和序列R时应选择引物1和引物4 D．反向PCR技术获得双链等长的目标产物至少需要扩增3轮 【答案】B 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建 【详解】A、过程①通常用相同限制酶切割是为了获得相同的末端，便于环化，若用不同限制酶切割，通常会产生不同末端，无法环化，A正确； B、DNA连接酶催化形成的是磷酸二酯键，不是氢键，B错误； C、PCR扩增未知序列时，只能从引物的3′端开始延伸，结合图示可知，扩增序列L和序列R时应选择引物1和引物4，C正确； D、反向PCR中，第1轮扩增得到母链环状、子链未成环的DNA，第2轮扩增产物两条链一长一短的线性DNA，第3轮才能获得双链等长的目标产物，D正确； 故选B。 6．（2026·浙江·二模）Cre-LoxP系统是一种重组酶系统，主要由Cre与LoxP两部分组成，Cre是一种酶，能够特异性识别LoxP位点，使2个LoxP位点间的DNA序列被删除，从而实现基因组DNA中特异位点基因的敲除。Cre品系小鼠是体内2号染色体带有Cre重组酶基因的小鼠，flox品系小鼠是在3号染色体的基因2两边都插入了loxP位点的小鼠。现利用两个品系小鼠培育基因2完全敲除的纯合小鼠，下列说法正确的是（　　） A．在两品系小鼠杂交所得F1代中检测到Cre重组酶即可说明Cre-LoxP系统对基因2删除成功 B．要获得肝脏中基因2敲除的小鼠，可在loxP基因序列上游添加肝脏特异性启动子 C．LoxP基因的插入不会改变基因2的碱基序列，因此不属于可遗传变异 D．至少在F2代中才能获得基因2完全敲除的纯合小鼠 【答案】D 【知识点】基因分离定律的实质和应用、基因突变、基因表达载体的构建 【详解】A、F1代检测到Cre重组酶仅说明个体携带Cre基因，若个体未继承两侧插入LoxP位点的基因2等位基因，Cre无法识别靶序列完成基因2的删除，不能说明系统发挥作用，A错误； B、要实现肝脏特异性敲除基因2，需让Cre重组酶仅在肝脏细胞中表达，因此应在Cre基因上游添加肝脏特异性启动子，LoxP是Cre的识别序列，不需要特异性表达，B错误； C、LoxP序列插入后，基因组DNA的总碱基序列发生改变，遗传物质发生了变化，属于可遗传变异，C错误； D、两品系杂交得到的F1代最多为基因2敲除杂合子（仅一条3号染色体的基因2被敲除），F1个体相互交配，最早在F2代可获得两条3号染色体的基因2均被敲除的纯合小鼠，D正确。 故选D。 知识点3 将目的基因导入受体细胞 7．（2026·湖北·一模）密码子偏好性是指在蛋白质合成过程中，不同生物对某些密码子的使用频率表现出明显的倾向性。例如，在大肠杆菌中，70%的亮氨酸由密码子CUA编码；原核生物与真核生物偏好的起始密码子编码序列分别是GTG、ATG等。下列叙述错误的是（    ） A．通过基因工程将某基因导入受体细胞后表达量不高的原因可能是因为密码子的偏好性 B．若要将某细菌的基因导入酿酒酵母，在扩增其基因时，可将其中一个引物的5′-端序列GTG改为ATG C．为满足大肠杆菌的密码子偏好性，可以通过基因改造改变基因的碱基序列 D．为满足生物的密码子偏好性而改造后的基因转录出的mRNA分子数量大幅下降 【答案】D 【知识点】遗传信息的翻译、PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞 【详解】A、不同生物对某些密码子的使用频率有偏好，如果目的基因的密码子在受体细胞中使用频率低，会导致翻译效率低，甚至无法表达。 所以通过基因工程将某基因导入受体细胞后表达量不高的原因可能是因为密码子的偏好性，A正确； B、原核生物与真核生物偏好的起始密码子序列分别是GTG和ATG。若将某细菌的基因导入酿酒酵母，在扩增目的基因时，将其中一个引物的GTG改为ATG，可以让基因在真核细胞中更高效地起始翻译，B正确； C、为满足大肠杆菌的密码子偏好性，通过基因改造改变基因的碱基序列，使其使用大肠杆菌偏好的密码子，能提高翻译效率，C正确； D、改造基因的密码子偏好性时，是对基因的碱基序列进行同义替换，转录出的mRNA的碱基数量不变，因此mRNA分子数量不会大幅下降，D错误。 故选D。 8．（25-26高三下·江苏扬州·开学考试）研究者获得导入S基因的基因编辑小鼠的过程如下图所示，下列相关叙述错误的是（　　） A．过程①一般需要用含促性腺激素的饲料以获得更多卵母细胞 B．过程②存在多种防止多精入卵的机制 C．过程③需将表达载体注射到小鼠的受精卵中 D．过程④无需抑制雌鼠b对植入胚胎的免疫排斥 【答案】A 【知识点】将目的基因导入受体细胞、动物的体外受精、胚胎移植技术 【详解】A、过程①通过注射促性腺激素对供体进行超数排卵处理，获得更多的卵母细胞，但促性腺激素的化学本质是蛋白质，不能放入饲料中饲喂，否则会通过消化作用被分解，A错误； B、受精过程中存在防止多精子入卵的两道屏障是透明带反应和卵黄膜的封闭作用，B正确； C、过程③需将表达载体注射到小鼠的受精卵中，这样获得的胚胎中所有的细胞都带有目的基因，C正确； D、受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应，故过程④不需要抑制雌鼠b对植入胚胎的免疫排斥，D正确。 故选A。 