第3章 第2节 第1课时 目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建-【新课程学案】2025-2026学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程教师用书word（人教版 单选版）

本讲义聚焦基因工程基本操作程序，系统梳理目的基因的筛选与获取（含PCR技术原理、条件、过程及产物鉴定）和基因表达载体的构建（组成、限制酶选择等），形成从目的基因获取到载体构建的完整学习支架。 资料通过“探究学习”分析PCR复性温度、限制酶选择等问题，结合典例解析和迁移训练培养科学思维与探究实践能力。课中辅助教师引导学生理解技术原理，课后综合检测反馈助力学生查漏补缺，提升解决实际问题的能力。

第2节　基因工程的基本操作程序 　【学习目标】 1.阐明基因工程的原理和基本操作程序。 2.针对人类生产或生活中的某一需求,选取适当的基因工程的技术和方法,尝试设计获得某一转基因产品的方案。 3.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。 第1课时　目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建 聚焦·学案一　目的基因的筛选与获取 [学案设计] (一)了解基因工程的基本步骤与目的基因的筛选与获取方法 1.培育转基因抗虫棉的四个步骤 (1)目的基因的筛选与获取。 (2)基因表达载体的构建。 (3)将目的基因导入受体细胞。 (4)目的基因的检测与鉴定。 2.筛选合适的目的基因 3.获取目的基因的方法 4.利用PCR获取和扩增目的基因 (1)PCR的含义:PCR是聚合酶链式反应的缩写,它是一项根据DNA半保留复制的原理,在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 (2)PCR的基本条件 参与的组分 在DNA复制中的作用 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 (耐高温的) DNA聚合酶 催化合成DNA子链 引物(长度通常 为20~30个核苷酸) 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 添加Mg2+ 的缓冲液 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活 (3)PCR的过程 (4)PCR的仪器:PCR扩增仪(PCR仪)。 (5)PCR产物的鉴定方法:琼脂糖凝胶电泳。 (二)深化分析PCR过程的疑难问题 |探|究|学|习| 　　聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,结合所学知识回答下列问题: (1)PCR过程中为什么需要引物?DNA链复制的方向是怎样的? 提示:DNA聚合酶不能从头合成子链,只能把游离的脱氧核苷酸连接到已经存在的片段上。加入引物,能够使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。DNA链复制的方向总是从子链的5'端向3'端延伸。 (2)PCR扩增目的基因时,复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对,复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关,假设引物的长度相同,在G—C含量高时,对复性温度的设定有什么要求?说明理由。 提示:当引物的长度相同,在G—C含量高时,设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键,A—T之间有两个氢键,氢键越多形成的双链DNA越牢固。在G—C含量高时,提高复性温度会增加引物与模板链结合的特异性。 (3)在利用PCR获取和扩增目的基因时,从第几轮循环才会产生完整的目的基因(可用相关图解解释)? 提示:第3轮,如图所示: |认|知|生|成| 1.PCR过程中的注意事项 (1)在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料,又可为DNA的合成提供能量。 (2)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸,作为新子链的合成起点,只能结合在母链的3'端,使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 (3)复性温度过高,则会破坏引物与模板链的碱基配对,温度过低则易使两条母链配对结合,均无法获得PCR产物。 (4)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。 2.生物体内DNA复制与PCR反应的比较 比较项目 生物体内DNA复制 PCR反应 解旋 在解旋酶作用下, 细胞提供能量,部 分DNA双链解开 90 ℃以上高温下解 旋,DNA双链全部 解开,不需要解旋酶 酶 解旋酶、DNA聚合酶等 耐高温的DNA聚合酶 引物 一小段RNA 可以是RNA或单 链DNA分子片段 合成子链 在引物基础上,一条链连续合成;另一条链不连续合成,再由DNA连接酶连接 分别从两条链引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,都是连续合成 过程 循环次数 与细胞分裂同步 人为设置 产物 完整DNA 两个引物之间的 DNA片段 相同点 都需要DNA模板、4种脱氧核苷酸、分别与两条模板链相结合的两种引物;都是半保留复制,严格遵循碱基互补配对原则 　　[典例]　(2025·南京期末)科研人员利用PCR技术扩增X基因片段,需加入两种引物,引物结合位置如图甲所示。