第4章 第1节 第3课时 基因工程的操作步骤-【新课程学案】2025-2026学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程教师用书word（浙科版）

本讲义聚焦基因工程操作步骤核心知识点，系统梳理从目的基因获取（含化学合成法、cDNA文库构建等方法及真原核基因结构比较）、重组DNA分子构建（克隆与表达载体差异、酶切连接技术）、目的基因导入受体细胞（细菌、动植物细胞方法）到检测（DNA、RNA、蛋白质及个体水平）的完整流程，辅以表格对比、微提醒等学习支架。 该资料以任务驱动（如埃博拉病毒VP40蛋白案例）引导科学思维，通过cDNA与基因组文库比较等表格培养分析能力，预习自评与跟踪训练结合，助力课后查漏补缺。融入探究实践（如农杆菌转化流程分析）和科学态度（转基因技术应用与风险），课中辅助教师突破重难点，课后帮助学生巩固知识体系。

第3课时　基因工程的操作步骤 　　　　　　　　　　　　　　　　 [主干知识梳理] 1.获取目的基因 (1)目的基因：人们感兴趣、想研究的基因，如人胰岛素原基因、植物的抗病基因等。 (2)真、原核生物基因结构比较 项目 真核生物 原核生物 基因结构 包括启动子、外显子、内含子及终止子 启动子、终止子 mRNA是否需要加工 需要 不需要 [微提醒] 　　内含子与外显子所对应的基因序列均会被转录，但是内含子对应的部位需要修饰切去，连接外显子对应部位，从而形成成熟mRNA。 (3)目的基因获取方法及比较 方法 化学合成法 建立cDNA文库 聚合酶链式反应 序列特点 序列已知，相对较短 序列未知 (部分)序列已知 具体 操作 将核苷酸按照特定的顺序一个一个地连接起来，直接合成目的基因 利用成熟的mRNA在逆转录酶等酶的作用下合成互补DNA(即cDNA)，借助载体构建cDNA文库 在DNA聚合酶的作用下，在体外进行DNA大量扩增，主要包括变性、退火、延伸三步 应用 合成较短序列，成本高 不同组织细胞cDNA文库存在差异，需针对不同的表达产物构建特定的cDNA文库 该技术具有简便、快速、灵敏等特点，广泛应用于医学诊断、法医鉴定、古生物学研究等方面 2.构建重组DNA分子 (1)克隆载体与表达载体 克隆载体 用于大量扩增外源DNA的载体 表达载体 使目的基因既能扩增又能表达出相应蛋白质的载体，包含适当的转录和翻译信号 (2)重组DNA分子的形成 ①通常用相同的限制性内切核酸酶分别剪切含有目的基因的DNA片段和表达载体，以形成相同的黏性末端或平末端。 ②用DNA连接酶将目的基因和表达载体连接在一起，形成重组DNA分子。 3.将目的基因导入受体细胞 受体细胞 处理方式 细菌 常用CaCl2溶液制备感受态细胞，低温下将感受态细胞与重组DNA分子混合，短暂热刺激处理，使外源DNA转入细胞 动物细胞 常用显微注射法将目的基因导入动物细胞 植物细胞 常使用农杆菌转化法，具体操作：将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，用重组Ti质粒转化农杆菌，再让农杆菌感染植物细胞，目的基因随T-DNA整合到植物染色体DNA中 4.检测目的基因及其表达产物 目的基因及其表达产物的检测和鉴定可以从DNA、RNA、蛋白质、个体性状四个方面进行。 (1)通过检测DNA可确定目的基因在受体细胞内是否稳定存在。 ①借助载体上的标记基因可以检测目的基因是否在受体细胞中稳定地存在并遗传。 ② PCR和核酸分子杂交技术可鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。 (2)检测RNA和蛋白质以及个体水平上是否出现相应性状，可得知目的基因是否正确表达。 ①运用核酸分子杂交技术可检测受体细胞中是否含有目的基因转录出的mRNA。 ②运用抗原-抗体杂交技术可以检测目的基因是否表达出相应的蛋白质。 ③观察测定个体是否表现出目的基因控制的特定性状并稳定遗传，是判断转基因成功的直接证据。 [预习效果自评] 1.判断下列说法的正误 (1)质粒上的抗生素抗性基因有利于质粒与外源基因连接。 (×) 提示：抗生素抗性基因用于筛选含目的基因的受体细胞。 (2)应用核酸分子杂交技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达。 (×) 提示：应用核酸分子杂交技术，可以检测受体细胞是否转入了目的基因以及目的基因是否转录，运用抗原-抗体杂交技术检测目的基因是否表达出相应蛋白质。 (3)在宿主细胞中检测到目的基因存在，说明转基因技术操作成功。 (×) 提示：导入受体细胞的目的基因未必能正常表达，若不能正常表达对于基因工程而言是不成功的。 (4)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中。 (×) 提示：将人的血清白蛋白基因导入了受精卵细胞中，目的基因在乳腺细胞中特异性表达。 2.下图为农杆菌转化法示意图，请将①~④的操作序号填写在图中相应的方框内。 ①导入农杆菌　②构建表达载体　③导入植物细胞　④将携带目的基因的T-DNA整合到植物染色体DNA中 答案：A.②　B.①　C.③　D.④ 3.思考题 (1)科学家将人的抗体编码基因体外克隆后，插入噬菌体中并转染大肠杆菌时，一般不需要用CaCl2处理大肠杆菌以制备感受态细胞，试分析原因。 提示：噬菌体可以侵染大肠杆菌，将重组DNA分子注入大肠杆菌内。 (2)若用PCR技术获得某基因的同时，在该基因的两端分别插入限制性内切核酸酶EcoRⅠ和BamHⅠ的切点，尝试写出设计思路。 提示：在设计PCR的两种引物时，在两种引物的5'端分别添加不与模板配对的限制性内切核酸酶EcoRⅠ和BamHⅠ特异性识别序列。 [精要内容把握] 一、知识体系建一建 二、核心语句背一背 1.获取目的基因的方法有化学合成法、基因文库法、PCR扩增等。 2.利用表达载体构建重组DNA分子是基因工程的核心，重组DNA分子的组成包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3.目的基因导入植物细胞常用花粉管通道法和农杆菌转化法，导入动物细胞常用显微注射法，导入微生物细胞常用感受态细胞法(CaCl2溶液处理)。 4.检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或目的基因是否转录出了mRNA常用PCR技术和核酸分子杂交技术等，检测目的基因是否翻译成蛋白质常用抗原-抗体杂交技术。 提能点(一)　基因工程操作的步骤 [任务驱动] 　　利用单克隆抗体的特异性，作用于埃博拉病毒侵染蛋白(VP40蛋白)，是一种战胜埃博拉病毒的有效途径。 (1)过程①中选用两种限制性内切核酸酶切割，使目的基因的两端产生不同的黏性末端，这样处理的目的是什么? 提示：防止目的基因与质粒错误连接或自身环化。 (2)图中过程②通常需要什么物质处理大肠杆菌，进行处理的原因是什么? 提示：处理大肠杆菌的物质通常为CaCl2溶液。处理原因是CaCl2溶液处理过的大肠杆菌易于吸收外源DNA(或处于感受态)。 (3)在基因表达载体中，VP40蛋白基因的“上游”必须含有什么结构?该结构与过程③的完成存在何种联系? 提示：基因表达载体中，VP40蛋白基因必须插到启动子和终止子之间，即“上游”必须含有启动子，启动子是RNA聚合酶结合位点，可以启动VP40蛋白基因的转录。 [生成认知] 一、cDNA文库和基因组文库的比较 比较项目 cDNA文库 基因组文库 文库大小 小 大 基因中启动子 无 有 基因中内含子 无 有 基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 物种间的基因交流 可以 部分基因可以 二、基因表达载体的构建 1.构建基因表达载体的方法步骤 (1)用同种限制性内切核酸酶或产生相同末端的限制性内切核酸酶剪切含目的基因的DNA片段和载体DNA，使其产生相同末端。 (2)将切下的目的基因片段与切开的质粒混合，再加入适量DNA连接酶，使目的基因插入质粒的切口处，形成一个重组DNA分子(重组质粒)。构建过程如下图所示： 2.构建基因表达载体时限制性内切核酸酶的选择 通常采用相同的限制性内切核酸酶分别剪切目的基因和载体DNA(如质粒)，获得相同的黏性末端，在DNA连接酶的作用下形成重组质粒，如图1所示。但应用此种方式，在实际操作中目的基因、载体质粒经DNA连接酶处理后，获得的两两相连产物可能有三种：①目的基因与目的基因连接物；②质粒与质粒连接物；③目的基因与质粒连接物。为了使目的基因与质粒能定向连接，可使用两种不同的限制性内切核酸酶(可产生两种不同的末端)剪切目的基因和质粒，然后在DNA连接酶的作用下形成重组质粒，如图2所示。 3.基因表达载体的组成及作用 三、目的基因导入受体细胞的方法 类型 方法 说明 特点 植物细胞 农杆菌转化法 将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→用农杆菌侵染植物细胞→将目的基因整合到植物细胞染色体的DNA上→目的基因表达 经济、有效，适用于双子叶植物和裸子植物，尤其适用于双子叶植物 花粉管通道法 在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头→滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞→目的基因表达 简便、经济，我国科学家独创的一种方法 动物细胞 显微注射技术 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→注射了目的基因的受精卵，经胚胎早期培养后，移植到雌性动物的子宫内→获得具有新性状的动物 将目的基因导入动物细胞最为有效的方法 微生物细胞 Ca2+处理法(感受态细胞法) 用CaCl2溶液处理微生物细胞→感受态细胞→将重组DNA分子与感受态细胞混合→在一定温度下促进外源DNA转入细胞 简便、经济、有效 四、基因工程的几种检测方法 类型 步骤 检测内容 方法 结果显示 分子水平检测 导入检测 检测是否插入目的基因 核酸分子杂交技术 目的基因DNA的一条链(作探针)与受体细胞中提取的DNA杂交，看是否有杂交带 表达检测 检测是否转录出了mRNA 目的基因DNA的一条链(作探针)与受体细胞中提取的mRNA杂交，看是否有杂交带 检测目的基因是否翻译成蛋白质 蛋白质分子杂交(抗原-抗体杂交)技术 抗原与抗体进行杂交，看是否能特异性结合 个体水平检测 对个体接种或抗性实验 确定是否有抗性以及抗性的程度 抗虫或抗病的接种实验 是否赋予了预期抗性或蛋白质活性 　　[例1]　(2025·杭州八校联考)下列关于基因文库的说法，正确的是 (　　) A.基因文库与基因组文库并无差别 B.cDNA文库中的基因含有启动子 C.一种生物的cDNA文库只有一种 D.cDNA文库具有组织或细胞特异性 　　[解析]　基因文库分为基因组文库和cDNA文库。基因组文库含有一种生物的全部基因，而cDNA文库含有一种生物的部分基因，A错误；cDNA文库中的基因都没有启动子，B错误；由于cDNA文库是从特定的组织或细胞中提取并纯化的mRNA逆转录形成的，因此该种cDNA文库可能有多种，且具有组织或细胞特异性，C错误，D正确。 　　