9．（2026·辽宁·模拟预测）某科研团队欲将抗虫基因（Bt基因）导入棉花细胞，培育抗虫棉。现有以下两种导入方案： ①用农杆菌转化法将Bt基因导入棉花细胞； ②在棉花授粉后，将含Bt基因的溶液注入花粉管通道。 下列叙述错误的是（    ） A．方案①普遍适用于双子叶植物和裸子植物，一般单子叶植物不宜使用 B．方案①将Bt基因随机插入Ti质粒后，要先将重组质粒转入农杆菌 C．方案①的最终目的是将Bt基因整合到棉花细胞的染色体DNA上 D．相比方案①，方案②的优势是无需进行植物组织培养即可得到抗虫棉 【答案】B 【知识点】将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 【详解】A、农杆菌转化法利用了Ti质粒中T-DNA的转移特性实现细胞转化，双子叶植物和裸子植物细胞可分泌酚类物质吸引农杆菌，促进T-DNA转移，单子叶植物缺乏此机制，A正确； B、农杆菌转化法操作时，需先将目的基因（Bt基因）插入Ti质粒的T-DNA区域形成重组质粒，再导入农杆菌，利用农杆菌的侵染特性实现转移，B错误； C、方案①中，农杆菌的T-DNA携带Bt基因转移至棉花细胞，随机整合到染色体DNA上，使目的基因稳定遗传和表达，C正确； D、方案②是花粉管通道法，Bt基因会被导入受精卵，受精卵可直接发育成种子，最终长成完整植株，不需要像农杆菌转化法一样对离体受体细胞进行植物组织培养，D正确。 故选B。 知识点4 目的基因的检测与鉴定 10．（25-26高三下·河北衡水·开学考试）某科研团队通过转基因获得了一种大肠杆菌（工程菌），可作为监测残留在生物组织或环境中的四环素水平的“报警器”，其监测原理如下图所示，天然大肠杆菌不含有图中所示基因。（GFP基因是绿色荧光蛋白基因）。下列有关说法正确的是（    ） A．启动子1、2是DNA聚合酶识别和结合的位点，启动基因的转录过程 B．转基因工程菌中TetR基因的表达是GFP基因表达的前提条件 C．转基因工程菌中的GFP基因表达产物还需要内质网等细胞器的加工 D．当环境中存在四环素时，大肠杆菌可在一定条件下发出绿色荧光 【答案】D 【知识点】真核细胞与原核细胞、遗传信息的转录、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【详解】A、启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，启动基因的转录过程，而不是DNA聚合酶，DNA聚合酶参与DNA的复制过程，A错误； B、由图可知，TetR基因表达产生的TetR蛋白会抑制GFP基因的表达，所以TetR基因的表达不是GFP 基因表达的前提条件，B错误； C、大肠杆菌是原核生物，原核生物没有内质网等复杂的细胞器，C错误； D、从图中可以看出，当环境中存在四环素时，四环素与TetR蛋白结合，使得TetR蛋白对GFP基因的抑制作用被解除，从而GFP基因能够表达，大肠杆菌可在一定条件下发出绿色荧光，D正确。 故选D。 11．（2026·福建莆田·二模）科研人员构建荧光素酶基因（G基因）和增强型绿色荧光蛋白基因（E基因）可融合表达的重组质粒，该质粒的部分结构如图1.重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗G蛋白抗体和抗E蛋白抗体分别检测相应蛋白的表达情况，结果如图2（注：条带粗细代表蛋白质含量，条带1所检出的蛋白质的分子量比条带2大）下列叙述正确的是（　　）    A．用PCR检测重组质粒时应选择引物1和引物4 B．表达G-E融合蛋白时是以a链为模板进行转录的 C．出现条带1无法证明受体细胞表达了G-E融合蛋白 D．条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的G基因表达的 【答案】D 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【详解】A、重组质粒的模板链为3'→5'方向，PCR扩增需要引物与模板链的3'端结合。引物1结合在a链5'端，方向与扩增方向不符；引物4结合在b链3'端，方向也不符；正确引物应为引物2和引物3，A错误； B、启动子位于G基因上游（a链的5'端），转录时RNA聚合酶结合启动子，沿5'→3'方向合成RNA，因此模板链是b链（3'→5'），而非a链，B错误； C、据图2可知，用抗G蛋白抗体和抗E蛋白抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是G-E融合蛋白，C错误； D、据图2可知，用抗G蛋白抗体和抗E蛋白抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是G-E融合蛋白；抗G蛋白抗体检测出现条带2，抗E蛋白抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的融合的G基因表达的，D正确。 故选D。 12．（25-26高三下·河南驻马店·开学考试）人乳铁蛋白（hLF）有抑菌、提高免疫力等功能。科研人员构建了含hLF基因的重组质粒pW2-hLF，拟从牛奶中分离提纯hLF，流程如图所示。下列有关分析错误的是（　　） A．