PCR循环后产生五种DNA分子,如图乙所示。下列叙述正确的是 (　　) A.利用DNA聚合酶和DNA连接酶才能完成PCR扩增过程 B.如果加入大量引物1和引物2,会干扰正常的PCR扩增过程 C.在第四轮复制后,会出现8个⑤片段 D.经过第二轮PCR后会出现①②③④⑤五种DNA分子 　　[解析]　PCR扩增过程中不需要DNA连接酶,A错误。由图甲可知,利用PCR技术扩增X基因片段需要引物1和引物2,加入大量引物1和引物2,不会干扰正常的PCR扩增过程,B错误。若图乙表示第三轮复制的产物,则①②各有1个,③④⑤各有2个,第四次复制将得到16个DNA分子:①复制得①和③,②复制得②和④,2个③复制得2个③和2个⑤,2个④复制得2个④和2个⑤,2个⑤复制得4个⑤,C正确。第一轮PCR后得到2个两种DNA分子:①和②;第二轮PCR后得到4个四种DNA分子:①复制得①和③,②复制得②和④,所以经过第二轮PCR后会出现①②③④四种DNA分子,D错误。 　　[答案]　C 　　[思维建模]　PCR中的数量关系 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物的 DNA分子数 2 4 8 2n 含其中一种引物 的DNA分子数 1=21-1 3=22-1 7=23-1 2n-1 同时含两种引物 的DNA分子数 0=21-2 2=22-2 6=23-2 2n-2 共消耗引物 的对数 1=21-1 3=22-1 7=23-1 2n-1 含脱氧核苷酸 链等长的 DNA分子数 0=21-2 0=22-4 2=23-6 2n-2n [迁移训练] 1.判断下列表述的正误 (1)目的基因一定是编码蛋白质的基因。 (×) (2)DNA聚合酶能够从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸。 (×) (3)PCR过程不需要解旋酶。 (√) (4)PCR技术中,DNA模板链上碱基G和C的比例越高,DNA变性所需的温度就越高。 (√) 2.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述,错误的是 (　　) A.二者子链的延伸方向相同,均为5'端→3'端 B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋 C.体内DNA复制需要能量,PCR反应也需要能量 D.二者遵循的碱基互补配对原则相同 解析:选B　DNA体内复制与利用PCR技术扩增DNA时,子链的延伸方向相同,均为5'端→3'端,A正确;PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶,而是在高温条件下氢键断裂,B错误;DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时都需要能量,但两者所需能量来源不同,C正确;DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时,遵循的碱基互补配对原则相同,D正确。 3.下图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段,下列有关说法正确的是 (　　) A.片段a、b、c的长度均相同 B.片段a、b只是第一次循环的产物 C.片段c最早出现在第二次循环的产物中 D.经过30次循环后,片段c的数量为230 解析:选C　图中片段a、b只有一种引物,是以原始DNA链为模板复制而来,其长度比片段c长,A错误。由于原始模板在每次循环中均可作为模板,则每次循环都能产生图中片段a、b,B错误。由于第一次循环的产物只有一种引物,而图中片段c有两种引物,则最早出现在第二次循环的产物中,C正确。经过30次循环后,得到的DNA片段总数为230,这包括图中的片段a、b、c,D错误。 4.某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生,以下措施中有效的是 (　　) A.增加模板DNA的量 　B.延长热变性的时间 C.延长延伸的时间 　D.提高复性的温度 解析:选D　PCR过程中,引物和模板不完全配对会形成非特异条带,增加模板DNA的量不会减少反应中非特异条带的产生,A错误;延长热变性的时间,有利于双链DNA解聚为单链,不能减少反应中非特异条带的产生,B错误;延长延伸的时间,有利于合成新的DNA链,但不能减少反应中非特异条带的产生,C错误;在一定温度范围内,选择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合,从而减少非特异条带的产生,D正确。 聚焦·学案二　基因表达载体的构建　　　　　　 [学案设计] (一)理清基因表达载体的作用、组成与构建过程 1.构建基因表达载体的目的 (1)使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代。 (2)使目的基因能够表达和发挥作用。 2.基因表达载体的组成 微提醒:启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别 项目 位置 作用 启动子 位于DNA 分子上 RNA聚合酶识别结合位点,启动转录过程 起始 密码子 位于mRNA 分子上 决定翻译的开始 终止子 位于DNA 分子上 决定转录的结束 终止 密码子 位于mRNA 分子上 决定翻译的结束 3.