[答案]　D 　　[例2]　(2025·浙江9+1联盟期中)某病毒中的S蛋白是引发机体免疫的核心抗原。某科研小组开展了利用基因工程大量生产S蛋白来生产疫苗的课题，请回答问题： (1)目的基因的获取：该研究课题的目的基因是　　　　　，目前获取目的基因的常用方法有　　　　　　　　　　　(填两种)。  (2)构建表达载体——重组质粒：该科研小组选用的质粒上有氨苄青霉素抗性基因和LacZ两种基因，其中后者控制合成的酶能使无色的X-gal分解为蓝色的5-溴-4-氯靛蓝和半乳糖。在切割目的基因和质粒时常采用“双酶切法”，这样不仅可以避免　　　　　，从而有利于重组质粒的拼接；还可以避免　　　　　，从而有利于目的基因的表达。另外，在拼接过程中，科研人员将目的基因插入到LacZ基因内部，使重组质粒中的LacZ基因失活。  (3)导入受体细胞：如果将重组质粒导入大肠杆菌中，为了增大导入的成功率，科学家常用低浓度的　　　溶液处理大肠杆菌，使其成为　　　　　细胞。  (4)目的基因的检测及表达：①在LB固体培养基上加入　　　　　　　　　两种特殊物质来筛选导入重组质粒的细胞。如果大肠杆菌中成功导入了重组质粒，则可以在培养基上形成　　　　　　(填“蓝色”或“无色”)菌落。②为了更精准的检测目的基因是否成功导入受体细胞，还可以用　　　　　技术，该技术还可以用于检测目的基因是否成功表达。  　　[解析]　(1)由题文可知：该科研小组开展了利用基因工程大量生产S蛋白来生产疫苗的课题，说明目的基因是S蛋白基因，目前获取目的基因的常用方法有PCR扩增、从基因文库中获取。(2)在切割目的基因和质粒时常采用“双酶切法”，这样不仅可以避免质粒和目的基因自身环化，从而有利于重组质粒的拼接；还可以避免反向连接，从而有利于目的基因的表达。(3)如果将重组质粒导入大肠杆菌中，为了增大导入的成功率，科学家常用低浓度的CaCl2溶液处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞。(4)由于质粒上有氨苄青霉素抗性基因和LacZ两种基因，但在拼接过程中，科研人员将目的基因插入到LacZ基因内部，使重组质粒中的LacZ基因失活，故在LB固体培养基上加入氨苄青霉素、X-gal两种特殊物质来筛选导入重组质粒的细胞。如果大肠杆菌中成功导入了重组质粒，则可以在培养基上形成无色菌落。为了更精准的检测目的基因是否成功导入受体细胞，还可以用核酸分子杂交技术，该技术还可以用于检测目的基因是否成功表达。 　　[答案]　(1)S蛋白基因　PCR扩增、构建基因文库　(2)质粒和目的基因自身环化　反向连接　(3)CaCl2　感受态　(4)氨苄青霉素、X-gal　无色　核酸分子杂交 [易错提醒] 基因工程操作中的易错点 (1)在切割目的基因时要求用同种限制性内切核酸酶处理载体，目的是产生相同的末端。 (2)将目的基因从DNA分子中切割出来需要消耗4分子水，形成4个末端，目的基因上含有2个末端。 (3)不同DNA分子用相同限制性内切核酸酶切割产生相同的末端，同一种DNA分子用不同的限制性内切核酸酶切割，产生的末端一般不同。 [跟踪训练] 1.(2025·安吉高级中学测评)图甲、乙分别表示质粒和外源DNA，其中箭头表示相关限制酶的酶切位点，下列叙述正确的是 (　　) A.用质粒和外源DNA构建重组质粒过程中，不能使用SmaⅠ切割 B.图甲所示的质粒分子在经SmaⅠ酶切割后含有4个游离的磷酸基团 C.为获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入DNA聚合酶 D.