选用NruI和MluI切割便于插入启动子。 B．插入终止子时会删除质粒pW1的部分碱基序列 C．用抗原—抗体杂交技术检测hLF基因是否导入受体细胞 D．转基因早期胚胎需要经过性别鉴定、遗传筛查后再移植 【答案】C 【知识点】DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【详解】A、启动子的两端含有Nru I和Mlu I的识别和切割位点，选用Nru I和Mlu I切割便于插入启动子，A正确； B、终止子序列两端含有Mlu I和Not I的识别和切割位点，质粒pW1中原有的部分序列两端也含有Mlu I和Not I的识别和切割位点，因此，插入终止子时会删除质粒pW1中原有的部分序列，B正确； C、检测hLF基因是否导入受体细胞可利用PCR法，抗原-抗体杂交技术用于检测hLF基因是否翻译，C错误； D、实验目的是拟从牛奶中分离提纯hLF，转基因早期胚胎需要经过性别鉴定，也要进行发育检测后才能移植，D正确。 故选C。 知识点5 DNA片段的扩增及电泳鉴定实验 13．（2026·山东临沂·一模）戈谢病患者体内葡萄糖脑苷脂酶（GCASE）活性异常，与体内相关基因的突变密切相关。已知正常基因为G，突变基因G1会导致GCASE轻度缺陷，突变基因G₂会导致GCASE重度缺陷。某研究团队对戈谢病患者的家系进行调查，绘制了该家系的系谱图（图1），并对部分个体的相关基因进行PCR扩增后电泳分离，得到电泳结果（图2）。下列说法错误的是（　　） A．结合系谱图和电泳结果可判断，该病的遗传方式为常染色体隐性遗传 B．基因G突变为G1或G2，根本原因是G发生了碱基对的替换、增添或缺失 C．Ⅲ2的基因型为G1G2，其致病基因G1来源于I4，致病基因G2来源于I1或I2 D．根据Ⅱ5的患病程度不能确定其基因型，可通过电泳技术进一步鉴定 【答案】B 【知识点】遗传系谱图中遗传方式的判定及应用、基因突变、电泳鉴定 【详解】A、分析图 1，Ⅰ1和Ⅰ2正常，却生出了患病的Ⅱ3，无中生有为隐性。再看患病个体Ⅱ3为女性，若为伴X隐性遗传，其父亲Ⅰ1应患病，而Ⅰ1正常，所以可判断该病为常染色体隐性遗传，A正确； B、根据遗传图和电泳图，可以推得Ⅰ4基因型为G1G1，Ⅱ3基因型为 G2G2，则基因①②③分别代表G、G2、G1，说明G基因电泳距离最近，碱基对越多，突变后发生了碱基对的缺失，B错误； C、由图 2 可知Ⅲ2的基因型为 G1G2，Ⅱ3基因型为G2G2，所以G2可能来自Ⅰ1或Ⅰ2，而G1只能来自Ⅰ4，因为Ⅰ4基因型为G1G1，C正确； D、Ⅰ4基因型为G1G1，Ⅰ3基因型为GG1或者GG2，Ⅱ5为轻度患病，其基因型可能是G1G1或 G1G2，仅根据患病程度不能确定其基因型，D正确。 故选B。 14．（25-26高三下·河南·月考）研究人员利用PCR扩增转基因植物基因组中的某段外源基因片段，并通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行鉴定。下列相关叙述正确的是（　　） A．PCR反应体系中只需加入模板DNA、引物和耐高温的DNA聚合酶 B．PCR复性温度与引物的GC含量有关，一般后者含量越高则复性温度越低 C．若将已知长度的DNA标准品加入同一凝胶中，可用于估算其他扩增产物的分子大小 D．3号泳道中的亮度较低，说明样本2植物不含有该基因或该植株为相关基因的杂合子 【答案】C 【知识点】PCR扩增的原理与过程、电泳鉴定 【详解】A、PCR反应体系中需加入模板DNA、引物、耐高温的DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸以及缓冲液等，A错误； B、PCR复性温度与引物的碱基组成（GC含量）有关。一般引物GC含量越高，其解链温度通常越高，所需复性温度也相应提高，B错误； C、DNA标准品含有已知长度的DNA片段，与待测样品在同一凝胶中电泳，通过对比条带迁移位置，可估算未知扩增产物的分子大小，C正确； D、若样本不含有该外源基因，电泳不会出现目的条带；3号泳道出现了与样本1位置一致的目的条带，仅亮度较低，说明含有该基因，只是扩增产物量少，D错误。 故选C。 15．（25-26高三上·福建漳州·期末）为探究DNA片段M与蛋白X结合的位点，研究者获得片段M不同位点的突变体M1、M2和M3，用蛋白X进行结合试验（结合了蛋白X的DNA片段电泳时移动速率受到影响），并用带荧光的片段M作为指示探针进行检测（指示探针可与待测DNA竞争蛋白X），电泳结果如图所示。据结果分析，下列相关叙述错误的是（　　） A．条带2显示没有结合蛋白X的探针所迁移到的位置 B．点样位置位于图中的上方 C．M1的突变位点不影响蛋白X与M1的结合 D．M3与蛋白X的结合强度比M2更大 【答案】D 【知识点】电泳鉴定 【详解】A、条带2是没有结合蛋白X的探针所迁移到的位置，因为在未添加蛋白X的泳道1中，只有条带2，A正确； B、结合蛋白X的DNA片段电泳移动速度变慢，所以条带1（结合蛋白X）的位置比条带2（未结合）更靠上（迁移距离更短），说明点样位置位于图的上方，B正确； C、泳道4（M1）的条带1和泳道2（野生型）的条带1亮度相似，说明M1的突变位点不影响蛋白X与M1的结合，C正确； D、泳道5（M2）的条带1亮度比泳道6（M3）更亮，说明M2与蛋白X的结合强度比M3更大，D错误。 