第3章 第2节 第1课时 目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建-【新课程学案】2025-2026学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程配套课件PPT（人教版 多选版）

该高中生物学课件聚焦基因工程基本操作程序，以培育转基因抗虫棉的四个步骤为导入，系统讲解目的基因的筛选与获取（如PCR技术）及基因表达载体的构建，搭建前后知识联系的学习支架，帮助学生逐步掌握核心内容。 其亮点在于通过探究学习（如PCR复性温度与引物G-C含量关系分析）和科学思维（如生物体内DNA复制与PCR的对比），结合典例解析与迁移训练，培养学生科学思维和探究实践能力。随堂小结通过概念体系建构和思维建模，助力学生系统梳理知识，教师可借助结构化资源提升教学效率。

第2节　基因工程的基本操作程序 学习目标 1.阐明基因工程的原理和基本操作程序。 2.针对人类生产或生活中的某一需求,选取适当的基因工程的技术和方法,尝试设计获得某一转基因产品的方案。 3.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。 第1课时　目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建 聚焦·学案一　目的基因的筛选与获取 聚焦·学案二　基因表达载体的构建 目录 随堂小结 课时跟踪检测 聚焦·学案一　目的基因的筛选与获取 学案设计 (一)了解基因工程的基本步骤与目的基因的筛选与获取方法 1.培育转基因抗虫棉的四个步骤 (1)目的基因的______________。 (2) ______________的构建。 (3)将目的基因导入____________。 (4)目的基因的_____________。 筛选与获取 基因表达载体 受体细胞 检测与鉴定 2.筛选合适的目的基因 3.获取目的基因的方法 4.利用PCR获取和扩增目的基因 (1)PCR的含义:PCR是________________的缩写,它是一项根据_________________的原理,在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件,对___________的核苷酸序列进行大量复制的技术。 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 目的基因 (2)PCR的基本条件 参与的组分 在DNA复制中的作用 DNA母链 提供DNA复制的_______ 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 (耐高温的)DNA聚合酶 催化合成DNA子链 引物(长度通常为20~30个核苷酸) 使DNA聚合酶能够从___________开始连接脱氧核苷酸 添加Mg2+的缓冲液 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活 引物的3'端 模板 (3)PCR的过程 (4)PCR的仪器:______________ (PCR仪)。 (5)PCR产物的鉴定方法:____________________。 PCR扩增仪 琼脂糖凝胶电泳 (二)深化分析PCR过程的疑难问题 |探|究|学|习| 　　聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,结合所学知识回答下列问题: (1)PCR过程中为什么需要引物?DNA链复制的方向是怎样的? 提示:DNA聚合酶不能从头合成子链,只能把游离的脱氧核苷酸连接到已经存在的片段上。加入引物,能够使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。DNA链复制的方向总是从子链的5'端向3'端延伸。 (2)PCR扩增目的基因时,复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对,复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关,假设引物的长度相同,在G—C含量高时,对复性温度的设定有什么要求?说明理由。 提示:当引物的长度相同,在G—C含量高时,设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键,A—T之间有两个氢键,氢键越多形成的双链DNA越牢固。在G—C含量高时,提高复性温度会增加引物与模板链结合的特异性。 (3)在利用PCR获取和扩增目的基因时,从第几轮循环才会产生完整的目的基因(可用相关图解解释)? 提示:第3轮,如图所示: |认|知|生|成| 1.PCR过程中的注意事项 (1)在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料,又可为DNA的合成提供能量。 (2)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸,作为新子链的合成起点,只能结合在母链的3'端,使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 (3)复性温度过高,则会破坏引物与模板链的碱基配对,温度过低则易使两条母链配对结合,均无法获得PCR产物。 (4)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。 2.生物体内DNA复制与PCR反应的比较 比较项目 生物体内DNA复制 PCR反应 解旋 在解旋酶作用下,细胞提供能量,部分DNA双链解开 90 ℃以上高温下解旋, DNA双链全部解开,不需要解旋酶 酶 解旋酶、DNA聚合酶等 耐高温的DNA聚合酶 引物 一小段RNA 可以是RNA或 单链DNA分子片段 合成子链 在引物基础上,一条链连续合成;另一条链不连续合成,再由DNA连接酶连接 分别从两条链引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,都是连续合成 过程 循环次数 与细胞分裂同步 人为设置 产物 完整DNA 两个引物之间的DNA片段 相同点 都需要DNA模板、4种脱氧核苷酸、分别与两条模板链相结合的两种引物;都是半保留复制,严格遵循碱基互补配对原则 续表 [典例]　(2025·南京期末)科研人员利用PCR技术扩增X基因片段,需加入两种引物,引物结合位置如图甲所示。PCR循环后产生五种DNA分子,如图乙所示。下列叙述正确的是 (　　) A.利用DNA聚合酶和DNA连接酶才能完成PCR扩增过程 B.如果加入大量引物1和引物2,会干扰正常的PCR扩增过程 C.在第四轮复制后,会出现8个⑤片段 D.经过第二轮PCR后会出现①②③④⑤五种DNA分子 √ [解析]　PCR扩增过程中不需要DNA连接酶,A错误。由图甲可知,利用PCR技术扩增X基因片段需要引物1和引物2,加入大量引物1和引物2,不会干扰正常的PCR扩增过程,B错误。若图乙表示第三轮复制的产物,则①②各有1个,③④⑤各有2个,第四次复制将得到16个DNA分子:①复制得①和③,②复制得②和④,2个③复制得2个③和2个⑤,2个④复制得2个④和2个⑤,2个⑤复制得4个⑤,C正确。第一轮PCR后得到2个两种DNA分子:①和②;第二轮PCR后得到4个四种DNA分子:①复制得①和③,②复制得②和④,所以经过第二轮PCR后会出现①②③④四种DNA分子,D错误。 　　[思维建模]　PCR中的数量关系 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物的DNA分子数 2 4 8 2n 含其中一种引物 的DNA分子数 1=21-1 3=22-1 7=23-1 2n-1 同时含两种引物 的DNA分子数 0=21-2 2=22-2 6=23-2 2n-2 共消耗引物的对数 1=21-1 3=22-1 7=23-1 2n-1 含脱氧核苷酸链等长的 DNA分子数 0=21-2 0=22-4 2=23-6 2n-2n 迁移训练 1.判断下列表述的正误 (1)目的基因一定是编码蛋白质的基因。 ( ) (2)DNA聚合酶能够从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸。 ( ) (3)PCR过程不需要解旋酶。 ( ) (4)PCR技术中,DNA模板链上碱基G和C的比例越高,DNA变性所需的温度就越高。 ( ) × × √ √ 2.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述,错误的是 (　　) A.二者子链的延伸方向相同,均为5'端→3'端 B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋 C.体内DNA复制需要能量,PCR反应也需要能量 D.二者遵循的碱基互补配对原则相同 解析:DNA体内复制与利用PCR技术扩增DNA时,子链的延伸方向相同,均为5'端→3'端,A正确;PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶,而是在高温条件下氢键断裂,B错误;DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时都需要能量,但两者所需能量来源不同,C正确;DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时,遵循的碱基互补配对原则相同,D正确。 √ 3.下图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段,下列有关说法正确的是 (　　) A.片段a、b、c的长度均相同 B.片段a、b只是第一次循环的产物 C.片段c最早出现在第二次循环的产物中 D.经过30次循环后,片段c的数量为230 √ 解析:图中片段a、b只有一种引物,是以原始DNA链为模板复制而来,其长度比片段c长,A错误。由于原始模板在每次循环中均可作为模板,则每次循环都能产生图中片段a、b,B错误。由于第一次循环的产物只有一种引物,而图中片段c有两种引物,则最早出现在第二次循环的产物中,C正确。经过30次循环后,得到的DNA片段总数为230,这包括图中的片段a、b、c,D错误。 4.某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生,以下措施中有效的是 (　　) A.