用EcoRⅠ、HindⅢ和BamHⅠ中的任意一种酶切割质粒和外源基因都可以 解析：选A　据图分析，质粒的标记基因(抗生素抗性基因)和目的基因上都有SmaⅠ的切割位点，若用SmaⅠ切割会破坏标记基因和目的基因，因此构建重组质粒的过程中，不能使用SmaⅠ切割，A正确；图甲所示的质粒分子只有一个SmaⅠ切割位点，所以在经SmaⅠ酶切割后含有2个游离的磷酸基团，B错误；为获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入DNA连接酶，C错误；只使用EcoRⅠ，则质粒和目的基因两端的黏性末端相同，用DNA连接酶连接时，易产生质粒和目的基因自身连接物，而利用BamHⅠ或HindⅢ剪切时，在目的基因上只有一个酶切位点，因此不能切割出完整的目的基因，D错误。 2.(2025·温州新力量联盟期中)蚯蚓富含金属硫蛋白(MT)等重金属结合蛋白能选择性吸收土壤中的镉。利用一定技术可将蚯蚓MT基因转入烟草，流程如图所示。下列叙述错误的是 (　　) A.过程③把重组质粒导入大肠杆菌的主要目的是对MT基因进行扩增 B.过程④中携带目的基因的Ti质粒进入烟草愈伤组织细胞，并整合到植物细胞的染色体上 C.转基因产品既具有潜在的巨大经济效益，也可能存在一定的风险性 D.观察测定烟草是否表现出MT等蛋白并稳定遗传，是判断转基因成功的直接证据 解析：选B　过程③把重组质粒导入大肠杆菌的主要目的是利用大肠杆菌对MT基因进行扩增，以获得更多的目的基因，A正确；过程④表示用农杆菌转化法将目的基因(T-DNA)导入植物愈伤组织细胞，利用农杆菌的Ti质粒可以将目的基因整合到植物的染色体上，Ti质粒并没有整合到植物细胞的染色体上，B错误；转基因产品存在一定的安全争议，也带来了巨大的经济效益，C正确；MT等重金属结合蛋白能选择性吸收土壤中的镉，判断转基因成功，最直接的证据是看MT蛋白是否合成并稳定遗传，D正确。 3.虫草中的超氧化物歧化酶(PSSOD)具有抗衰老作用。研究人员培育了能合成PSSOD的转基因酵母菌。据图回答下列问题： (1)基因工程基本操作程序的核心步骤是　　　　　　　　　。将图中的重组DNA分子用HindⅢ和ApaLⅠ完全酶切后，可得到　　　种DNA片段。图示的表达载体存在氨苄青霉素抗性基因，不能导入用于食品生产的酵母菌中，据图分析，可用　　　　　切除该抗性基因的部分片段使其失效，再用DNA连接酶使表达载体重新连接起来。  (2)作为受体细胞的酵母菌缺失URA3基因，必须在含有尿嘧啶的培养基中才能存活，因此，图示表达载体上的URA3基因可作为　　　　　　，供鉴定和选择；为了筛选出成功导入表达载体的酵母菌，所使用的培养基　　　(填“需要”或“不需要”)添加尿嘧啶。  (3)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为　　　　　；为了确定受体细胞中PSSOD基因是否转录，可用标记的　　　　　　作为探针进行分子杂交试验，分子杂交的原理是　　　　　　。  解析：(1)基因工程基本操作程序的核心步骤是基因表达载体的构建。分析题图可知，图中的重组DNA分子中存在Hind Ⅲ的一个酶切位点，存在ApaLⅠ的两个酶切位点，因此用两种酶同时切割环状质粒，会得到3种不同的DNA片段。图示的表达载体存在氨苄青霉素抗性基因，不能导入用于食品生产的酵母菌中，否则会导致人体对抗生素不敏感，因此可以利用ApaLⅠ切除该抗性基因的部分片段使其失效，再用DNA连接酶使表达载体重新连接起来。(2)作为受体细胞的酵母菌缺失URA3基因，必须在含有尿嘧啶的培养基中才能存活，因此，图示表达载体上的URA3基因可作为标记基因，供鉴定和选择；由于导入表达载体的酵母菌中含有URA3基因，而普通酵母菌中不含有URA3基因，因此为了筛选出成功导入表达载体的酵母菌，所使用的培养基不需要添加尿嘧啶。