故选D。 二、综合题 16．（25-26高三下·江苏南通·开学考试）抗PD-L1的单克隆抗体可用于癌症的免疫治疗。某研究者利用PiggyBac转座系统将抗PD—L1抗体的基因重组到CHO细胞（源于中国仓鼠的卵巢）中，最终筛选出稳定高效表达外源基因的细胞株。请回答相关问题： 注：NdeI、HindⅢ、NotI为限制酶；EGFP是增强型绿色荧光蛋白基因；Amp是氨苄青霉素抗性基因；Neo是新霉素抗性基因；TR是末端重复序列 (1)PiggyBac转座系统的核心组分是转座子质粒（图1）和辅助质粒（携带转座酶基因）。转座酶可识别转座子质粒中两个TR序列，并将两者间的转座片段切割下来，而后将其插入受体细胞基因组中。由此推测，转座片段的功能和农杆菌Ti质粒上________的功能类似。 (2)转座子质粒中EGFP基因（约750bp）会干扰抗体基因的表达，故研究者应选用限制酶________处理该质粒，并对处理后和未处理的质粒分别进行电泳，结果如图2所示。电泳后应回收图2中条带________位置的DNA作为后续使用，影响条带①③电泳时迁移速率不同的原因是________。 (3)当目的基因末端和载体末端有相同的同源臂序列时，同源重组酶可识别该序列，并从DNA的5'端开始去掉部分核苷酸形成“黏性末端”，进一步处理形成重组DNA．研究者欲利用该原理构建重组质粒，经PCR获取抗PD-L1抗体的基因（图3），应添加的上游和下游引物分别是________（填序号），前者5′端的序列是5′________3′，后者5′端的序列是5′—________3'。（只写出前9个碱基的序列）。 (4)利用PiggyBac转座系统转化时，用脂质体包裹重组质粒和________，将其添加到含CHO细胞的培养基中进行培养，获取转化成功的CHO细胞。该培养基含有G418（小分子有机物），不含新霉素，推测可能的原因是________（填序号）。 ①重组质粒中没有Neor基因 ②新霉素对真核细胞不起作用，G418对真核细胞有毒性 ③Neor基因表达后能使细胞对G418产生抗性 ④转化成功的CHO细胞对G418的抗性强 ⑤新霉素会抑制PiggyBac转座系统中转座酶的活性 (5)目前近80%的重组蛋白均由CHO细胞株生产。但基因随机整合的CHO细胞株在培养过程中往往表现出转基因拷贝数丢失和表观遗传沉默等不利特性，最终降低转基因转录和相应的重组蛋白产量。中国科学家利用CRISPR/Cas9技术首次实现抗PD—L1抗体基因在C12、f35位点的精准靶向整合，检测细胞株中抗PD—L1抗体基因的相对mRNA水平及蛋白质表达情况，结果如图4、图5所示： 注：RA-1、RA-2随机整合细胞株，SA-3、SA-5靶向整合细胞株。β-actin为内参蛋白。 分析结果，培育靶向整合株生产重组蛋白更高效，依据是________。 【答案】(1)T-DNA (2) HindIII和NotI ① DNA分子的大小和构象 (3) ③② GACTCACTA GAATAGGGC (4) 辅助质粒 ②③④ (5)靶向整合的细胞株中抗PD-L1抗体基因的转录水平（相对mRNA表达量）、蛋白质合成量均高于随机整合细胞株 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）转座酶可识别转座子质粒中两个末端重复序列（TR），并将两者间的转座片段切割下来插入受体细胞基因组，转座片段的功能和农杆菌Ti质粒上T-DNA的功能类似。 （2）为去除影响抗体基因表达的EGFP基因，需用切割EGFP基因的限制酶。图1显示EGFP基因两侧有同源a、同源b序列分别含有NotⅠ和HindⅢ的酶切位点，因此选用NotⅠ和 HindⅢ处理质粒。未处理的质粒长度为7077bp，经限制酶处理后会线性化，长度不变，从图2来看，条带①位置的DNA是处理后的质粒DNA，所以电泳后应回收图2中条带①位置的DNA作为后续使用。电泳时未处理的质粒条带相对分子质量大，迁移距离短，处理后的质粒条带相对分子质量小，迁移距离长，即DNA分子的大小和构象导致条带①③电泳时迁移速率不同。 （3）使目的基因末端和载体末端有相同的同源序列，PCR 引物需添加与载体末端互补的序列。且引物是沿5'向3'延伸的，由题意可知，图 1 中转座子质粒的多克隆位点两端序列的编码链上游为5'-GACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTT-3'（同源序列a） 下游为5'-GCGGCCGCGACTCTAGAGGGGCCCTATTC-3'（同源序列b），结合转录方向可知，选用②和③进行扩增目的基因，且引物②应该靠近终止子，引物③（与同源序列a的5'相同）应该靠近启动子区域，因此应在引物③的5'端添加序列GACTCACTA； 对引物②（与同源序列b的3'端互补配对）的5'端添加序列GAATAGGGC。 （4）PiggyBac转座系统需要转座子质粒（含目的基因）和辅助质粒（携带转座酶基因）共同作用，因此需将重组质粒和辅助质粒用脂质体包裹。转座子质粒携带新霉素抗性基因（Neo⁺），该基因表达使细胞对G418有抗性，新霉素对真核细胞不起作用，G418对真核细胞有毒性，转化成功的CHO细胞对G418的抗性强，因此培养基中应含有G418，便于筛选成功转化的CHO细胞。 