增加模板DNA的量 　 B.延长热变性的时间 C.延长延伸的时间 　 D.提高复性的温度 √ 解析:PCR过程中,引物和模板不完全配对会形成非特异条带,增加模板DNA的量不会减少反应中非特异条带的产生,A错误;延长热变性的时间,有利于双链DNA解聚为单链,不能减少反应中非特异条带的产生,B错误;延长延伸的时间,有利于合成新的DNA链,但不能减少反应中非特异条带的产生,C错误;在一定温度范围内,选择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合,从而减少非特异条带的产生,D正确。 聚焦·学案二　基因表达载体的构建 学案设计 (一)理清基因表达载体的作用、组成与构建过程 1.构建基因表达载体的目的 (1)使目的基因在受体细胞中___________,并且可以_______给下一代。 (2)使目的基因能够_______和发挥作用。 稳定存在 遗传 表达 2.基因表达载体的组成 微提醒:启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别 项目 位置 作用 启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别结合位点,启动转录过程 起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始 终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束 终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束 3.基因表达载体的构建过程 (1)图示 (2)过程分析 ①先用特定的________切割载体,使它出现一个切口; ②然后用同种限制酶或_________________的限制酶切割含有目的基因的DNA片段; ③再利用____________ 将目的基因片段拼接到载体的切口处,形成重组DNA分子。 限制酶 能产生相同末端 DNA连接酶 (二)掌握基因表达载体构建过程中限制酶的选择技巧 |探|究|学|习| 　　目的基因导入受体细胞之前,需构建基因表达载体,图1、图2表示质粒及目的基因所在DNA片段,图中箭头表示相关限制酶的切割位点。 (1)构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里?为什么? 提示:启动子下游和终止子上游;因为只有插入在启动子和终止子之间,目的基因才可以正常表达。 (2)构建基因表达载体时,能否用SmaⅠ酶切割质粒?为什么? 提示:不能;因为用SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因,该基因是标记基因,便于重组DNA分子的筛选,若被破坏,无法进一步筛选。 (3)与只使用EcoRⅠ相比较,使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么? 提示:可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接。 |认|知|生|成| 　　构建基因表达载体中限制酶的选择技巧 (1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择PstⅠ。 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点,如图乙)。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 A.EcoRⅠ或BamHⅠ B.Sau3AⅠ和BamHⅠ C.Sau3AⅠ和EcoRⅠ D.EcoRⅠ和BamHⅠ √ [解析]　限制酶Sau3A Ⅰ 会破坏目的基因,质粒含有限制酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ 的酶切位点,获取目的基因也可以用限制酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ 切割,但为了防止目的基因或质粒自身环化,需要使用不同种限制酶进行切割,则应使用限制酶EcoR Ⅰ 和BamH Ⅰ 切割质粒和目的基因。 迁移训练 1.用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体,并转化到受体菌中。下列叙述 错误的是 (　　) A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同 B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因 C.