基因表达载体的构建过程 (1)图示 (2)过程分析 ①先用特定的限制酶切割载体,使它出现一个切口; ②然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段; ③再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处,形成重组DNA分子。 (二)掌握基因表达载体构建过程中限制酶的选择技巧 |探|究|学|习| 　　目的基因导入受体细胞之前,需构建基因表达载体,图1、图2表示质粒及目的基因所在DNA片段,图中箭头表示相关限制酶的切割位点。 (1)构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里?为什么? 提示:启动子下游和终止子上游;因为只有插入在启动子和终止子之间,目的基因才可以正常表达。 (2)构建基因表达载体时,能否用SmaⅠ酶切割质粒?为什么? 提示:不能;因为用SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因,该基因是标记基因,便于重组DNA分子的筛选,若被破坏,无法进一步筛选。 (3)与只使用EcoRⅠ相比较,使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么? 提示:可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接。 |认|知|生|成| 　　构建基因表达载体中限制酶的选择技巧 (1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择PstⅠ。 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点,如图乙)。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 　　[典例]　已知限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的识别序列及切割位点分别为含某目的基因的DNA片段如图所示,若利用质粒A(含限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点各1个)构建基因表达载体,为克服目的基因和质粒A的自身环化以及目的基因与质粒的任意连接等,应该选择 (　　) A.EcoRⅠ或BamHⅠ B.Sau3AⅠ和BamHⅠ C.Sau3AⅠ和EcoRⅠ D.EcoRⅠ和BamHⅠ 　　[解析]　限制酶Sau3A Ⅰ 会破坏目的基因,质粒含有限制酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ 的酶切位点,获取目的基因也可以用限制酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ 切割,但为了防止目的基因或质粒自身环化,需要使用不同种限制酶进行切割,则应使用限制酶EcoR Ⅰ 和BamH Ⅰ 切割质粒和目的基因。 　　[答案]　D [迁移训练] 1.用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体,并转化到受体菌中。下列叙述错误的是 (　　) A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同 B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因 C.若用SphⅠ酶切,可通过琼脂糖凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 解析:选D　若用HindⅢ酶切,目的基因可能正向插入,也可能反向插入,转录的产物可能不同,A正确;若用PvuⅠ酶切,重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR),因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因,B正确;琼脂糖凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段,重组质粒的大小与质粒不同,能够鉴定重组质粒构建成功与否,C正确;SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中,若用SphⅠ酶切,会破坏四环素抗性基因,重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR),因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落,在含Tet的培养基中不能形成菌落,D错误。 2.某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析错误的是 (　　) A.用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割质粒,可得到2条DNA片段 B.不能用限制酶AluⅠ切割质粒和外源DNA的原因是限制酶AluⅠ会破坏目的基因 C.构建重组DNA时,需选择限制酶SmaⅠ和PstⅠ同时切割质粒和外源DNA D.