故选①②③。 （5）分析图4和图5可知，靶向整合的细胞株中抗PD-L1抗体基因的转录水平（相对mRNA表达量）、蛋白质合成量均高于随机整合细胞株，故培育靶向整合株生产重组蛋白更高效。 （一）教材知识链接 3．目前，在PCR反应中使用Taq DNA聚合酶，而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因： Taq DNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活. 4．启动子的位置和生物作用： 启动子是位于基因上游一段有特殊结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，它能驱动基因转录出mRNA。 5.终止子的位置和生物作用： 终止子是位于基因下游的一段有特殊序列结构的DNA片段，使转录在所需要的地方停下来。 6．农杆菌转化法中农杆菌的作用： 农杆菌可在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，其所含的Ti质粒上的T－DNA可转移并整合到受体细胞染色体的DNA上。 7．转移的基因能在受体细胞内表达的原因： 生物界共用同一套遗传密码。 8．原核生物作为转基因受体细胞的优点： 原核生物具有繁殖快、多为单细胞遗传物质相对较少等特点。 9.用两种不同限制酶同时处理质粒和含目的基因的片段的主要优点： 可以防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化和反向连接。 11．不同生物的DNA能拼接的原因： DNA都是双螺旋结构，都由四种脱氧核苷酸组成 12．基因工程检测目的基因是否导入、转录、翻译的方法依次为： 是否导入和转录通过PCR技术检测、是否翻译用相应的抗体进行抗原—抗体杂交 13.目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是 目的基因能够在受体细胞的基因和转组中稳定存在，且能够正常表达。 （二）教材深挖拓展 1．下图是某同学画出的限制酶BamHⅠ 和Hind Ⅲ 切割产生的黏性末端，判断他的写法是否正确？如果不正确，请改正。 答案：限制酶BamH Ⅰ切割产生的黏性末端不正确，限制酶Hind Ⅲ切割产生的黏性末端正确。 限制酶BamH Ⅰ 切割产生的黏性末端应为 —G　　　GATCC— —CCTAG　　　G— 2． 若PCR扩增过程加入模板DNA片段a个，经过n次循环后，产生的DNA片段中含有模板DNA片段的DNA个数为2a个，试分析原因？  DNA是半保留复制，一开始的模板链最终分布在子代DNA分子中 3.某同学认为PCR过程中不同的DNA片段变性时温度是不同的，你认为他的说法正确吗？说明你的理由？              正确 性的目的是通过升高温度破坏氢键，将DNA分子双链解聚为单链，不同片段的DNA分子中氢键的数量不同导致稳定性不同。 4．培育转基因生物的核心工作是基因表达载体的构建 。构建基因表达载体的目的？  ①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；②使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。 5.通过PCR技术获取足够量的目的基因后，能够直接导入受体细胞吗？原因是？ 不能，若将目的基因直接导入受体细胞，目的基因可能被受体细胞分解或无法随细胞分裂进行复制，不能稳定遗传和表达。 6.农杆菌转化法要将目的基因插入农杆菌质粒的T-DNA 片段的原因是？ Ti质粒上的T-DNA片段可以整合到受体细胞的染色体DNA上 7.如果改用花粉管通道法将目的基因导入受体细胞，与农杆菌转化法相比，其具有的优点是？ 操作简便；无需组织培养即可获得植株(答出一点即可，其他答案合理也可) （三）新情景素材速递 1、在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同识别序列的限制酶(R1和R2)处理基因表达载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如下图所示。 试探究： (1)该载体是环形DNA还是链状DNA？说明理由。(科学思维) 环形DNA。因为仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度为800 bp的DNA片段。 (2)两种限制酶在载体上的酶切位点各有几个？(科学思维) 各有1个。 (3)限制酶R1与R2的酶切位点的最短距离是多少？(科学思维) 200 bp。 2、我国研制的重组新冠病毒疫苗已在全世界广泛应用。重组新冠病毒疫苗的制备流程如下图所示。 试探究： (1)上述过程中④的目的是什么？(生命观念) 提示：④为基因表达载体的构建，目的是使目的基因在受体细胞中能稳定存在并传递给下一代，同时能表达和发挥作用。 (2) 上述过程②③代表什么含义？获得的S蛋白基因中是否含有启动子？(科学思维) 提示：②表示逆转录，③表示通过PCR获得大量S蛋白基因。