2026届高三一轮复习生物：基因工程的基本工具和基本操作程序 第3课时课件

知识构建 第3课时 考情分析 考点 由高考知核心知识点 预测 基因工程的基本工具和基本操作程序 考点一：重组DNA技术的基本工具（3年12考，全国卷3年1考） 2024·贵州（选择题）、2024·湖南（选择题） 2024·江西（解答题）、2023·湖北（选择题） 2022·湖南（选择题） 题型：选择题、解答题 内容： 考基因工程是选修教材中的重点考察内容之一，基因工程的基本操作程序、蛋白质工程的原理是重高频考点，山东卷北京卷广东卷兼顾了实验“DNA的粗提取与鉴定”。 考点二：基因工程的基本操作程序（3年40考，全国卷3年3考） 2024·福建（选择题）、2024·海南（解答题） 2024·重庆（解答题）、2024·贵州（解答题） 2024·江西（解答题）、2024·北京（解答题） 2024·浙江（解答题）、2024·湖南（解答题） 2024·吉林（解答题）、2024·全国（选择题） 2024·宁夏（解答题）、2024·安徽（解答题） 2023·江苏（选择题）、2023·广东（选择题） 2022·北京（选择题）、2022·山东（选择题） 考点三：DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的 扩增与电泳鉴定（3年9考，全国卷3年 0考） 1.DNA体外扩增的原理 PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，实现体外扩增。 PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。 PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 2.DNA片段电泳鉴定的原理 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 四、DNA片段的扩增及电泳鉴定 P84-85 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 940C，5min 30 次 940C, 30s 550C, 30s 720C，1min 最后一次 940C，1min 550C, 30s 720C，10min 缓冲液、脱氧核苷酸、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 移液 离心 扩增 3.PCR实验操作步骤 注意：预变性和最后一次循环时加热变性时间更长 程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min — — 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，10min PCR仪的循环程序 使DNA充分变性，双链打开，以利于引物更好地和模板结合。 思考：预变性的目的是什么？ 思考：为什么最后1次变性时间延长？ Taq DNA聚合酶活性会随着循环次数增加而下降。在每一轮循环中，部分片段可能没有完全延伸完，Taq DNA聚合酶就脱落了。最后1次变性时间延长，让这些DNA打开，重新延伸。 使DNA充分变性，DNA双链充分打开，以利于引物更好地和模板结合。 4.PCR产物的鉴定 常采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定PCR扩增产物。 较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。 当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置(标准)，这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。 6 (2024·山东青岛模拟)DNA琼脂糖凝胶电泳的分子筛选效应是指作为支持介质的琼脂糖，具有网络结构，使大分子物质在通过时受到较大阻力，借此分离不同大小的DNA片段。下列说法错误的是(　　) A．琼脂糖凝胶电泳可用于分离、鉴定DNA分子的混合物 B．双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越大 C．凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，用于分离后DNA的检测 D．凝胶中的DNA分子通过染色，可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来 B (1)构建基因表达载体的目的 ①使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代； ②使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。 (2)基因表达载体的组成 位置： 功能： RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。 目的基因的上游（一段有特殊结构的DNA片段，紧挨转录起始位点） 人们所需要的基因 位置： 功能： 基因的下游3’端（一段特殊的DNA片断） 终止mRNA的转录 如抗性基因，筛选重组DNA分子 第二步 基因表达载体的构建 8 (3)基因表达载体的构建过程 基因表达载体构建模式图 第二步 基因表达载体的构建 单酶切缺点? A.目的基因自身环化 B.质粒重新环化 C.质粒与目的基因反向连接 通过双酶切法解决这些问题 9 将目的基因导入受体细胞的方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法 花粉管通道法 ——显微注射法 ——Ca2+处理法 我国科学家独创,培育出了抗虫棉 第三步 将目的基因导入受体细胞 10 (1)花粉管通道法 ②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。 ①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中； 第三步 将目的基因导入受体细胞(植物) 11 (2)农杆菌转化法示意图 Ti质粒 目的基因 构建基因表达载体 含目的基因的重组Ti质粒 转入 农杆菌 导入 植物细胞 目的基因插入植物染色体DNA中 植物细胞 表现出新性状的植株 植物组织培养 转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。 12 b.