若用SphⅠ酶切,可通过琼脂糖凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 √ 解析:若用HindⅢ酶切,目的基因可能正向插入,也可能反向插入,转录的产物可能不同,A正确;若用PvuⅠ酶切,重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR),因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因,B正确;琼脂糖凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段,重组质粒的大小与质粒不同,能够鉴定重组质粒构建成功与否,C正确;SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中,若用SphⅠ酶切,会破坏四环素抗性基因,重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR),因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落,在含Tet的培养基中不能形成菌落,D错误。 2.[多选]某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析正确的是 (　　) A.用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割质粒,可得到2条DNA片段 B.不能用限制酶AluⅠ切割质粒和外源DNA的原因是限制酶AluⅠ会破坏目的基因 C.构建重组DNA时,需选择限制酶SmaⅠ和PstⅠ同时切割质粒和外源DNA D.导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的 培养基上生长 √ √ √ 解析:限制酶HindⅢ和PstⅠ在质粒上各有一个识别切割位点,用HindⅢ和PstⅠ切割质粒,可得到2条DNA片段,A正确;AluⅠ的切割位点位于目的基因中,用限制酶AluⅠ切割外源DNA会破坏目的基因,B正确;不宜选择限制酶SmaⅠ和PstⅠ同时切割质粒和外源DNA,因为质粒中的两个标记基因均会被破坏,且DNA会反向连接至载体上,C错误;构建重组DNA时,应选择限制酶HindⅢ和PstⅠ同时切割质粒和外源DNA,此时会破坏质粒中的氯霉素抗性基因,保留四环素抗性基因,所以导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长,D正确。 一、建构概念体系 二、融通科学思维 1.设计引物是PCR技术的关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图),请分别说明理由。 ①第1组:________________________________________________; ②第2组:_________________________________________________。 引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 引物Ⅰ'自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 2.在构建基因表达载体时,一般用同种限制酶切割目的基因和载体的目的是______________________________________________________ ______________。 产生相同的黏性末端,便于DNA连接酶将目的基因和载体连接成重组DNA 三、综合检测反馈 1.下图表示形成cDNA并进行PCR扩增的过程。据图分析,下列叙述正确的是 (　 ) A.过程①所需的原料是核糖核苷酸 B.过程②所需的酶必须耐高温 C.过程③需要解旋酶破坏氢键 D.过程④的引物对之间不能互补配对 √ 解析:过程①为逆转录,所需的原料是脱氧核苷酸,A错误;由DNA单链合成DNA双链的过程中所需要的DNA聚合酶不需要耐高温,B错误;过程③为变性,温度超过90 ℃时,双链DNA解聚为单链,不需要解旋酶破坏氢键,C错误;过程④为复性,温度降到50 ℃左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合,但引物对之间不能互补配对,D正确。 2.PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键,5'端无严格限制,可用于添加限制酶切点等序列,dNTP是DNA合成的原料,还可供能。下列相关说法错误的是 (　 ) A.图示环节所需的温度比上一个环节的低 B.设计引物时,要有一段目的基因的已知核苷酸序列 C.耐高温的DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链 D.1个循环后,子代DNA双链的脱氧核苷酸数量相同 √ 解析:图示环节为引物与模板碱基互补配对,表示的是复性环节,复性的上一环节为变性,复性的温度比变性的温度低,A正确;设计引物时,要有一段目的基因的已知核苷酸序列,保证其与已知模板能碱基互补配对,在后续扩增的过程中才能进行子链的延伸,B正确;子链是从5'端向3'端延伸的,耐高温的DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链,C正确;由于两个引物均不在该片段的端点,因此一个循环后,子代DNA双链的脱氧核苷酸数量不一定相同,D错误。 3.(2025·济南六校联考)番茄在日常生活中的需求量较大,但是在较低温度下运输或储存的过程中容易出现冻伤的现象,从而影响番茄的口感和品质。