获得的S蛋白基因中不含启动子。 (3)新冠病毒疫苗制备后，经过一段时间，可能起不到良好的预防作用，可能的原因有哪些？(社会责任) 提示：新冠病毒的遗传物质为RNA，易发生变异。 学科网（北京）股份有限公司 $ 第三章 基因工程 第二节 基因工程的基本操作程序情境化练习题 情境创新练（5大知识）+素养拓展练（教材深挖+情境速递） 知识点 1 目的基因的筛选与获取 1．（2026高三下·福建厦门·专题练习）KRS是A2基因突变引起的罕见遗传病。某家系患病情况如下图1，已知亲代中I-1的一个A2基因第1306位G替换成A，I-2的一个A2基因第3057位C缺失，其余均正常。提取家系中各人的总RNA，利用结合于1306位上、下游的一对特异性引物进行逆转录PCR，电泳检测结果如下图2。不考虑其它突变，下列叙述错误的是（　　） A．该病遗传方式为常染色体隐性遗传病 B．I-1中A2基因碱基替换导致相应mRNA变长 C．Ⅱ-1的两个A2基因均正常的概率为1/2 D．Ⅱ-2与正常男性婚配，后代不一定患KRS 2．（2026高三下·福建厦门·专题练习）蛛丝蛋白是一种特殊纤维蛋白，有强度高、韧性大等特点，在纺织、医疗、军工等多领域具有广阔的应用前景。利用PCR技术扩增蛛丝蛋白基因，可用于蛛丝蛋白的规模化生产。下列叙述正确的是（　　） A．耐高温的DNA聚合酶在PCR扩增的复性和延伸阶段发挥作用 B．PCR扩增蛛丝蛋白基因时，子链的延伸方向是3'→5' C．为使PCR产物能被特定限制酶切割，可在引物的5'端添加对应识别序列 D．限制酶破坏一个PCR产物中的两个磷酸二酯键，可获得两端为黏性末端的蛛丝基因片段 3．（25-26高三下·青海西宁·开学考试）某逆转录病毒侵染某真核细胞后，其RNA逆转录形成的双链DNA（V—DNA）整合到宿主细胞的DNA中。研究人员提取宿主细胞的DNA，用特定限制酶切割后连接成环，以环为模板进行PCR扩增V—DNA整合位置两侧的宿主未知序列，从而确定V—DNA的整合位点，如图所示。下列说法正确的是（　　） A．该病毒的RNA逆转录的过程需要逆转录酶和核糖核苷酸 B．将宿主DNA连接成环时用到的限制酶甲、乙需为同种酶 C．理论上用引物F1和F4可扩增出V—DNA中的序列M和N D．PCR呈指数式扩增，若循环4次，理论上需要16个引物 知识点 2 基因表达载体的构建 4．（2026·江西九江·一模）科研人员为培育转基因大豆，构建了含特定功能元件的基因表达载体（左图为载体部分结构，右图为限制酶BsaⅠ的识别序列及酶切位点），LB/RB是T-DNA的边界序列，Kanr为卡那霉素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，下列说法正确的是（    ） A．经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列相同 B．用PCR技术扩增目的基因时，复性温度越低，扩增产物特异性越低 C．用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有4种 D．应选择含有氨苄青霉素的培养基去筛选成功转化的大豆细胞 5．（25-26高三下·河南·开学考试）反向PCR技术是一种用于扩增已知序列两侧未知序列的技术，其基本思路是先将目标DNA进行环化，再以环化的DNA为模板进行扩增，相关过程如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．过程①通常用相同的限制酶分别切割目的基因的两侧 B．过程②需要DNA连接酶催化形成黏性末端碱基间的氢键 C．PCR扩增序列L和序列R时应选择引物1和引物4 D．反向PCR技术获得双链等长的目标产物至少需要扩增3轮 6．（2026·浙江·二模）Cre-LoxP系统是一种重组酶系统，主要由Cre与LoxP两部分组成，Cre是一种酶，能够特异性识别LoxP位点，使2个LoxP位点间的DNA序列被删除，从而实现基因组DNA中特异位点基因的敲除。Cre品系小鼠是体内2号染色体带有Cre重组酶基因的小鼠，flox品系小鼠是在3号染色体的基因2两边都插入了loxP位点的小鼠。现利用两个品系小鼠培育基因2完全敲除的纯合小鼠，下列说法正确的是（　　） A．在两品系小鼠杂交所得F1代中检测到Cre重组酶即可说明Cre-LoxP系统对基因2删除成功 B．要获得肝脏中基因2敲除的小鼠，可在loxP基因序列上游添加肝脏特异性启动子 C．LoxP基因的插入不会改变基因2的碱基序列，因此不属于可遗传变异 D．至少在F2代中才能获得基因2完全敲除的纯合小鼠 知识点3 将目的基因导入受体细胞 7．（2026·湖北·一模）密码子偏好性是指在蛋白质合成过程中，不同生物对某些密码子的使用频率表现出明显的倾向性。例如，在大肠杆菌中，70%的亮氨酸由密码子CUA编码；原核生物与真核生物偏好的起始密码子编码序列分别是GTG、ATG等。下列叙述错误的是（    ） A．通过基因工程将某基因导入受体细胞后表达量不高的原因可能是因为密码子的偏好性 B．若要将某细菌的基因导入酿酒酵母，在扩增其基因时，可将其中一个引物的5′-端序列GTG改为ATG C．为满足大肠杆菌的密码子偏好性，可以通过基因改造改变基因的碱基序列 D．