导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长 解析:选C　限制酶HindⅢ和PstⅠ在质粒上各有一个识别切割位点,用HindⅢ和PstⅠ切割质粒,可得到2条DNA片段,A正确;AluⅠ的切割位点位于目的基因中,用限制酶AluⅠ切割外源DNA会破坏目的基因,B正确;不宜选择限制酶SmaⅠ和PstⅠ同时切割质粒和外源DNA,因为质粒中的两个标记基因均会被破坏,且DNA会反向连接至载体上,C错误;构建重组DNA时,应选择限制酶HindⅢ和PstⅠ同时切割质粒和外源DNA,此时会破坏质粒中的氯霉素抗性基因,保留四环素抗性基因,所以导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长,D正确。 一、建构概念体系 二、融通科学思维 1.设计引物是PCR技术的关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图),请分别说明理由。 ①第1组:引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效; ②第2组:引物Ⅰ'自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。 2.在构建基因表达载体时,一般用同种限制酶切割目的基因和载体的目的是产生相同的黏性末端,便于DNA连接酶将目的基因和载体连接成重组DNA。 三、综合检测反馈 1.下图表示形成cDNA并进行PCR扩增的过程。据图分析,下列叙述正确的是 (　　) A.过程①所需的原料是核糖核苷酸 B.过程②所需的酶必须耐高温 C.过程③需要解旋酶破坏氢键 D.过程④的引物对之间不能互补配对 解析:选D　过程①为逆转录,所需的原料是脱氧核苷酸,A错误;由DNA单链合成DNA双链的过程中所需要的DNA聚合酶不需要耐高温,B错误;过程③为变性,温度超过90 ℃时,双链DNA解聚为单链,不需要解旋酶破坏氢键,C错误;过程④为复性,温度降到50 ℃左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合,但引物对之间不能互补配对,D正确。 2.PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键,5'端无严格限制,可用于添加限制酶切点等序列,dNTP是DNA合成的原料,还可供能。下列相关说法错误的是 (　　) A.图示环节所需的温度比上一个环节的低 B.设计引物时,要有一段目的基因的已知核苷酸序列 C.耐高温的DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链 D.1个循环后,子代DNA双链的脱氧核苷酸数量相同 解析:选D　图示环节为引物与模板碱基互补配对,表示的是复性环节,复性的上一环节为变性,复性的温度比变性的温度低,A正确;设计引物时,要有一段目的基因的已知核苷酸序列,保证其与已知模板能碱基互补配对,在后续扩增的过程中才能进行子链的延伸,B正确;子链是从5'端向3'端延伸的,耐高温的DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链,C正确;由于两个引物均不在该片段的端点,因此一个循环后,子代DNA双链的脱氧核苷酸数量不一定相同,D错误。 3.(2025·济南六校联考)番茄在日常生活中的需求量较大,但是在较低温度下运输或储存的过程中容易出现冻伤的现象,从而影响番茄的口感和品质。科学家利用基因工程技术培育出抗冻的转基因番茄。如图为外源DNA和质粒上标出的酶切位点及相关基因,其中AFPs基因为抗冻基因。下列相关叙述错误的是 (　　) A.基因工程中常用的工具酶有限制酶和DNA连接酶 B.获得的AFPs基因应插入质粒上的启动子与终止子之间 C.应用BamHⅠ和HindⅢ切割目的基因和质粒以避免其自连或反接 D.能在含四环素的培养基上生长的受体细胞中一定都含有AFPs基因 解析:选D　基因工程中常用的工具酶有限制酶和DNA连接酶,A正确。为了保证目的基因正常表达,获得的目的基因应插入质粒上的启动子与终止子之间,B正确。用限制酶SmaⅠ切割会破坏目的基因,因此构建基因表达载体时不能选用该酶;为了防止目的基因和质粒的自身环化或反向连接,应该用两种限制酶切割目的基因和载体,结合题图分析可知,应用BamHⅠ和HindⅢ切割目的基因和质粒,C正确。能在含四环素的培养基上生长的受体细胞中不一定都含有AFPs基因,也有可能是导入普通质粒的受体细胞,D错误。 4.(2025·沧州期末)无缝克隆技术(In⁃Fusion技术)是一种先进的DNA重组技术,用于将目标DNA片段插入载体中。其中In⁃Fusion酶可以连接任何具有相同15 bp(bp为碱基对)末端序列的线性DNA分子,过程如图所示。下列关于该技术的叙述错误的是 (　　) A.推测In⁃Fusion酶可替代限制酶和DNA连接酶用于构建重组载体 B.PCR扩增目的基因时,需在引物5'端添加与载体相同的特定序列 C.利用In⁃Fusion技术构建图示重组载体时,可避免目的基因与载体的反向连接 D.当目的基因内部有多种限制酶识别序列时,该方法将无法使用 解析:选D　根据题意,In⁃Fusion酶可以替代限制酶和DNA连接酶,用于构建基因表达载体,A正确;根据题意“In⁃Fusion酶可以连接任何具有相同15 bp末端序列的线性DNA分子”,因此PCR扩增目的基因时,需在引物5'端添加与载体相同的特定序列,以便于In⁃Fusion酶的连接,B正确;通过在目的基因与线性载体两端连入不同的15 bp末端序列,可实现目的基因的定向插入,从而避免目的基因与载体的反向连接,C正确;当目的基因内部有多种限制酶识别序列时,将无法使用限制酶构建重组载体,但可设计15 bp末端序列,使用In⁃Fusion酶来构建,D错误。 学科网（北京）股份有限公司 $