科学家利用基因工程技术培育出抗冻的转基因番茄。如图为外源DNA和质粒上标出的酶切位点及相关基因,其中AFPs基因为抗冻基因。下列相关叙述错误的是 (　　) A.基因工程中常用的工具酶有限制酶和DNA连接酶 B.获得的AFPs基因应插入质粒上的启动子与终止子之间 C.应用BamHⅠ和HindⅢ切割目的基因和质粒以避免其自连或反接 D.能在含四环素的培养基上生长的受体细胞中一定都含有AFPs基因 √ 解析:基因工程中常用的工具酶有限制酶和DNA连接酶,A正确。为了保证目的基因正常表达,获得的目的基因应插入质粒上的启动子与终止子之间,B正确。用限制酶SmaⅠ切割会破坏目的基因,因此构建基因表达载体时不能选用该酶;为了防止目的基因和质粒的自身环化或反向连接,应该用两种限制酶切割目的基因和载体,结合题图分析可知,应用BamHⅠ和HindⅢ切割目的基因和质粒,C正确。能在含四环素的培养基上生长的受体细胞中不一定都含有AFPs基因,也有可能是导入普通质粒的受体细胞,D错误。 4.(2025·沧州期末)[多选]无缝克隆技术(In⁃Fusion技术)是一种先进的DNA重组技术,用于将目标DNA片段插入载体中。其中In⁃Fusion酶可以连接任何具有相同15 bp(bp为碱基对)末端序列的线性DNA分子,过程如图所示。下列关于该技术的叙述正确的是 (　　) A.推测In⁃Fusion酶可替代限制酶和DNA连接酶用于构建重组载体 B.PCR扩增目的基因时,需在引物5'端添加与载体相同的特定序列 C.利用In⁃Fusion技术构建图示重组载体时,可避免目的基因与载体的反向连接 D.当目的基因内部有多种限制酶识别序列时,该方法将无法使用 √ √ √ 解析:根据题意,In⁃Fusion酶可以替代限制酶和DNA连接酶,用于构建基因表达载体,A正确;根据题意“In⁃Fusion酶可以连接任何具有相同15 bp末端序列的线性DNA分子”,因此PCR扩增目的基因时,需在引物5'端添加与载体相同的特定序列,以便于In⁃Fusion酶的连接,B正确;通过在目的基因与线性载体两端连入不同的15 bp末端序列,可实现目的基因的定向插入,从而避免目的基因与载体的反向连接,C正确;当目的基因内部有多种限制酶识别序列时,将无法使用限制酶构建重组载体,但可设计15 bp末端序列,使用In⁃Fusion酶来构建,D错误。 课时跟踪检测 1 2 3 4 5 6 7 8 9 一、选择题 1.下列关于PCR反应体系中所加物质作用的叙述,错误的是(　　) A.耐高温的DNA聚合酶用于催化DNA子链的合成 B.引物使耐高温的DNA聚合酶能从引物的5'端延伸DNA链 C.目标DNA的双链用作DNA复制的模板 D.四种脱氧核苷酸为PCR提供原料 √ 12 11 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 解析:通过PCR技术扩增目的基因时,需要用耐高温的DNA聚合酶催化单个脱氧核苷酸聚合形成DNA子链,A正确;耐高温的DNA聚合酶从引物的3'端开始延伸DNA链,B错误;PCR技术的原理是DNA半保留复制,DNA复制时目标DNA的两条链均作为复制的模板,C正确;PCR中DNA合成的原料是四种脱氧核苷酸,D正确。 12 11 10 1 5 6 7 8 2 3 4 9 2.下列有关获取目的基因的叙述,错误的是 (　　) A.目的基因就是编码蛋白质的基因 B.目的基因的筛选与获取是基因工程的第一步 C.来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因可作为转基因抗虫棉的目的基因 D.序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会 解析:目的基因是指人们所需要的、主要用来编码蛋白质的基因,A错误;目的基因的筛选与获取是实施基因工程的第一步,B正确;来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因可作为培育转基因抗虫棉的目的基因,C正确;随着测序技术的发展,以及序列数据库和序列比对工具等的应用,越来越多的基因的结构和功能为人们所知,这为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能,D正确。 √ 12 11 10 1 5 6 7 8 2 3 4 9 3.如图是基因工程中基因表达载体的模式图, 若结构X是表达载体所必需的,则X最可能是 (　　) A.目的基因插入位点 B.启动子 C.标记基因 D.DNA聚合酶识别位点 解析:基因表达载体由启动子、终止子、标记基因、复制原点和目的基因等组成。题图中有终止子、标记基因(抗生素抗性基因)、目的基因、复制原点等,还缺少启动子。启动子位于基因的上游,所以X最可能是启动子,B正确。 √ 12 11 10 1 5 6 7 8 2 3 4 9 √ 4.在核酸分子杂交技术中,常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针(探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段)。为了获得图中的B链作探针,可应用PCR技术进行扩增,应选择的引物种类是 (　) A.引物1与引物2 B.引物3与引物4 C.引物2与引物3 D.