为满足生物的密码子偏好性而改造后的基因转录出的mRNA分子数量大幅下降 8．（25-26高三下·江苏扬州·开学考试）研究者获得导入S基因的基因编辑小鼠的过程如下图所示，下列相关叙述错误的是（　　） A．过程①一般需要用含促性腺激素的饲料以获得更多卵母细胞 B．过程②存在多种防止多精入卵的机制 C．过程③需将表达载体注射到小鼠的受精卵中 D．过程④无需抑制雌鼠b对植入胚胎的免疫排斥 9．（2026·辽宁·模拟预测）某科研团队欲将抗虫基因（Bt基因）导入棉花细胞，培育抗虫棉。现有以下两种导入方案： ①用农杆菌转化法将Bt基因导入棉花细胞； ②在棉花授粉后，将含Bt基因的溶液注入花粉管通道。 下列叙述错误的是（    ） A．方案①普遍适用于双子叶植物和裸子植物，一般单子叶植物不宜使用 B．方案①将Bt基因随机插入Ti质粒后，要先将重组质粒转入农杆菌 C．方案①的最终目的是将Bt基因整合到棉花细胞的染色体DNA上 D．相比方案①，方案②的优势是无需进行植物组织培养即可得到抗虫棉 知识点4 目的基因的检测与鉴定 10．（25-26高三下·河北衡水·开学考试）某科研团队通过转基因获得了一种大肠杆菌（工程菌），可作为监测残留在生物组织或环境中的四环素水平的“报警器”，其监测原理如下图所示，天然大肠杆菌不含有图中所示基因。（GFP基因是绿色荧光蛋白基因）。下列有关说法正确的是（    ） A．启动子1、2是DNA聚合酶识别和结合的位点，启动基因的转录过程 B．转基因工程菌中TetR基因的表达是GFP基因表达的前提条件 C．转基因工程菌中的GFP基因表达产物还需要内质网等细胞器的加工 D．当环境中存在四环素时，大肠杆菌可在一定条件下发出绿色荧光 11．（2026·福建莆田·二模）科研人员构建荧光素酶基因（G基因）和增强型绿色荧光蛋白基因（E基因）可融合表达的重组质粒，该质粒的部分结构如图1.重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗G蛋白抗体和抗E蛋白抗体分别检测相应蛋白的表达情况，结果如图2（注：条带粗细代表蛋白质含量，条带1所检出的蛋白质的分子量比条带2大）下列叙述正确的是（　　）    A．用PCR检测重组质粒时应选择引物1和引物4 B．表达G-E融合蛋白时是以a链为模板进行转录的 C．出现条带1无法证明受体细胞表达了G-E融合蛋白 D．条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的G基因表达的 12．（25-26高三下·河南驻马店·开学考试）人乳铁蛋白（hLF）有抑菌、提高免疫力等功能。科研人员构建了含hLF基因的重组质粒pW2-hLF，拟从牛奶中分离提纯hLF，流程如图所示。下列有关分析错误的是（　　） A．选用NruI和MluI切割便于插入启动子。 B．插入终止子时会删除质粒pW1的部分碱基序列 C．用抗原—抗体杂交技术检测hLF基因是否导入受体细胞 D．转基因早期胚胎需要经过性别鉴定、遗传筛查后再移植 知识点5 DNA片段的扩增及电泳鉴定实验 13．（2026·山东临沂·一模）戈谢病患者体内葡萄糖脑苷脂酶（GCASE）活性异常，与体内相关基因的突变密切相关。已知正常基因为G，突变基因G1会导致GCASE轻度缺陷，突变基因G₂会导致GCASE重度缺陷。某研究团队对戈谢病患者的家系进行调查，绘制了该家系的系谱图（图1），并对部分个体的相关基因进行PCR扩增后电泳分离，得到电泳结果（图2）。下列说法错误的是（　　） A．结合系谱图和电泳结果可判断，该病的遗传方式为常染色体隐性遗传 B．基因G突变为G1或G2，根本原因是G发生了碱基对的替换、增添或缺失 C．Ⅲ2的基因型为G1G2，其致病基因G1来源于I4，致病基因G2来源于I1或I2 D．根据Ⅱ5的患病程度不能确定其基因型，可通过电泳技术进一步鉴定 14．（25-26高三下·河南·月考）研究人员利用PCR扩增转基因植物基因组中的某段外源基因片段，并通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行鉴定。下列相关叙述正确的是（　　） A．PCR反应体系中只需加入模板DNA、引物和耐高温的DNA聚合酶 B．PCR复性温度与引物的GC含量有关，一般后者含量越高则复性温度越低 C．若将已知长度的DNA标准品加入同一凝胶中，可用于估算其他扩增产物的分子大小 D．3号泳道中的亮度较低，说明样本2植物不含有该基因或该植株为相关基因的杂合子 15．（25-26高三上·福建漳州·期末）为探究DNA片段M与蛋白X结合的位点，研究者获得片段M不同位点的突变体M1、M2和M3，用蛋白X进行结合试验（结合了蛋白X的DNA片段电泳时移动速率受到影响），并用带荧光的片段M作为指示探针进行检测（指示探针可与待测DNA竞争蛋白X），电泳结果如图所示。据结果分析，下列相关叙述错误的是（　　） A．条带2显示没有结合蛋白X的探针所迁移到的位置 B．点样位置位于图中的上方 C．M1的突变位点不影响蛋白X与M1的结合 D．M3与蛋白X的结合强度比M2更大 二、综合题 16．（25-26高三下·江苏南通·开学考试）抗PD-L1的单克隆抗体可用于癌症的免疫治疗。