农杆菌的优势与缺点:农杆菌细胞内的Ti质粒上的　　　 可携带目的基因整合到受体细胞的　　　　　　上;但存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中,造成“基因污染”。 c.农杆菌转化法的两次拼接和两次导入: 第一次拼接:　　　　　　　　　　　　　　　　　　; 第二次拼接(非人工操作):指 ; 第一次导入:　　　　　　　　　　　　　　　　; 第二次导入(非人工操作):指　　　　　　　　　　　　　　　 　。 T-DNA 染色体 DNA 将目的基因拼接到Ti质粒的 T-DNA 上 插入目的基因的 T-DNA 拼接到受体细胞的染色体 DNA 上 将含目的基因的 Ti 质粒导入农杆菌 含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞 d.转化方法: 可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞,并再生成植株;受体细胞是　　 ；也可以将花序直接浸没在含农杆菌的溶液中一段时间,然后培养植株并获得种子,再进行筛选、鉴定等;受体细胞是　　　　。 体细胞 受精卵 操作程序： 取受精卵 显微注射 胚胎移植 为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？ 提纯基因表达载体 ①体积大，易操作。②全能性高，易培养成完整个体。 第三步 将目的基因导入受体细胞(动物)——显微注射法 方法——使用Ca2+处理：可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 P82 过程 Ca2+处理细胞 感受态细胞 基因表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子 大肠杆菌细胞 注意：原核生物没有内质网、高尔基体，它作为受体细胞产生出的真核生物蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。 第3步 将目的基因导入受体细胞(微生物) 微生物作为受体细胞的优点： 繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少，易于培养操作 15 类型 步骤 检测内容 方法 分子检测 第一步 转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 PCR等技术 第二步 目的基因是否转录出mRNA PCR等技术 第三步 目的基因是否翻译形成蛋白质 抗原-抗体杂交技术 个体水平鉴定 抗虫或抗病的接种实验抗性以及抗性程度 抗性检测； 基因工程产品与天然产品的功能活性比较 功能活性。 第四步 目的基因的检测与鉴定 加入相应的抗体 16 [提醒]启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别 据图分析抗虫棉的培育过程。 (1)该过程中的目的基因是 ，载体是 。 (2)基因工程中，往往使用两种限制酶切割 目的基因，这样做的原因是什么？ Bt基因 Ti质粒 为了避免目的基因和载体的自身环化和反向连接。 (3)为了保证目的基因在受体细胞中能正确表达，对目的基因在质粒中的插入位点有什么要求？ 目的基因应插入启动子与终止子之间。 (4)该实例中，导入目的基因的方法是 。为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？ 由于Ti质粒上的T－DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入T－DNA， 农杆菌转化法 (5)将目的基因导入受体细胞时，能否仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上？为什么？ 一般不能。如果仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上，由于细胞分裂可能导致目的基因丢失，无法稳定遗传。 (6)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪些？ 抗原—抗体杂交、用棉叶饲喂棉铃虫。 1. [2023·浙江6月选考] 某研究小组利用转基因技术,将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合 到野生型小鼠Gata3基因一端,如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合 子雌雄小鼠各1只,交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4 只新生小鼠的基因型,设计了引物1和引物2用于PCR扩增,PCR产物电泳结果如图乙所 示。下列叙述正确的是(　 ) A.Gata3基因的启动子无法 控制GFP基因的表达 B.翻译时先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白 C.2号条带的小鼠是野生型,4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地区分杂合子和纯合子 B 2、[2023·山东卷] 科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测, 该质粒的部分结构如图甲所示,其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是　　　　　　。除图甲中 标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有　　　　　　　　　 　　　　　　 　 (答出2个结构即可)。 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等 (2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测, 若仅用一对引物,应选择图甲中的引物　　　　　　 　。已知J基因转录的模板 链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的　　　　(填“a链”或“b链”)相应 部分的序列相同。 RNA 聚合酶 a 链 F 2和 R1或 F1与 R2 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了　　　　　　 ,条带2所检出的蛋白　　　(填 “是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 融合蛋白 不是 $