引物1与引物4 解析:要获得B链,根据PCR中子链延伸方向为5'到3',则需选择引物2与引物3进行扩增,故选C。 12 11 10 1 5 6 7 8 2 3 4 9 5.蜘蛛丝是天然蛋白纤维,其机械性能较高,有广泛的应用前景。中国科学家利用质粒(如图)成功构建了蛛丝蛋白基因的重组质粒,并在家蚕丝腺细胞中获得大量蛛丝蛋白。下列有关说法错误的是 (　　) A.为防止目的基因自身环化,可以用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因 B.不能选用HindⅢ切割载体和目的基因 C.启动子是RNA聚合酶的识别和结合部位,可以驱动遗传信息的复制和转录 D.基因表达载体中的标记基因便于重组DNA分子的筛选 √ 12 11 10 1 5 6 7 8 2 3 4 9 解析:用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因,可以使目的基因两端产生不同的黏性末端,防止目的基因自身环化,A正确;HindⅢ的识别和切割位点位于标记基因上,因此不能选用HindⅢ切割载体和目的基因,B正确;启动子能驱动遗传信息的转录,不能驱动遗传信息的复制,C错误;基因表达载体中的标记基因便于重组DNA分子的筛选,D正确。 12 11 10 1 5 6 7 8 2 3 4 9 A.质粒用限制性内切核酸酶Ⅱ切割,目的基因用限制性内切核酸酶Ⅰ切割 B.用限制性内切核酸酶切割获得目的基因时,有四个磷酸二酯键被水解 C.限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后获得的黏性末端不同 D.目的基因与载体拼接形成的重组DNA分子中,含两个限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列 6.(2025·天津滨海新区高二期末)基因工程中,需使用特定的限制性内切核酸酶切割目的基因和质粒,便于重组和筛选。已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切割位点是 √ 12 11 10 1 5 6 7 8 2 3 4 9 解析:限制性内切核酸酶Ⅱ能识别限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列,限制性内切核酸酶Ⅰ不一定能识别限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列;要将目的基因从该DNA链中提取出来,需要在目的基因左右切开,所以要用限制性内切核酸酶Ⅱ切割;质粒不能用限制性内切核酸酶Ⅱ切割,若用该酶切割,质粒的两个标记基因均会被破坏,A错误。由于DNA是双链,用限制性内切核酸酶Ⅱ将目的基因左右切开时,有四个磷酸二酯键被水解,B正确。限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割产生的黏性末端相同, C错误。重组DNA分子中含三个限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列,D错误。 12 11 10 1 5 6 7 8 2 3 4 9 7.(2025·本溪高二期中)如图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息,将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列有关叙述正确的是 (　) 注:AmpR为氨苄青霉素抗性基因,TetR为四环素抗性基因。 A.可选择的限制酶组合是酶E和酶G B.所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR C.用含氨苄青霉素的培养基就能筛选出含重组质粒的受体菌 D.同时用三种限制酶处理图中质粒,可得到3个DNA片段 √ 12 11 10 1 5 6 7 8 2 3 4 9 解析:酶E会破坏两种标记基因,为避免切割后DNA片段的自身环化,又保留质粒上的标记基因,切割时应选择的限制酶组合是酶F和酶G,A错误;所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR,以便于对含有目的基因的受体菌进行筛选,B正确;重组质粒上的四环素抗性基因被破坏,而氨苄青霉素抗性基因能表达,用含氨苄青霉素的培养基筛选出的是导入重组质粒的受体菌和导入普通质粒的受体菌,C错误;据题图可知,同时用三种限制酶处理图中质粒,能将质粒切割成4个DNA片段,D错误。 12 11 10 1 5 6 7 8 2 3 4 9 8.环境雌激素(EEs)会影响动物和人类的性腺发育。斑马鱼在EEs的诱导下,会表达出卵黄蛋白原(vtg)。已知绿色荧光蛋白(GFP)基因能使斑马鱼发光,欲获得能检测水中是否含有EEs的转基因斑马鱼,下列操作合理的是 (　　) A.将EEs基因的启动子与GFP基因重组 B.将vtg基因的启动子与GFP基因重组 C.将GFP基因的启动子与GFP基因重组 D.将GFP基因的启动子与vtg基因重组 √ 解析:由题意可知,环境中的EEs可诱导斑马鱼体内vtg基因的表达,在不含EEs的环境中,斑马鱼体内vtg基因不能表达。