某研究者利用PiggyBac转座系统将抗PD—L1抗体的基因重组到CHO细胞（源于中国仓鼠的卵巢）中，最终筛选出稳定高效表达外源基因的细胞株。请回答相关问题： 注：NdeI、HindⅢ、NotI为限制酶；EGFP是增强型绿色荧光蛋白基因；Amp是氨苄青霉素抗性基因；Neo是新霉素抗性基因；TR是末端重复序列 (1)PiggyBac转座系统的核心组分是转座子质粒（图1）和辅助质粒（携带转座酶基因）。转座酶可识别转座子质粒中两个TR序列，并将两者间的转座片段切割下来，而后将其插入受体细胞基因组中。由此推测，转座片段的功能和农杆菌Ti质粒上________的功能类似。 (2)转座子质粒中EGFP基因（约750bp）会干扰抗体基因的表达，故研究者应选用限制酶________处理该质粒，并对处理后和未处理的质粒分别进行电泳，结果如图2所示。电泳后应回收图2中条带________位置的DNA作为后续使用，影响条带①③电泳时迁移速率不同的原因是________。 (3)当目的基因末端和载体末端有相同的同源臂序列时，同源重组酶可识别该序列，并从DNA的5'端开始去掉部分核苷酸形成“黏性末端”，进一步处理形成重组DNA．研究者欲利用该原理构建重组质粒，经PCR获取抗PD-L1抗体的基因（图3），应添加的上游和下游引物分别是________（填序号），前者5′端的序列是5′________3′，后者5′端的序列是5′—________3'。（只写出前9个碱基的序列）。 (4)利用PiggyBac转座系统转化时，用脂质体包裹重组质粒和________，将其添加到含CHO细胞的培养基中进行培养，获取转化成功的CHO细胞。该培养基含有G418（小分子有机物），不含新霉素，推测可能的原因是________（填序号）。 ①重组质粒中没有Neor基因 ②新霉素对真核细胞不起作用，G418对真核细胞有毒性 ③Neor基因表达后能使细胞对G418产生抗性 ④转化成功的CHO细胞对G418的抗性强 ⑤新霉素会抑制PiggyBac转座系统中转座酶的活性 (5)目前近80%的重组蛋白均由CHO细胞株生产。但基因随机整合的CHO细胞株在培养过程中往往表现出转基因拷贝数丢失和表观遗传沉默等不利特性，最终降低转基因转录和相应的重组蛋白产量。中国科学家利用CRISPR/Cas9技术首次实现抗PD—L1抗体基因在C12、f35位点的精准靶向整合，检测细胞株中抗PD—L1抗体基因的相对mRNA水平及蛋白质表达情况，结果如图4、图5所示： 注：RA-1、RA-2随机整合细胞株，SA-3、SA-5靶向整合细胞株。β-actin为内参蛋白。 分析结果，培育靶向整合株生产重组蛋白更高效，依据是________。 （一）教材知识链接 1．目前，在PCR反应中使用Taq DNA聚合酶，而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因： 2．启动子的位置和生物作用： 3.终止子的位置和生物作用： 4．农杆菌转化法中农杆菌的作用： 。 5．转移的基因能在受体细胞内表达的原因： 。 6．原核生物作为转基因受体细胞的优点： 7．用两种不同限制酶同时处理质粒和含目的基因的片段的主要优点： 。 8．不同生物的DNA能拼接的原因： 。 9．基因工程检测目的基因是否导入、转录、翻译的方法依次为： 。 10．目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是 。 （二）教材深挖拓展 1．下图是某同学画出的限制酶BamHⅠ 和Hind Ⅲ 切割产生的黏性末端，判断他的写法是否正确？如果不正确，请改正。 2． 若PCR扩增过程加入模板DNA片段a个，经过n次循环后，产生的DNA片段中含有模板DNA片段的DNA个数为_   个，试分析原因？  3．某同学认为PCR过程中不同的DNA片段变性时温度是不同的，你认为他的说法正确吗？说明你的理由？              4．培育转基因生物的核心工作是              。构建基因表达载体的目的？  5.通过PCR技术获取足够量的目的基因后，能够直接导入受体细胞吗？原因是？ 6.农杆菌转化法要将目的基因插入农杆菌质粒的T-DNA 片段的原因是？ 7.如果改用花粉管通道法将目的基因导入受体细胞，与农杆菌转化法相比，其具有的优点是？ （三）新情景素材速递 1、在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同识别序列的限制酶(R1和R2)处理基因表达载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如下图所示。 试探究： (1)该载体是环形DNA还是链状DNA？说明理由。(科学思维) (2)两种限制酶在载体上的酶切位点各有几个？(科学思维) (3)限制酶R1与R2的酶切位点的最短距离是多少？(科学思维) 2、我国研制的重组新冠病毒疫苗已在全世界广泛应用。重组新冠病毒疫苗的制备流程如下图所示。 试探究： (1)上述过程中④的目的是什么？(生命观念) (2) 上述过程②③代表什么含义？获得的S蛋白基因中是否含有启动子？(科学思维) (3)新冠病毒疫苗制备后，经过一段时间，可能起不到良好的预防作用，可能的原因有哪些？(社会责任) 学科网（北京）股份有限公司 $