(3)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。为了确定受体细胞中PSSOD基因是否转录，可用标记的PSSOD基因作为探针进行分子杂交检测，分子杂交的原理是碱基互补配对。 答案：(1)基因表达载体的构建　3　ApaLⅠ (2)标记基因　不需要　(3)转化　PSSOD基因　碱基互补配对 科学思维——流程化农杆菌转化的操作 [素养评价] 1.用农杆菌转化法培育转基因植物，下列叙述错误的是 (　　) A.目的基因插入Ti质粒的位点是某种限制性内切核酸酶的识别位点 B.若目的基因的序列未知，可以通过构建基因文库的方法从中获取 C.采用抗原-抗体杂交技术可检测目的基因在受体细胞中是否表达 D.植物受体细胞必须是受精卵细胞，因其全能性最高 解析：选D　限制性内切核酸酶可以切割目的基因和Ti质粒，目的基因插入Ti质粒的位点是某种限制性内切核酸酶的识别位点，A正确；若目的基因的序列未知，可以通过构建基因文库的方法从中获取，B正确；检测目的基因在受体细胞中是否表达，常用抗原-抗体杂交技术，C正确；植物受体细胞可以是植物的受精卵，也可以是体细胞，D错误。 2.农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA插入植物基因组中，下图为获得抗除草剂转基因玉米的技术路线，请回答： (1)构建表达载体选择限制性内切核酸酶时，要求Ti质粒内每种限制性内切核酸酶只有一个剪切位点，同时要求酶切后，基因G形成的两个黏性末端序列不相同，这个过程需用　　　种限制性内切核酸酶，目的是防止酶切产物自身环化和错误连接。除草剂抗性基因G和Ti质粒载体连接时，用　　　酶催化连接，新形成的化学键是　　　　。  (2)农杆菌转化愈伤组织时，T-DNA携带　　　插入受体细胞的核DNA。常用　　　　处理使农杆菌使之成为感受态细胞。  (3)获得抗除草剂转基因玉米涉及多次筛选，其中筛选含重组质粒的农杆菌应使用含　　　　　　的选择培养基，使用含　　　　　　的选择培养基筛选出转化的愈伤组织，再诱导愈伤组织再生出抗除草剂转基因玉米。  解析：(1)在构建基因表达载体时，为了防止酶切产物自身环化和错误连接，需要使用2种不同的限制性内切核酸酶对目的基因(除草剂抗性基因G)和质粒进行剪切；除草剂抗性基因G和Ti质粒载体连接时，用DNA连接酶催化，形成的化学键是磷酸二酯键。(2)农杆菌转化愈伤组织时，T-DNA携带目的基因(除草剂抗性基因G)插入受体细胞的核DNA；常用CaCl2溶液处理使农杆菌成为感受态细胞。(3)据图分析，图示质粒上的标记基因是抗生素抗性基因，因此筛选含重组质粒的农杆菌应使用含抗生素的选择培养基；应该使用含除草剂的选择培养基筛选出转化的愈伤组织，再诱导愈伤组织再生出抗除草剂转基因玉米。 答案：(1)2　DNA连接　磷酸二酯键 (2)目的基因　CaCl2溶液　(3)抗生素　除草剂 课后思考与练习参考答案(教材P120) 一、选择题 1.A　2.A　3.A　4.B 二、简答题 1.提示：如下图所示。 2.提示：从人的胎盘细胞中提取mRNA，经逆转录获得cDNA。运用PCR技术扩增hGC的cDNA片段。用相同的限制性内切核酸酶剪切目的基因和Ti质粒，再用DNA连接酶将目的基因连接到Ti质粒的T-DNA中。用重组Ti质粒转化农杆菌，再用农杆菌感染烟草叶片细胞，使目的基因整合到烟草染色体DNA中。通过植物组织培养技术获得能合成hGC的转基因烟草，再从中提取hGC并进行加工、纯化。(根据本节所学内容作答，答案合理即可) 学科网（北京）股份有限公司 $