因此,只要将vtg基因的启动子与GFP基因重组并导入斑马鱼体内,便能根据斑马鱼是否发光检测水中是否含EEs。 12 11 10 1 5 6 7 8 2 3 4 9 9.[多选]某人利用下图中所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的 基因的重组表达载体。下列有关叙述正确的是 (　　) A.这三种重组表达载体中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的是甲、丙 B.启动子是DNA片段,是RNA连接酶识别和结合的部位 C.抗生素抗性基因便于重组DNA分子的筛选 D.复制原点可以让重组表达载体拥有自主复制的能力 √ √ √ 12 11 10 1 5 6 7 8 2 3 4 9 解析:在基因表达载体中,启动子位于目的基因的上游,终止子应位于目的基因的下游,这样目的基因才能表达,图中甲和丙均不能在宿主细胞内表达出目的基因产物,A正确;启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,是RNA聚合酶识别和结合的部位,它能驱动基因转录出mRNA,B错误;载体上的标记基因便于重组DNA分子的筛选,该载体上的标记基因是抗生素抗性基因,C正确;质粒上的复制原点可使重组表达载体能够在受体细胞中自主复制,D正确。 12 11 10 1 5 6 7 8 2 3 4 9 二、非选择题 10.图1表示目的基因及限制酶切割位点,图2表示质粒。请回答下列问题: (1)获得图1中目的基因的方法除了PCR技术,还有(答一点) ____________________________________。 从基因文库中获取、人工合成 解析:获得目的基因的方法有PCR技术、从基因文库中获取、人工合成等。 10 12 11 1 5 6 7 8 2 3 4 9 (2)采用PCR扩增目的基因的原理是_________________,图1中A、B、C、D 4种与目的基因互补的单链DNA片段中,_________可作为扩增目的基因的引物。 解析:采用PCR扩增目的基因的原理是DNA半保留复制,DNA复制只能从子链的5'端到3'端,因此A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取B和C作为引物。 DNA半保留复制 B、C 10 12 11 1 5 6 7 8 2 3 4 9 (3)在构建目的基因表达载体时,用PstⅠ、EcoRⅠ两种酶同时切割目的基因和质粒,是为了防止一种酶切割时_____________________________________,从图1切割下目的基因需要消耗______个水分子。不选用限制酶PstⅠ和HindⅢ同时对质粒和目的基因进行切割的原因是______________________ ________________。 目的基因与载体的自身环化和反向连接 4 会同时破坏质粒上的 两种标记基因 解析:在构建目的基因表达载体时,用PstⅠ、EcoRⅠ两种酶同时切割目的基因和质粒,是为了防止一种酶切割时目的基因与载体的自身环化和反向连接。限制酶破坏的是磷酸二酯键,图中目的基因切割需要破坏4个磷酸二酯键,因此需要消耗4个水分子。由图2可知,不选用限制酶PstⅠ和HindⅢ同时对质粒和目的基因进行切割的原因是会同时破坏质粒上的两种标记基因。 10 12 11 1 5 6 7 8 2 3 4 9 11.蜂毒前溶血肽原是PL基因的表达产物,在蜜蜂体内合成后首先加工成蜂毒溶血肽原(蜂毒肽前体蛋白),被进一步水解形成分泌蛋白蜂毒肽。与蜂毒肽相比,蜂毒前溶血肽原具有较大的溶解度,且对细胞的破坏能力小,可利用基因工程合成蜂毒肽的前体产物。 (1)生产蜂毒肽常选用微生物作为受体细胞,优点是___________________ _____________________________________________________________ (答出两点即可);原核细胞________(填“能”或“不能”)将蜂毒前溶血肽原加工成蜂毒肽,原因是___________________________________________ __________________________。 和遗传物质简单,生产成本低,生长繁殖快,容易进行遗传物质操作 微生物的生理结构 不能 原核细胞无内质网和高尔基体,无法对表达出的 蜂毒前溶血肽原进行加工 10 11 12 1 5 6 7 8 2 3 4 9 解析:由于微生物的生理结构和遗传物质简单,生产成本低,生长繁殖快,对环境因素敏感和容易进行遗传物质操作,故基因工程中常用微生物作为受体细胞。原核细胞无内质网和高尔基体,无法对表达出的蜂毒前溶血肽原进行加工,故通过原核细胞不能直接获得蜂毒肽,还需要进一步加工。 11 10 12 1 5 6 7 8 2 3 4 9 (2)对目的基因可利用人工化学合成方法进行全基因合成,设计并合成引物对合成基因进行PCR扩增,引物序列的长度越长、G—C含量越高,PCR过程中复性温度的设定值越____。将PCR产物和pGEX⁃4T⁃1载体利用限制酶____________________________进行重组DNA分子的构建,获得蜂毒前溶血肽原与GST(一种标签蛋白)融合表达重组质粒pGEX⁃4T⁃1/PPMel(见图)。 高 EcoRⅠ、SalⅠ和DNA连接酶 11 10 12 1 5 6 7 8 2 3 4 9 解析:G—C碱基对之间含有3个氢键,A—T之间含有2个氢键,G—C含量越高, DNA越稳定,为保证引物与模板链特异性配对,复性温度的设定值应较高。重组DNA分子构建时需要用到限制酶(切割目的基因和载体)和DNA连接酶(连接切割后的目的基因和载体)。据题图可知,目的基因两端含有EcoRⅠ和SalⅠ切割位点,推测所选的限制酶是EcoRⅠ和SalⅠ。 11 10 12 1 5 6 7 8 2 3 4 9 (3)若培育相应的转基因植物,常用农杆菌转化法,需将目的基因插入Ti质粒的__________中,最后通过植物组织培养技术培育转基因植株。 T⁃DNA 解析:常用农杆菌转化法培育转基因植物,将目的基因插入Ti质粒的T⁃DNA上,利用农杆菌的转化作用,就可以将目的基因随机整合到植物细胞染色体的DNA上。 11 10 12 1 5 6 7 8 2 3 4 9 12.图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图,载体质粒P0具有四环素抗性基因(TetR)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)。请回答下列问题: 解析:据题图和EcoRⅤ酶切位点可知,EcoRⅤ酶切出来的线性载体P1为平末端。 平 11 10 12 1 5 6 7 8 2 3 4 9 (2)用耐高温的DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段,其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理,在两端各添加了一个碱基为______________的脱氧核苷酸,形成P2;P2和目的基因片段在__________酶的作用下,形成重组质粒P3。 胸腺嘧啶(或T) DNA连接 解析:从图1中可以看出,目的基因的两端各有一个游离的腺嘌呤脱氧核苷酸,由于载体P1为平末端,所以载体P1的两端应该各添加一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸,这样在DNA连接酶的作用下才能把目的基因和载体P1连接起来。 12 11 10 1 5 6 7 8 2 3 4 9 (3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板进行筛选,得到A、B、C三类菌落,其生长情况如下表(“+”代表生长,“-”代表不生长)。根据表中结果判断,应选择的菌落是_______(填表中字母)类,另外两类菌落质粒导入情况分别是__________________、______________________。 平板类型 菌落类型 A B C 无抗生素 + + + 氨苄青霉素 + + - 四环素 + - - 氨苄青霉素+四环素 + - - B A类菌落含有P0 C类菌落未导入质粒 12 11 10 1 5 6 7 8 2 3 4 9 解析:由题意可知,构建重组质粒时四环素抗性基因被破坏,所以导入目的基因的菌落只能在没有抗生素或含有氨苄青霉素的培养基中存活,应该选B类菌落。A类菌落能在所有平板类型条件下存活,说明导入的是P0质粒。C类菌落只能在无抗生素的平板上存活,说明C类菌落没有导入质粒。 12 11 10 1 5 6 7 8 2 3 4 9 (4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是___________。某学生尝试用图中另外一对引物,结果从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段,原因是_________________________________________。 乙、丙 选用甲、乙作引物,且目的基因反向连接 解析:据图2分析,目的基因的外侧链只能用丙作引物,内侧链可用甲、乙作引物,如果用甲、丙作引物,则无论目的基因是否插入正确,都能通过PCR扩增大量目的基因,如果用乙、丙作为引物,当目的基因插入不正确(反向插入)时,则乙、丙两引物都结合在外侧,PCR不能正常进行,因此选用乙、丙作为引物可以进行PCR鉴定。若扩增出的DNA片段为400 bp,则正好是目的基因反向连接后,外侧链用乙作引物,内侧链用甲作引物扩增出的片段。 12 11 10 本课结束 更多精彩内容请登录：www.zghkt.cn [典例]　已知限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的识别序列及切割位点分别为含某目的基因的DNA片段如图所示,若利用质粒A(含限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点各1个)构建基因表达载体,为克服目的基因和质粒A的自身环化以及目的基因与质粒的任意连接等,应该选择 (　　) ,限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切割位点是根据图示分析,下列叙述正确的是 (　　) (1)EcoRⅤ的酶切位点为EcoRⅤ酶切出来的线性载体P1为______末端。 $